抗核型多角体病毒的转基因蚕及其产生方法

文档序号:1097099阅读:307来源:国知局
专利名称:抗核型多角体病毒的转基因蚕及其产生方法
技术领域
本发明涉及到抗核型多角体病毒的转基因蚕。此外,本发明涉及到生产抗核型多角体病毒的转基因蚕的方法。
背景技术
在蚕业工场,蚕被核型多角体病毒(NPV)严重侵害。迄今为止,许多研究者进行着生产抗NPV蚕的研究工作,但是,至今无一取得成功。这是由于世界上现有的蚕都缺乏抗NPV基因。为了阻止这种病毒的侵害,对蚕卵孵化区及相关设备进行彻底消毒被鼓励使用。然而,在养蚕场这样的做法不但麻烦,而且造成了巨大的人力物力消耗,结茧成本昂贵,并成为了农场复杂化的因素之一。
NPV是具有至少50或更多个基因的大DNA型病毒。众所周知,这些基因在宿主蚕细胞中增殖表达。已知其中若干的基因是病毒生长所必需的(Kool M,AhrensCH,Goldbach RW,Rohrmann GF,Vlak JM.(1994)Identification of genes involved inDNA replication of the Autographa californica baculovirus.Proc.Natl.Acad.Sci.USA91(23)11212-11216;Lu A,Miller LK.(1995)The roles of eighteen baculovirus lateexpression factor genes in transcription and DNA replication.J.Virol.69(2)975-982)。
近来,发展了一些利用转座子或标记基因生产转基因蚕的新方法(Tamura,T.(1999)Methods for producing transformed silkworms using transposons.Abstracts of the7th Conference on Insect Functions,p10-22;Horn,C.,B,Jaunich and E.A.Wimmer,(2000)Highly sensitive,fluorescent transformation marker for Drosophila transgenesis.Dev Genes Evol 210623-629;Horn,C.,and E.A.Wimmer,(2000)A versatile vetor setfor animal transgenisis Dev Genes Evol 210630-637;Thomas,J.L.,M.Da Rocha,A.Besse,B.Mauchamp and G.Chavancy,2002 3xP3-EGFP marker facilitates screening fortransgenic silkworm Bombyx mori L.from the embryonic stage onwards.Insect BiochemMol Biol 32247-253;Tamura,T.,Thibert,C.,Royer,C.,Kanda,T.,Abraham,E.,Kamba,M.,Komoto,N.,Thomas,J.-L.,Mauchamp,B.,Chavancy,G,Shirk,P.,Fraser,M.,Prudhomme,J.-C.and Couble,P.(2000)A piggyBac element-derived vector efficientlypromotes germ-line transformation in the silkworm Bombyx mori L.NatureBiotechnology 18,81-84;Berghammer,A.J.,Klingler and E.A.Wimmer,(1999)Auniversal marker for transgenic insects.Nature 402370-371;Tomita,M.,Sato,T.,Adachi,T.,Munetsuna,H.,Tamuara,T.,Kanda,T.,Yoshizato,K.(2001)Production of humancollagen gene-incorporated transgenic silkworm.Abstracts of the 24th Annual Meeting ofMolecular Biology Society of Japan)。这些方法使用DNA型piggyBac转座子作为载体,使用绿色荧光蛋白(GFP)基因作为标记基因。由于这些方法能够有效的生产重组体,因此被运用于多种实际应用,例如用于生产有用的蛋白(Tomita,M.,M..H.,SatoT,Adachi T,Hino R,Haysshi M,Shimizu K,Nakamura N,Tamura T,Yoshizato,K.,(2003)Transgenic silkworms produce recombinant human type III procollagen in cocoons.Nat.Biotechnol.21,52-56.)和新的纤维,以及培育被认为具有抗病毒特性的变种。因此,一部分这类研究已经着手进行。

发明内容
鉴于上述情形作出了本发明。本发明的目的是提供一种表现出抗NPV抗性的转基因蚕及其生产的方法。更具体地说,要提供一种携带有编码RNA分子的表达型DNA的NPV-抗性转基因蚕,该RNA分子显示出对于NPV增殖必需的基因(agene essential for proliferation of NPV in silkworms)的RNAi效应(RNAi effect),以及这种蚕的生产方法。
本发明人进行了大量分析使之达到了上述目的。首先,发明人检验了是否能够通过转基因蚕生产抗NPV的蚕。更具体而言,以来源于病毒的基因作为模板人工合成能形成具有发卡式结构的mRNA的基因,并检测携带有该基因的转基因蚕中NPV的增殖情况。结果是,病毒繁殖被显著抑制。
更具体地,本发明涉及表现出抗NPV抗性的转基因蚕及其生产的方法。[1]-[17]是本发明的具体目的,描述如下。
表现出抗核型多角体病毒抗性的转基因蚕,其中该蚕携带有编码一种RNA分子的表达型DNA,该RNA分子显示出对核型多角体病毒增殖所必需的基因的RNAi效应。
如[1]的转基因蚕,其中编码RNA分子的DNA是一种编码具有发卡型结构的RNA分子的DNA。
如[2]所述的转基因蚕,其中编码具有发卡型结构的RNA分子的DNA是这样一种DNA,其中编码mRNA任一区域的有义RNA的有义编码DNA以及与该有义编码DNA互补的DNA通过接头连接,使得所述有义编码DNA及其互补DNA相互面向,其中所述mRNA编码核型多角体病毒增殖所必需的基因。
如[1]-[3]任一项所述的转基因蚕,其中所述核型多角体病毒增殖所必需的基因是lef1基因。
如[4]的转基因蚕,其中编码有义RNA的DNA是(a)或(b)的DNA(a)含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA;(b)含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA,其中一个或多个的核苷酸被取代,删除,插入,和/或添加。
如[4]的转基因蚕,其中编码显示出RNAi效应的RNA分子的DNA是包含SEQ ID NO2所示的核苷酸序列的DNA。
一种生产表现出抗核型多角体病毒抗性的转基因蚕的方法,该方法包括以下步骤(a)将编码一种RNA分子的DNA转入蚕卵,该RNA分子显示出对核型多角体病毒增殖所必需的基因的RNAi效应;(b)从转入了所述DNA的卵孵化的蚕中挑选出转基因蚕。
制备抗核型多角体病毒的蚕的方法,其中该方法包括了在蚕细胞中表达编码一种RNA分子的DNA的步骤,该RNA显示出对核型多角体病毒增殖所必需的基因的RNAi效应。
如[7]或[8]的方法,其中编码RNA分子的DNA是一种编码具有发卡型结构的RNA分子的DNA。
如[9]所述的方法,其中编码具有发卡型结构的RNA分子的DNA是这样一种DNA,其中编码mRNA任一区域的有义RNA的有义编码DNA以及与该有义编码DNA互补的DNA通过接头连接,使得所述有义编码DNA及其互补DNA相互面向,其中所述mRNA编码核型多角体病毒增殖所必需的基因。
如[7]-[10]任一项方法,其中所述的核型多角体病毒增殖所必需的基因是lef1基因。
包含有编码一种RNA分子的DNA的载体,该RNA分子显示出对核型多角体病毒增殖所必需的基因的RNAi效应,其中所述的DNA被插入转座子的末端反向重复序列之间并与启动子功能性相连;所述的DNA包括编码有义RNA的有义编码DNA及其互补DNA,该有义RNA为编码所述基因的mRNA任一区域的有义RNA;其中所述的有义编码DNA与其互补DNA通过接头连接使得它们相互面向。
如[12]的载体,所述的核型多角体病毒增殖所必需的基因是lef1基因。
如[13]的载体,其中编码有义RNA的DNA是(a)或(b)的DNA(a)含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA;(b)含有SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA,其中一个或多个的核苷酸被取代,删除,插入,和/或添加。
如[13]的载体,其中编码显示出RNAi效应的RNA分子的DNA是包含SEQID NO2的核苷酸序列的DNA。
试剂盒,其包含[12]-[15]任一项所述的载体以及具有编码转座酶的DNA的载体。
具有制备抗核型多角体病毒的蚕的试剂,该试剂含有[12]-[15]的任一项所述的载体,或者[16]的试剂盒。


图1表示用于生产转基因蚕的载体结构。P表示来源于病毒的SK18启动子,lef表示与病毒复制有关的部分lef1基因(以箭头表示基因的方向),Fbp(A)是蚕丝心蛋白基因来源的多聚A信号,A3pGFP表示用于区分转基因蚕的标记基因。在lef1的有义DNA和反义DNA之间存在长度为96个核苷酸的接头。
图2表示在具有抗病毒基因的转基因蚕中的病毒繁殖。在将一定数量的病毒(每个个体105病毒多角体)施加予转基因蚕(tg)和对照组后72小时和96小时后,测定血中的病毒数量。病毒数量是通过实时(real-time)PCR定量病毒DNA的方法进行测定。
具体实施例方式
本发明首次成功地通过诱导一种编码RNA分子的DNA的表达生产了抗NPV的蚕,其中RNA分子显示出了对NPV在蚕细胞中增殖所必需的基因的RNAi效应。
本发明是基于该研究,提供了一种表现出抗NPV抗性的转基因蚕,该转基因蚕携带有编码RNA分子的表达型DNA,该RNA分子显示出抗NPV增殖必需基因的RNAi效应。
在本发明中,“携带有编码RNA分子的表达型DNA的转基因蚕,该RNA分子显示出对NPV增殖所必需的基因的RNAi效应”的含义不仅包括组成型表达该DNA的转基因蚕,而且还包括在具体条件(如诱导型表达)下能够表达该DNA的转基因蚕。
本发明所述的编码表现RNAi效应的RNA分子的DNA,包括了那些编码代谢物表现RNAi效应的RNA分子的DNA(例如通过RNA链裂解得到的产品)。
本发明所述的编码表现为RNAi效应的RNA分子的DNA,优选地是编码具有发卡型结构的RNA分子的DNA。编码具有发卡型结构的RNA分子的DNA的例子包括,但不限于,含有编码mRNA任一区域的有义(或反义)RNA的有义(或反义)密码子DNA之DNA,该mRNA编码NPV的增殖必需基因;以及与该DNA互补的DNA通过接头连接使得相互面向。
这里,“相互面向”意味着两条序列彼此之间位于相互面对的方向。换句话说本发明的DNA具有的结构是,其具有的末端反向重复序列是通过用接头连接编码有义RNA的DNA形成的。更具体的说,当编码有义RNA的DNA序列(双链)是例如AGTC(有义链)::::
TCAG(反义链)上述通过接头形成末端反向重复序列的、编码有义RNA的DNA序列的结构可以表示为AGTC-LLL-GACT:::: ::::
TCAG-LLL-CTGA(这里“L”表示接头的任意核苷酸,“:”表示氢键)本发明的DNA优选具有的结构是如上述的结构,即编码靶基因mRNA任一区域的有义RNA的有义编码DNA,和该DNA的互补DNA通过接头使得它们相互面向地连接。“互补DNA”可以更具体的描述为编码反义于上述的“靶基因mRNA任一区域”的RNA的DNA。因此,换句话说,本发明的DNA可以描述为具有这样的结构,其中具有编码反义于靶基因mRNA任一区域的RNA的反义编码DNA与该DNA互补的DNA通过接头以相对的(opposite)方向连接。
由于本发明的DNA具有在反向重复序列之间的接头,那么本发明的DNA转录产物也具有包含在末端反向重复序列中的接头的结构。而具有这样结构的RNA分子通常在重复序列之间形成氢键并形成发卡结构。
本发明组成接头的DNA长度并不特别加以限制,只需要其能够使邻近的重复序列形成氢键。然而,当不把内含子计算在内时,其长度范围通常在几个核苷酸(如1-10核苷酸)到大约100个核苷酸之间,更优选的是几十个核苷酸(如60,70,80,或90个核苷酸)。
组成接头的DNA核苷酸序列并不特别加以限制,可以是任意的核苷酸序列。并且,只要上述的反向重复序列之间能够形成氢键,接头也并非绝对需要。因此,本发明所述的DNA包括了缺乏接头的情况。
在本发明所述的DNA中有义编码DNA,或其互补DNA的长度,通常是1000个核苷酸或者更少,更优选的是大约500个核苷酸。
而且,在本发明中,在双链RNA部分中的RNA碱基对不需要完全配对,事实上可以存在着不配对的位点。在一定程度内存在着的不配对位点并不影响RNA形成。
本发明所述的DNA可以由本领域技术人员使用通常的基因工程技术合成。例如,可以用过下述操作制备从lef1的ORF序列的5’末端第430位核苷酸上,以及从5’末端第526位核苷酸上,分别进行PCR扩增,将扩增产物以相对的方向(opposite orientations)连接在一起。
例如,本发明所述的NPV增殖必需基因包括了lef1基因,ie-1基因,和p143(DNA解旋酶)基因。这些基因的核苷酸序列已经公开于Accession NoNC_001962,lef1基因,ie-1基因,和p143基因分别是ORF6(GENE ID1488636),ORF123(GENE ID1488755),和ORF78(GENE ID1724488)(Sumiko Gomi,Kei Majima and SusumuMaeda,Journal of General Virology(1999),80,1323-1337)。
本领域技术人员熟知病毒DNA很容易变异。因而,本发明所述的基因并不仅限于含有上述公开序列的基因,只要所述突变基因对于NPV增殖是必需的即可。
当lef1基因被选作NPV增殖必需基因,例如编码RNA分子的DNA含有的有义编码DNA包括了含有SEQ ID NO1序列的DNA,但不限于此。一个或多个核苷酸被取代,删除,插入,和/或添加的含有SEQ ID NO1序列的DNA也同样可以被利用。
包括一个或多个核苷酸的取代,删除,插入,和/或添加的SEQ ID NO1核苷酸序列中的突变,不仅包括了自然突变还包括了人工突变。核苷酸序列的突变数量和突变位点不受限制,只要该核苷酸序列可以表达表现出对核型多角体病毒增殖所必需的基因的RNAi效应的RNA分子。通常,突变数量不超过总核酸的10%,优选不超过5%,更优选不超过1%。
当lef1基因被选作靶基因,例如编码具有发卡式结构的RNA分子的DNA例子包括了含有SEQ ID NO2序列的DNA(位置1-430lef1位点有义序列,位置431-526接头序列,位置527-956反义序列),但不以此为限。
本发明生产转基因蚕的方法将在实施例中描述;然而,本发明所述的转基因蚕并不被限定为以实施例所述的方法生产的蚕。
例如,本发明的转基因蚕能够被这样的方法生产将编码RNA分子的DNA转入蚕卵,其中RNA分子显示出抗核型多角体病毒NPV增殖必需基因的RNAi效应,从携带所述DNA的卵孵化的蚕中挑选出转基因蚕。
例如,将DNA转入蚕卵如下实施将piggyBAC转座子作为载体注射进发育早期的蚕卵(Tamura,T.,Thibert,C.,Royer,C.,Kanda,T.,Abraham,E.,Kamba,M.,Komoto,N.,Thomas,J.-L.,Mauchamp,B.,Chavancy,G.,Shirk,P.,Fraser,M.,Prudhomme,J.-C.and Couble,P.,2000,Nature Biotechnology 18,81-84)。
例如,含有位于转座子末端反向重复序列之间的DNA的载体(Handler,A.M.,McCombs,S.D.,Fraser,M.J.,Saul,S.H.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(13)7520-5),其中该DNA具有这样的DNA,其编码显示出靶向NPV增殖所必需基因的RNAi效应的RNA,并功能性的连接到任意启动子的下游,该载体和携带有编码转座子的DNA的载体(辅助载体)一起转移入蚕卵。
在本发明中,“功能性连接”表示启动子和DNA连接,使得转录因子和启动子结合从而诱导位于启动子下游的DNA表达。因而,只要DNA转录可以发生,那么在启动子和该DNA之间可以有任意DNA序列。
例如,适合本发明使用的启动子包括,但不限制为,可以在任意组织中表达的基因的启动子,如SK18启动子,热休克蛋白基因的启动子,和胞质肌动蛋白与tRNA基因的启动子,异源基因启动子系统如利用转录调控系统的GAL4/UAS系统,和在脂肪体(fat body)以及中肠中特异性表达的基因的启动子。
进一步地,辅助载体的例子包括,但不限制为,pHA3PIG(Tamura,T.,Thibert,C.,Royer,C.,Kanda,T.,Abraham,E,Kamba,M.,Komoto,N.,Thomas,J.-L.,Mauchamp,B.,Chavancy,Shirk,P.,Fraser,M.,Prudhomme,J.-C.and Couble,P.,2000,NatureBiotechnology 18,81-84),但不以此为限。
本发明所述的转座子的例子包括piggyBac,但不以此为限,mariner和minos被使用(Shimizu,K.,Kanba,M.,Sonobe,H.,Kanda,T.,Klinakis,A.G.,Savakis,C.andTamura,T.(2000)Insect Mol.Biol.,9,217-281;wang W,Swevers L,Iatrou K.(2000)Insect Mol Biol 9(2)145-55)。
在本发明中,杆状病毒载体也可以被用来生产本发明转基因蚕(Yamao,M.,N.Katayama,H.Nakazawa,M.Yamakawa,Y.Hayashi et al.,1999,Genes Dev.13511-516)。
以下,详细描述将DNA转入蚕卵的方法;但是,本发明的将DNA转入蚕卵的方法并不以此为限。例如,可以用一将DNA注射入蚕卵用针管将DNA直接转入蚕卵。在优选的实施方案中,事先在蛋壳上用物理或化学方法打个孔,DNA就是通过这个孔转入蚕卵。在这个实施方案中,用来通过这个孔将DNA注射入卵的插入管的插入角度应保持与蚕卵腹表面接近垂直。
在本发明中,在蛋壳上进行物理打孔的方法,例如是用针或微型激光器。优选地,使用针在蛋壳上打孔。针的制造材料、针的强度等,都不需要特别限定,只要该针能够在蚕卵上打孔就可。本发明使用的针通常是用有一个尖端的杆状针但是,并不只限定为该形状。只要能在蚕卵上打孔,任何形状的物体都可以采用。例如,本发明所述的“针”也包括了具有尖端的金字塔型物体,有尖端的圆锥物体。在本发明中,优选使用钨针。本发明采用的针的粗细(直径)打出的孔要能够让下述的毛细管穿过,因而针的粗细通常大约在2-20μm,或优选的是5-10μm。另外的,在蛋壳上以化学方法打孔的方法,可以采用化学物质,包括但不限于次氯酸。
在本发明中,打孔的位置不作特别限制,只要能使通过该孔注射DNA的插入管的插入角度保持与蚕卵腹表面接近垂直。打孔的位置优选地在卵的腹侧表面(ventral surface)或其对侧面,更优选的在腹侧表面,甚至更优选略微朝着蚕卵腹侧表面中央的背面末端(back end)。
本发明中,“接近垂直”意味着70°-120°更优选的是80°-90°。本发明中,“将发育为胚细胞的位置”通常在卵腹侧贴近卵表面的位置(通常是在距卵表面0.01mm-0.05mm的位置),优选是在卵的腹面中央,靠近卵表面位置的略微靠后端的位置。
本发明注射DNA采用的管子并不特别限定材料、强度、内直径等;然而,在DNA注射管插入之前在蛋壳上用物理或化学方法打孔,优选管子的粗细(外直径)应该要能够穿过这个打开的孔。例如,这样的管子的实例包括,但不限定为,玻璃毛细管。
在本发明中DNA转移方法的优选实施方案,利用装备了针和DNA注射管的机械手(manipulator)来执行以下步骤,在蚕卵上用物理或化学方法打孔,将DNA注射管穿过该孔插入蚕卵,其插入角度与蚕卵腹面接近垂直,注射DNA。通常,本发明优选使用包含以上述机械手作为组成部件的装置来进行操作。
这样的装置的组成部件包括,解剖显微镜、光源、可移动平台、用金属零件固定到显微镜的粗机械手、固定在粗机械手上的微机械手、和一个可以调节DNA注射空气压力的注射器。注射器使用的压力由氮罐提供,并使用脚踏开关来打开压力阀。要注射的蚕卵固定在基质上,例如玻璃玻片,蚕卵的位置移动则使用可移动平台控制。连接四个管子的控制器用来操作微机械手的玻璃毛细管。实际操作过程是,使用粗机械手将钨针对准蚕卵,通过平台操纵杆水平移动蚕卵而打孔。接着操作微机械手的控制器使玻璃毛细管的尖端导向到打孔的位置,再使用平台操纵杆将毛细管插入蚕卵。在这个方案中,玻璃毛细管必须插入使之与蚕卵腹面垂直。打开脚踏开关注射DNA,再操作操纵杆拔出毛细管。使用速效粘合剂或类似物封闭该孔,在恒温恒湿的孵卵器中照护蚕卵。本发明使用的装置优选的是日本专利NO.1654050所述的装置,或者是其的改进产品。
进一步,在本发明的具体方案中,被用作DNA转移的蚕卵优选的固定在基底(substrate)上。适合本发明的基底例如包括玻片和塑料片,但不以此为限。在本发明的具体方案中,理想的情况是,在蚕卵的方向恰当放置后固定,使得DNA能够精确的注射入将发育为胚细胞的蚕卵位置。进一步,在具体方案中,固定到基底上的蚕卵数量并不特别限定。当要操作多个蚕卵时,通过将其定向优选将蚕卵固定在基底上以使蚕卵的腹背放置方向应当一致。本发明可以采用固定蚕卵的方法有,例如,诱导蚕产卵在一种可购得的事先抹有水溶性胶水的纸(疏卵卡(loose egg cards))上,通过加水在纸上分开卵,然后把湿的卵在基底上排成列,风干。优选的以合适的方向把卵固定在玻片上。并且,可以使用双面胶带,粘合剂等类似物将卵固定在基底上。
检查DNA是否被转移入蚕卵的方法实例包括,例如,从卵中重提取注射的DNA并加以测定(Nagaraju,J.,Kanda,T.,Yukuhiro.K.,Chavancy,G,Tamura,T.,&Couble,P.(1996).Attempt of transgenesis of the silkworm(Bombyx mori L)by egg-injection offoreign DNA.Appl.Entomol.Zool.,31,589-598),或者观察注射入蚕卵的DNA的基因表达(Tamura,T.,Kanda,T.,Takiya,S.,Okano,K.,&Maekawa,H.(1990).Transientexpression of chimeric CAT genes injected into early embryos of the domesticatedsilkworm,Bombyx mori.Jpn.J.Gemet.,65,401-410)。
在本发明生产转基因蚕的方法中,接下来的步骤涉及从转入了本发明所述DNA的蚕卵孵化的蚕中挑选出转基因蚕。例如,在本发明中,可以通过使用筛选标记物挑选出转基因蚕。用于本发明的选择标记,是本领域技术人员通常使用的标记,包括,但不限定为,荧光蛋白例如CFP,GFP(如A3GFP),YFP,和DsRed。采用这些标记,可以使用荧光立体显微镜轻易地检测出转基因蚕。并且,由于荧光颜色的不同,可以同时使用多种标记。
本发明还进一步提供了用于上述方法的载体,及其试剂盒。具体地,本发明提供了含有编码一种RNA分子的DNA的载体,该RNA分子显示出对核型多角体病毒增殖所必需的基因的RNAi效应。在优选的具体方案中,所述的DNA被插入到转座子的末端反向重复序列,与启动子功能性地连接,并且包括编码有义RNA的有义编码DNA以及该DNA的互补DNA,所述有义RNA为编码该基因的mRNA任一区域的有义RNA;所述有义编码DNA及其互补DNA通过接头相互面向地连接。例如这样的载体包括,但不限定为,含有连接到如SK18等启动子下游的DNA的载体,该DNA还插入到来源于piggyBac载体的转座子末端反向重复序列(Tamura,T.,et al.,2000,Nature Biotechnology 18,81-84),其中插入的DNA具有编码有义(或反义)编码DNA的DNA以及该DNA之互补的DNA,前者编码NPV增殖必需基因的编码mRNA的任一区域的有义(或反义)RNA,所述有义编码DNA及其互补DNA通过接头连接以使其相互面向。当lef1基因被选作为载体中的NPV增殖必需基因,含有前述序列的DNA被用作有义编码DNA及编码具有发卡式结构的RNA分子的DNA。本发明还提供了含有上述载体和具有编码转座子的DNA的载体(辅助载体)的试剂盒。例如辅助载体包括,但不限定为,pHA3PIG(Tamura,T.,et al.,2000,NatureBiotechnology 18,81-84)。并且,本发明提供了这些载体和试剂盒的用途。尤其是,本发明提供了作为产生抗NPV蚕的试剂的用途,该试剂含有本发明的载体或试剂盒作为活性成分。
本发明在产业上的用途是能通过产生携带重组病毒基因的转基因蚕提供显示出抗NPV的转基因蚕。
生产显示抗NPV蚕的极大益处是能够避免蚕业工场中最严重的问题,即NPV的侵害。从而,这可以提高蚕品种生产的效率,节省农作劳动力,及生产高质量蚕丝。
本申请中引用的专利、专利申请和公开出版物在此引入作为参考。
实施例本发明可以参考以下实施例进行详细解释;然而,并不以此为限。
为了抑制病毒生长,将一种来源于病毒的基因用来重组生产可以制备具有发卡结构mRNA的基因。生产出的基因和载体的结构表示在图1中。
lef1基因是与蚕中NPV的DNA复制有关的基因,也是病毒增殖所必需的基因。连接该基因,其中该基因转录方向已发生反转,并用在培养细胞中表现强活性的SK18作为其启动子。并且,可以用A3GFP基因作为标记基因以区分携带该基因的转基因蚕,A3GFP可以在整个蚕体表达荧光蛋白,并可以很容易在荧光立体显微镜下分辨出携带该基因的个体。
将该载体DNA以及能够表达具有将靶基因导入到目的基因组的效应的因子的DNA(辅助DNA)注射入发育早期的蚕卵中。饲养从卵中孵化出的幼虫直到其发育为成体,然后获得第二代。通过在荧光显微镜下观察这些第二代幼虫来鉴定整个蚕体发出荧光的个体。那些看起来是转基因蚕的个体,将被继续饲养并体系化。将一定数量的NPV多角体给予这些体系化的处于最后虫龄期的转基因蚕后72小时、96小时,通过实时PCR测定血中的病毒增殖。结果表明,在携带有如图1所示基因的蚕中,病毒的增殖如图2所示受到明显抑制。
上述结果表明,携带通过使病毒基因重组所生产的基因的转基因蚕的产生可以导致抗病毒型蚕的产生。
序列表<110>独立行政法人农业生物资源研究所(NATIONAL INSTITUTE OF AGROBOLOGICALSCIENCES)<120>抗核型多角体病毒的转基因蚕及其产生方法<130>MOA-A0408<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>430<212>DNA<213>Bombyx mori<400>1atgttattgt gcaattatac acagaagcgc gtcgacatga tgtgggacgc gattgcgtac 60aacgacagcc gcaagtacgc gttcatgacg gtcaacgcgc gctggattca cgccgacaaa120tattttgata ccgccgcaca attgtatagt tacattgtgc aaaacaaagt gtccgacgtg180cacgtcaaac cgttggacga cggcggcggc agggaatggg tcgtagacgc cgattacaag240aattatgttg acgaacacga tttaatgctg aaaatttaca ttggcgccac ggcgtttttg300ttgttttaca cggaagagaa cgtgtcaaga gtcatgtat accggcaaccg tggatttcac360ttgtggttaa aattcaccga caagtttaaa atcacgtccg ctcaaaatgt tcgcgtgcat420cggtaca agg 430<210>2<211>956<212>DNA<213>人工的<220>
<223>人工合成的DNA序列<400>2atgttattgt gcaattatac acagaagcgc gtcgacatga tgtgggacgc gattgcgtac 60aacgacagcc gcaagtacgc gttcatgacg gtcaacgcgc gctggattca cgccgacaaa120tattttgata ccgccgcaca attgtatagt tacattgtgc aaaacaaagt gtccgacgtg180cacgtcaaac cgttggacga cggcggcggc agggaatggg tcgtagacgc cgattacaag240aattatgttg acgaacacga tttaatgctg aaaatttaca ttggcgccac ggcgtttttg300ttgttttaca cggaagagaa cgtgtcaaga gtcatgtata ccggcaaccg tggatttcac360ttgtggttaa aattcaccga caagtttaaa atcacgtccg ctcaaaatgt tcgcgtgcat420cggtacaagg tatgcggaat gtacaaacgt acggcctctc tcacacaatg cgcaaaactg480cccggctgaa tgcaatcact atccaacttt gcaggttttt cgaaggcctt gtaccgatgc540acgcgaacat tttgagcgga cgtgatttta aacttgtcgg tgaattttaa ccacaagtga600aatccacggt tgccggtata catgactctt gacacgttct cttccgtgta aaacaacaaa660aacgccgtgg cgccaatgta aattttcagc attaaatcgt gttcgtcaac ataattcttg720taatcggcgt ctacgaccca ttccctgccg ccgccgtcgt ccaacggttt gacgtgcacg780tcggacactt tgttttgcac aatgtaacta tacaattgtg cggcggtatc aaaatatttg840tcggcgtgaa tccagcgcgc gttgaccgtc atgaacgcgt acttgcggct gtcgttgtac900gcaatcgcgt cccacatcat gtcgacgcgc ttctgtgtat aattgcacaa taacat95权利要求
1.表现出抗核型多角体病毒抗性的转基因蚕,其中该蚕携带有编码一种RNA分子的表达型DNA,该RNA分子显示出对核型多角体病毒增殖所必需的基因的RNAi效应。
2.如权利要求1所述的转基因蚕,其中编码RNA分子的DNA是一种编码具有发卡型结构的RNA分子的DNA。
3.如权利要求2所述的转基因蚕,其中编码具有发卡型结构的RNA分子的DNA是这样一种DNA,其中编码mRNA任一区域的有义RNA的有义编码DNA以及与该有义编码DNA互补的DNA通过接头连接,使得所述有义编码DNA及其互补DNA相互面向,其中所述mRNA编码核型多角体病毒增殖所必需的基因。
4.如权利要求1-3中任一所述的转基因蚕,其中核型多角体病毒增殖所必需的基因是lef1基因。
5.如权利要求4所述的转基因蚕,其中编码有义RNA的DNA是(a)或(b)的DNA(a)含有SEQ ID NO1的核苷酸序列的DNA;(b)含有SEQ ID NO1的核苷酸序列的DNA,其中一个或多个的核苷酸被取代,删除,插入,和/或添加。
6.如权利要求4所述的转基因蚕,其中编码显示出RNAi效应的RNA分子的DNA是含有SEQ ID NO2的核苷酸序列的DNA。
7.一种产生表现出抗核型多角体病毒抗性的转基因蚕之方法,该方法包括以下步骤(a)将编码一种RNA分子的DNA转入蚕卵,其中RNA分子显示出对核型多角体病毒增殖所必需的基因的RNAi效应;和(b)从转入了所述DNA的卵得到的蚕中筛选出转基因蚕。
8.一种用于制备抗核型多角体病毒的蚕的方法,其中该方法包括了在蚕细胞中表达编码一种RNA分子的DNA的步骤,该RNA显示出对核型多角体病毒增殖所必需的基因的RNAi效应。
9.如权利要求7或8所述的方法,其中编码RNA分子的DNA是一种编码具有发卡型结构的RNA分子的DNA。
10.如权利要求9所述的方法,其中编码具有发卡型结构的RNA分子的DNA是这样一种DNA,其中编码mRNA任一区域的有义RNA的有义编码DNA以及与该有义编码DNA互补的DNA通过接头连接,使得所述有义编码DNA及其互补DNA相互面向,其中所述mRNA编码核型多角体病毒增殖所必需的基因。
11.如权利要求7-10任一项所述的方法,其中所述的核型多角体病毒增殖所必需的基因是lef1基因。
12.包含有编码一种RNA分子的DNA的载体,该RNA分子显示出对核型多角体病毒增殖所必需的基因的RNAi效应,其中所述的DNA被插入转座子的末端反向重复序列之间并与启动子功能性相连;所述的DNA包括编码有义RNA的有义编码DNA及其互补DNA,该有义RNA为编码所述基因的mRNA任一区域的有义RNA;其中所述的有义编码DNA与其互补DNA通过接头连接使得它们相互面向。
13.如权利要求12所述的的载体,其中所述的核型多角体病毒增殖所必需的基因是lef1基因。
14.如权利要求13所述的载体,其中编码有义RNA的DNA是(a)或(b)的DNA(a)含有SEQ ID NO1的核苷酸序列的DNA;(b)含有SEQ ID NO1的核苷酸序列的DNA,其中一个或多个的核苷酸被取代,删除,插入,和/或添加。
15.如权利要求13所述的载体,其中编码显示出RNAi效应RNA分子的DNA是含有SEQ ID NO2所示核苷酸序列的DNA。
16.试剂盒,其包含有权利要求12-15任一项所述的载体以及具有编码转座酶的DNA的载体。
17.一种用于制备抗核型多角体病毒蚕的试剂,该试剂含有权利要求12-15任一项所述的载体,或者权利要求16所述的试剂盒。
全文摘要
本发明的目的是提供一种表现出抗NPV抗性的转基因蚕及其产生的方法。生产了携带有编码一种RNA分子的表达型DNA的转基因蚕,该RNA分子显示出抗NPV增殖必需基因的RNAi效应。在这种转基因蚕中对NPV增殖的研究表明这些病毒的增殖能够被抑制。
文档编号A61K35/66GK1706939SQ200510079259
公开日2005年12月14日 申请日期2005年5月30日 优先权日2004年5月28日
发明者田村俊树, 小岛桂, 神田俊男, 伴户久德, 松井英雄, 町田顺一, 桑原伸夫 申请人:独立行政法人农业生物资源研究所
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