人溶菌酶药物、制法及应用的制作方法

专利名称：人溶菌酶药物、制法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药，特别是人溶菌酶新剂型药物，另外还涉及制药领域，及药物的应用。
背景技术：
抗生素创造了许多医学奇迹，使许多疾病消失无踪，如肺炎、脑膜炎、产褥热、败血症、结核等。21世纪的今天，耐药菌的发展令人触目惊心。所谓耐药菌就是细菌对药物产生抗性，是细菌多次与药物接触后，对药物的敏感性减小甚至消失，致使药物对细菌的敏感性降低甚至无效。其中耐药菌包括金黄色葡萄球菌MRSA、表皮葡萄球菌MRSE、肺炎链球菌、溶血性链球菌、肠球菌属、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、丙酸杆菌、不动杆菌、枸橼酸杆菌、沙雷氏菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单孢菌、白色念珠菌等。主要是对下列药品产生耐药性克拉霉素、罗红霉素、阿莫西林、万古霉素、德可霉素、广谱青霉素、甲氧西啉类、头孢类、青霉素钠、青霉素钾、磺胺类。
具体的耐药标准是(抑菌圈直径mm)
从细菌地耐药发展史可以看出，在某种新的抗生素出现以后，就有一批耐药菌株出现。开发一种新的抗生素一般需要10年左右的时间，而一代耐药菌的产生只要2年的时间，抗生素的研制速度远远赶不上耐药菌的发展速度。目前急需开发一种针对不同耐药菌株均有效的“超级抗生素”用于临床治疗。
重组人溶菌酶是一种有效的抗菌剂，全称为1，4-β-N-溶菌酶或者称粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶。它能切断细菌细胞壁的肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键的联结，破坏肽聚糖支架，细菌在内部渗透压的作用下细胞胀裂开，引起细菌裂解。入和动物细胞无细胞壁结构亦无肽聚糖，故溶菌酶对人体细胞无毒性作用。重组人溶菌酶除可以直接裂解细菌外，还有抗病毒、抗肿瘤、抗炎和免疫调节作用。中国专利03110824.5已记载基因重组入溶菌酶制药对抗耐药菌有明显疗效，对抗病毒有明显疗效，但其剂型一般为现有的普通剂型，但是剂型对于药物的吸收、作用效果的影响也是很重要的因素，如何选取并实现针对某些疾病最佳的剂型，对于用药途径和药物的吸收可以进一步提高。

发明内容
本发明的目的在于克服上述不足问题，提供一种人溶菌酶药物，剂型合理，吸收快、作用效果显著，使用方便是。另外还提供其制法，简单易操作，最后还提供其在医药方面的应用，在疾病预防及治疗方面的应用。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是人溶菌酶药物，剂型为吸入气(粉、液)雾剂。
所述药物含有活性1500-300万U/ml人溶菌酶。
所述药物由下述各重量份组分组成，活性15000u～30万U/ml重组人溶菌酶溶液，司盘85 0.28g，油酸乙酸0.28g，134A 10g，磷酸盐缓冲液10～20mM(pH6.5～7.5)80％、5～25％丙二醇。
所述人溶菌酶为基因工程表达的重组人溶菌酶、基因工程表达人溶菌酶的氨基端带有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的重组人溶菌酶或基因工程表达或化学合成突变体重组人溶菌酶。
制备工艺如下所述
将重组人溶菌酶纯度95％～99％活性30000U/mg冻干粉制成15000u～300000u/粒气雾胶囊剂，胶囊吸入气(粉)雾泵，在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成。
将制备好的纯度95％～99％活性30000U/mL/mg基因重组人溶菌酶配制成15000u～300000u/mL/支吸入气(液)雾剂，在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成。
吸入气(粉、液)雾剂应在避菌环境下配置，各种用具、容器等须用适应的方法清洁、灭菌，在整个操作过程中应注意防止微生物的污染。(在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成)
制备工艺流程如下容器与阀门系统的处理和装配→药物的配制和分装→填充抛射剂→质量检查→成品(在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成)。
一、容器的处理在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成洗净、灭菌、烘干气雾剂罐备用。采用气雾剂泵，用三氯甲烷熏蒸灭菌备用。
二、药物的配制和分装取重组人溶菌酶纯度95％以上、活性15000u～300万U/ml重组人溶菌酶溶液，司盘85 0.28g，油酸乙酸0.28g，134A 10g，磷酸盐缓冲液10～20mM(pH6.5～7.5)80％、5～25％丙二醇、在常温下混合均质，(在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成)配制成15000u～300万U/ml重组人溶菌酶吸入气(粉、液)雾剂成品。按分散体系配置后，分别经过质量检查，定量分装在已准备好的容器内，安装阀门，扎紧封帽。
三、抛射剂的填充抛射剂的充填方法分为压罐法，将已分装药物的容器装上阀门，扎紧封帽，先抽去容器内的空气，以免影响容器内的压力，然后通过压力灌装机将定量的抛射剂压灌入内。进入成品检定。
本发明所述人溶菌酶药物在预防或治疗由病毒、细菌、耐药菌、化学气体氯气引起的疾病中的应用。
所述人溶菌酶药物在预防或治疗由病毒、细菌、耐药菌、化学气体氯气引起的肺炎、气管炎、咽喉炎或扁桃体炎中的应用。
所述人溶菌酶药物在治疗由病毒(RNA、DNA病毒)或非典型肺炎(SAES)引起的气管炎、肺炎及肺脓肿中的应用。
本发明对人溶菌酶药物开发研究了新的剂型，与其他剂型药物相比具有更突出的持点1、肺部具有较大的吸收表面积和较薄的吸收层。肺部的肺泡表面积之和药为100m2，而且肺泡上皮很薄，布满毛细血管，这不仅可以使小分子气体快速交换，而且可以吸收很多大分子药物。2、肺部的代谢酶活性较低，没有各种消化酶的存在和干扰，使得多肽和蛋白质类药物可以稳定存在，药物吸收后不先经过肝脏，降低首过效应。3、肺部环境比较稳定，药物停留时间较长，吸收很慢的药物也可以有很好的生物利用度。4、吸入气雾剂的使用不受环境影响，设备技术简单，使用方便快捷。肺部给药通常被认为具有释药速度快，作用迅速等特点。压缩雾化吸入机的气体雾化颗粒直径在1～5微米是固定的，雾化颗粒直径1～3微米之间的点70％，所以70％的药物能够达到下呼吸道和肺部，能够达到理想的临床治疗效果。本发明剂型的合理选用，拓宽了人溶菌酶的应用领域，增强了用治疗效果，安全无毒副作用；制备工艺简单，以气雾的形式直接吸入给药，使用更方便、疗效显著。
为了更好地理解本发明的实质，下面将用重组人溶菌酶吸入气(粉、液)雾剂的药理试验及结果来说明其在制药领域中的新用途。
基因重组人溶菌酶以配制200毫升培养基为基准，用H3PO44-8毫升、MgSO41-5克，K2SO42-6克，KOH1-3克，CaSO42H2O1-3.5克，加蒸馏水至200毫升，高压灭菌后接种甘油管种子，摇床转数为每分钟250转，培养温度为20-35℃，在恒温床上培养36-48小时。进行种子罐培养后进行生产罐培养。将发酵表达完成的培养液进行提取纯化，对提取纯化的蛋白浓缩液冰冻干燥，测定蛋白量、纯度和溶菌酶活性保存。将合格的基因重组人溶菌酶制成粉或溶液制得吸入气(粉、液)雾剂1500U～30000U/ml备用。
一对小鼠的模型试验
A、雾化吸入基因重组人溶菌酶(Human Lysozyme，HLZ)对金黄色葡萄球菌MRSA BAA-42感染小鼠所致支气管肺炎的治疗作用
药物和对照药
受试药基因重组人溶菌酶(Human Lysozyme，HLZ)活性单位30000u/mg，批号020110，由大连奇龙生物技术研究所提供，实验前用PBS配成所需浓度。
对照药克拉霉素效价948U/mg，中国药品生物制品检定所标准品。
实验菌株
2002年于临床分离的耐药金黄色葡萄球菌MRSA BAA-42，为四川大学华西医学中心赠送。
实验动物
昆明种小鼠，体重17-20克，由四川抗菌素工业研究所动物室提供，动物合格证号川实动质管第99-30号(2003年合格)
仪器
<1>雾化机蕊，型号46mm，由宁波市勤州塘溪洪达电器配件厂生产，将其固定在φ12cm不锈钢杯中，该自制设备作为雾化吸入盐酸造模用。
<2>治疗用雾化器德国白瑞公司生产的压缩喷雾器(PAR1.BOY)，该设备用于喷雾人溶菌酶治疗用。
<3>BL 3100型，BS 200S-WE1型电子天平，北京赛多利斯天平公司生产。
<4>玻璃干燥器大小φ23×12.5cm。
小鼠细菌性肺炎治疗实验
(1)菌液制备及模型建立
挑取受试菌菌苔，用生理盐水冲洗后，用麦氏比浊管校正菌液浓度为2#MCF，约2.7×1011CFU/ml的浊度，再分别用生理盐水稀释至10-1，10-2，10-3菌液浓度，分别给小鼠滴鼻感染(先将小鼠用戊巴比妥麻醉，30mg/kg，ip)，每只小鼠0.05ml。观察小鼠体症变化，并于感染后48h活杀部分小鼠，取全肺组织匀浆，用生理盐水10倍稀释，吸取0.1ml至盛有MH琼脂平皿表面，35℃隔夜培养，革兰氏染色，镜检，并做活菌计数。同时观察记录小鼠死亡个数，并抽取部分小鼠气管、支气管、肺组织作病理组织观察。
细菌培养阳性，肺中细菌数≥100CFU/ml，病理组织学观察小鼠气管、支气管、肺组织出现明显充血，水肿，炎性细胞浸润等病理组织学变化。同时小鼠死亡率在50％以上则表明造模成功。
取致小鼠出现肺部病理变化并50％致死的菌量做为最低致死菌量(LD50)用该菌量作为治疗实验的感染菌量。
(2)感染小鼠及分组
选取健康昆明种小鼠，体重17-20克，以戊巴比妥麻醉(30mg/kg，ip)，吸取相当于10倍LD50的菌液对小鼠进行滴鼻感染(0.05ml/只鼠)，具体方法同上，共感染300只。取感染成功小鼠，按体重随机分为10组，每组30只。
(3)药物治疗
剂量设计人溶菌酶临床雾化治疗时药液的浓度为15000u/ml，初步拟定剂量为15000u/次，每日一次，即0.5mg/次/日。按体表面积推算至小鼠剂量为1.3×10-3mg/只(20g体重计)，由于人通气量9000ml/分相当于小鼠通气量24ml/分的375倍，人用单次剂量0.5mg/70kg相当于小鼠剂量1.3×10-3mg/20g的384倍，上二者较为接近。所以设定用临床人用浓度0.5mg/ml对小鼠进行雾化治疗，另考虑到临床人用吸入雾化溶菌酶气体利用率较高，而小鼠在雾化缸内只能靠自身呼吸吸入含药气体，故只有延长吸入时间才能确保吸入药量，设定为0.5小时。在0.5mg/ml浓度基础上再配制0.25mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml共四个浓度剂量组作为治疗时的药液浓度。结果见表1-1。
表1-1雾化吸入人溶菌酶实验分组
将同一组动物同时放入超声雾化器内，用PAR1.BOY压缩喷雾器雾化吸入不同浓度的人溶菌酶液对小鼠进行雾化治疗(见图1)，每日两次，连续5天。
(4)检测方法
各组以感染当日计算，连续观察14天，逐日记录动物发病情况和死亡数，并于感染后第14天，各组抽取2-3只小鼠活杀，取全肺匀浆后做细菌学检测，剩余动物活杀后取气管、支气管、全肺，称重后固定于10％甲醛溶液中，送病理检查。
细菌培养接种细菌后24h，每组取部分小鼠活杀，取出全肺称重，加入2ml灭菌PBS液匀浆10倍稀释，吸取0.1ml于空白MH琼脂平板，35℃培养24h，取每个平板上菌落数在30～300CF的培养平板计数，若相邻两个级别浓度组织液接种平板的菌落数均为30～300CFU，则取低浓度的菌落数计数(每份组织液同时做3个平板，计算其平均值)。于给药后5，7，14天同法各组随机抽取2只小鼠做细菌培养。
病理检测解剖小鼠后，先肉眼观察气管、支气管及肺与胸壁，隔胸膜的粘连情况，肺体积及肺病灶大小，肺表面充血，水肿，实变及不张情况。取出气管、支气管及全肺组织用10％的甲醛溶液固定，取材。脱水，石蜡包埋，切片，HE染色，在光镜下观察气管、支气管、肺组织的病理变化。
死亡率及半数有效剂量ED50的计算 自感染日起，连续观察记录14天内死亡动物数及其存活率，平均存活天数，与感染对照组进行比较。按Bliss法，运用NDST软件计算半数有效剂量ED50值及其95％可行限。
实验结果
细菌培养结果于感染细菌后第3天，第7天和第14天取部分小鼠肺组织研磨液进行细菌学检测，细菌检测结果见表1。结果表明雾化吸入人溶菌酶2，1，0.5mg/ml第1天，第3天和第5天小鼠全肺中细菌数明显低于感染模型组，细菌数随着给药天数的递增而明显降低，且具有显著性差异(P＜0.05)，至第14天，人溶菌酶给药组细菌基本转阴，≤10CFU/ml。
病理组织学观察结果表明基因重组人溶菌酶2、1、0.5mg/ml组及感染模型组气管、支气管、肺组织在给药后第3，7天抽杀解剖，病理检测结果见表2、3和4，结果表明人溶菌酶组小鼠气管、支气管、肺部病症程度明显低于感染模型组，至给药后第7、14天，观察结束24h后活杀各组动物，解剖取小鼠肺组织进行病理组织学观察表明，人溶菌酶各给药组小鼠气管、支气管、肺部基本恢复正常，而感染模型组80％动物死亡，存活的少数小鼠濒临死亡状况，肺部呈现局灶性肺泡壁组织增厚，局部或弥散分布单核、淋巴细胞浸润，局部出血、水肿等病理变化。
存活率及ED50值雾化吸入基因重组人溶菌酶(HLZ)2、1、0.5mg/ml对金葡菌MRSA BAA-42感染小鼠支气管肺炎治疗的存活率依次为76.7％、56.7％、46.7％和40％，平均存活天数分别为12.93±2.05天、11.23±3.36天、10.3±3.77天、9.30±4.08天，其存活率及存活天数均显著高于感染对照组(较感染模型组提高30-60％，P＜0.05)。其半数有效剂量ED50为0.53mg/ml(0.20-0.90mg/ml)，见表5、表6。
结果表明雾化吸入基因重组人溶菌酶对金葡菌MRSA BAA-42致小鼠支气管肺炎感染具有较好的治疗作用，其半数有效剂量ED50为0.53mg/ml。雾化吸入2，1，0.5，0.25mg(ml次)-1，其小鼠14天存活率分别为76.7，56.7，46.7和40％。平均存活天数分别为12.93±2.05天、11.23±3.36天、10.3±3.77天、9.30±4.08天，与感染对照组比较有显著性的差异(P＜0.05)。以上实验结果表明，雾化吸入基因重组人溶菌酶对小鼠细菌性感染的支气管肺炎有较好保护治疗作用。
表1 雾化吸入人溶菌酶对小鼠肺部感染金葡菌MRSA BAA-42的细菌检测结果
与感染对照组比*P＜0.05，**P＜0.01
与克拉霉素组(0.75mg/ml)相比△P＜0.05，△△P＜0.01
表2人溶菌酶各给药组小鼠肺组织病理检测结果
注*人溶菌酶给药组分别为高剂量2mg/ml，中剂量1mg/ml，低剂量0.5mg/ml。
表3 人溶菌酶各给药组小鼠支气管病理组织学检测结果
注*人溶菌酶雾化吸入剂量为高剂量2mg/ml，中剂量1mg/ml，低剂量0.5mg/ml。
表4 人溶菌酶各给药组小鼠气管病理组织学检测结果
注*人溶菌酶雾化吸入剂量为高剂量2mg/ml，中剂量1mg/ml，低剂量0.5mg/ml。
5雾化吸入人溶菌酶对小鼠金葡菌MRSA BAA-42所致细菌性肺炎的小鼠死亡分布
注与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
与克拉霉素组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01，△△△P＜0.001
表6雾化吸入人溶菌酶对小鼠肺部感染金葡菌MRSA BAA-42的治
疗作用
B、耐药化脓性链球菌上呼吸道感染所致小鼠急慢性化脓性咽喉炎模型的制备
选用健康昆明种小鼠10只，雌雄各半，体重为18-22克，挑取一定量的耐药化脓性链球菌用喷雾方式感染小鼠上呼吸道感染所致小鼠急慢性咽喉炎10只，感染后即吸入气(粉、液)雾剂的受试药30000U/ml/20g鼠重，观察一周，每日三次给药，记录小鼠有效率。实验结果表明重组人溶菌酶雾化溶液及吸入剂对耐药化脓性链球菌上呼吸道感染所致小鼠急慢性化脓性咽喉炎有明显疗效。结果如下表
C、耐药化脓性链球菌上呼吸道感染所致小鼠扁条体炎模型的制备
选用健康昆明种小鼠10只，雌雄各半，体重为18-22克，挑取一定量的化脓性链球菌用喷雾方式感染小鼠上呼吸道致扁条体炎小鼠10只，感染后即吸入气(粉、液)雾剂的受试药30000u/ml/20g鼠重，观察一周，每日三次给药，记录小鼠有效率。实验结果表明重组人溶菌酶雾化溶液及吸入剂对化脓性链球菌感染所致扁条体炎有明显疗效。结果如下表
D、人溶菌酶(Human Lysozyme，)对小鼠吸入盐酸性支气管肺炎的作用
实验材料
1、动物健康KM种小鼠50只，雄性，体重26克左右，由四川抗菌素工业研究所实验动物中心提供，质量符合壹级标准，许可证号005。
2、试药人溶菌酶(HLZ)系白色粉末，批号020110，效价30000u/mg，由大连奇龙生物技术研究所提供，临用前用生理盐水配成所需浓度备用。
3、试剂AR级盐酸，市售。用蒸馏水配制成1N浓度备用。
4、仪器<1>雾化机蕊，型号46mm，由宁波市勤州塘溪洪达电器配件厂生产，将其固定在φ12cm不锈钢杯中，该自制设备作为雾化吸入盐酸造模用。
<2>治疗用雾化器德国白瑞公司生产的压缩喷雾器
(PAR1.BOY)，该设备用于喷雾人溶菌酶治疗用。
<3>BL 3100型，BS 200S-WE1型电子天平，北京赛多利斯天平公司生产。
<4>玻璃干燥器大小φ23×12.5cm。
实验方法
将50只小鼠随机均分五组，每组10只，任意挑选其中四组进行吸入雾化盐酸造模。
造模原理
将小鼠置于存有自制雾化器的玻璃干燥器内，每批10只，雾化器内存有1N Hcl液，利用电子超频震荡原理将盐酸雾化，小鼠在雾化盐酸空气中吸入酸性气体，造成吸入性支气管肺损伤模型。吸入时间为一小时。其机理为酸性物质吸入肺时，引起白细胞的粘附，ICAM-1表达的升高，酸性物质导致肺的内皮细胞和上皮细胞对蛋白的通透性增加，从而引起肺水肿，另外酸性物质吸入肺，引起一些炎细胞因子的释放。这些细胞因子和中性粒细胞肺组织中的聚集和相互激活可导致细胞粘附、组织受损。
将造模后的40只小鼠重新合并后再随机分成四组，分别设立三给药组和一模型组。
雾化治疗
人溶菌酶临床雾化治疗时药液的浓度为15000u/ml，初步拟定剂量为15000u/次，每日一次，即0.5mg/次/日。按体表面积推算至小鼠剂量为1.3×10-3mg/只(20g体重计)，由于人通气量9000ml/分相当于小鼠通气量24ml/分的375倍，人用单次剂量0.5mg/70kg相当于小鼠剂量1.3×10-3mg/20g的384倍，二者较为接近。所以设定用临床人用浓度0.5mg/ml对小鼠进行雾化治疗，另考虑到临床人用吸入雾化溶菌酶气体利用率较高，而小鼠在雾化缸内只能靠自身呼吸吸入含药气体，故只有延长吸入时间才能确保吸入药量，设定为一小时。在0.5mg/ml为低剂量浓度基础上再配制1.0mg/ml、2.0mg/ml二浓度作为中、高剂量组治疗时的药液浓度。
小鼠置于玻璃干燥器后，用PAR1.BOY压缩喷雾器雾化不同浓度的人溶菌酶液对小鼠进行雾化治疗，每日一次，连续5-10天。(见图2)
雾化治疗第5天和10天时，每组处理一半动物(5只)，解剖取肺组织称重，并根据体重计算肺脏器系数，肉眼观察肺外观病变情况，取肺组织进行病理切片观察。
实验结果
(1)雾化治疗5天后，解剖发现模型组小鼠肺呈暗红色，有个别肺叶颜色更深暗，比正常对照组的肺色泽相比存在明显反差，正常对照组肺呈鲜明淡粉红色。各用药组肺外观色泽有较明显的改观。各组肺脏器系数见表7。
表7 雾化治疗5天后各组小鼠肺脏器系数
由表7可见，雾化治疗5天后，模型组体重仍明显低于正常对照组，用药组使体重恢复。模型组肺脏器系数明显增大，用药组除高剂量组外，中、低二剂量组与模型组比较显著性下降。
病理切片结果显示，模型组肺组织大片弥散分布性肺泡壁明显增厚，致肺泡压闭，其间多量单核细胞及部分中性白细胞浸润。4/5只产生病变；高剂量组有2/5只呈现病变，为细支气管周单核细胞为主浸润，另一只为多处小灶分布肺泡壁增厚伴单核细胞浸润，其余3/5只正常；中剂量组5/5只基本正常；低剂量组4/5只基本正常，有一只为肺泡壁型及细支气管周少许单核细胞浸润(见图3)。
对肺组织中细小支气管病理组织学的观察
正常对照组细支气管、小支气管、终末性细支气管以及呼吸性支气管，肺泡管均未见异常。模型组细、小支气管腔内充满大量变性炎细胞，相应支气管壁见多量单核细胞、淋巴细胞浸润，部分细支气管、小支气管内见少许粉红色粘液伴少许单核细胞，少许假复层上皮、单层柱状上皮脱失；终末性细支气管、呼吸性细支气管仍可见单层柱状或立方上皮脱失。高剂量组偶见小叶间支气管见假复层上层内少许单核、淋巴细胞浸润，部分细支气管内见少许炎细胞及分泌物。中剂量组少数细小支气管周偶见少许淋巴、单核细胞浸润，多数细小支气管粘膜上层，管壁完好，偶见少许粘膜上皮脱失。低剂量组一肺组织两处细小支气管粘膜上皮脱失，另一肺组织一处细支气管管腔内少许红血球，余未见异常。其于肺组织细小支气管未见异常。
(2)雾化治疗10天后，解剖发现模型组小鼠肺似呈暗红色，与正常对照组相比较明显存在色泽反差，并且该组动物于第9天有死亡(一只)，解剖肺脏见有重度病变，肺叶系暗黑色。各用药组小鼠肺外观有较大程度改观(见图4)，各组肺脏器系数见表8。
表8 雾化治疗10天后各组小鼠肺脏器系数
由表8可见，雾化治疗10天，模型组体重显著性(P＜0.05)低于正常对照组，各用药组体重与正常对照组接近，模型组肺脏器系数显著性(P＜0.01)高于正常对照组，用药组有下降趋势，但只有低剂量组表现显著性(p＜0.01)。
综合以上实验结果分析，人溶菌酶治疗小鼠吸入盐酸性支气管肺损伤模型有效，以临床人用浓度进行雾化治疗疗效最佳，其治疗效果与使用浓度无明显量效关系。
E、重组人溶菌酶药物体外预防、抑制冠状病毒的试验
1、验证药物重组人溶菌酶 蛋白含量4.3845mg 由长春奇龙生物技术研究所提供
2、阳性对照药物注射用更昔洛韦 批号020802 由湖北科益药业股份有限公司提供。
3、细胞人宫颈癌传代细胞(HELA)由本室提供。
4、病毒冠状病毒04号分离株(SARS病人血清04号标本)由佑安医院提供。
5、CO2培养箱NUAIR US AUTO FLOW提供
6、(XSZ-D2)由重庆光学仪器厂生产
7、其它试剂、器材等均由本室提供。
试验方法
1.重组人溶菌酶对HELA细胞的毒性测定
HELA细胞以40万/ml浓度接种96孔培养板，37℃、5％CO2培养2小时，加入验证药物，重组人溶菌酶倍比稀释为6000ug/ml～11.7ug/ml，阳性对照药物更昔洛韦稀释为6000ug/ml～11.7ug/ml，每浓度接种3孔，每孔100μl，同时设正常细胞对照，37℃ 5％CO2孵箱培养6天，每天在倒置显微镜下观察细胞形态变化(CPE)，以25％以下形态变化为“+”，26％～50％形态变化为“++”，51％～75％形态变化为“+++”，76％～100％形态变化为“++++”，用Reed-Muench法，计算药物半数中毒浓度(TD50)和最大无毒浓度(TD0)。
2.在HELA细胞培养内对冠状病毒04号的毒力的测定冠状病毒04号的分离(SARS病人血清分离)
HELA细胞以每毫升40万浓度接种试管，37℃5％CO2培养24小时，弃掉培养液，每管加入SARS病人血清0.2ml，33℃转鼓培养5小时后，加入维持液1ml，同时设正常细胞对照，33℃转鼓培养5～7天。细胞出现CPE变化后，采用PCR的方法检测冠状病毒，04号标本PCR阳性，确定为冠状病毒分离株。用终末稀释法纯化病毒2次，PCR检测冠状病毒仍为阳性，经免疫荧光测定双份SARS病人血清，IgM阳性，IgG4倍升高，确定为冠状病毒。采用病毒CPE法测定其效价。
病毒CPE法
HELA细胞以每毫升40万浓度接种96孔培养板，37℃5％CO2培养24小时，加入病毒液，病毒稀释10-1～10-5，5个浓度，每浓度3孔，每孔100μl，设正常细胞对照，37℃5％CO2培养5～7天，每24小时在倒置显微镜下观察记录细胞形态变化(CPE)以25％以下变化为“+”，26％～50％变化为“++”，51％～75％为“+++”，76％～100％变化为“++++”，用Reed-Muench法，计算病毒半数感染浓度TCID50。
3、重组人溶菌酶在HELA细胞培养内对冠状病毒04号的抑制作用
HELA细胞以40万/ml浓度接种96孔培养板，37℃ 5％ CO2孵箱培养24小时，细胞培养至单层，弃掉培养液，加入100 TCID50的冠状病毒液，置37℃5％CO2吸附2小时后，弃掉病毒液，加入不同浓度的重组人溶菌酶药液，药物选用对细胞的最大无毒浓度(TD0)2倍稀释10个浓度即750μg/ml～1.46μg/ml，阳性对照药物更昔洛韦为2倍稀释10个浓度即6000μg/ml～1.46μg/ml，将稀释的药物分别加入细胞孔内，每浓度3孔，同时设正常细胞对照和病毒对照，置37℃5％CO2培养箱培养5～7天，逐日在倒置显微镜下观察病毒CPE，以病毒对照出现+++-++++时结束试验，用Reed-Muench法，计算药物的半数有效浓度(IC50)和最小有效浓度(MIC)及治疗指数(TI)判断药效，试验重复三次。
4、重组人溶菌酶对冠状病毒04号的预防作用
HELA细胞以40万/ml浓度接种96孔培养板，37℃5％CO2孵箱培养24小时，细胞培养至单层，弃掉培养液，加入不同浓度的重组人溶菌酶药液，药物选用对细胞的最大无毒浓度(TD0)2倍稀释10个浓度即750μg/ml～1.46μg/ml，阳性对照药物更昔洛韦为2倍稀释13个浓度即6000μg/ml～1.46μg/ml，将稀释的药物分别加入细胞孔内，每浓度3孔，置37℃5％CO2吸附2.5小时后，加入100 TCID50的冠状病毒液，同时设正常细胞对照和病毒对照，置37℃5％CO2培养箱培养5～7天，逐日在倒置显微镜下观察病毒CPE，以病毒对照出现+++-++++时结束试验，用Reed-Muench法计算药物的半数有效浓度(IC50)和最小有效浓度(MIC)及治疗指数(TI)判断药效，试验重复三次。
试验结果
1.重组人溶菌酶对HELA细胞的毒性试验结果
重组人溶菌酶最大无毒浓度(TD0)为750±0μg/ml，半数中毒浓度(TD50)为1500±0μg/ml
阳性对照药物注射用更昔洛韦最大无毒浓度(TD0)为＞6000±0μg/ml，半数中毒浓度(TD50)为＞6000±0μg/ml。
2.在HELA细胞培养内对冠状病毒04号毒力测定结果(TCID50)
冠状病毒04号半数感染量(TCID50)为10-3。
3、重组人溶菌酶在HELA细胞培养内对冠状病毒04号的抑制作用(以下试验数据为三次试验结果的均值)
重组人溶菌酶CPE法，药物半数有效浓度(IC50)为23.4±0μg/ml，最小有效浓度(MIC)为46.8±0μg/ml，治疗指数(TI)为16。
阳性对照药物注射用更昔洛韦CPE法，药物半数有效浓度(IC50)为11.7μg/ml±0，最小有效浓度(MIC)为23.44μg/ml±0，治疗指数(TI)为256。
4、重组人溶菌酶在HELA细胞培养内对冠状病毒04号的预防作用(以下试验数据为三次试验结果的均值)
重组人溶菌酶CPE法，药物半数有效浓度(IC50)为5.9±0μg/ml，最小有效浓度(MIC)为11.7±0μg/ml，治疗指数(TI)为64。
阳性对照药物注射用更昔洛韦CPE法，药物半数有效浓度(IC50)为11.7μg/ml±0，最小有效浓度(MIC)为23.44μg/ml±0，治疗指数(TI)为256。
以上试验结果表明重组人溶菌酶药物有预防和抑制冠状病毒的作用，预防冠状病毒的效果优于抑制试验结果。


图1为用PAR1.BOY压缩喷雾器雾化吸入不同浓度的人溶菌酶液对小鼠进行雾化治疗。
图2为用PAR1.BOY压缩喷雾器雾化不同浓度的人溶菌酶液对小鼠进行雾化治疗。
图3为肺组织病理切片结果。
图4为肺外观图。
具体实施例方式
实施例1
重组人溶菌酶的制备将培养基高压灭菌后，接种人溶菌酶菌株、摇床转数为每分钟250转，培养温度为20℃，在恒温床上培养36小时。进行种子罐培养，最后进行生产罐培养。并将发酵表达完成的培养液进行提取纯化，对提取纯化的蛋白浓缩液进行冻干，测得蛋白活性后保存。将制备好的纯度95％～99％活性30000U/mL/mg基因重组人溶菌酶备用。
人溶菌酶吸入气(粉)雾剂的制备取重组人溶菌酶纯度99％活性30000U/mg冻干粉制成30000u/粒气雾胶囊剂，装入法国瓦咯瓦公司生产的胶囊吸入气(粉)雾泵，在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成，使用时以气雾的形式直接吸入肺部给药，主要用于对病毒、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌引起的抗耐药性的上、下呼吸道病症。如咽喉炎、气管炎、肺炎等疾病。
实施例2
根据实施例1所述的方法制备人溶菌酶，将制备好的纯度97％活性30000U/mL/mg基因重组人溶菌酶配制成150000u/mL/只吸入气(液)雾剂，在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成，用德国百瑞公司生产的气雾化机，以气雾的形式直接吸入肺部给药，主要用于对病毒、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌引起的抗耐药性的上、下呼吸道病症。如咽喉炎、气管炎、肺炎等疾病。
实施例3
根据实施例1所述的方法制备人溶菌酶，将重组人溶菌酶纯度98％活性30000U/mg冻干粉制成220000u/粒气雾胶囊剂，装入法国瓦咯瓦公司生产的胶囊吸入气(粉)雾泵，在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成。
实施例4
根据实施例1所述的方法制备人溶菌酶，将制备好的纯度95％活性30000U/mL/mg基因重组人溶菌酶配制成100000u/mL/支吸入气(液)雾剂，在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成。
权利要求
1、人溶菌酶药物，其特征是剂型为吸入气(粉、液)雾剂。
2、根据权利要求1所述的人溶菌药物酶，其特征是含有活性1500-300万U/ml人溶菌酶。
3、根据权利要求1所述的人溶菌酶药物，其特征是由下述各重量份组分组成，活性15000u～30万U/ml重组人溶菌酶溶液，司盘85 0.28g，油酸乙酸0.28g，134A 10g，磷酸盐缓冲液10～20mM(pH6.5～7.5)80％、5～25％丙二醇。
4、根据权利要求1所述的人溶菌酶药物，其特征是人溶菌酶为基因工程表达的重组人溶菌酶、基因工程表达人溶菌酶的氨基端带有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的重组人溶菌酶或基因工程表达或化学合成突变体重组人溶菌酶。
5、根据权利要求1-4任一所述人溶菌酶药物在预防或治疗由病毒、细菌、耐药菌、化学气体氯气引起的疾病中的应用。
6、根据权利要求1-4任一所述人溶菌酶药物在预防或治疗由病毒、细菌、耐药菌、化学气体氯气引起的肺炎、气管炎、咽喉炎或扁桃体炎中的应用。
7、根据权利要求1-4任一所述人溶菌酶药物在治疗由病毒(RNA、DNA病毒)或非典型肺炎(SAES)引起的气管炎、肺炎及肺脓肿中的应用。
8、根据权利要求1-4任一所述的人溶菌酶药物的制法，其特征是将重组人溶菌酶纯度95％～99％活性30000U/mg冻干粉制成15000u～300000u/粒气雾胶囊剂，装入胶囊吸入气(粉)雾泵，在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成。
9、根据权利要求1-4任一所述的人溶菌酶药物，其特征是将制备好的纯度95％～99％活性30000U/mL/mg基因重组人溶菌酶配制成15000u～300000u/mL/支吸入气(液)雾剂，在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成。
全文摘要
本发明涉及生物医药领域，人溶菌酶药物，剂型为吸入气(粉、液)雾剂，含有活性1500－300万U/ml人溶菌酶。本发明对人溶菌酶药物开发研究了新的剂型，与其他剂型药物相比具有更突出的特点吸入气雾剂的使用不受环境影响，设备技术简单，使用方便快捷。肺部给药通常被认为具有释药速度快，作用迅速等特点。压缩雾化吸入机的气体雾化颗粒直径在1～5微米是固定的，雾化颗粒直径1～3微米之间的点　　70％，所以70％的药物能够达到下呼吸道和肺部，能够达到理想的临床治疗效果。本发明剂型的合理选用，拓宽了人溶菌酶的应用领域，增强了用治疗效果，安全无毒副作用；制备工艺简单，以气雾的形式直接吸入给药，使用更方便、疗效显著。
文档编号A61K38/48GK1698891SQ200510071578
公开日2005年11月23日 申请日期2005年5月24日 优先权日2004年6月10日
发明者安米 申请人:安米