体外细胞的培养方法

专利名称：体外细胞的培养方法
技术领域：
本发明涉及哺乳动物包括人细胞及其细胞培养方法，具体讲，涉及一种潜能再生细胞及其在体外培养和复制形成的哺乳动物包括人的细胞、组织和组织器官，本发明还涉及体外培养哺乳动物包括人的细胞、组织、组织器官的方法和培养用的细胞生长调节剂。
背景技术：
世界生命科学自19世纪中叶，由于发现了遗传物质，生命科学家们均集中于细胞内遗传物质的生物化学研究，继而形成了系统的细胞分子生物学研究，但在二十世纪，经过数十年的研究狂热后，现在进入理性的发展研究阶段；20世纪终末的1998年，科学家们又想起了细胞学的研究，重新研究人体的胚胎发育，将胚胎发育的过程，用干细胞的名称来表述，并设想将用胚胎的干细胞可在体外培养成人体的各个脏器器官，而后再用这些器官进行自体移植治疗疾病；同时也设想，用胚胎干细胞进行细胞疗法，将胚胎干细胞注射在人体的发病部位，让干细胞在局部再生一个器官，最终实现对疾病的治疗。但人们的美好愿望，由于目前的科学研究进度，尚没有突破，均被现有技术中的“体外干细胞培养技术”所困饶，由于在体外没有能够培养成活干细胞，所以无法实现这一美好的愿望。
现有技术中，通常意义上的细胞培养是指从体内组织取出细胞模拟体内环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。
在医学遗传学研究中应用最广泛的是外周血淋巴细胞、皮肤或纤维细胞和各种能在体外长期生长的细胞系。外周血淋巴细胞培养具有时间短、技术简便、可重复取材等优点，它在临床染色体分析中使用最广泛。体外培养细胞株可在培养过程中发生自发的或在外界作用下的转化，成为永久细胞系，也可直接建成永久细胞系，永久细胞系能在体外无节制的传代和生长。永久细胞系通常具有非整倍体细胞和各个细胞的核型不完全相同特征。但细胞克隆的细胞系其这一特征可以不明显。
细胞培养的环境要求细胞在体外培养中所需的条件与体内细胞基本相同。因此，培养环境无毒和无菌是保证细胞生存的首要条件。当细胞放置于体外培养时，与体内相比细胞丢失了对微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代谢物质积累等，可导致细胞死亡。因此在进行培养中，保持细胞生存环境无污染、代谢物及时清除等，是维持细胞生存的基本条件。
另外，细胞培养的温度是维持培养细胞旺盛生长的另一条件，培养时要求有恒定适宜的温度。人体细胞培养的标准温度为36.5℃±0.5℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。培养细胞对低温的耐受力较对高温强，温度上升不超过39℃时，细胞代谢与温度成正比；人体细胞在39-40℃1小时，即能受到一定损伤，但仍有可能恢复；在40-41℃1小时，细胞会普遍受到损伤，仅小半数有可能恢复；41-42℃1小时，细胞受到严重损伤，大部分细胞死亡，个别细胞仍有恢复可能；当温度在43℃以上1小时，细胞全部死亡。
气体也是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环，产生供给细胞生长增殖的能量和合成细胞生长所需用的各种成分。开放培养时一般把细胞置于95％空气加5％二氧化碳混合气体环境中。
二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的pH值。大多数细胞的适宜pH为7.2-7.4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。但细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。有资料显示，原代羊水细胞培养pH6.8时最适。
细胞培养液pH浓度的调节最常用的为加NaHCO3的方法，因为NaHCO3可供CO2，但二氧化碳易于逸出，故最适用于封闭培养，而羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)因其对细胞无毒性，也起缓冲作用，有防止pH迅速变动的特性而用于开放细胞培养技术中，其最大优点是在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定的pH值。
再者，细胞培养基既是培养细胞中供给细胞营养和促使细胞生殖、增殖的基础物质，也是培养细胞生长和繁殖的生存环境。培养基的种类很多，按其物质状态分为半固体培养基和液体培养基两类；按其来源分为合成培养基和天然培养基。
(1)合成培养基合成培养基是根据细胞所需物质的种类和数量严格配制而成的。内含碳水化合物、氨基酸、脂类、无机盐、维生素、微量元素和细胞生长因子等。单独使用时细胞虽有生存但不能很好的生长增殖。
(2)天然培养基使用最普遍的天然培养基是血清，基本以小牛血清最普遍。血清由于含有多种细胞生长因子、促贴附因子及多种活性物质。与合成培养基合用，能使细胞顺利增殖生长。常见使用浓度最为5-20％。
体外培养细胞根据它们在培养器皿中是否能贴附于支持物上的生长特征，可分为贴附型生长和悬浮型生长两大类。贴附型细胞在培养时能贴附在支持物表面生长，如羊水细胞为贴附型细胞，常见的贴附型细胞是成纤维型细胞、上皮型细胞生长和游走型细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。
1、成纤维型细胞在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为成纤维型细胞。本型细胞因形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵园形核，胞质向外伸出2-3厘米长短不同的突起，除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间质起源的组织细胞常呈本类形态生长。
2、上皮型细胞此类型细胞在培养器皿支持物上生长具有扁平不规则多角形特征，细胞中央有园形核，细胞紧密相连呈单层膜样生长。起源于内、外胚层细胞如皮肤、表皮衍生物、消化管上皮等组织细胞培养时，皆呈上皮型形态生长。
3、游走型细胞本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且不规则。此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞区别。在一定的条件下，由于细胞密度增大联成片后，可呈类似多角型或成纤维细胞形态。常见于羊水细胞培养的早期。
培养细胞形态分析培养细胞随贴附支持物形状不同而形态各异，最常见的是贴附于平面支持物细胞。在一般光镜下生存中的细胞是均质而透明的，结构不明显。细胞在生长期常有1-2个核仁在细胞机能状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。若胞质中时而出现颗粒和空泡等，表明细胞代谢不良。
现有技术中对外周血淋巴细胞培养时，正常情况下人外周血中是没有分裂相的，只有在异常情况下才能发现。植物血球凝集素(PHA)是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂，在PHA作用下，原处于Go期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。利用PHA这一特性，淋巴细胞经过含有PHA培养液培养，在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体，终止分裂中期的淋巴细胞。
另外，组织培养细胞染色体制备时，组织细胞用于遗传学分析最常见的是体外培养的细胞株，多为恶性肿瘤细胞株，且呈贴壁生长，仅少数细胞株为悬浮生长。培养细胞有来源易得、细胞分裂率高和染色体标本制出清晰度高等优点。组织细胞染色体制备的关键是掌握好体外细胞的生长动态，只有处在对数生长期的细胞才能出现较高的分裂相，所以秋水仙素处理的时机及量是染色体标本形态及分裂指数的关键。
由此可见，现有技术中，仅仅是对获得的细胞进行培养，得到与原细胞相同的细胞或者细胞群。未见有报道在体外培养成体细胞具有较强持续增殖能力并能形成新的组织或组织器官的培养技术。

发明内容
为了克服现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种哺乳动物包括人的再生细胞，命名为潜能再生细胞，它是具有干细胞增殖潜能的、以普通组织细胞形态存在于组织中的细胞。
本发明的另一目的在于提供一种体外培养潜能再生细胞，并复制形成所需要的细胞、组织、组织器官的方法，所述的细胞包括为哺乳动物包括人的细胞培养方法。
本发明的另一目的在于提供一种细胞生长调节剂，它用于体外培养细胞，尤其是哺乳动物包括人的细胞培养，特别是哺乳动物包括人的细胞、组织与组织器官复制。
本发明的另一目的在于提供一种含有本发明细胞生长调节剂的培养基。
本发明的再一目的在于提供一种经本发明方法在体外培养得到的复制哺乳动物包括人的细胞、组织与组织器官。
本发明的再一目的在于提供一种经本发明方法在体外培养得到的复制哺乳动物包括人的细胞、组织与组织器官的用途。
为了完成本发明的目的，本发明提供一种体外培养细胞的方法，该方法包括获取从哺乳动物体预定部位分离得到的组织细胞或组织；将细胞生长调节剂添加到培养基中形成组织培养基，所述细胞生长调节剂，按该细胞生长调节剂总重量计算，含有0.5重量％-20重量％的甾醇化合物、0.1重量％-2重量％的黄芩甙和1重量％-20重量％的蜂蜡；在组织培养基中培养所述的分离得到的组织细胞或组织。
在本发明中，所述的组织细胞或组织分离自啮齿类动物或人。所述的组织细胞或组织分离自发育成熟的成人。所述的组织细胞或组织分离自活体哺乳动物。所述的获得的组织细胞或组织来自哺乳动物的除胚胎干细胞和囊胚泡之外的肠和/或肠粘膜、骨髓、神经、胰腺、肾脏、毛囊、心肌、胸腺、肝脏或皮肤。
另外，所述的组织在体外处理以产生细胞，然后分离该细胞并在组织培养基中进行培养以产生组织-器官。
在组织培养基中激活所述的分离的组织细胞或组织所含有的细胞，并继续增殖和分化15-78天。
所述的油脂包括植物油或动物油。
所述的油脂包括一个选自玉米油、花生油、棉子油、红花油、茶树油、芝麻油、橄榄油或豆油的油。优选为芝麻油。
所述的甾醇化合物是动物甾醇或植物甾醇。
所述的甾醇化合物包括胆固醇以及所有天然或合成的、异构体或其衍生物。
具体讲，所述的甾醇化合物选自豆甾醇、β-谷甾醇、角甾醇、γ-谷甾醇、菜子甾醇、α-菠菜甾醇、24-去氢胆固醇、多孔甾醇、胡萝卜甙或所有天然或合成的，异构体或衍生物及其组合。
所述甾醇化合物还可以是豆甾醇、β-谷甾醇和菜籽甾醇的组合。
按该细胞生长调节剂总重量计算，该细胞调节剂中的甾醇化合物的量为1重量％-10重量％。
所述的细胞调节剂中的蜂蜡，按该细胞生长调节剂总重量计算，其含量为2重量％-10重量％。
所述的细胞生长调节还可以含有蜂胶，按该细胞生长调节剂总重量计算，其含量为0.1重量％-30重量％。
所述的黄芩甙，按该细胞生长调节剂总重量计算，其含量为0.2重量％-1重量％。
在上述细胞生长调节剂中，还可以含有黄柏内酯，按该细胞生长调节剂总重量计算，其含量为0.1重量％-2重量％。
所述的细胞生长调节剂还可以含有黄小蘖碱，按该细胞生长调节剂总重量计算，其含量为0.001重量％-2重量％。
所述的细胞生长调节剂还可以含有黄连素，按该细胞生长调节剂总重量计算，其含量为0.001重量％-2重量％。
所述的细胞生长调节剂还可以含有罂粟壳碱，按该细胞生长调节剂总重量计算，其含量为0.001重量％-2重量％。
所述的细胞生长调节剂还可以含有地龙，按该细胞生长调节剂总重量计算，其含量为0.001重量％-2重量％。
本发明中使用的术语为了便于阐述本发明的研究过程，首先确定本发明中所使用的名词术语，以区别于与传统概念的异同，确立本发明专用名词如下组织器官现有技术中，人体组织、器官中的“器官”的概念在国际上统一的医学概念是具有功能的组织单位。根据吴德昌院士编译的《人体机能解剖学》(1983年科学出版社)中对组织和器官的定义是“相同的细胞通过介入细胞之间的非细胞物质的疏松或紧密地结合在一起，而形成机体的组织。而器官是两种或者多种组织结合起来，并以这种形式完成一定机能的结构”。
另外，张朝佑著的《人体解剖学》中(1996年人民卫生出版社)认为“不同类型的细胞，以一种细胞为主题，分别构成不同组织，各种组织构成器官”。
王敬美著《人体解剖学》(1994年人民卫生出版社)中认为“许多形态相似、功能相近的细胞由细胞间质结合在一起，形成的结构成为组织；几种不同的组织按照一定的规律分布，组成一定形态和机能的结构，成为器官。”本发明所述的“组织器官”是指再生的原位和体外的“器官”是由“潜能再生细胞”首先形成组织，而后再由组织形成有功能的单位，因此，称组织器官。
潜能再生细胞本发明的发明人在研究中发现的哺乳动物包括人的再生细胞，命名为潜能再生细胞，它是具有干细胞增殖潜能的、以普通组织细胞形态存在于组织中的细胞。也可称再生潜能细胞(Potential Regeneration Cell)。这种细胞是以普通细胞形式存在于所有人体组织里，在组织学上，它可以相应的组织细胞形式或形态出现。这种细胞还可能转变成其他不相应的组织细胞，甚至也可以变成原始的细胞。因此，当器官病变坏死时，潜能再生细胞能够及时地再生一种或多种细胞，以补偿空缺，这样就不会出现人体器官坏死的现象。
因此，人类的生命延续是人体组织器官中的潜能再生细胞，及时不断地增殖补充凋亡、退化、损伤坏死的组织细胞，以维持其组织架构和功能来实现的。这些潜能再生细胞是人类在细胞克隆复制过程中留下来的拷贝。这些细胞与正常的组织细胞在一起，并不表达为干细胞，所以把它定名为“潜能再生细胞”。人类组织器官中的潜能再生细胞，是在组织器官发育形成的各个时期，由原始的多能干细胞增殖时产生的，这些细胞以普通细胞形式参与组织器官的架构和功能形成，与增殖分化的干细胞形成的组织共同组合成器官。当组织器官的细胞凋亡、退化、损伤坏死时，这些潜能再生细胞原位启动自身增殖的功能，再生复制新的细胞，及时补充器官中的细胞、组织空缺，及时恢复器官的结构和功能，保障器官组织功能的正常发挥。人体所有器官的这项修复功能发挥正常，人体就能维护整体生命的平衡，实现其健康长寿；如果某一器官或组织的这一功能不能发挥或低下，某器官或组织就会产生疾病。这是人类生命的奥秘。
潜能再生细胞与干细胞是有区别的，潜能再生细胞是与组织细胞在一起的，有潜能，但是静态的；干细胞是增殖中的过程细胞，是动态的。由此可见潜能再生细胞与干细胞功能上是不同的，结构上的不同表现在早期，潜能再生细胞与组织细胞相同，增殖以后就与干细胞的增殖情况相同。
干细胞是潜能细胞的再生过程，并不是潜能细胞变转变成干细胞，而是潜能再生细胞具有干细胞的再生功能，并且这种细胞是潜能的，是组织原位的。潜能再生细胞与原位干细胞是前后关系。哪个细胞能被激活、再生、克隆并具有干细胞再生功能，哪一个细胞就是本发明所属的潜能再生细胞。
通过原位组织细胞和体内和/或体外复制的组织细胞形态学的动态研究，初步证实潜能再生细胞产生于细胞增殖过程中，在细胞分裂的增殖过程中，潜能再生细胞产生后，不再分裂，而是以成熟的细胞形式与增殖后的成熟细胞一起形成组织。只要细胞增殖分裂，就有潜能再生细胞产生。
为了完成上述的发明目的，一方面，本发明涉及一种体外能够连续增殖的哺乳动物包括人潜能再生细胞，其特征在于，它是具有干细胞增殖潜能的、以普通组织细胞形态存在于组织中的细胞。
所述的潜能再生细胞可以在体外和/或体内增殖成与该潜能再生细胞来源相同的细胞。也可以在体外和/或体内增殖成与该潜能再生细胞来源不相同的细胞。所述的潜能再生细胞可以在体外和/或体内增殖成与该潜能再生细胞来源相同的组织和/或器官。可以在体外和或/体内增殖成与该潜能再生细胞来源不相同的组织和/或器官。
另一方面，本发明还涉及用于体外培养复制哺乳动物包括人的细胞、组织、组织器官的细胞生长调节剂，该细胞生长调节剂至少含有溶解在油脂中的甾醇。
另一方面，换言之，本发明还提供一种体外培养细胞，尤其是哺乳动物包括人的细胞培养方法，特别是培养潜能再生细胞复制哺乳动物包括人的细胞、组织与组织器官的方法，该方法包括A、获取哺乳动物包括人的成体细胞和/或组织，或者原位的组织和/或细胞；B、将该细胞或者组织接种在培养基中培养，使潜能再生细胞激活；C、培养激活的潜能再生细胞，并使其持续增殖并具有干细胞特性的细胞；D、增殖后的细胞连接，形成与潜能再生细胞原位相同的组织；E、继续培养形成的组织，使其成为具有生理功能的组织器官；其中，在培养基中加入一种细胞生长调节剂，该细胞生长调节剂至少含有溶解在油脂中的甾醇。
所述的细胞生长调节剂至少含有溶解在油脂中的甾醇化合物，其重量百分比至少是0.5重量％。优选的含量为0.5重量％-20重量％，1重量％-10重量％更佳，2重量％-6重量％最佳。
所述油脂是动物油或植物油。植物油可以选自玉米油、花生油、棉子油、红花油、茶树油、芝麻油、橄榄油和豆油。
所述的甾醇可选用动物甾醇或植物甾醇(也称植物甾醇类)。动物甾醇，如胆固醇以及所有天然或合成的，异构体及以其衍生物。甾醇化合物包括豆甾醇、β-谷甾醇、角甾醇，γ-谷甾醇，菜籽甾醇，α-菠菜甾醇，，24-去氢胆固醇、多孔甾醇，胡萝卜甙以及所有天然或合成的，异构体形式及以其衍生物及其组合。所述的甾醇优选为豆甾醇、β-谷甾醇和菜籽甾醇的组合物。
虽然不希望受到有关甾醇在组织修复和器官再生中的作用机理的理论限制，本发明人认为，甾醇物质在通过改变细胞膜的流动性和渗透性来诱导细胞形态方面发挥重要作用。如结果显示，很多细胞膜有关的蛋白如激酶和磷酸酶可以被激活来刺激细胞生长。也许休眠的干细胞由于细胞膜形态的改变而被激活。更进一步，不同的成体组织细胞也会被诱导转化为一个无区别型即进入被称作“反分化”的过程。随着细胞膜流动性、渗透性发生变化，其它分裂素和调节分子可以更容易被细胞膜接受，模拟细胞生长的信号，以满足生理性组织修复和功能性器官的再生需要。细胞粘附分子(CAMs)的表达和胞内磷酸化可以被模仿，据推测是由于在形态形成过程中的细胞膜骨架蛋白和细胞内骨架结合蛋白的激活，从而进一步提高同族细胞的协作形成特定的组织，同族组织的聚合在体内形成全功能的器官。
本发明涉及的甾醇化合物中可以同其他物质混合构成组合物。因此，本发明的另一技术方案是上述的细胞生长调节剂还可以加入蜂蜡，按该细胞生长调节剂总重量计算，其加入量为1重量％-20重量％，2重量％-10重量％更佳，3重量％-6重量％最佳。
蜂蜡很久以来就被用作赋形剂来生产外用药。在中国传统医学中，蜂蜡具有解毒、生肌、定痛。治急心痛，下痢脓血，久泻不止，胎动下血，疮痈内攻，久溃不敛，水火烫伤。(《中国中药大词典》，上海科技出版社，1986，2581页)。
蜂蜡的组成可以被分为4类即脂类、游离酸类、游离醇类和烃类。蜂蜡也含有微量的挥发油和色素。在脂类里包括软脂酸蜂花酯、蜡酸蜂花酯和蜂花生油酸蜂花酯。在游离酸类中有蜡酸、廿四酸、褐煤酸、蜂花酸、叶虱酸、落花生油酸、新蜡酸。在游离醇类中有正廿八醇、蜂花醇。在烃类中有廿五烷、廿七烷、廿九烷卅一烷，和称作蜂花烯的石蜡。一种芳香性有色物质，名为虫蜡素，也被在蜂蜡中发现。
蜂蜡在发明的成分中为溶解在游内的甾醇提供支持结构。蜂蜡能形成鸽巢样三维结构，其中包含溶有甾醇的油滴。该细胞生长调节剂中也可选择性地加入蜂胶，按细胞生长调节剂总重量计算，加入量为0.1重量％-30重量％，1重量％-20重量％更佳，5重量％-10重量％为最佳。
本发明的另一技术方案是所述的细胞生长调节剂还可以含有蜂胶，按照该调节剂总重量计算，其含量为0.1重量％-30％重量。优选为1重量％-20重量％，更优选为5重量％-10重量％。
众所周知，蜂胶是一种粘性的、橡胶样物质，它被用来构筑蜂巢。完整的蜂胶内含各种微量成分以单一组合物形式存在，其中松香、蜂蜡、挥发油和花粉是主要成分，也有其它成分如黄酮类似物和苯酚羧基酸。天然蜂胶几乎不溶于水，并有特殊的气味。蜂胶可以用有机溶剂如乙醇、乙醚和三氯甲烷从蜂巢中提取。
本发明的再一技术方案是细胞生长调节剂可进一步含黄芩甙，按细胞生长调节剂总重量计算，其含量为0.1重量％-2重量％，优选0.2重量％-1重量％更佳，0.5重量％-1重量％更佳。黄芩甙可对细胞组织具有抗炎作用，有助于为器官复制提供一个优良的分化生长环境。另外，黄芩甙可以抑止细胞膜多聚糖受体和促进细胞之间的连接。
黄芩甙可以从黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)中提取，可以使用油、酒精或其它有机溶剂，适宜使用100℃的油，更合适的温度是在120-200℃之间，最适宜的温度是在160-180℃。更适宜的是使用黄芩的根，可以从同属植物中的一种或几种被获取，唇形科的粘毛黄芩、滇黄芩、甘肃黄芩、薄叶黄芩、丽江黄芩和川黄芩。《中国中药大词典》，上海科技出版社，1986，2017-2021页。
本发明的又一技术方案是该细胞生长调节剂还可以含有黄柏内酯(柠檬苦酸)，按细胞生长调节剂总重量计算，其含量为0.1重量％-2重量％，优选0.2重量％-1重量％，更优选为0.5重量％-1重量％。
黄柏内酯可以从黄柏中提取(Phellodendron amurense Rupr)，可以使用油、酒精或其它有机溶剂，适宜使用100℃的油，更合适的温度是在120-200℃之间，最适宜的温度是在160-180℃。另外黄柏内酯也可以使用乙醇从黄柏中提取。更适宜的是使用黄柏的树皮，可以从同属植物中的一种或几种被获取，黄皮树、秃叶黄皮树峨嵋黄皮树、云南黄皮树、镰刀叶和黄皮树。《中国中药大词典》，上海科技出版社，1986，2031-2035页。
本发明的再一技术方案为细胞生长调节剂也可选择地加入黄小蘖碱(obabenine)，按细胞生长调节剂总重量计算，其含量为0.001重量％-2重量％，优选为0.002重量％-0.5重量％，更优选为0.003重量％-0.1重量％。
黄小蘖碱可以从黄芩、黄柏和/或黄连(Coptis chinensis Franch)中提取，可以使用油、酒精或其它有机溶剂。黄连的根适于使用。黄连可以从同属植物中的一种或几种被获取，毛莨科的三角叶黄连、峨嵋黄连、云南黄连。《中国中药大词典》，上海科技出版社，1986，2022-2030页同样，本发明的又一技术方案是细胞生长调节剂还可选择性地含黄连素，按细胞生长调节剂总重量计算，其含量为0.001重量％-2重量％，优选为0.002重量％-0.5重量％，更优选为0.003重量％-0.1重量％。
另外，本发明的技术方案中所述的细胞生长调节剂还可选择含罂粟壳碱，按细胞生长调节剂总重量计算，其含量为0.001重量％-2重量％，优选为0.002重量％-0.5重量％，更优选为0.003重量％-0.1重量％。
黄小蘖碱、黄连素和罂粟壳碱单独或联合使用。
本发明的细胞生长调节剂中还可选择含各种氨基酸，最好是所有天然的18种氨基酸，为细胞生长提供营养支持。氨基酸可以是化学合成的，也可以是来自天然的。例如，天然氨基酸的完整谱系可以通过油或酒精提取地龙获得，地龙富含蛋白质/氨基酸。本发明物质可进一步含有基础核酸如腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶。
本发明的技术方案中的细胞生长调节剂中还可以含有地龙，按细胞生长调节剂总重量计算，其含量为0.001重量％-2重量％，优选为0.002重量％-0.5重量％更佳，更优选为0.003重量％-0.1重量％。
该细胞生长调节剂中由于原料本身的原因可以含有少量的水，按重量计算，含量最好是少于0.1重量％。
本发明的细胞生长调节剂的使用量为，10克-50克/100ml培养基，优选为20克-30克/100ml培养基，更优选为20克/100ml培养基。
这种细胞生长调节剂可用于刺激成体细胞的生长，而不发生突变或基因改变，尤其是，培养基内的细胞可无限分裂，且可防止发生不需要的分化。
另外，这种细胞生长调节剂还可把变异的基因转移到细胞内用来确定初级细胞系。原代培养物事先取自一有机体的组织，有或没有初始的细胞分离分级步骤。在多数情况下，原代培养物中的细胞能被从培养皿中移除，用来形成大量中级培养物；这些细胞可用这种方法重复传代培养数周或数月。这样的细胞经常显示出许多属于它们的起源物的不同特性纤维原细胞持续分泌胶原蛋白；起源于胚胎骨骼肌的细胞在培养皿中相融合以形成大的自主收缩的肌纤维；神经细胞伸展具有电兴奋性的神经轴突，以及和其他的神经细胞形成神经突触；上皮细胞形成具有完整的上皮细胞所拥有的许多特性的大面积细胞层。
本发明的细胞生长调节剂能以一定的量添加到常规的组织培养基中，以适合于生长某种特殊的细胞或组织类型的数量。尽管组织培养基含有特定数量的小分子，例如盐、葡萄糖、氨基酸和维生素，但是多数培养基内还含有界定不明确的大分子组合物，有马血清或胎牛血清或鸡胚的天然提取物。化学上确定的不含血清的培养基包括利于细胞在培养基内生存和增殖的各种生长因子。这类培养基还包括携带铁到细胞的运铁蛋白。其他蛋白质信号分子对于特殊细胞类型的生存、发育和增殖是必不可少的。
这种发明细胞生长调节剂可促进某些或所有的某个适合于培植哺乳动物细胞的典型培养基的成分的功能。以下列举了这些组织培养试剂的种类，当然并不仅限于这些，1)氨基酸，如精氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸；2)维生素，如生物素、胆碱、叶酸、烟碱、泛酸、维生素B6、维生素B1和核黄素；3)盐，如NaCl，KCl，NaHPO4，NaHCO3，CaCl2和MgCl2；4)蛋白质，如胰岛素、运铁蛋白、特殊的生长因子；5)其他葡萄糖、青霉素、链霉素、酚红和全血清。
值得注意的是，在正常条件下原代培养物通常在50代之后就死亡。而生长在含有这种细胞生长调节剂的培养基中小鼠皮肤进行的实验所证实的，细胞能够连续增殖，而不表现出任何异常或转化的显型。
本发明的细胞生长调节剂可以加入任何公知的培养基中使用，这些培养基包括(1)合成培养基(synthetic medium)，例如，但不限于Eagle MEM培养基及其衍生培养基(Eagle MEM and its all derivatives)；Ham’s F-12培养基(Ham’s F-12medium)；RPMI 1640培养基(RPMI 1640medium)；199培养基(199medium)；L15培养基(L15medium)；Fischer培养基(Fischer medium)；MB752/1培养基(MB752/1medium)；CMRL1066培养基(CMRL 1066medium)；McCoy5A培养基(McCoy5Amedium)；(2)天然培养基(natural medium)，例如，但不限于，胎牛血清(fetal bovineserum)；新生牛血清(newborn calfserum)；马血清(horse serum)；大白鼠鼠尾胶原(rattail collagen)；水解乳蛋白(hydrolytic albumin)；鸡血清(chicken serum)；兔血清(rabbitserum)；羊血清(sheep or goat serum)等等。另外培养过程中还需要水、生理盐水(0.9％sodium chloride solution)和平衡盐溶液，所述的水可以是用Millipore超纯水器制备的超纯水(ultra-pure water)；所述的平衡盐溶液(balanced salt solution，BBS)包括磷酸盐缓冲盐水(phosphate buffered saline，PBS)和无钙离子和镁离子的Hanks液(Ca++and Mg++free Hanks solution)等等。
本发明的培养方法具体包括选用人体组织或者哺乳动物组织，人体组织来自外科手术切除的组织以及胚胎组织。哺乳动物来自下列标准医学实验动物WISTAR大白鼠、SD大白鼠、BALB/C小白鼠和昆明小白鼠、以及上述大白鼠和小白鼠的胚胎鼠和乳鼠，这些实验动物均购自中国医学院科学院实验动物研究所，该所是中国国家认可的有资质的实验动物专门供应商。这些实验动物为二级(清洁级)实验动物，购回后在标准动物室饲养一定时间。
人体组织在无菌条件下按照解剖学定位准确获取特定组织或细胞。
获取动物组织时按照普遍采用的断颈处死法，处死实验动物，用75％乙醇消毒动物体表两次，每次5分钟，按解剖学定位，准确切(剪)取动物的活体组织。
在本发明的培养方法中，一种方法是器官型植块的培养，具体包括(1)将组织用双抗-冷PBS连续洗涤两次，每次1分钟；(2)将组织置于含双抗(青、链)的完全培养液中冲洗2次，每次1分钟；(3)将组织剪成极小的器官型植块，大小约1mm×1mm；(4)将植块置于培养板的培养孔中央，每孔数5块，间隔约2mm，布局合理，轻轻按压每块植块，使其紧贴培养板的表面；(5)沿着培养孔的边缘，每孔中加入约0.5ml的完全培养液，勿使培养液与植块接触；(6)将培养板置于37℃，5％CO2培养箱中预孵育1-1.5小时；(7)每孔加完全培养液2ml，轻拿轻放，切勿使植块飘起，实验组加细胞生长调节剂。
在本发明的另一种细胞培养方法中，是具体包括为将组织块离散为单个细胞，首先将组织块置入含有两种抗生素(例如，青霉素和链霉素)的4℃预冷的磷酸缓冲盐水(PBS)中，洗涤3遍，然后将此大的组织块切成1mm3的小组织块，再用含有双抗的冷PBS洗涤两遍，将经过洗涤的组织块置入用无菌PBS配制的0.25％胰蛋白酶溶液或者1％胶原酶溶液中消化，条件是4℃振荡过夜(约16小时)，或者是37℃恒温水浴振荡，时间因组织而异，从30分钟至3小时不等，然后可按照下列方法进行实验。
(1)用加样器或者吸管反复吹打组织块，或者将组织块连同消化液一起倾倒至不锈钢滤网上，用注射器栓研磨组织块，直到组织块完全离散，成为单个细胞为止。将此含有细胞和本领域技术人员公知的消化酶溶液的混合物静置5分钟，弃去沉淀的大块以及不易消化的结缔组织等，将含大量细胞和消化酶的上清液移至另一离心管，如有必要可用不锈钢滤网过滤此上清一次，得一消化混合物；(2)在4℃条件下，1500转/分钟，离心5分钟，弃去含有消化酶的上清液，加少量冷PBS旋涡振荡将细胞旋起，再加多量冷PBS，混匀；(3)在4℃条件下，1500转/分钟，离心5分钟，弃去上清液，加少量(定量)冷PBS旋涡振荡将细胞旋起，再加定量冷PBS，混匀，计数细胞；(4)在4℃条件下，1500转/分钟，离心5分钟，弃去上清液，加少量(定量)含15％胎牛血清的MEM或者RPMI1640培养液，旋涡振荡将细胞旋起，再加适量(定量)培养液，并调整细胞浓度为1×105个/ml，混匀，得到定量细胞悬液；(5)将细胞悬液加至预先用大白鼠鼠尾胶原铺被的塑料多孔培养板中(96孔板、24孔板、12孔板或6孔板)，96孔板每孔加200μl、24孔板每孔加1ml、12孔板每孔加2ml、6孔板每孔加4ml；(6)置于37℃、5％CO2细胞培养箱或者37℃、5％CO2、45％O2三气细胞培养箱中培养，24小时后，细胞全部贴壁；(7)细胞培养24小时后，镜下观察贴壁细胞生长正常，将培养孔分为两组，一组为实验组，另一组为对照组，在实验组的培养孔中加入各种培养液和甾醇化合物，在无菌条件下，加入细胞生长调节剂，即甾醇化合物的量为占培养基重量的1-20重量％。对于培养基的选择本领域技术人员是公知的。
可以用尼康显微镜观察得到的培养结果，采用明视野、相差、微分干射、霍夫曼和荧光等不同方法动态观察；细胞计数；生物染料或荧光染料染色；细胞增殖检测；细胞组织化学检测；免疫细胞组织化学检测等。
经过加入本发明的细胞生长调节剂，使用本发明的培养基可以长期连续培养哺乳动物包括人的各种细胞或组织以及器官，在条件适宜的情况下，其培养时间可以长达90-180天或更长。
本发明可以各种法律允许的方式，从体内器官组织中，或者原位直接获取组织或细胞，而后将获取的这些组织细胞在体外进行培养，使其成为与原位相同的细胞、组织、组织器官。
另外，现有技术中，一般人们都试图在体外直接培养干细胞，使其能够分化成所需要的体细胞。而本发明的目的是，在从哺乳动物包括人的体细胞直接经过本发明的方法，在本发明所述的培养基上获得相应的具有原来细胞功能的正常细胞，组织以及组织器官。
本发明体外培养获得的细胞、组织、和组织器官可以作为动物体功能实验模型，对药物进行安全、有效性实验；筛选对动物体原位器官、组织、细胞的激活、维持、保障再生功能的生命物质；筛选针对原位器官组织本身疾病的治疗物质。
通过获得的生命物质，作用于动物体原位的器官、组织、细胞，实现动物器官、组织细胞的原位再生，实现直接治疗动物体原位器官、组织、细胞疾病的治疗。
由此可见，本发明利用动物成体原位的组织细胞，在体外培养为具有较持续生理增殖能力的细胞；再培养这些持续增殖的细胞继续克隆复制，形成组织；而后再培养这新形成的组织组合为具有功能的生命单位——组织器官。
通过发明体外培养哺乳动物包括人的细胞、组织、组织器官的培养方法和培养物质，建立了体外的原位细胞、组织、器官实验模型和药物筛选模型。
通过体外复制的哺乳动物包括人的细胞、组织、器官模型，实验寻找支持和维持及激活潜能再生细胞、组织、器官的所需生命物质，而后再将这些生命物质送到人体原位的组织器官中，促使原位的潜能再生细胞增殖，形成新的细胞、组织器官增补或代替原来损伤的或缺损的细胞及组织器官，及时恢复器官的功能，达到自行医疗疾病和预防疾病的目的。
通过本发明的细胞培养方法和细胞生长调节剂，可在体外将癌细胞转变为干细胞。并利用其方法将原位的癌变组织转变为正常组织。
由此可见，本发明的主体思路以及目的在于1、研究探讨“人体的生命活动为什么能延续”即生命体延续的秘密；2、建立人体的原位和体外生命器官的活体研究模型；用于药物的筛选和毒理学研究。
3、通过活体实验模型寻找激活和维持、支持组织器官的生命物质；4、用活体“组织器官”模型验证获得的生命物质用于人体原位的器官，直接作用于各个器官，保障人体生命的整体生命平衡，实现其预防和治疗疾病、器官的健康长寿。
5、用获得的“细胞、组织、组织器官”的生命物质，调控癌细胞的干细胞转化，治愈癌症。
根据本发明的结果，本发明的有益效果表现在本发明人认为人类的生命延续是人体组织器官中的潜能再生细胞，及时不断的增殖补充已凋亡、退化、损伤坏死的组织细胞，以维持其组织架构和功能来实现的；人类组织器官中的再生潜能细胞，是在组织器官发育形成的各个时期，由原始的多能干细胞增殖时产生的。这些细胞以普通细胞形式参与组织器官的架构和功能形成，与增殖的干细胞形成的组织共同组合成器官。当组织器官的细胞凋亡、退化、损伤坏死时，这些潜能细胞原位启动自身增殖的功能，再生复制新的细胞，来及时补充器官中的细胞、组织、功能空缺，从而及时恢复器官的结构和功能，保障器官组织功能的正常发挥，人体所有器官的这项修复功能发挥正常，人体就能维持整体生命的平衡，实现其健康长寿；如果某一器官或组织的这一功能不能发挥或低下，某器官或组织就会产生疾病。这就是人类生命的奥秘”。
通过本发明，完成了临床实现皮肤大器官和胃肠粘膜器官的原位复制。
通过本发明，体外用成体原位潜能再生细胞培养出毛囊、骨髓、胰腺、肾小球肾小管、心肌、神经等“组织器官”；最终可以实现原位和体外所有组织器官的复制；通过完成对组织器官的生命物质研究，进行了原位器官功能实验，得到初步结果。
换言之，本发明的科学及医学和经济价值是具有重大意义的，一方面，它不仅仅破解了人体生命延续之谜，找到了人体组织器官及功能延续的源头，即再生潜能细胞，为人类寻找到了一条顺应生命的医疗和健康长寿的方法，而且找到了能维持、支持、激活再生潜能细胞的生命物质，用生命物质代替药物。另一方面通过本发明组合物对体外复制的组织器官的作用研究，获得激活持续保障人体组织器官的生理功能，实现其健康长寿、预防组织器官疾病的发生的方法和食品；再一方面，可以通过组织器官的原位复制，及时生理性修补组织器官，维持生命器官的平衡；治疗疑难顽症和疾病；使病人摆脱医疗痛苦和损伤。
因此，由于建立了组织器官体外模型，今后在研究某些药物时可以减少人体实验，避免了实验药物对人体的伤害；更准确的获得有效的医疗和营养成分，将彻底抛弃用毒药治病的思路和方法。
本发明为生命科学的研究提供了体外正常的增殖细胞模型，可以革命性地取代现有的生命科学研究的癌细胞系模型，使生命科学的发展一跃跨入原位或体外顺应生命研究新阶段。
本发明还可从本研究创立的细胞正常生态条件入手，用顺应细胞调控的方法，攻克癌症。
本发明采用器官体外模型的研究方法获得的生命物质，将使人们维持生命的原始物体食品改为像无土栽培植物一样，用精华的生命物质替代至少大十倍量的一日三餐的“粗茶淡饭”，为人体节省70％的能量，使胃肠节省70％的损耗；不仅减少消耗地球的食品资源，而且提高了人体的健康素质。
本发明的利用也可以改变现有医疗保健模式。
本发明的细胞生长调节剂也可以用于植物细胞或组织等的培养，因此全面开发和利用，定会改变现在的农业结构，可能是国家经济强大的主体产业。


图1表示实施例1人的肠粘膜细胞经本发明方法培养后的显微镜图片。
图2经表示实施例1人的肠粘膜细胞经本发明方法培养后的显微镜图片。
图3表示实施例1人的肠粘膜细胞经本发明方法培养后的显微镜图片。
图4经表示实施例1人的肠粘膜细胞经本发明方法培养后的显微镜图片。
图5为再生潜能细胞的产生过程说明图，其中A细胞就是所发现的具有增殖能力并能形成组织或器官的细胞，B细胞是持续增殖分裂的细胞。
图6为实施例2中实验组和对照组小鼠肠壁组织植块培养后的镜下所见。
图7-图10是实施例2中实验组小鼠肠壁组织植块培养后的显微镜图片。
图11a和11b是实施例2中小鼠肠粘膜细胞克隆复制的定标动态跟踪图。
图12a和12b是实施例2中小鼠肠粘膜细胞克隆复制后形成的肠绒毛的横断面图。
图13是实施例2中小鼠肠粘膜细胞克隆复制后的肠粘膜绒毛器官图。
图14是实施例2中正常小鼠肠粘膜细胞与经过本发明实施例2培养后的到的克隆复制后肠粘膜绒毛器官比较图。
图15是实施例2中正常小鼠肠粘膜细胞与经过本发明实施例2培养后的到的克隆复制后肠粘膜绒毛器官比较图。
图16a是实施例3中实验组小鼠骨髓细胞的显微镜图片。
图16b是实施例3中对照组的小鼠骨髓组织的显微镜图片。
图17a是实施例4中实验组的大鼠神经组织肉眼所见。
图17b是实施例4对照组的大鼠神经组织通过HE染色，在放大100倍的显微镜下图片。
图18是实施例5中小鼠胰腺组织再生的比较图。
图19是实施例5中对实施例得到的小鼠胰腺组织进行胰腺功能测定的结果图。
图20是实施例6中小鼠肾脏组织器官复制的结果图。
图21是实施例7人的毛囊复制的显微镜图片。
图22是实施例8中小鼠心肌组织复制的显微镜图片。
图23是实施例9大鼠胸腺组织器官的克隆复制的显微镜图片。
图24是实施例10中大鼠肝脏组织的复制的显微镜图片。
图25是实施例11中小鼠体内胃粘膜在使用本发明细胞生长调节剂前后的比较。
图26是实施例12中人使用体内使用本发明细胞生长调节剂前后的胃粘膜的变化比较。
具体实施例方式
以下将结合附图和实施例详细说明本发明，以下的实施例并非是限定本发明的技术方案。
为了便于本领域技术人员的理解，本发明采用的技术方案是获得哺乳动物包括人的原位器官组织细胞；体外培养所述的组织细胞；促使潜能再生细胞克隆复制形成初级组织；进一步培养形成有功能的组织以及组织器官。
以复制的组织器官为模型验证寻找组织器官的生命维持、再生复制的生命物质；将生命物质用于哺乳动物包括人的原位功能低下或坏死缺损的组织器官；使原位再生潜能细胞自我复制在原位形成新的组织器官；这样可以替换功能不全和缺损的组织器官，最终实现原位组织器官复制的目的。
实施例1体外培养人肠细胞获取人的手术切除携带出的正常活体小肠，首先将组织块置入含有双抗(青霉素和链霉素)的4℃预冷的磷酸缓冲盐水(PBS)中，洗涤3遍，然后将此大的组织块切成1mm3的小组织块，再用含有双抗的冷PBS洗涤两遍，将经过洗涤的组织块置入用无菌PBS配制的0.25％胰蛋白酶溶液或者1％胶原酶溶液中消化，条件是4℃振荡过夜，约16小时，或者是37℃恒温水浴振荡，时间因组织而异，从30分钟至3小时不等，然后可按照下列方法进行实验。
用加样器或者吸管反复吹打该组织块，或者将组织块连同消化液一起倾倒至不锈钢滤网上，用注射器栓研磨组织块，直到组织块完全离散，成为单个细胞为止。
将此含有细胞和本领域技术人员公知的消化酶溶液，例如胰蛋白酶和胶原酶消化酶的混合物静置5分钟，弃去沉淀的大块以及不易消化的结缔组织等，将含大量细胞和消化酶的上清液移至另一离心管，如有必要可用不锈钢滤网过滤此上清一次，得一消化混合物；在4℃条件下，1500转/分钟，离心5分钟，弃去含有消化酶的上清液，加少量冷PBS旋涡振荡将细胞旋起，再加多量冷PBS，混匀；在4℃条件下，1500转/分钟，离心5分钟，弃去上清液，加少量(定量)冷PBS旋涡振荡将细胞旋起，再加定量冷PBS，混匀，计数细胞；在4℃条件下，1500转/分钟，离心5分钟，弃去上清液，加少量(定量)含15％胎牛血清的MEM或者RPMI1640培养液，旋涡振荡将细胞旋起，再加适量(定量)培养液，并调整细胞浓度为1×105个/ml，混匀，得到定量细胞悬液；将细胞悬液加至预先用大白鼠鼠尾胶原铺被的塑料多孔培养板中(96孔板、24孔板、12孔板或6孔板)，96孔板每孔加200μl、24孔板每孔加1ml、12孔板每孔加2ml、6孔板每孔加4ml；置于37℃、5％CO2细胞培养箱或者37℃、5％CO2、45％O2三气细胞培养箱中培养，24小时后，细胞全部贴壁；细胞培养24小时后，镜下观察贴壁细胞生长正常，将培养孔分为两组，一组为实验组，另一组为对照组，在实验组的培养孔中加入含15％胎牛血清的MEM培养液或者含15％胎牛血清的RPMI1640培养液和甾醇化合物，在无菌条件下，加入甾醇化合物的量为占细胞生长调节剂20重量％。
对于细胞培养基的选择本领域技术人员是公知的。对照组中不加入本发明的物质。该细胞培养调节剂的加入量为10克/100毫升培养基。
按程序要求更换培养液，换液方法为去掉一半陈旧培养液，加入等量新鲜的，含15％胎牛血清的MEM培养液或者含15％胎牛血清的RPMI1640培养液，以后换液时间缩短为3天，定时观察和随时观察相结合。
在培养25天后，如图1中可见人的肠粘膜组织细胞以不同形状单个形式于培养液中，这时细胞在培养液中成活，生命活跃，有的细胞呈分裂相。在这些细胞中有些细胞具有持续增殖的能力，我们称潜能再生细胞；有些细胞不具有持续增殖的能力。
参见图2，可见正在分裂的较大的细胞是正在复制组织器官的由潜能再生细胞变化来的细胞；较小的没有分裂的细胞是原有不增殖和新产生的潜能再生细胞；这些细胞在培养液中在特殊生命物质的作用下持续增殖，表现为干细胞的增殖规律。在对细胞的功能测定后，可作为体外正常细胞实验模型。
参见图3，可见持续增殖的细胞在培养液中部分开始连接成组织，已连接成组织的细胞其形态由圆型变为组织细胞的形态，部分细胞仍持续增殖活跃。其形成的组织可作为体外组织实验模型。
参见图4，可见增殖的细胞在初步连接形成组织后，继续按其遗传属性，组合成组织器官，即肠粘膜的绒毛。
在以上体外利用组织细胞进行培养为组织器官的研究中，发明人对具有增殖能力的源头细胞进行了研究，发现在同时培养的单个组织细胞中，部分细胞开始分裂，很快就成为终端细胞，没有形成新的组织；而另一部分细胞，则持续分裂增殖，而增殖的细胞则源源不断的形成组织，并形成不同形态的组织，几种不同形态的组织共同组合成大的组织或组织器官。为此，发明人对具有增殖能力的细胞和增殖细胞在不对称分裂时产生的不在增殖细胞进行的荧光标记研究，结果这两种细胞具有相同的标记，从而初步确定，组织细胞再生的源头细胞主要是来源于增殖细胞的不对称分裂的不继续增殖细胞。我们将这种细胞称“潜能再生细胞”或也称“再生潜能细胞”。这些细胞是动物体发育和再生期间的每个时段所留下了的“拷贝细胞”，带有此时段的全部信息，与细胞增殖形成的组织细胞共同形成组织或器官，当成体的组织或器官损伤或退化时，这些尚未增殖的细胞被激活，原位进行分裂增殖形成新的组织或器官补偿其组织器官的功能和空缺。其再生潜能细胞的产生过程示意见图5。
经过对以上细胞的研究，发明人掌握了细胞的生命特点，从而使该细胞在体外和/或原位再生新的细胞并形成新的组织或器官。发明人称本发明所述的潜能再生细胞为人体(动物体)生命延续再生之源。
实施例2体外培养再生复制的小鼠肠粘膜绒毛将购自中国医学科学院实验动物研究所的昆明小白鼠、采用本领域技术人员公知的断颈处死法，处死实验动物，用75％乙醇消毒动物体表两次，每次5分钟，按解剖学定位，准确切(剪)取动物的活体组织。为将该组织块离散为单个细胞，首先将组织块置入含有双抗(青霉素和链霉素)的4℃预冷的磷酸缓冲盐水(PBS)中，洗涤3遍，然后将此大的组织块切成1mm3的小组织块，再用含有双抗的冷PBS洗涤两遍，将经过洗涤的组织块置入用无菌PBS配制的0.25％胰蛋白酶溶液或者1％胶原酶溶液中消化，条件是4℃振荡过夜，约16小时，或者是37℃恒温水浴振荡，时间因组织而异，从30分钟至3小时不等。
采用与实施例1相同的方法进行培养，不同的是实验组使用17天胚胎昆明小鼠，将其近端小肠切成碎块；并将约5到10块肠组织植入含有培养基的培养板孔中，每个肠组织植块的间隔为约1厘米，贴壁培养。培养基中加入按细胞培养剂总重量计算，1重量的％的谷甾醇和5重量％的蜂蜡。可选择地加入5重量％的蜂胶作为细胞生长调节剂。该细胞生长调节剂的加入量为20克/100毫升培养基。
采用相同的组织设对照组，但是对照组的培养基中没有加入所述的细胞生长调节剂。其他条件相同，进行培养。
参见图6，经过连续30天的培养，可见实验组培养的肠组织植块贴壁生长良好，而对照组的肠组织开始出现从培养基上脱落的现象。
参见图7，经过连续60天的培养，可见实验组培养的肠组织植块存活，细胞从组织中游离，单个细胞浮游于培养液中。而对照组的肠组织出现组织植块死亡，少量已经游离出的细胞也出现死亡现象。经过继续培养，实验组的肠组织单细胞出现干细胞化增殖克隆复制。(见图8)。
请参见图9，继续培养实验组的肠细胞，出现细胞聚集，成群并发生连接现象。这些连接后的细胞形成基础组织，而基础组织进一步扩大，形成有形的肠粘膜组织。
参见图10，可以见到正在进行最后连接的肠绒毛的末端，以及局部放大后的肠粘膜的表现。
经过上述的方法培养的肠组织植块细胞游离在培养基中，参见图11a，可见大量的多种形态的肠组织单个细胞。所述的单细胞继续持续增殖，并且开始形成基础组织(图11b)。该基础组织逐步形成聚集，组合连接，开始形成具有基础功能的组织(参见图12a)，图中可以十分清楚地见到细胞连接、组织连接和连接移动的情况。在图12b中，能够见到基本功能组织的形成，即肠绒毛基胚的横断面的活体表现，细胞连接成环状，在该基胚的周围可见零散的向所述的基本功能组织靠近的细胞。
参见图13，小鼠的肠组织植块细胞，经过培养后，出现肠粘膜绒毛器官形成，细胞沿肠绒毛基环向两端复制，形成新的肠绒毛器官，完成肠绒毛粘膜的复制。
参见图14，经过本发明实施例2得到的结果(参见图12b)与《科学》杂志(发表人为Qi Yang，Nessan A.Bermingham，Milton J.Finegold，等，2001，294(5549)2155-8)发表的肠绒毛横断面的细胞组织学形态的比较可见，在两个显微镜图片中都可以清晰地见到在这一肠绒毛横断面上都存在肠上皮细胞\杯状细胞\肠内分泌细胞和潘氏细胞。
图15表示正常实体绒毛组织的纵向切面与本发明实施例2培养结果的比较，更进一步见到，本经过本发明的方法培养得到的复制出的多个肠粘膜绒毛器官和原位胚胎发育的肠绒毛横断面。
实施例3体外培养再生复制的小鼠骨髓组织采用与实施例1相同的方法进行培养，设立对照组与实验组，对照组中不加入本发明的物质。不同的是采用中国医学科学院实验动物研究所的BALB/C小白鼠骨髓细胞，获得该细胞的方法是本领域技术人员公知的。在实验组的培养孔中加入RPMI 1640培养基(RPMI 1640medium)和豆甾醇、β-谷甾醇和菜子甾醇(重量比1∶1∶1)，在无菌条件下，加入该甾醇组合物的量为占培养基重量的1重量％，另外还加入10重量％的蜂蜡，0.003重量％的黄小蘖碱。
经过64天的培养，得到以下结果参见图16a，实验组骨髓细胞在显微镜下可见经过培养后出现骨髓细胞的祖细胞，这些细胞发生集聚，进而形成细胞的大小集落，并且逐步形成骨髓组织。
如图16b所示，对照组的骨髓组织在培养10天后，开始出现骨髓的祖细胞，但是继续培养15天后，明显可见逐步形成纤维细胞。没有出现骨髓组织。
实施例4体外培养再生复制的大鼠神经组织采用与实施例1相同的方法进行培养，设立两个对照组与两个实验组，对照组中不加入本发明的物质。不同的是采用中国医学科学院实验动物研究所的SD大鼠神经细胞，获得该细胞的方法是本领域技术人员公知的。在实验组的培养孔中加入L15培养基(L15medium)培养液和豆甾醇、β-谷甾醇和菜子甾醇(重量比1∶1∶1)作为细胞生长调节剂，该细胞生长调节剂的加入量为15克/100毫升培养基，在无菌条件下，加入该甾醇组合物的量为占培养基重量的1重量％，另外还加入10重量％的蜂蜡，1重量％的黄芩甙和0.001重量％的黄连素。
经过25天的培养，得到以下结果参见图17a，实验组1的大鼠神经组织明显延长，而对照组2的神经组织发生萎缩，退化(图17a上组图片)。实验组2的大鼠神经出现与对照组2出现同样的结果。在250倍的显微镜下可见实验组1的再生神经组织的纹理清晰，成条束状，而对照组1的大鼠神经则表现明显的退化(图17b上组图片)。通过HE染色，在放大100倍的情况下实验组2还可见到与实验组1相同的形态(图17b下组图片)。而对照组2则出现神经组织明显退化的表现(图17b下组图片)。
实施例5体外培养再生复制的小鼠胰腺组织采用与实施例1相同的方法进行培养，设立对照组与实验组，对照组中不加入本发明的物质。不同的是采用中国医学科学院实验动物研究所的昆明小鼠胰腺细胞，获得该细胞的方法是本领域技术人员公知的。在实验组的培养孔中加入Ham’s F-12培养基(Ham’s F-12medium)和α-菠菜甾醇，，24-去氢胆固醇、多孔甾醇，胡萝卜甙的组合物作为细胞生长调节剂，其中该细胞生长调节剂中各种成分的重量比为(1∶1∶1∶1)，细胞生长调节剂的加入量为50克/每100毫升培养基。在无菌条件下培养。该细胞生长调节。剂包括20重量％的甾醇，0.1重量％的蜂蜡，1重量％的黄芩甙，0.001重量％的黄连素，0.001重量％的罂粟壳碱。
经过40天的培养，参见图18，胰腺细胞形成胰腺组织，培养92天后所见的胰腺组织进进一步成熟，而对照组织在培养65天后则出现大量的细胞死亡没有新成胰腺组织，进一步培养55天后，可见培养的胰腺细胞更加死亡、坏死。
为了测定实验组的胰腺组织的功能，取部分经过至少培养60天的培养基，采用公知的胰淀粉酶测定方法进行测定，参见图19，结果是每升培养液中含胰淀粉酶14.6U/L。对照组每升培养液中含胰淀粉酶大于850U/L。而且，实验组(0.15μu/ml)中的胰岛素的含量大大高于对照组(0.01μ u/ml)的含量。
实施例6体外培养再生复制的小鼠肾脏组织采用与实施例1相同的方法进行培养，设立对照组与实验组，对照组中不加入本发明的物质。不同的是采用中国医学科学院实验动物研究所的小鼠的肾脏细胞，获得该细胞的方法是本领域技术人员公知的。在实验组的培养孔中加入MB752/1培养基(MB752/1medium)和细胞生长调节剂，其加入量为30克/100毫升培养基。在无菌条件下，该细胞生长调节剂包括按，该细胞生长调节剂计算，0.5重量％的甾醇，20重量％的蜂蜡、1重量％的黄芩甙、0.001重量％的黄连素，0.001重量％的罂粟壳碱和2重量％的地龙。
参见图20，经过60天的培养，经过对肾皮质细胞的培养，实验组出现新的肾单位，而且清晰可见。对照组的细胞出现大量死亡。
实施例7体外培养再生复制的人毛囊利用在人体拔除头发或体毛的方法，获得发根处带出的毛囊突出部采取毛囊细胞，采用与实施例1相同的方法进行培养，设立对照组与实验组，对照组中不加入本发明的物质。不同的是采用人的毛囊细胞。实验组的含有24孔MEM/5％FCS培养皿(每孔有2ml)中进行培养。培养基中本发明所述的细胞生长调节剂，加入该甾醇的量为35克/100毫升培养基。该调节剂包括，按该细胞生长调节剂总重量计算，0.5重量％的β-谷甾醇，20重量％的蜂蜡、1重量％的黄芩甙、0.001重量％的黄连素，0.001重量％的罂粟壳碱和0.001重量％的地龙。
得到的毛囊细胞，经过70天的培养后，出现细胞的克隆复制现象，进一步培养在78天时出现毛囊细胞连接，并成毛囊成体，进而形成毛囊组织器官，可见毛发出现(见图21)。
实施例8体外培养再生复制的小鼠心肌组织采用与实施例1相同的方法进行培养，设立对照组与实验组，对照组中不加入本发明的物质。不同的是采用中国医学科学院实验动物研究所的SD小鼠心肌细胞，获得该细胞的方法是本领域技术人员公知的。在实验组的培养孔中加入CMRL1066培养基(CMRL 1066 medium)和本发明的物质作为细胞生长调节剂，在无菌条件下培养。加入该细胞生长调节剂的量为25克/100毫升培养基。所述的细胞生长调节剂包括，按该细胞生长调节剂总重量计算，甾醇的量为6重量％的甾醇，20重量％的蜂蜡、10重量％的黄芩甙、0.02重量％的黄小蘖碱、0.01重量％的黄连素，0.01重量％的罂粟壳碱和0.01重量％的地龙。
参见图22，经过对心肌细胞的培养，48天后出现心肌细胞的连接，经过65天的培养后可见心肌组织的完成。
实施例9体外培养再生复制的小鼠胸腺组织采用与实施例1相同的方法进行培养，设立对照组与实验组，对照组中不加入本发明的物质。不同的是采用中国医学科学院实验动物研究所的Wistar大鼠胸腺细胞，获得该细胞的方法是本领域技术人员公知的。在实验组的培养孔中加入CMRL1066培养基(CMRL 1066 medium)和本发明的细胞生长调节剂，其加入量为40克/100毫升培养基。该细胞生长调节剂包括豆甾醇、β-谷甾醇、角甾醇，γ-谷甾醇(其重量比为0.5∶1∶0.85∶0.5)，在无菌条件下培养。按照该细胞生长调节剂总重量计算，包括15重量％甾醇，15重量％的蜂蜡、2重量％的黄芩甙、0.05重量％的黄小蘖碱、0.03重量％的黄连素和0.01重量％的地龙。
参见图23，经过对大鼠胸腺细胞的培养，15天后出现心肌细胞的聚集和连接，经过34天的培养后可见胸腺组织的复制完成。对照组的胸腺组织在培养8-10天开始出现死亡，最后不能形成完成、完整的胸腺组织。
实施例10体外培养再生复制的大鼠肝脏组织采用与实施例1相同的方法进行培养，设立对照组与实验组，对照组中不加入本发明的物质。不同的是采用中国医学科学院实验动物研究所的Wistar大鼠肝脏细胞，获得该细胞的方法是本领域技术人员公知的。在实验组的培养孔中加入15％小牛血清的CMRL1066培养基(CMRL 1066medium)和本发明的细胞生长调节剂，其加入量为50克/100毫升培养基。该细胞生长调节剂包括豆甾醇、β-谷甾醇、角甾醇，γ-谷甾醇(其重量比为0.5∶1∶0.85∶0.5)的组合物，在无菌条件下培养，加入的细胞生长调节剂包括10重量％的甾醇，10重量％的蜂蜡、1重量％的黄芩甙、0.05重量％的黄小蘖碱、0.03重量％的黄连素和0.01重量％的地龙。
参见图24，经过对肝脏组织细胞的培养，15天后出现肝脏细胞增殖、聚集和连接，经过25天的培养后可见肝脏小叶形成，完成肝脏组织的复制。对照组的肝脏组织在培养8-10天开始出现死亡，最后不能形成完成完整的胸腺组织。
实施例11小鼠体内胃原位观察的结果本发明的细胞生长调节剂不仅可以在体外调节细胞的生长，而且可以在体内使用。
本实施例中选用对小鼠体内急性胃溃疡模型实验，用乙醇灌入法制作胃的急性出血溃疡模型，使用如实施例2相同的细胞生长调节剂分别对实验组和对照组的小鼠进行灌胃。三天后，处死部分小鼠，获得小鼠的胃。参见图25，镜肉眼观察对比实验组与对照组小鼠的胃。
可见实验组小鼠胃坏死粘膜原位复制修复，而且没有疤痕。但是，对照组小鼠的胃呈现典型的胃粘膜出血溃疡的表现，黑色点片为溃疡面，粘膜成坏死样表现。
实施例12人体内胃原位观察的结果参见图26，经胃镜确诊观察胃十二指肠溃疡病人，确认该病人的胃角处粘膜可见一明显溃疡斑，胃粘膜全层坏死，周围组织出现炎性反应。使用与实施例2相同的细胞生长调节剂，十天后，再经胃镜观察病变处，可见胃粘膜原位复制修复，无疤痕表现，与周围组织相同。
实施例13植物培养取一正在生长中的冬瓜，在冬瓜的皮上用刀削去三块直径为2×2大小的薄皮，而后分别在去薄皮处，用食用油，例芝麻油，或者大豆油、湿纱布、不作任何覆盖，每日更换一次；10天后，涂用食油处重新生长出了皮，敷湿纱布处烂了个洞，没有覆盖处形成了一个“疤”。
本发明并非限制在本文中描述的特定实施方案的范围内。确实，除了那些在本文中所描述的以外，如果描述中对本发明的多种修正对本领域的技术人员是显而易见的，均落入到权利要求保护的范围之内。
权利要求
1.一个体外培养细胞的方法，该方法包括获取从哺乳动物体预定部位分离得到的组织细胞或组织；将细胞生长调节剂添加到培养基中形成组织培养基，所述细胞生长调节剂，按该细胞生长调节剂总重量计算，含有0.5重量％-20重量％的甾醇化合物、0.1重量％-2重量％的黄芩甙和1重量％-20重量％的蜂蜡；在组织培养基中培养所述的分离得到的组织细胞或组织。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的组织细胞或组织分离自啮齿类动物或人。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的组织细胞或组织分离自发育成熟的成人。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的组织细胞或组织分离自活体哺乳动物。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的获得的组织细胞或组织来自哺乳动物的除胚胎干细胞和囊胚泡之外的肠和/或肠粘膜、骨髓、神经、胰腺、肾脏、毛囊、心肌、胸腺、肝脏或皮肤。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的组织在体外处理以产生细胞，然后分离该细胞并在组织培养基中进行培养以产生组织-器官。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在组织培养基中激活所述的分离的组织细胞或组织所含有的细胞，并继续增殖和分化15～78天。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的油脂包括植物油或动物油。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的油脂包括一个选自玉米油、花生油、棉子油、红花油、茶树油、芝麻油、橄榄油或豆油的油。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的油酯包括芝麻油。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的甾醇化合物是动物甾醇或植物甾醇。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的甾醇化合物包括胆固醇以及所有天然或合成的、异构体或其衍生物。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的甾醇化合物选自豆甾醇、β-谷甾醇、角甾醇、γ-谷甾醇、菜子甾醇、α-菠菜甾醇、24-去氢胆固醇、多孔甾醇、胡萝卜甙或所有天然或合成的，异构体或衍生物及其组合。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述甾醇化合物是豆甾醇、β-谷甾醇和菜籽甾醇的组合。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，按该细胞生长调节剂总重量计算，该细胞调节剂中的甾醇化合物的量为1重量％-10重量％。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蜂蜡，按该细胞生长调节剂总重量计算，其含量为2重量％-10重量％。
17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的培养基还含有蜂胶，按该细胞生长调节剂总重量计算，其含量为0.1重量％-30重量％。
18.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的黄芩甙，按该细胞生长调节剂总重量计算，其含量为0.2重量％-1重量％。
19.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞生长调节剂还含有黄柏内酯，按该细胞生长调节剂总重量计算，其含量为0.1重量％-2重量％。
20.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞生长调节剂还含有黄小蘖碱，按该细胞生长调节剂总重量计算，其含量为0.001重量％-2重量％。
21.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞生长调节剂还含有黄连素，按该细胞生长调节剂总重量计算，其含量为0.001重量％-2重量％。
22.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞生长调节剂还含有罂粟壳碱，按该细胞生长调节剂总重量计算，其含量为0.001重量％-2重量％。
23.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞生长调节剂还可以含有地龙，按该细胞生长调节剂总重量计算，其含量为0.001重量％-2重量％。
全文摘要
本发明涉及体外培养细胞的方法，该方法包括1)获取从哺乳动物体预定部位分离得到的组织细胞或组织；2)将细胞生长调节剂添加到培养基中形成组织培养基，所述细胞生长调节剂，按该细胞生长调节剂总重量计算，含有0.5重量％－20重量％的甾醇化合物、0.1重量％－2重量％的黄芩甙和1重量％－20重量％的蜂蜡；3)在组织培养基中培养所述的分离得到的组织细胞或组织。
文档编号A61K31/20GK1818058SQ20051012333
公开日2006年8月16日 申请日期2002年9月27日 优先权日2001年10月30日
发明者徐荣祥 申请人:徐荣祥