一种尖吻蝮蛇血凝酶制备方法与用途的制作方法

专利名称：一种尖吻蝮蛇血凝酶制备方法与用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种尖吻蝮蛇血凝酶制备方法与用途。特别是指一种从中国特产的尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化的具有止血作用的蛇毒类凝血酶的制备方法。
背景技术：
蛇毒类凝血酶(Thrombin-like enzymes，TLEs)是从蛇毒中分离提纯的一类具有凝血酶样活性的蛋白酶，能直接特异性地水解纤维蛋白原形成纤维蛋白而促使血液凝固。在国外和国内已批准生产的用于止血的类凝血酶制剂主要是立止血，是从洞蝮蛇(Bothrops Atrox)蛇毒纯化出的类凝血酶。由瑞士巴塞素高大药厂研制的商品名“立止血”(Reptilase)的止血药物，就是从巴西独有的洞蝮蛇毒中提炼的类凝血酶，我国每年从瑞士进口数百万支立止血在临床上广泛的应用。我国至今还没有类似的药物能替代立止血。立止血是一种分子量约为42000Da的蛋白质，其止血作用的机理是在血液中可水解纤维蛋白原的A-链，由此形成的纤维蛋白I单体可进一步聚合成复合物。与纤维蛋白原相比，这种纤维蛋白I单体及其复合物更易受到凝血酶和纤溶酶的作用，同时也易粘附于血管的破损部位。因此，在血管损伤的局部，由于凝血酶的浓度较高，可迅速将纤维蛋白I单体的B-链水解去除，交联形成生理性的纤维蛋白凝块而产生止血作用，而在循环中的纤维蛋白I则可被纤溶酶清除。但是立止血是从巴西洞蝮蛇蛇毒中分离纯化的止血药物，在我国没有该蛇种的分布(具文献中国大药房，1996，7(3)137)。
尖吻蝮蛇是我国华南地区常见的蛇种，蛇毒来源丰富，并含有丰富的TLEs。对于尖吻蝮蛇蛇毒的TLEs，台湾学者Ouyang，C.和Cheng，H.C.等，以及中国科技大学等单位曾进行了大量的研究，但均未见动物体内外止血作用的研究报道，分离的TLEs也与目前临床使用的降纤酶性质大多类似。肖昌华等学者曾报道尖吻蛇毒至少有四种TLEs组分，其中有两种TLEs在动物体内有促凝止血作用。管锦霞等学者也曾报道尖吻蝮蛇蛇毒的组分可缩短动物的凝血时间，但未见进一步开发研究的报道。魏文莉、孙家钧等学者曾尝试利用尖吻蝮蛇蛇毒和蝮蛇毒的TLEs用于动物的体外局部止血，但这些学者所用的尖吻蛇毒TLEs至少有四种，并含有其他杂蛋白，其实验设计的目的主要是想利用尖吻蛇毒TLEs和蝮蛇毒TLEs对纤维蛋白原Aα链和Bβ链不同的水解特点，形成一种更为接近生理状态的凝块，在出血的局部进行止血，但并未证明这些TLEs本身单独使用时有止血作用。综合国内研究的报道，目前尚没有我国自主研究的类似立止血这样的类凝血酶作为止血药批准用于临床。
目前文献报道的尖吻蝮蛇蛇毒类凝血酶的分离纯化一般均采用阴离子交换层析和分子筛层析方法进行。采用这种工艺方法，生产周期长、收率低、纯度较差。

发明内容
本发明所要解决的技术问题在于避免上述现有技术中的不足，而提出一种新的尖吻蝮蛇血凝酶的制备方法与用途。
本发明所提供的生产一种尖吻蝮蛇血凝酶的制备方法，该方法包括以下步骤A.尖吻蝮蛇粗毒用磷酸缓冲液溶解离心，透析，经DEAE-Sepharose层析，不同溶液的NaCl溶液梯度洗脱，收集得到组分。
B.再透析在经DEAE-Sepharose层析，得到精制的纯度尖吻蝮蛇血凝酶。
C.收精制的尖吻蝮蛇血凝酶，经Sephadex625层析柱脱盐后，得到尖吻蝮蛇血凝酶原料药。
D.收所得的尖吻蝮蛇血凝酶原料药加赋形剂过滤、分装和冷冻干燥，制得注射用尖吻蝮蛇血凝酶。
一种从中国特有的尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化得到的尖吻蝮蛇血凝酶，是由A和B两个亚基组成，具有促进血液凝固和止血作用。
进一步地，尖吻蝮蛇血凝酶A和B两个亚基的分子量为15.0KD和14.2KD。A亚基N端第一至25位的氨基酸序列为DCSSGWSSYEGHCYKVFKQSKTWTA，B亚基N端第一至25位的氨基酸序列为DCPSDWSSYECHCYKPDEPKTWEDA。
进一步地，尖吻蝮蛇血凝酶具有的止血作用是指该酶可用于哺乳动物出血的止血以及临床上人的各种类型出血的止血。
一种在临床上具有止血功能的药物组合物，该药物组合物含具有止血作用的尖吻蝮蛇血凝酶。
进一步地，在临床上具有止血功能的药物组合物，除含有具有止血作用的尖吻蝮蛇血凝酶外，还含有药学上可接受载体和/或赋形剂。
本发明有如下优点1、本发明的制备工艺是生产周期短、原料药收率高、纯度好的大批量制备工艺。原料药的收率约0.5％，纯度在95％以上。
2、尖吻蝮蛇血凝酶是从中国特有的尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化的双亚基类血凝酶，生产成本低，符合中国国情。
3、按上述方法所制备的尖吻蝮蛇血凝酶特点如下第一，尖吻蝮蛇血凝酶作为一种新的止血药，具有止血作用强，毒性极低的优点。从目前动物和人体I期、II期、III期临床研究结果来看，尚没有观察到尖吻蝮蛇血凝酶有明显的毒性作用。第二，经飞行质谱测定，该酶分子量约为29300-29500Dalton，分别由约15.0KD和16.2KD的两条多肽链以二硫键连接而成的糖蛋白，含204个氨基酸。动物试验表明，该酶能缩短凝血时间，具有很好的止血作用，其作用机理也是通过水解纤维蛋白原的A-链，形成纤维蛋白而起到止血作用。更重要的是该酶毒性非常低，急性毒性实验中测不出LD50。经过结构确证理化性质和酶学特性等的研究证明，立止血为单链，尖吻蝮蛇血凝酶是一种完全不同于立止血的类凝血酶，是一种全新的蛋白类止血药物。
尖吻蝮蛇血凝酶与立止血的比较

上述尖吻蝮蛇血凝酶与立止血的比较表明，尖吻蝮蛇血凝酶是一种结构完全不同于立止血，但具有止血作用的新的蛇毒类凝血酶。该产品仅具有止血功能，并不影响血液中的凝血酶原数量和血小板数量，在正常血管内没有血小板凝聚作用，因此无血栓形成危险。尖吻蝮蛇血凝酶是经过分离和提取的凝血酶，纯度为95％以上，不含神经毒素和其它毒素。其毒理学研究显示，该产品是一种安全的止血药物。经药学、药效学、毒理学、药代动力学的研究表明，本发明涉及的尖吻蝮蛇血凝酶具有毒性小、有显著的促进凝血作用和止血作用，适用于临床上各种类型的出血性疾病的预防和治疗。


图1为本发明的生产工艺流程图。
具体实施例方式
下面结合

本发明的具体实施方式
。
本发明的技术方案是首先从中国特有的尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化的纯度大于97％以上，分子量为29.2KD的尖吻蝮蛇血凝酶，并确定结构特征为A亚基N端第一至25位的氨基酸序列为DCSSGWSSYEGHCYKVFKQSKTWTA，B亚基N端第一至25位的氨基酸序列为DCPSDWSSYECHCYKPDEPKTWEDA。并采用药效学实验证明具有止血功能。
如图1所示1.粗毒样品的处理称取蛇毒30g，溶于200ml 0.01M磷酸缓冲液(pH7.4)，5000rpm×30min在4℃离心，上清液倒入透析袋(截留分子量为8000-10,000)内，在4℃冰箱内，置于同样的缓冲液中透析24小时，其中提透析液两次。
2.DEAE-Sepharose FF层析层析柱(3.6×40cm3)用0.01M磷酸缓冲液(PH7.4)充分平衡，透析后的蛇毒用恒流泵以15ml/min的速度注入柱内。上样完毕，用含0.02M NaCl的上述磷酸缓冲液洗脱，洗脱至体积约3100ml后，用0.02-0.1M NaCl的上述磷酸缓冲液进行直线梯度洗脱，流速约20ml/min，记录并收集蛋白洗脱峰。
3.透析收集的洗脱组分经人血浆凝固活性定性、HPLC和SDS-PAGE鉴定无误后，收集含目标成分的组分，用含0.02M NaCl的磷酸缓冲液作为透析液，透析24小时，其中提透析液两次。
4.DEAE-Sepharose FF层析上样后，分别用含0.04、0.06、0.08和1.0M NaCl磷酸缓冲液洗脱，洗脱组分经人血浆凝固活性定性、HPLC和SDS-PAGE鉴定，确定0.08M NaCl洗脱的峰即为目标组分。
5.Sephadex G25层析脱盐层析柱(7.0×100cm3)用注射用水充分冲洗平衡。蛇毒组分上样，体积约800ml，以注射用水洗脱，流速30ml/min，收集洗脱峰。
6.冷冻真空干燥脱盐后的蛇毒组分溶液，经0.22μm微孔滤膜过滤后，无菌分装，冷冻干燥后，即得尖吻蝮蛇血凝酶原料药。
7.尖吻蝮蛇血凝酶的特征鉴定A.SOS-聚丙烯酰胺凝胶电泳可见两条亚基蛋白区带，A亚基分子量为15.0KD，B亚基分子量为14.2KD。
B.经高效液相色谱鉴定，采用BIOSEP SEC层析柱，尖吻蝮蛇血凝酶呈单一对称峰，按照峰面积归一化法计算，尖吻蝮蛇血凝酶含量大于97％。
C.经氨基酸测定尖吻蝮蛇血凝酶A亚基N端第1至25位的氨基酸序列为DCSSGWSSYEGHCYKVFKQSKTWTA，B亚基N端第一至25位的氨基酸序列为DCPSDWSSYECHCYKPDEPKTWEDA。
尖吻蝮蛇血凝酶生产工艺设备，包括分离纯化，质量监控设备。
分离纯化设备主要采用国产玻璃层析柱以及G25、G75等葡聚糖凝胶装填玻璃柱后，能多次反复应用。其技术经济指标是制备出高纯度的尖吻蝮蛇血凝酶原料药，并延长凝胶的使用周期，以降低成本。
质量监控设备主要采用高效液相层析和电泳系统进行检测，采用分析型高效液相和常规电泳装量进行，由于高效液相和电泳均为目前蛋白质药物研究中常用的设备，其技术经济指标以达到能检测出单峰和单一区带的尖吻蝮蛇血凝酶原料药，保证产品的纯度质量。尖吻蝮蛇血凝酶原料药的纯度，如图5，HPLC纯度≥95％。
实施例一将10g尖吻蝮蛇粗毒用磷酸缓冲液溶解后，在5000rpm离心30min，离心上清液在透析袋中透析24小时后，上DEAE-Sepharose层析柱层析，先用0.02M NaCl磷酸缓冲液洗脱，再用0.02-0.1M NaCl磷酸缓冲液进行梯度洗脱，流速为20ml/min，收集蛋白洗脱峰，再装入透析袋进行透析24小时。收集透析后的溶液在上DEAE-Sepharose层析柱层析，用0.04，0.06，0.08和1.0M NaCl磷酸缓冲液梯度洗脱后，采用人血浆凝固活化，HPLC和SOS-PAGE鉴定，确定0.08M NaCl洗脱部分(体积为200ml)为尖吻蝮蛇血凝酶。
上述收集的尖吻蝮蛇血凝酶经SDS-PAGE鉴定，为两个亚基组成，A亚基分子量为15.0KD，B亚基分子量为14.2KD，经HPLC鉴定纯度为98％。最后加赋形剂，分装、过滤除菌、冷冻干燥、压盖制得注射用尖吻蝮蛇血凝酶为3500支。
实施例二将15g尖吻蝮蛇粗毒用磷酸缓冲液溶解后，在5000rpm离心30min，离心上清液在透析袋中透析24小时后，上DEAE-Sepharose层析柱层析，在0.02M NaCl磷酸缓冲液洗脱，再用0.02-0.1M NaCl磷酸缓冲液进行梯度洗脱，流速为20ml/min，收集蛋白洗脱峰，再装入透析袋进行透析24小时。收集透析后的溶液再上DEAE-Sepharose层析柱层析，用0.04，0.06，0.08和1.0M NaCl磷酸缓冲液梯度洗脱后，采用人血浆凝固活化，HPLC和SOS-PAGE鉴定，确定0.08M NaCl洗脱部分(体积为230ml)为尖吻蝮蛇血凝酶。
上述收集的尖吻蝮蛇血凝酶经SDS-PAGE电泳鉴定为两个亚基组成，A亚基分子量为15.0KD，B亚基分子量为14.2KD，经HPLC鉴定纯度为98％。最后加赋形剂，分装、过滤除菌、冷冻干燥、压盖制得注射用尖吻蝮蛇血凝酶为5000支。
试验方法与结果试验(一)本研究采用日本白兔和小鼠对尖吻蝮蛇血凝酶进行了血液凝固系统、纤溶系统、出血时间、血小板数量、血小板功能及全血粘度等药效学指标进行了研究。
一、试验目的观察尖吻蝮蛇血凝酶经静脉一次注射对日本白兔和小鼠止血的药效学作用，为临床用药提供药效学依据。
二、试验材料1、受试药物尖吻蝮蛇血凝酶，由康辰医药发展有限公司所提供，批号20010110。活性单位每瓶含一个活性单位(1U/瓶)的冻干粉剂，临用前将注射用水注入瓶内溶解。
2、对照品立止血为瑞士巴塞尔素高大药厂，每瓶一个活性单位，批号8834111克氏单位/瓶，临用前将注射用水注入瓶内溶解。
3、动物(1)、昆明小鼠，购于流行病学研究所动物部，合格证号京动许字(1999)-038号，体重17-22g，雌雄兼有。
(2)、日本白兔，购于北京大学医学部动物中心，合格证号京动许字2000第209号，体重为2.0公斤左右，雌雄兼有。
三、试验方法按《新药(西药)临床前研究指导原则汇编(药学、药理学、毒理学)》P.106-107的要求进行试验。
1、小鼠剪尾出血时间的测定取小白鼠随机分为5组，即高(0.5U/kg)、中(0.25u/kg)、低(0.125u/kg)3个给药剂量组；1个阳性对照组(立止血0.5u/kg)和1个溶剂对照组(生理盐水)。静脉注射给药后30分钟，在鼠尾尖向上约0.5厘米处快速剪断尾部，立即按动秒表记时，用滤纸片吸取流出的血液，出血时间的计算从剪尾开始至无出血为止。
2、全血凝固时间及全血凝块溶解试验取日本白兔全血1ml加入玻璃试管内，置于37℃水浴中，定时倾斜试管以观察血液是否凝固，记录从血液加入试管至血液全部凝固的时间。血液全部凝固的判断以90度倾斜试管时，血液不流动为标准。待血液全部凝固后再将试管继续置于37℃水浴中24小时，观察全血凝块溶解情况。
3、血浆凝血酶原(PT)的测定0.1抗凝血浆37℃水浴保温1min，加入0.2m人的促凝血酶，同时打开凝集检测仪，检测凝块形成的时间。
4、纤维蛋白原(FIB)含量的测定比浊法使用ACL-100美国库尔特凝血仪测定
5、活化部分凝血活酶时间(APTT)向0.1ml柠檬酸盐抗凝的血浆中加入0.1ml人胎盘提取液，置37℃水浴温育2分钟，加入0.1ml 25mmol/Lcacl2以引发凝集过程，同时打开凝集检测仪检查血凝块形成的时间。
6.优球蛋白凝固时间与优球蛋白溶解时间(ELT)的测定取全血1ml加入预先放入0.1ml 3mM构橼酸钠溶液的试管中混匀，3000rpm/min离心10分钟分离血浆。取尖底离心管，加蒸馏水7.5ml，1％的醋酸约0.12ml，使pH为4.5，置冰浴中。取0.5ml血浆加到上述的离心管中，混匀，继续置冰浴中10分钟，使优球蛋白充分析出。3000r/min离心5min，倾去上清液，倒置离心管于滤纸上，吸去残余液体。加硼酸缓冲液(pH9.0)0.5ml于沉淀中，置37℃水浴中，轻轻搅拌使之完全溶解。加入0.025mol/Lcacl2溶液0.5ml，开动秒表记录凝固时间。置37℃水浴中，观察凝块完全溶解的时间。
7、白细胞、红细胞和血红蛋白的测定取1ml全血立即放入盛有10ml细胞稀释液的小杯中加盖后充分振摇。用自动血细胞计数仪(Celltac，MEK-5108K日本NIHONKOHOEN公司)计数白细胞(WBC)、红细胞(RBC)和血红蛋白(HB)。
8、血小板数量(PLT)取10μl待测血样，用稀释液(生理盐水)稀释成500倍后，到入塑料检测专用杯中摇匀，放到仪器的检测处，使血样达到规定要求的高度，开动仪器进行记数(上海国嘉光电有限公司生产JXJ-300型激光血细胞记数仪)。
平均血小板体积(MPV)取10μl待测血样，放入含10ml稀释液每升含Nacll 17.47g，Kcl 10.22g，Na2Hpo4.35g，Kcl 10.28g，Licl 10.43g，EDTA-Na20.36g。制备成1001倍稀释的悬液，充分摇匀。在Baker，Series-810型血小板记数仪上计算血小板数。
血小板压积(PCT)取正常吸附血浆、兔脑粉浸出液、0.02mol/Lcacl2溶液各0.1ml，混匀，37℃温育1分钟。于上述溶液中加已预温至37℃的受检血清0.1ml，开动秒表记录凝血时间(s)，重复2次取平均值。
9、体外血小板聚集试验从兔心脏取血1ml，加入已有枸橼酸钠溶液(0.1ml，3mM)的试管中混匀，在500rpm/min离心5min，取0.3ml上层血浆加膜密封后作为富血小板血浆(PRP)。剩余的血浆在3000rpm/min离心10min，再取0.2ml上层血浆作为贫血小板血浆(PPP)。将血浆预热后，以PPP调100％，取磷酸缓冲液20ul或立止血或尖吻蝮蛇血凝酶20ul加入PRP中保温3min，再加入ADP 10ul后测定血小板聚集率的变化(血小板聚集测定仪)。
10、血栓数A2(TXA2)含量测定血栓素A2(TXA2)是血小板花生四烯酸的代谢产物。测定其含量可作为评价血小板功能的指标。但TXA2不稳定，在37℃时很快代谢成稳定的TXB2。所以通常以测定TXB2含量来代替TXA2含量。本实验采用125I标记的TXB2放免方法测定，试剂盒购于苏州大学血栓研究室。取兔全血1.5ml加入有0.2ml消炎痛-EDTA.Na2的试管中混匀，在3500rpm/min(4℃)离心15min，吸出血浆，在-20℃冰箱保存，测定时按下表操作。

全部溶液加好后混匀，在室温下放置15min。在3500rpm/min(4℃)离心20min，取其中2管的上清液测定的cpm值作为T管。在γ-自动测量仪上测定各管沉淀部分的cpm值，并依据标准曲线算出TXB2浓度。
11、全血粘度的测定从兔心脏取全血1ml，加1％肝素0.1ml抗凝。用血液粘度计(VISCONIC ED型)测定在切变率为1、5、30、和200时的全血粘度变化。
四、给药剂量、给药方法及取血方法1、给药剂量日本白兔耳缘静脉注射尖吻蝮蛇血凝酶的剂量分别为0.12u/kg、0.06u/kg、0.03u/kg。小鼠尾静脉注射给药剂量分别为0.5U/kg、0.25U/kg和0.12U/kg。
2、给药方法日本白兔采用耳缘静脉注射给药，小鼠采用尾静脉给药，与临床用药途径一致。
3、兔取血方法兔背位固定，乙醚麻醉状态下颈静脉或心脏取血。
五、阳性对照药选用目前应用广泛的立止血作为阳性对照药，由瑞士巴塞尔素高大药厂生产。
实验结果1、尖吻蝮蛇血凝酶对小鼠剪尾出血时间的影响小鼠尾静脉注射尖吻蝮蛇血凝酶0.5u/kg、0.25u/kg、0.125u/kg和立止血0.50u/kg，给药后30min测定小鼠剪尾出血时间。结果表明，尖吻蝮蛇血凝酶0.5u/kg、0.25u/kg、0.125u/kg可明显缩短小鼠剪尾出血时间，有明显量效关系。与生理盐水对照组比较，有显著差异。阳性对照药立止血0.50u/kg也明显缩短小鼠剪尾出血时间。结果见表1。
表1尖吻蝮蛇血凝酶静脉给药对小鼠剪尾出血时间的影响

**P＜0.001与空白对照组比较。
2、尖吻蝮蛇血凝酶对兔全血凝固时间的影响尖吻蝮蛇血凝酶各剂量组(0.12、0.06、0.03u/kg)均可使全血凝固时间明显缩短。药物在静注10分钟起效，30分钟时达到高峰，高、中、低剂量组及立止血组全血凝固时间缩短的最大百分率分别为47.95％、45.92％和34.97％和41.35％。药物的作用持续至给药后6小时左右，在给药12小时后逐渐恢复到给药前水平。阳性对照药立止血也能明显缩短全血凝固时间，作用强度和持续时间与尖吻蝮蛇血凝酶相差不大。结果见表2。全血凝固后将全部样品管置于37℃水浴中持续24小时，均未出现血块溶解现象。
表2静脉注射尖吻蝮蛇血凝酶对日本白兔全血凝固时间的影响

备注1、表中测定的全血凝固时间单位以秒计算，括号内数据为全血凝固时间缩短率(％)。
2、*p＜0.05，**p＜0.01，与给药前自身比较。
3、尖吻蝮蛇血凝酶对兔血浆凝血酶原的影响尖吻蝮蛇血凝酶静脉给药剂量为0.12、0.06和0.03U/kg时，对兔血浆凝血酶原无影响。结果见表3。
表3静脉注射尖吻蝮蛇血凝酶对日本白兔血浆凝血酶原(PT)的影响

表中测定数据以s表示4、尖吻蝮蛇血凝酶对兔活化部分凝血活酶时间(APTT)的影响尖吻蝮蛇血凝酶静脉给予剂量为0.12、0.06、0.03U/kg时，对APTT无明显影响。结果见表4。
表4静脉注射尖吻蝮蛇血凝酶对日本白兔部分活化凝血活酶的影响

表中数据以s表示
5、尖吻蝮蛇血凝酶对纤维蛋白(Fib)含量的影响尖吻蝮蛇血凝酶各剂量组与照药相比对纤维蛋白原的含量无明显影响，未出现药物引起的规律性变化，结果见表5。
表5静脉注射尖吻蝮蛇血凝酶对日本白兔纤维蛋白原含量的影响

表中数据以mg/dl表示。
6、尖吻蝮蛇血凝酶对优球蛋白凝固和溶解时间(ELT)的影响尖吻蝮蛇血凝酶对优球蛋白凝固时间及溶解的影响结果见表6-7。
尖吻蝮蛇血凝酶在0.06和0.03U/kg剂量下，ELT有轻度下降趋势。在阳性对照立止血组ELT也有轻度的下降，但三个剂量的尖吻蝮蛇血凝酶和立止血的作用均无明显的规律性变化。
表6静脉注射尖吻蝮蛇血凝酶对日本白兔优球蛋白凝固时间的影响

表中数据以分表示。
表7静脉注射尖吻蝮蛇血凝酶对日本白兔优球蛋白溶解时间的影响

表中数据以小时表示。
7、尖吻蝮蛇血凝酶对血小板数量、血小板体积、血小板压积的影响尖吻蝮蛇血凝酶在0.12、0.06和0.03U/kg剂量下，给药后各时问点的血小板数量、血小板体积、血小板压积与给药前相比无明显规律性变化，结果见表8-10。
表8静脉注射尖吻蝮蛇血凝酶对日本白兔血小板计数的影响

表中单位X10-9/L。
表9静±脉注射尖吻蝮蛇血凝酶对日本白兔血小板体积的影响

表中单位为fI表10静脉注射尖吻蝮蛇血凝酶对日本白兔血小板压积的影响

表中数据以％表示。
8、尖吻蝮蛇血凝酶对体外血小板聚集功能的影响表11静脉注射尖吻蝮蛇血凝酶对日本白兔血小板聚集率的影响

表中数据以(％)表示。
9、尖吻蝮蛇血凝酶对血小板生成TXA2的影响本实验采用TXB2放免试剂盒，用放射免疫分析法测定血浆中TXB2含量。结果表明尖吻蝮蛇血凝酶各剂量组和阳性对照药立止血对血小板释放TXA2的功能无明显影响，结果见表12.
表12静脉注射尖吻蝮蛇血凝酶对日本白兔TXB2的影响

表中数据以pg/ml表示。
10、尖吻蝮蛇血凝酶对兔全血粘度的影响。
在切变率分别为1、5、30、200时，高剂量组(0.12U/kg)的尖吻蝮蛇血凝酶在给药后不同时间点的全血粘度比给药前稍低。阳性对照药立止血在切变率为30和200时的全血粘度比给药前稍低。尖吻蝮蛇血凝酶在0.06和0.03U/kg时对全血粘度无明显影响。结果见表13、14、15、16。
表13静脉注射尖吻蝮蛇血凝酶对日本白兔全血粘度的影响

表中数据单位L/s。
表14静脉注射尖吻蝮蛇血凝酶对日本白兔全血粘度(mPaS)的影响

表中数据单位L/s。
表15静脉注射尖吻蝮蛇血凝酶对日本白兔全血粘度(mPaS)的影响

表中数据单位L/s表16静脉注射尖吻蝮蛇血凝酶对日本白兔全血粘度(mPaS)的影响

表中数据单位L/s。
11、尖吻蝮蛇血凝酶对红细胞(RBC)、血红蛋白(Hg)和白细胞(WBC)的影响。
尖吻蝮蛇血凝酶在0.12、0.06和0.03U/kg三个剂量时，对RBC、Hb和WBC无明显影响。阳性对照药立止血对RBC、Hb和WBC也无影响。在表17和表18中各组测定的RBC和Hb与给药前比较，随时间的变化有下降的趋势，与药物作用无关，其下降的原因可能与动物多次抽血引起的人为性失血有关。
表17静脉注射尖吻蝮蛇血凝酶对日本白兔红细胞计数的影响

X1012表18静脉注射尖吻蝮蛇血凝酶对日本白兔血红蛋白红细胞的影响

g/L。
表19静脉注射尖吻蝮蛇血凝酶对日本白兔白细胞计数的影响

六、结论1、尖吻蝮蛇血凝酶具有显著缩短出血时间的作用。静脉注射0.50，0.25和0.125U/kg三个剂量的尖吻蝮蛇血凝酶使小鼠剪尾出血时间显著缩短。
2、尖吻蝮蛇血凝酶具有促进血液凝固的作用。静脉注射0.12、0.06和0.03U/kg三个剂量的尖吻蝮蛇血凝酶可使兔全血凝固时间缩短，给药后10分钟起作用，30分钟达到高峰，作用持续射6小时以上。尖吻蝮蛇血凝酶促血液凝固的强度和时间与阳性对照药立止血基本平行。
3、尖吻蝮蛇血凝酶在0.12、0.06和0.03U/kg剂量时对凝血酶原、活化部分凝血活酶时间和血浆纤维蛋白原含量无明显影响。
4、尖吻蝮蛇血凝酶在0.12、0.06和0.03U/kg剂量时对优球蛋白溶解时间无明显影响。说明在此剂量下尖吻蝮蛇血凝酶对纤溶系统无明显作用。
5、尖吻蝮蛇血凝酶在0.12、0.06和0.03U/kg剂量时对血小板的数量和血小板压积、血小板体积、血小板释放TXA2及体外血小板聚集功能无明显影响。
6、尖吻蝮蛇血凝酶在高剂量0.12U/kg静脉给药后，全血粘度有下降趋势。阳性对照药立止血在0.06U/kg时全血粘度也有轻度下降趋势。
试验(二)注射用尖吻蝮蛇血凝酶对外科手术切口止血作用的有效性和安全性的II期临床试验。
1、试验目的初步评价注射用尖吻蝮蛇血凝酶对外科手术切口出血的临床安全性和有效性，为III期临床试验研究设计和给药剂量的确定提供依据。
2、观察指标1)安全性观察生命体征、血常规、尿常规、肝功能(谷丙转氨酶、总胆红素)、肾功能(尿素氮、肌酐)、电解质(K、Na、Cl、P)、血糖、血脂(TG、TC)、凝血相(PT、TT、APTT、FIB)、全血粘度、心电图检查。
2)疗效性观察手术切口止血时间、切口出血量、切口单位面积出血量。
3、给药方案低剂量治疗组注射用尖吻蝮蛇血凝酶2U/支；高剂量治疗组注射用尖吻蝮蛇血凝酶3U/支；安慰剂组0.8％右旋糖苷组成。
用法根据随机编号选择相应编号药品，每次1支，用2ml注射用水溶解后，静脉缓慢注射或滴注。
4、疗效性评价根据手术切口止血时间、切口出血量、切口单位面积出血量评价疗效。
5、统计分析方法统计数据集意向分析集(ITT)；符合方案集(PP)；安全数据集(SS)。
统计方法描述性统计和推断性统计。
统计表达主要采用表格形式。
统计软件采用DAS数据库和DAS(verl.0)软件分析。
6、受试入组情况及各组人群资料5家研究中心共入组180例，其中高剂量治疗组60例，低剂量治疗组60例，安慰剂组60例。高剂量治疗组完成58例，剔除2例；低剂量治疗组完成58例，剔除2例；安慰剂组完成58例，剔除2例。高剂量治疗组、低剂量治疗组和安慰剂组剔除病例数比较差异无统计意义。可比性分析显示，两组患者在人口学特征、生命体征、研究前期实验室检查、手术情况等方面的比较差异无统计意义。
7、疗效结果尖吻蝮蛇血凝酶高剂量治疗组、低剂量治疗组与安慰剂组比较，手术切口止血时间明显缩短，切口出血量和单位面积出血量均明显少于安慰剂组，统计学均有非常显著性差异。尖吻蝮蛇血凝酶高剂量治疗组和低剂量治疗组比较，切口止血时间、切口出血量、单位面积出血量差异无统计学意义。
8、安全性观察结果试验药物对生命体征、血常规、尿常规、肝功能(谷丙转氨酶、总胆红素)、肾功能(尿素氮、肌酐)、电解质(K、Na、Cl、P)、血糖、血脂(TG、TC)、凝血相(PT、TT、APTT、FIB)、全血粘度、心电图等均无不良影响。在试验过程中，无不良事件和严重不良反应发生。
9、结论注射用尖吻蝮蛇血凝酶高低剂量治疗组和低剂量治疗组对于手术切口出血均有明确的止血作用；无明显毒副作用；高剂量治疗组和低剂量治疗组疗效和安全性无显著性差异；未观察到明显的量效关系。
综上所述，尖吻蝮蛇血凝酶的I期临床耐受性研究结果显示，给药后体温、呼吸、脉搏、血压、血常规、肝功能、肾功能、电解质、心电图等未见有临床意义的改变，试验中未见严重不良反应发生。人体药代动力学研究结果显示其半衰期为2.5小时。在完成180例的随机双盲、安慰剂对照的临床II试验，其中高剂量治疗组(3U)60例，低剂量治疗组(2U)60例，安慰剂组(0.8％右旋糖苷)60例。试验结果显示对于手术切口止血时间、切口出血量、切口单位面积出血量，尖吻蝮蛇血凝酶高剂量治疗组和低剂量治疗组均明显优于安慰剂组，但高剂量治疗组和低剂量治疗组比较无显著性差异；全部180例患者均未见不良事件发生，对各安全性指标的观察结果显示两个治疗组与安慰剂组无显著性差异。综上说明尖吻蝮蛇血凝酶具有良好的有效性和安全性。
权利要求
1.一种尖吻蝮蛇血凝酶的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤A.尖吻蝮蛇粗毒用磷酸缓冲液溶解离心，透析，经DEAE-Sepharose层析，不同溶液的NaCl溶液梯度洗脱，收集得到组分；B.再透析在经DEAE-Sepharose层析，得到精制的纯度尖吻蝮蛇血凝酶；C.收精制的尖吻蝮蛇血凝酶，经SephadexG25层析柱脱盐后，得到尖吻蝮蛇血凝酶原料药；D.收所得的尖吻蝮蛇血凝酶原料药加赋形剂过滤、分装和冷冻干燥，制得注射用尖吻蝮蛇血凝酶。
2.一种由权利要求1所述方法分离纯化得到的尖吻蝮蛇血凝酶，其特征在于由A和B两个亚基组成，具有促进血液凝固和止血作用。
3.根据权利要求2所述的尖吻蝮蛇血凝酶，其特征在于A和B两个亚基的分子量为15.0KD和14.2KD；A亚基N端第一至25位的氨基酸序列为DCSSGWSSYEGHCYKVFKQSKTWTA，B亚基N端第一至25位的氨基酸序列为DCPSDWSSYECHCYKPDEPKTWEDA。
4.根据权利要求2所述的尖吻蝮蛇血凝酶，其特征在于尖吻蝮蛇血凝酶具有的止血作用是指该酶可用于哺乳动物出血的止血以及临床上人的各种类型出血的止血。
5.一种在临床上具有止血功能的尖吻蝮蛇血凝酶药物组合物，其特征在于该药物组合物含具有止血作用的尖吻蝮蛇血凝酶。
6.根据权利要求5所述的尖吻蝮蛇血凝酶药物组合物，其特征在于它还含有药学上可接受载体和/或赋形剂。
全文摘要
本发明公开了一种尖吻蝮蛇血凝酶的制备方法与用途。它包括溶解蛇毒、低温离心、透析、DEAE－Sepharose FF层析、透析、DEAE－SepharoseFF层析及Sephadex G25层析步骤。它从中国特有的尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化得到的尖吻蝮蛇血凝酶，是由A和B两个亚基组成，具有促进血液凝固和止血作用。A和B两个亚基的分子量为15.0KD和14.2KD。A亚基N端第一至25位的氨基酸序列为DCSSGWSSYEGHCYKVFKQSKTWTA，B亚基N端第一至25位的氨基酸序列为DCPSDWSSYECHCYKPDEPKTWEDA。尖吻蝮蛇血凝酶可用于临床上人的各种类型出血的止血。
文档编号A61P7/00GK1766100SQ20051008517
公开日2006年5月3日 申请日期2005年7月25日 优先权日2005年7月25日
发明者王锡娟 申请人:康辰医药发展有限公司