化合物ps-341在制备治疗慢性粒细胞性白血病的药物中的应用的制作方法

文档序号:1097942阅读:302来源:国知局
专利名称:化合物ps-341在制备治疗慢性粒细胞性白血病的药物中的应用的制作方法
技术领域
本发明涉及化合物PS-341在制备治疗白血病药物中的应用,尤其是涉及在制备治疗慢性粒细胞性白血病(chronic myeloid leukemia,CML)的药物中的应用。
背景技术
慢性粒细胞性白血病是一类以具有t(9;22)染色体易位及其形成的BCR-ABL融合基因为特征的克隆性髓系造血干细胞疾病,粒细胞、单核细胞、红细胞、血小板、B淋巴细胞均可受累,在部分病例T淋巴细胞也被累及。临床症状包括乏力、发热、消瘦、脾大等,自然病程可分为慢性期、加速期及急变期,随着病程的演变对治疗的耐药性越来越严重。研究显示,BCR-ABL融合蛋白的形成可导致ABL蛋白酪氨酸激酶活性的异常增高并引起细胞周期异常、凋亡抑制与白血病细胞的恶性增殖,因而是CML发病的基本原因。在动物实验,BCR-ABL可引起小鼠发生CML。
治疗上,羟基脲(hydroxyurea,Hu)、阿糖胞苷(cytarabine,Ara-C)等曾被广泛应用,而α干扰素(interferonα,IFNα)与Hu相比可使患者的生存期延长1-2年,并使带有t(9;22)的细胞数减少;IFNα与Ara-C联合应用进一步改善了疗效而一度被认为是CML治疗的“金标准”。但是,以上疗法均不能取得分子缓解,即BCR-ABL转录本的清除使之不能被聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测到。同种异体干细胞移植固然可使约26%的患者获得长期的临床缓解,但较高(约25%)的移植相关死亡率及高昂的费用又令不少病人望而却步。近年来发现,酪氨酸激酶活性抑制剂STI-571/Imatinib mesylate/Gleevec可占据BCR-ABL蛋白分子上的ATP结合位点,抑制ABL激酶活性,阻抑底物分子的磷酸化,从而抑制CML细胞的生长、诱导其发生凋亡与分化。Druker等用STI-571治疗54例对IFNα无反应或不能耐受IFNα治疗的慢性期CML患者,结果53例(98%)获得了血液学缓解,29例获得了细胞遗传学缓解。对出现原始细胞危象的CML病人,STI-571亦显示出一定的疗效。对初诊慢性期病人,STI-571治疗无论在诱导血液学/细胞遗传学缓解、耐受性及控制病情进展等方面均较IFNα+Ara-C疗法更有优势。但是,STI-571需长期服药,而且价格昂贵;对加速期与急变期病人,STI-571虽可使病情获得短暂缓解,但很快即可复发;即使对于慢性期病人,STI-571亦不能彻底清除异常克隆。因而开发新的治疗药物进一步改善患者预后仍是一项迫切需要解决的研究课题。
化合物PS-341(化学名[(1R)-3-甲基-1-[[(2S)-1-氧-3-苯基-2-[(吡嗪羰基)氨基]丙基]氨基]丁基]硼酸),分子式C19H25BN4O4,是美国千年制药公司(MillenniumPharmaceuticals)开发的一种二肽硼酸衍生物,它作为一种蛋白酶体抑制剂使用,可强烈而可逆地抑制蛋白酶体的功能,目前主要制作为一种注射液用于多发性骨髓瘤的临床治疗。鉴于不同肿瘤其发病原因各不相同,蛋白酶体也有不同组分或亚单位,蛋白酶体抑制剂在不同肿瘤对不同亚单位的作用不一,PS-341对髓系白血病,特别是具有t(9;22)的CML有无治疗作用,以何种原理治疗以及有效治疗的浓度,目前尚未见报道。

发明内容
本发明的目的在于提供化合物PS-341在制备治疗慢性粒细胞性白血病的药物中的应用。
PS-341在制备治疗慢性粒细胞性白血病的药物中的应用机制在于在分子水平上,PS-341活化凋亡效应分子caspase-9、caspase-3,降解聚-ATP-核糖多聚酶(PARP),而且降解/下调BCR-ABL融合蛋白,从而抑制具有t(9;22)染色体易位及其形成的BCR-ABL融合基因的克隆性髓系造血干细胞的增殖、生长、并诱导其凋亡。
本发明所述的化合物PS-341在制备治疗慢性粒细胞性白血病的药物中的应用,PS-341优选的浓度为1×10-8~1×10-6M。
化合物PS-341在制备治疗慢性粒细胞性白血病的药物中的应用更优选的浓度为1×10-8~1×10-7M。
化合物PS-341在制备治疗慢性粒细胞性白血病的药物中的应用最优选的浓度为50nM。
化合物PS-341在制备治疗慢性粒细胞性白血病的药物时可与阿糖胞苷、羟基脲、干扰素、蛋白酪氨酸激酶抑制剂STI-571中的一种或多种联合使用。
本发明是关于化合物PS-341新的医学临床用途。PS-341可活化凋亡效应分子caspases,降解引起CML发病的BCR-ABL融合蛋白,应用于制备治疗慢性粒细胞性白血病的药物中,作用机制不同于PS-341治疗多发性骨髓瘤时对蛋白酶体的抑制作用,为CML病人提供在了新的治疗药物,具有剂量小,费用适中,用药方便,疗效显著等优点。与酪氨酸激酶活性抑制剂STI-571相比,PS-341对CML的凋亡诱导效应更强,其IC50比STI-571对K562细胞的IC50值更小,因而临床需要的用药量较STI-571更小;在用药方式上,PS-341可静脉注射,更利于规则用药与维持血药浓度;在用药时间上PS-341每周用二次,连用两周,然后休息10天为一疗程,共用8疗程,而STI-571需要每天服药,长期用药,可使病人难于坚持,而且费用昂贵,故PS-341用于CML的治疗更具优势。并且,由PS-341制备的药物可用于CML慢性期、加速期和急变期的治疗,为开发具有t(9;22)染色体易位的CML新疗法奠定了基础。


图1是PS-341活化Caspase-9、降解PARP及BCR-ABL融合蛋白的作用示意图。
图2是PS-341对K562细胞的抑制率图。
图3是K562细胞在PS-341处理下的生长曲线图。
图4是K562细胞在PS-341处理后Annexin V的表达情况图。其中,4a为对照,4b为K562细胞在50nM的PS-341处理48小时后的变化。
具体实施例方式
由化合物PS-341制备的药物可活化凋亡效应分子Caspases,降解/下调BCR-ABL融合蛋白,抑制具有t(9;22)染色体易位及其形成的BCR-ABL融合基因的克隆性髓系造血干细胞的增殖、生长、并诱导其凋亡。采用浓度为1×10-9~1×10-5M的PS-341(购自美国千年制药公司)处理含有t(9;22)染色体易位的CML细胞株K562细胞,12~48小时后可引起K562细胞增殖抑制,生长抑制,并出现细胞凋亡。由PS-341制备的药物可静脉注射,每周给药二次,连用两周,然后休息10天为一疗程,共用8疗程。不需每天用药,利于病人规则用药,利于检测病人血药浓度,并可用于CML慢性期、加速期和急变期的治疗。
实施例1用5~50nM浓度的PS-341处理K562细胞,作用12~24小时后收集细胞并用1×细胞裂解液裂解细胞提取蛋白质,然后用抗PARP抗体、抗caspase-9抗体、抗Abl抗体(均为美国Santa Cruz公司产品)进行Western blot免疫印迹实验,发现PS-341处理可引起凋亡效应分子Caspase-9活化、PARP裂解(说明caspase-3也被活化),并且使BCR-ABL融合蛋白发生降解。如图1所示,其中Actin蛋白作为对照。
实施例2用不同浓度的化合物PS-341(1×10-9~1×10-5M)处理K562细胞,44小时后加入含有2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐(WST-8)的CCK-8检测试剂,再孵育4小时,然后用酶标仪测定其在450nm的吸光值(OD450)。结果发现,PS-341处理可明显降低K562对WST-8的吸收,说明PS-341可明显抑制K562细胞的增殖,抑制率与药物浓度成正相关,见图2。根据PS-341对K562细胞的生长抑制作用,我们计算出PS-341对K562细胞的半数抑制浓度(IC50)为(5±0.3)×10-8M。
实施例3用不同浓度(5nM~100nM)的PS-341处理K562细胞,分别在处理后12、24、36、48小时通过胎盼蓝拒染法计数活细胞数并绘制K562细胞的生长曲线,发现PS-341可明显抑制K562细胞生长,这种作用呈时间-剂量依赖性。其中,当PS-341的浓度为50nM时,活细胞数随着PS-341处理时间的延长而明显降低,见图3。
实施例4用不同浓度的PS-341(1×10-9~1×10-6M)处理K562细胞,分别在处理后12、24、36、48小时取细胞用瑞氏染液进行染色,并在显微镜下观察,发现PS-341处理可使K562细胞出现胞体变小、胞核浓缩/碎裂、出现凋亡小体、但胞膜完整的细胞凋亡特征。发生凋亡的细胞随PS-341浓度的增大、处理时间的延长而增多。
实施例5用不同浓度的PS-341(1×10-9~1×10-6M)处理K562细胞,分别在处理后12、24、36、48小时取细胞用Annexin V(膜联蛋白V)/碘化丙啶(PI)处理,然后用流式细胞仪检测Annexin V阳性细胞,发现PS-341处理可使K562细胞的Annexin V阳性率明显增高,说明PS-341可诱导K562细胞凋亡。发生凋亡的细胞随PS-341浓度的增大、处理时间的延长而增多。当PS-341的浓度为50nM的时,Annexin V阳性率增高很明显,如图4所示,其中,4a为对照,4b为K562细胞在50nM的PS-341处理48小时后的变化。
化合物PS-341能强烈地抑制具有t(9;22)染色体易位及其形成的BCR-ABL融合基因的克隆性髓系造血干细胞的增殖、生长、并诱导其凋亡,且其浓度为50nM时效果最佳。
权利要求
1.化合物PS-341在制备治疗慢性粒细胞性白血病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的化合物PS-341的应用,其特征是PS-341的浓度为1×10-8~1×10-6M。
3.根据权利要求2所述的化合物PS-341的应用,其特征是PS-341的浓度为1×10-8~1×10-7M。
4.根据权利要求3所述的化合物PS-341的应用,其特征是PS-341的浓度为5×10-8M。
5.根据权利要求1所述的化合物PS-341的应用,其特征是PS-341可与阿糖胞苷、羟基脲、干扰素、蛋白酪氨酸激酶抑制剂STI-571中的一种或多种联合使用。
全文摘要
本发明涉及化合物PS-341在制备治疗慢性粒细胞性白血病的药物中的应用,其有效浓度为1×10
文档编号A61K31/7068GK1820781SQ200510102190
公开日2006年8月23日 申请日期2005年12月9日 优先权日2005年12月9日
发明者周光飚, 胡政, 陈赛娟, 张凤香 申请人:周光飚
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