活体组织片及其制作方法、以及应用该片的移植方法

专利名称：活体组织片及其制作方法、以及应用该片的移植方法
技术领域：
本发明涉及活体组织片。具体来讲，本发明涉及活体组织片及其制作方法以及该片的利用(移植方法等)，所述活体组织片不使用来自于异种动物的细胞作为饲养细胞，而是将来自于角结膜上皮细胞、皮肤表皮细胞、毛囊上皮细胞、口腔粘膜上皮细胞、气管粘膜上皮细胞或肠粘膜上皮细胞等活体细胞在羊膜上培养而使其增殖来制作的。
背景技术：
皮肤是被覆机体最外层的器官，是使机体免受外界损害的屏障。皮肤由表皮、真皮及皮下组织构成，表皮主要含有角化细胞，其中混有少量的色素细胞和郎格罕细胞等。构成表皮的细胞主要是角化细胞，其包括(1)处于最外层的、核消失了的角质细胞，(2)其下层由有核的细胞(颗粒细胞、棘细胞、基底细胞)。接着在最下层的基底细胞和真皮之间存在表皮基底膜。基底层是一层细胞层，是表皮角化细胞的母细胞层，目前认为只有基底细胞具有分裂能力。
由某些原因缺失了表皮的状态就是溃疡。在表皮的缺损部位，由来自于周边的角化细胞的增殖以及一部分来自毛囊的角化细胞的增殖来再生表皮，使溃疡面上皮化。但是，对于一次性产生大范围表皮缺损的烫伤和难治性的深度、毛囊欠缺的溃疡而言，只靠由周边表皮的再生来上皮化需要很长时间。
基底层的细胞周期约450小时。由分裂产生的子细胞，向棘细胞层移动的同时其形态和功能发生变化，接着经过颗粒层角化成角质层、最终脱落到体外。把直到脱落为止的时间称为更新时间(turnover time)，认为是47～48天。
在目前公认的表皮的再生模型中，根据其分裂能力把表皮角化细胞分为干细胞(stem cell)、过渡放大细胞(transit-amplifying cell)、有丝分裂后细胞(post-mitotic cell)3种。干细胞是具有无限自我再生能力的细胞，经分裂产生过渡放大细胞。过渡放大细胞具有一定的分裂能力，分裂后成为过渡放大细胞，但最终失去分裂能力而成为有丝分裂后细胞。
表皮的干细胞具有以下特征(1)干细胞本身的细胞周期长(slowcycling)；(2)根据部位，存在的地方不同；(3)聚集存在。(4)强烈表达α2β1以及α3β1整合蛋白。但基底细胞中约有40％的细胞强烈表达整合蛋白，推测干细胞实际上约占基底细胞的10％左右。即基底层中不仅有干细胞，也存在过渡放大细胞、有丝分裂后细胞。
当表皮受损伤时，引起增殖刺激，细胞开始旺盛地增殖，开始再生。这时，具有最重要作用的是一系列的上皮细胞生长因子群。上皮细胞生长因子(epidermal growth factor、EGF)家族包括EGF、转化生长因子(transforming growth factor、TGF)-α、肝素结合性EGF样增殖因子(heparin binding EGF like growth factor、HB-EGF)、β-动物纤维素(betacellulin)、两栖调节素(amphiregulin)、神经生长调节因子(neuregulins)，但认为实际上与表皮角化细胞的增殖相关的是TGF-α、HB-EGF、两栖调节素，这些因子显示出对表皮角化细胞具有自我增殖的作用。相反，对表皮角化细胞的增殖起抑制作用的因子，已知的有TGF-β、维生素D3、视黄酸(retinoic acid)等。
在再生医学的领域中，用于移植人皮肤的真皮、上皮的全层缺损的损伤部位的移植片的开发不断发展。例如，特开平10-277143号公报(专利文献1)中，记载有用于治疗人皮肤等全层缺损创伤治疗的移植片及其制备方法。该文献中公开的移植片是在人的纤维蛋白片内包埋来自于真皮组织的成纤维细胞，并将表皮组织附着于该片的表面而制作的。
以往，对于皮肤缺损的修复，进行移植皮肤全层的全层植皮及移植表皮和真皮上层的分层植皮，但受到取材部位大小的限制。在该点上，培养表皮具有一次只采取小的皮肤片就能获得数千倍面积皮肤的优点，而且可以冻存，因此可以反复使用，与以往植皮术相比较，这是最大的优点。
表皮片根据所使用细胞的由来不同而分为自体培养表皮片与异体培养表皮片。自体培养表皮片移植在多数情况下主要是为了覆盖表皮缺损部位、使其存活，而异体培养表皮片移植在多数情况下是为了起到作为生物学的生物敷料(biological dressing)的效果。通过表皮细胞的基础研究，确定表皮角化细胞产生多种细胞生长因子、细胞因子，从而明确了异体培养表皮片的有效性。
如果建立安全且稳定地提供培养表皮的技术，结合移植技术的发展，则再生医疗可以实用化，对患者带来无限的福音。考虑表皮的再生时，把具有分裂·增殖能力的基底细胞分离、培养，使其大量增殖而再生表皮，从而应用于移植，这可以说非常有道理。可是，基底细胞中不仅仅是干细胞，也含有过渡放大细胞、有丝分裂后细胞，为了更高效地制备良好的培养皮肤，希望建立选择性地培养表皮干细胞的技术。
以往许多研究者尝试了表皮细胞培养技术的研究及开发，其成果对皮肤生物学领域带来了很大的益处。具体来讲，通过使用培养的角化细胞，不断迅速阐明表皮细胞的特性、表皮的再生、分化、增殖机制。另外，采取患者的小皮肤片，把角化细胞传代培养，使其大量增殖成为可能，并且能冻存，因此，培养皮肤不断被应用于大面积烫伤、难治性溃疡等的治疗中。
与皮肤并列可以期待着对再生医疗贡献的另一个组织是角膜。角膜位于构成眼球光学系的最外层，是没有血管的透明组织，与泪液共同形成平滑的表面，由此在获得良好的视力中起作用。并且角结膜上皮细胞通常与外界接触，具有保护眼球使之免受外界微生物等的异物、紫外线等的光线的损害的防御作用。即角结膜上皮细胞对角膜透明性和保护整个眼球并维持恒常性具有重要的作用。
角膜有时由于例如角膜炎、角膜溃疡、穿孔等的病态而混浊、失去透明性。对于这样的角膜混浊引起的永久的视力降低，进行用眼球提供者所提供的角膜进行角膜移植的治疗。角膜移植是取除患者的失去透明性的角膜后移植透明的角膜，通过该移植恢复透明性，能再次恢复视力。
通过这样的角膜移植有时可以期待着有效的治疗效果，然而也存在着只通过角膜移植不能治疗的疾病。例如史蒂芬强森综合症、眼类天疱疮、化学外伤、烫伤等。通常，角结膜上皮细胞是每天反复分裂，衰老的细胞脱落，并由干细胞组织再生新的细胞。然而，已知在如上病态中，再生角膜的干细胞组织存在障碍。
再生角膜上皮的干细胞组织被称为“角膜缘部组织”，正好局限于虹膜和巩膜的交界部位，位于裸露于外界的特殊环境。上述的病态时，认为该干细胞组织本身由于受到某些损害而完全没有了。而后，由于该干细胞组织的灭绝，其缺损部分由周边存在的结膜上皮所覆盖，透明性欠缺而造成视力的极度下降。这样，在如上病情时因角膜缘部枯竭，因此只靠单纯的角膜移植不能长期维持被移植的角膜。因此，为再建持久的眼表面，有必要移植角膜缘部。作为移植该角膜缘部的一种方法，开发了羊膜移植法(MEDICAL朝日1999年9月号p62～65、N Engl JMed 3401697～1703、1999非专利文献1)。该移植法所使用的羊膜是由剖腹产产妇等的胎盘获得。羊膜因具有厚的基底膜，因此被移植时作为用于角结膜上皮细胞增殖、分化的基质而起作用。而且，羊膜几乎没有免疫原性，同时具有抗炎症、瘢痕形成抑制等的作用，因此被移植到羊膜上的角结膜上皮及它们的干细胞组织，可以免遭受者的排斥反应。
专利文献1特开平10-277143号公报非专利文献1MEDICAL朝日1999年9月号p62～65、N EnglJ Med 3401697～1703、1999发明内容以往认为表皮角化细胞的培养是很困难的事，但1975年由Rheinwald和Green发表了小鼠3T3饲养层法，表皮角化细胞的培养首次成为可能。该方法是把小鼠3T3细胞作为饲养层、以及使用胎牛血清而存在批量间的差异等，因而培养绝非容易。到了1980年代，由Hennings和Yuspa指出，一旦降低培养液中的Ca2+浓度，则表皮角化细胞变为未分化状態，增殖加快。进而，Boyce和Ham开发了低Ca2+浓度培养基的MCDB153培养基，指出了通过添加牛脑下垂体抽取液的人表皮角化细胞的无血清培养法的可能性。1986年，Pittelkow等应用无血清培养法培养了表皮角化细胞，进一步改为胎牛血清添加高钙的培养基，由此制作了培养表皮片，移植给烫伤患者，得到了良好效果。现在该无血清培养法是主流，但来自于异种动物的3T3细胞作为饲养层使用。在来自于异种动物的细胞共存情况下培养得到的移植片中，存在着混有来自于异种动物的产物的危险性。因此使用该移植片的移植手术是异种移植或者被认为是以此为基准的移植，认为伦理、安全上存在大的问题。事实上，在医疗实际中没有将异种移植实用化的例子。
培养表皮片移植是用邮票大的皮肤进行传代培养角化细胞，由此使覆盖大范围的创面成为可能。而且由于可以冻存，因此可以应用于必需反复移植的难治性、再发性皮肤溃疡的治疗中。以往的培养法所制作的培养片，例如，使被移植的培养表皮片很好地存活并非容易的事情。这是由于培养表皮片欠缺基底膜的组成成分，重叠的表皮没有形成坚固的角化层所致。由Bell开发的三维培养皮肤有角化层、颗粒层，是目前最接近于皮肤的培养皮肤，但其工艺烦琐，必需特殊的技术，在日本仍没有得到普及。三维培养皮肤在海外对异体移植显示出有效性，已被商品化。虽然在异体移植中促进上皮化作用已被确认，但不能期待永久地存活。在日本，从确保伦理、安全性的角度考虑，异体移植普及的可能性小，焦点集中在自体移植的改善方面。
另一方面，对角膜被结膜上皮覆盖而引起混浊的眼表面疾病的外科治疗，目前是进行角膜上皮移植术，但对伴有严重炎症的难治性角结膜疾病(史蒂芬强森综合症(Stevens-Johnson症候群)或眼类天疱疮、角膜腐蚀等)而言，其预后非常不好。其最大的原因可以举出具有强抗原性的异体(アロ)的角膜上皮被宿主的免疫系统所识别，受到排斥。进而为了予防排斥反应而在手术后全身以及局部给予大量的免疫抑制剂所引起的并发症也是其预后不良的重大因素。另一方面，利用异体的角膜上皮时，存在供体不足的问题。如果有利用一只眼获得的角膜就可制作数十个角膜上皮片的技术，就可以解决供体不足的课题。
本发明是鉴于以上背景及课题而完成的，其目的在于提供可望有很高的治疗效果而且在移植时安全性高的活体组织片。为了达到所述目的，本发明人等首先尝试了培养表皮片的制作。具体来讲，考虑安全性，培养上皮细胞的时侯，在不使用来自于异种动物的细胞(饲养细胞)的条件下，作为以往的培养表皮片自体移植的发展，制作三维培养皮肤，对基底膜组成成分、细胞粘着分子、分化抗原，进行免疫组织学以及电子显显微镜的研究。其结果与以往的培养表皮片相比较，可见到坚固的角化层的形成，细胞粘附分子、分化的标记是与体内(vivo)表皮相同，有着充分的表达。对于基底膜构成成分而言，半桥粒的形成良好，类天疱疮抗原、β4整合蛋白的表达充分。
培养表皮片的存活性被其基底膜构成成分的形成所左右。即培养表皮片是附着于塑料培养皿的底面培养的，制作片时有必要从培养皿底面剥离。其剥离用分散酶或胶原酶，但基底膜的构成成分被这些酶所分解。在至今的报告中，报道有由于分散酶，用蛋白质印迹法无法检出类天疱疮抗原，在荧光抗体法中用GB3单克隆抗体识别的昆布氨酸5被分解。还报道有胶原酶使锚纤维和IV型、VII型胶原的表达减少，但α6β4整合蛋白不受影响。与此相对，发现三维培养皮肤保持与体内表皮相近的结构，形成了基底膜构成成分。本发明人等的研究也确定β1整合蛋白、β4整合蛋白、类天疱疮抗原的形成比较良好，电子显微镜所见也确认了半桥粒的形成良好。
接着，本发明人等对于能否用与培养表皮片相同的手法制作可以适用于其它组织的移植材料进行了研究。具体来说，尝试了角膜上皮片的制作。其结果为通过在载置于含有成纤维细胞的胶原上的羊膜上培养角膜上皮细胞，而不使用饲养细胞，达到了良好的多层化以及上皮化。
如上所述，本发明人等完全不使用来自于异种动物的细胞，成功地制作了安全而实用的活体组织片。而且发现了即使在无血清培养条件下也能制作活体组织片。
进而，本发明人等在特别优选羊膜作为表皮细胞的培养基质的假设前提下进行了各种实验。首先，使羊膜附着于含有成纤维细胞的胶原上，在其上播种人表皮角化细胞(角质化细胞)，观察人表皮角化细胞向周边的游走情况时，与在含有成纤维细胞的胶原凝胶上直接播种细胞(对照组)相比较，细胞的游走明显加快。另一方面，将在载置于含有成纤维细胞的胶原凝胶上的羊膜上培养的人表皮角化细胞和羊膜一起回收，然后，载置到附着于含有成纤维细胞的胶原凝胶上的其他羊膜上，观察人表皮角化细胞向周边的游走，与载置于含有成纤维细胞的胶原凝胶上(对照组)相比，游走显著加快。由这些实验结果发现，在羊膜上面表皮角化细胞的增殖良好并且良好地发挥细胞的游走能力。即，明确了羊膜极为优选作为表皮角化细胞的培养基质。另外，基于该认识，认为如下二种移植技术是优异的表皮再建术即(1)把在载置于含有成纤维细胞的胶原凝胶上的羊膜上培养的表皮角化细胞与羊膜一起回收，然后，载置在另外的羊膜上，将通过培养而得到的片状构筑物(在羊膜(第1羊膜)的另一面粘着另外的羊膜(第2羊膜)，并且具有以一部分覆盖第1羊膜而以另一部分覆盖第2羊膜的细胞层的构筑物)移植到表皮缺损部位的方法；以及(2)把在载置于含有成纤维细胞的胶原凝胶上的羊膜上培养的表皮角化细胞与羊膜一起回收，并把其移植到预先移植在表皮缺损部的羊膜上的方法。在此，缺损真皮全层以及直到皮下组织时以保存治疗就难以上皮化，因此首先有必要备置移植床。真皮缺损时以往使用人工真皮，有一定程度的治疗效果。人工真皮中可见到血管的再生，但在其上移植培养表皮时，发现由于基底膜的构成不充分而引起存活不良。另一方面，如果人工真皮移植与上述的(1)或(2)的移植术相结合，则通过具有基底膜构成成分的羊膜就可以移植培养表皮，因而可以期待高的存活率。而且，在羊膜上形成了培养表皮的状态，因此移植后促进构成培养表皮细胞良好地增殖以及向周边游走，其结果为培养表皮迅速伸展，取得高的治疗效果。因此，即使对达到大范围直至皮下组织的皮肤缺损，通过人工真皮移植与上述的移植术相组合的方法，可期待对整容也能确立很好的治疗方法。
本发明是基于以上成果以及见解而完成的，提供如下的构成。
即本发明提供含有在不存在异种动物细胞的情况下，于羊膜上增殖的来自于活体的细胞而成的活体组织片。
本发明的一种方式是以在含有人成纤维细胞的胶原凝胶上载置有羊膜的状态来使来自于活体的细胞增殖，由此实现来自于活体的细胞的增殖率的提高。
使来自于活体的细胞增殖时所用的培养基可以用(1)无血清培养基，或者(2)作为血清成分只含有来自于受者的血清的培养基。
来自于活体的细胞优选是来自于角膜上皮、结膜上皮、皮肤表皮、毛囊上皮、口腔粘膜、气管粘膜或者肠管粘膜的细胞。
作为培养基质的羊膜优选使用去除上皮的羊膜。
本发明的另一种方式是除了增殖的细胞之外，还含有作为培养基质的羊膜，从而构成活体组织片。
本发明的活体组织片是例如直接，或者与作为培养基质而使用的羊膜一起通过另外的羊膜来移植到组织缺损部的。后一种情况典型的是，对组织缺损部移植羊膜(第2羊膜，即与制作活体组织片时使用的羊膜不同的另一羊膜)之后，在该羊膜上移植活体组织片。
本发明另一种方式的活体组织片，其特征为，含有如下细胞即，把在不存在异种动物细胞的情况下、在载置于含有人成纤维细胞的胶原凝胶上的羊膜上增殖的来自于活体的细胞与上述羊膜共同载置于第2羊膜上，进一步使其增殖而获得的细胞。
本发明进一步提供活体组织片的制作方法。本发明的制作方法的一种方式包括如下的步骤。即(a)调制来自于活体的细胞的步骤；(b)把上述来自于活体的细胞播种于羊膜上的步骤；以及(c)在不存在异种动物细胞的情况下，培养上述来自于活体的细胞而使其增殖的步骤。
本发明的一种方式是，上述的步骤b实施以下步骤。即(b-1)在胶原凝胶内培养人成纤维细胞的步骤；以及(b-2)在上述的胶原凝胶上载置羊膜之后，把上述来自于活体的细胞播种于该羊膜上的步骤。
本发明的另一种方式是(d)上述来自于活体的细胞增殖以后，进一步实施使最表层与空气接触的步骤。通过该步骤促进细胞层的角质化(上皮化)。
本发明的另一种方式是进一步实施(e)将上述来自于活体的细胞与上述羊膜一起回收的步骤；及(f)把回收的上述来自于活体的细胞和上述羊膜以羊膜侧向下载置在第2羊膜上以后，接着培养上述来自于活体的细胞而使其增殖的步骤。即实施2阶段的培养。
实施步骤c时所使用的培养基可以使用(1)无血清培养基，或者(2)作为血清成分只含有来自于受者的血清的培养基。
来自于活体的细胞优选是来自于角膜上皮、结膜上皮、皮肤表皮、毛囊上皮、口腔粘膜、气管粘膜或者肠管粘膜的细胞。
作为培养基质的羊膜优选使用去除上皮的羊膜。
本发明进一步提供了皮肤表皮细胞的调制方法，其包括以下步骤即(A)把皮肤表皮细胞播种于羊膜上的步骤；(B)培养上述皮肤表皮细胞而使其增殖的步骤；及(C)把增殖的皮肤表皮细胞回收的步骤。


图1表示用实施例1的方法制作的三维培养皮肤片(培养表皮片)的HE染色图像(空气-上举后第8天)的图。从上层依次为表皮角化细胞层、羊膜、含有成纤维细胞的胶原凝胶(基质)。在表皮角化细胞层中，从下依次由基底细胞层、棘细胞层、颗粒层、角质层有序构成，显示出与人正常表皮非常接近的形态。
图2表示用实施例2的方法制作的三维培养皮肤片(培养表皮片)的HE染色图像(空气-上举后第8天)的图。羊膜上播种的人表皮角化细胞含有一层基底细胞层和5-6层的细胞层，也可见到角质层的形成，表皮被再构成。
图3表示羊膜对表皮角化细胞增殖及游走的效果的试验结果图。右栏是试验组(在含有成纤维细胞的胶原凝胶上附着的羊膜上培养表皮角化细胞的情况)的结果(从上依次为第1天、第10天)。左栏是对照组的结果。
图4表示羊膜对表皮角化细胞增殖及游走的效果的试验结果图。左栏是试验组(在含有成纤维细胞的胶原凝胶上附着的羊膜上载置培养表皮片，进行培养)的结果(由上依次为第1天、第7天、第10天、及第14天)。中间栏是对照组1(在含有成纤维细胞的胶原凝胶上载置培养表皮片，进行培养)的结果。同样，右栏是对照组2(将不使用羊膜而进行三维培养所得到的细胞层载置在含有成纤维细胞的胶原凝胶上，进行培养时)的结果。
具体实施例方式
本发明提供含有如下构成的活体组织片。即，含有在不存在异种动物细胞的情况下、于羊膜上增殖的来自于活体的细胞的活体组织片。来自于活体的细胞形成细胞层。以下详述本发明的活体组织片以及其制法的特征。
本发明的活体组织片是通过含有如下步骤的方法制作的，所述步骤为(a)调制来自于活体的细胞的步骤；(b)把上述来自于活体的细胞播种在羊膜上的步骤；(c)在不存在异种动物细胞的情况下，培养上述来自于活体的细胞而使其增殖的步骤。
在步骤(a)中调制来自于活体的细胞。作为来自于活体的细胞，使用适合用于最终得到的活体组织片的细胞，例如制作皮肤表皮组织再生用的片时，优选使用皮肤表皮细胞(包括其干细胞、前体细胞)或毛囊上皮细胞(包括其干细胞、前体细胞)等。同样，以角膜上皮组织的再生为目的时，优选使用角膜上皮细胞(包括其干细胞、前体细胞)；以再生粘膜上皮组织为目的时，优选使用粘膜上皮细胞(包括其干细胞、前体细胞)。以粘膜上皮细胞为例，可以举出口腔粘膜上皮细胞、肠管粘膜上皮细胞、气管粘膜上皮细胞等。
关于来自于活体的细胞的调制方法，以皮肤表皮细胞、角膜上皮细胞、口腔粘膜上皮细胞、肠管粘膜上皮细胞以及气管粘膜上皮细胞为例进行说明。
(皮肤表皮细胞)首先，对于皮肤的采取，事先用聚乙烯吡咯酮碘等消毒药预防性地消毒采取部位，进行抗真菌剂的外用涂布之后，依照皮肤活检采取小皮肤片。对于表皮角化细胞的培养，用剪子从皮肤片中尽量剔除脂肪组织和真皮，用杜氏磷酸缓冲液(PBS)清洗数次。在70％乙醇中浸泡1分钟来进行灭菌。切成长方条状，浸于分散酶液，在4℃下静置一晚。接着将表皮从真皮上剥离。把剥离得到的表皮清洗后，切碎表皮片，调配表皮角化细胞浮游液。把细胞悬浮在无血清培养液中，播种于胶原被覆培养皿上，进行传代培养。
(角膜上皮细胞)角膜上皮细胞可从角膜缘部组织中获得。例如，从角膜缘部组织剥离去除内皮细胞，切除结膜，制作单一细胞悬浮液。然后把它保存于氮罐中，接着迅速在37℃下融解来调配角膜上皮细胞悬浮液。根据需要，进行传代培养。对传代培养而言，比如，可使用无血清培养基EpilifeTM(CASCADE公司)、MCDB153培养基(日水制药株式会社)或改变这些培养基的氨基酸组成等而制成的培养基等。
(口腔粘膜上皮细胞)作为口腔粘膜上皮细胞，可以使用存在于齿根部的细胞(口腔内缘粘膜上皮细胞)、口唇部细胞、口上颚细胞、颊部细胞等。其中，口腔内缘粘膜上皮细胞因其增殖能力高且抗原性低，而特别优选使用它。口腔粘膜上皮细胞可以用手术刀等切除目标细胞存在的部位，或通过进行刮除来采取。对于口腔内缘粘膜上皮细胞，将拔牙上附着的口腔粘膜上皮从牙釉质牙骨质移行部分离，由此可以采取。在此，为了去除结缔组织等杂质，优选进行用分散酶和胰蛋白酶等酶的处理或过滤器处理。
(肠管粘膜上皮细胞)肠管粘膜上皮细胞是在大肠内窥镜下从肠管上皮活检组织中采取，或者用剖腹手术时用常规的手法采取。还可以用激光捕捉显微解剖(lazer capture microdissection)方法从组织中切除上皮细胞。本发明技术也适用于用食道、胃、十二指肠、小肠、大肠等人的所有消化道上皮细胞而制作的活体组织片。由于溃疡和炎症等人的消化道上皮受到损伤时，来自于骨髓的细胞发挥应对紧急事态的急救作用，从而上皮被修复。消化道上皮细胞的一部分也可以说是由骨髓制作。从这个意义上可以认为本发明的意义与使用角膜上皮细胞等同。通常1000个中只有少数几个由骨髓生成的上皮细胞，在胃溃疡、大肠炎等引起的消化道内面的溃疡(伤口)治愈的过程中增加50倍到100倍，确认大致10个中有1个消化道上皮细胞是来自于骨髓的。这里制作的来自于消化道粘膜上皮细胞的活体组织片，认为对于指定为难症的重症肠管感染症、溃疡性大肠炎、克隆病、贝切特病等肠道病的难治溃疡、炎症而言，促进肠管上皮的再生也是非常有意义的。也期待着对肠管变态反应的可使用性。
(气管粘膜上皮细胞)气管粘膜上皮细胞容易从气管粘膜活检组织中得到，与上述的组织相同，为了去除结缔组织等杂质，优选进行用分散酶或胰蛋白酶等酶处理或过滤器处理。气管粘膜上皮细胞通过β防御素的生物合成、释放，对各种感染症病情发展起重要的作用。而且，气管粘膜上皮对哮喘和变态反应疾病中所起的作用也高。对受到组织损伤的气管粘膜提供由本发明的气管粘膜上皮细胞制作的活体组织片，这超过应急对应，还与人工气管的提供有关。尤其羊膜上制作的片所具有的免疫抑制作用是有益的。
口腔粘膜上皮细胞和肠管粘膜上皮细胞等，特别是在采取组织之后，为了去除结缔组织等杂质，优选进行用分散酶或胰蛋白酶等酶的处理或过滤器处理。
来自于活体的细胞优选由接受活体组织片移植的受者(受者)制备。即、优选来自于活体的细胞的供体和活体移植片的受者是相同的人。通过使用这样的自体细胞，解决免疫排斥的问题。
把调制好的来自于活体的细胞播种(载置)于羊膜上(步骤b)，用于其后的培养(步骤c)“羊膜”是指哺乳动物中覆于子宫和胎盘最表层的膜，是在胶原丰富的实质组织上形成基底膜、上皮层而构成的。羊膜优选使用人的羊膜。人的羊膜例如可以在分娩时从产后得到的人胎儿膜、胎盘等上采取。具体来说，可以通过处理、精制刚刚分娩后得到的含有人胎儿膜、胎盘及脐带的一体物来调制人的羊膜。处理、精制方法可以采用特开平5-5698号中所记载的方法等公知的方法。也就是说，从分娩时得到的胎儿膜上剥离羊膜，用超声波清洗等的物理处理及酶处理等来去除残存组织，经过适当的清洗工序就可调制人的羊膜。
这样制备得到的人羊膜可以冻结保存到使用时为止。人羊膜的冻结，例如可以在-80℃下，保存在以体积比等量混合DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)和甘油等的液体中。通过冻结保存可提高操作性是勿庸置疑的，还有望降低抗原性。
羊膜可以原样使用，但优选使用经刮除处理等去除上皮的羊膜。例如，将如上述冻存的人的羊膜解冻以后，用EDTA和蛋白分解酶处理，缓解细胞间的粘附，而后用细胞刮器刮除上皮，由此能调制去除上皮的人羊膜。
利用去除上皮的人羊膜时，优选把来自于活体的细胞播种在去除上皮而裸露的面侧(即基底膜侧)。该侧面丰富地含有IV型胶原，认为所播种的来自于活体的细胞的增殖、多层化可顺利进行。
来自于活体的细胞以例如细胞密度为约1×103个/cm2或更高，优选为约1×103个/cm2～约1×107个/cm2，进一步优选为约1×104个/cm2～约1×106个/cm2的密度播种在羊膜上。
在优选的一种方式中，在予先调制好的含有人成纤维细胞的胶原基质上载置羊膜，接着在羊膜上播种来自于活体的细胞，进行培养。即，该方式中实施在胶原凝胶内培养人成纤维细胞的步骤(步骤b-1)及在上述胶原凝胶上载置羊膜后把上述来自于活体的细胞播种(载置)在该羊膜上的步骤(步骤b-2)。用该顺序制作的活体组织片含有在羊膜上增殖的来自于活体的细胞，所述羊膜载置于含有人成纤维细胞的胶原凝胶上。该方式的活体组织片可以连同胶原基质作为移植材料使用。还可以在去除胶原基质以后作为移植材料使用。或者也可以在去除胶原基质和羊膜后作为移植材料使用。
“胶原凝胶”作为人成纤维细胞的培养基质而发挥作用。作为胶原凝胶原材料的胶原种类没有特殊的限定，可以使用I型胶原、III型胶原、IV型胶原等。也可以使用多种胶原混合存在的胶原。这些胶原可以由猪、牛、羊等动物的皮肤、软骨等结缔组织，经酸溶解法、碱溶解法、酶溶解法等提取、精制。在此，为了降低抗原性，优选使用通过用胃蛋白酶或胰蛋白酶等分解酶处理来去除端肽的、所谓的组织修复胶原。作为胶原凝胶的材料可以使用来自于羊膜的、特别是来自于人羊膜的胶原。在此，所谓的来自于羊膜是指广义的以羊膜为出发原材料所得到的物质。
胶原凝胶所含有的来自于人的成纤维细胞没有特别限定，只要产生胶原则来自于哪一种组织都可以，例如可以使用由皮肤组织、口腔粘膜组织等调制的人成纤维细胞。
显示胶原基质的制作方法的具体例子。首先，用以下的顺序调制人成纤维细胞。采取皮肤，接着由皮肤剥离真皮。把真皮切细，使其附着于I型胶原被覆的试皿。静置培养，将从真皮片游离的人成纤维细胞进行传代培养。使细胞从试皿底面剥离，调配细胞悬浮液，播种于细胞培养用的试皿。适宜地冻存细胞(例如在液氮中保存)。
另外，用I型胶原调制中和胶原液(参照后述的实施例)。把它添加到培养容器(例如培养嵌套(カルチセ一インサ一ト))，在室温中静置10分钟左右，使其凝胶化。接着用上述方法将预先培养好的对数增殖期的人成纤维细胞混合于该凝胶中，使其再度凝胶化。然后静置培养。通过以上顺序得到含有人成纤维细胞的胶原基质。创通过该创意努力，形成了有必需的强度、且能够载置羊膜层和来自于活体的细胞的胶原基质，成为本发明的根本。胶原基质上载置(附着)另外准备的羊膜。
羊膜上播种的来自于活体的细胞的培养(步骤c)是在不存在异种动物细胞的情况下实施的。本发明的“在不存在异种动物细胞的情况下”是指作为培养来自于活体的细胞时的条件，不使用与该来自于活体的细胞异种的动物细胞。具体来讲，使用人的细胞(例如人皮肤表皮细胞或人角膜上皮细胞)作为来自于活体的细胞时，培养液中不存在(并存)小鼠或大鼠等人以外的动物种的细胞的条件。通过在这样的条件下实施培养，最终得到的移植材料(即活体组织片)中不会混入来自于异种的成分(包括异种细胞本身)的危险。
培养来自于活体的细胞时所使用的培养基，只要使该细胞增殖就没有特别的限定。例如，可以使用MCDB 153培养基(日水制药株式会社)、或EpiLifeTM(CASCADE公司)、改变这些培养基的氨基酸组成等制作的培养基、将常用于上皮细胞生长的DMEM(Dulbecco′s modified Eagle′smedium)和Ham′s F12培养基(Ham′s F12 medium)按规定比例混合得到的培养基等。在本发明中特别优选使用无血清且不含有来自于异种动物的蛋白质的培养基。另一方面，也可以使用添加有生长因子和抗生素等的培养基。但优选使用不含血清的培养基。即本发明的培养方法优选采用无血清培养法。这是因为可以避免因来自于血清的成分混入所引起的免疫排斥等的问题。此外，也可以在含有血清的培养基中培养，但这种情况下优选使用来自于同种的血清(培养来自于人的活体细胞时使用来自于人的血清)，或者优选使用自体血清。当然，可能的话优选使用不会引起免疫排斥反应危险的自体血清。
为了使来自于活体的细胞良好增殖，在培养步骤的过程中也可以改变培养条件。
步骤c的结果是在羊膜上来自于活体的细胞得到增殖。有必要将这样得到的细胞层的表层进行角化时(例如用皮肤表皮细胞制作皮肤表皮片或用角膜上皮细胞制作角膜上皮片时)，可以实施使细胞层的表层接触空气的步骤(步骤d)。在此，本说明书中把该步骤称为空气-上举(Air-1ifting)。该步骤d是为了形成细胞层细胞的分化以及诱导屏障功能而进行的。
该步骤可以通过如下方式进行用吸液玻璃管、移液管等把部分培养液暂时去除而使培养液表面下降，由此使细胞层最表层暂时露出于培养液外。或者，也可以通过把细胞层与羊膜一起上举，使最表层从培养液表面暂时裸露出来而进行。还可以用管子等把空气送入培养液中，使细胞层最上层与空气接触。从容易操作的观点考虑，优选用使培养液表面下降而露出细胞层最表层的方法进行。
实施步骤d的时间，即把细胞层最表层与空气接触的时间根据细胞状态和培养条件等变动，例如3天～3周左右，优选为5天～2周，进一步优选为约1周。
本发明的一种方式为在步骤c(培养步骤)以后，进一步实施(e)把上述来自于活体的细胞与上述羊膜一起回收的步骤与(f)把回收的上述来自于活体的细胞以及上述羊膜以羊膜侧朝下载置在第2羊膜上之后，培养上述来自于活体的细胞而使其增殖的步骤。通过实施步骤e和步骤f，得到在羊膜(第1羊膜)的另一面粘附另外的羊膜(第2羊膜)、且具有以一部分覆盖第1羊膜而以另一部分覆盖第2羊膜的细胞层的构筑物。此外，通过适当调配第2羊膜的大小和培养条件等，可以得到第2羊膜的全部表面由细胞层覆盖的构筑物以及第2羊膜表面的一部分由细胞层覆盖的构筑物中的任意一种。
步骤e中，回收培养后的来自于活体的细胞和作为培养基质使用的羊膜。例如，在载置于培养皿内的羊膜上培养来自于活体的细胞的情况下，培养后把羊膜从培养皿剥离，就能回收增殖的来自于活体的细胞及羊膜。另一方面，在载置于胶原凝胶上的羊膜上培养来自于活体的细胞时，培养后把羊膜从胶原凝胶上剥离，就能回收增殖的来自于活体的细胞及羊膜。
步骤f中，把回收的来自于活体的细胞和羊膜载置于另一羊膜上以后，再次培养来自于活体的细胞。这样，在本方式中实施二段阶的培养(步骤c及步骤f)。
步骤f中，首先，把回收的来自于活体的细胞和羊膜的构筑物(以下称为“细胞-羊膜构筑物”)以羊膜侧向下载置于另外准备的羊膜(第2羊膜)上。第2羊膜上也可载置多个细胞-羊膜构筑物。例如，通过步骤c把培养后回收的细胞-羊膜构筑物裁断，可以得到多个细胞-羊膜构筑物。或者准备相互独立的多个培养系，通过平行实施步骤c，也能得到多个细胞-羊膜构筑物。
把多个细胞-羊膜构筑物载置于第2羊膜上时，优选以均匀分散的状态、即要间隔一定地配置细胞-羊膜构筑物。这是因为在其后培养中(及移植于机体后)细胞增殖，细胞层向周围伸展时，第2羊膜中起初没有形成细胞层的区域可以迅速且高效地被细胞层覆盖的缘故。即，如采用如上方法，在第2羊膜上可以短时间内形成大的表面积的细胞层。这样，可以更加高效地制作细胞层。另一方面，在覆盖第2羊膜全部表面的细胞层形成之前，也可以把第2羊膜连同细胞层移植于机体的组织缺损部位，在这种情况下，移植后促使细胞层迅速地形成，得到好的治疗效果。
由于在短时间内能得到大表面积的细胞层，因此，以上的方法特别优选制作培养表皮片。应说明的是，有必要将细胞层的表层角化时，在步骤e之前、步骤e和步骤f之间、或步骤f以后，用与上述同样的方法实施空气-上举(步骤d)。
步骤f的培养可以在与上述步骤c的培养条件同样的条件下实施。即，优选在不存在异种动物细胞的情况下培养，培养基优选用无血清且不含有来自于异种动物的蛋白质的培养基。采用含血清的培养基时，优选使用来自于同种的血清(培养人的来自于活体的细胞时用来自于人的血清)，或者使用自体血清。而且，与步骤c同样，即使在步骤f中，为了很好地增殖来自于活体的细胞，在培养步骤过程中也可以变更培养条件。
本发明的活体组织片，在其制作过程中不使用来自于异种动物的细胞，以及培养来自于活体的细胞时使用羊膜作为基底，由此极大地提高了安全性。使用羊膜对提高存活性也有帮助，因此本发明的活体组织片在移植时可以获得好的治疗效果。特别是在通过使用羊膜及胶原凝胶方法制作的活体组织片中可以形成极其致密的细胞层，移植后的存活性非常高。
本发明的活体组织片被用于皮肤表皮、毛囊上皮、角膜上皮、口腔粘膜上皮、肠管粘膜上皮以及气管粘膜上皮等的再生(再建)中。例如，可以把本发明的活体组织片直接移植于机体组织缺损部。在此所说的“直接移植”是指在组织缺损部和活体组织片之间实质上不介有其它物质地移植。另一方面，也可以把本发明的活体组织片(但除了制作过程中使用第2羊膜的情况)移植于机体的组织缺损部，使得在两者之间介有其它物质。例如，可以通过与作为培养基质所用的羊膜不同的羊膜(第2羊膜)，把活体组织片移植于组织缺损部。具体来说，可以对组织缺损部移植羊膜(第2羊膜)之后，把预先制作好的活体组织片移植在该羊膜上。通过这样的移植术，羊膜以基底形式存在，因此期待着高效地增殖活体组织片中所含有的细胞，并且向周围良好地游走。即，可期待构成活体组织片的细胞层迅速伸展，获得好的治疗效果。另一方面，组织缺损部由羊膜覆盖，从而保护其免受外部的影响。该点也有助于提高治疗效果。
接着本发明基于羊膜上皮肤表皮细胞的增殖及游走变得更好的知识，提供皮肤表皮细胞的新的调制方法。本发明的调制方法的特征为，包括如下步骤即(A)把皮肤表皮细胞播种于羊膜上的步骤；(B)培养上述皮肤表皮细胞而使其增殖的步骤；以及(C)回收增殖的皮肤表皮细胞的步骤。通过本发明的调制方法，能使细胞高效增殖，细胞向周边的游走也良好。因此有可能以短时间制作大面积的细胞层(培养上皮)。在此，皮肤表皮细胞的采取及培养可以按常规方法(参照上述)进行。开且，对于回收增殖的皮肤表皮细胞，可以使用物理的方法(用细胞刮器等进行剥离)、酶的方法(用分解酶或胰蛋白酶等进行处理)等。还可以把皮肤表皮细胞以层状态原样回收，或者也可以以分离成一个一个细胞的状态进行回收。
以下，用实施例更具体地说明本发明，但本发明并不限于以下的实施例。
实施例1使用羊膜的三维培养皮肤片(培养表皮片)的制作1.羊膜的调制1-1.羊膜的采取对没有全身并发症的予定剖腹产的孕妇，事先与妇产科医生共同进行充分的说明与同意以后，在手术室剖腹产时采取羊膜。操作要注意清洁，按照手术操作洗手以后穿上手术袍。分娩前准备清洁的取羊膜用的搪瓷盘和清洗用的生理盐水。分娩后把胎盘组织移到搪瓷盘中，用手把羊膜组织从胎盤上剥离。羊膜与胎盘之间粘连强的部分用剪刀切除。
1-2.羊膜的处理羊膜处理的过程是按(1)清洗、(2)修整、(3)保存的顺序进行的。所有过程中的操作优选在清洁的通风橱内进行，所使用的容器和器具也全部灭菌后使用，培养皿等使用已灭菌的一次性(可任意处理的)器皿。将附着于所采取的羊膜上的血液成分用生理盐水清洗去除，再用足够量的生理盐水(添加0.005％氧氟沙星)清洗。接着用添加有青霉素—链霉素(50IU)的磷酸缓冲液(PBS)合计清洗3次。然后把羊膜移到培养皿内，用剪刀分割成约4×3cm左右的大小。分割后依据形状和厚度选择状态好的羊膜。
1-3.羊膜的保存在灭菌的2cc低温管内各装入lcc保存液，向其中各加1片采取、清洗后选择好的羊膜并标记后，保存于-80℃的冷冻装置中。保存液是使用了含有50％灭菌后甘油的DMEM(杜氏改良MEM培养基、GIBCOBRL公司)。保存的羊膜其使用期限设为3个月，过期则进行焚烧处理。另外，也可以不进行这样的保存处理，而实施如下的上皮处理。
1-4.羊膜上皮的处理将-80℃下保存的羊膜在室温下解冻后，用添加有青霉素—链霉素(50IU)的磷酸缓冲液(PBS)清洗2次。把清洗后的羊膜浸在0.02％EDTA溶液(Nacalai tesque公司)中(100mm培养皿)，使其在CO2孵育箱内于37℃反应1小时。反应后，用足够量的PBS清洗羊膜2次，在实体显微镜下用细胞刮器(Nunc公司、USA)以手式刮除(除去)上皮。在此，以光学和电子显微镜的操作(扫描型电子显微镜)确认，用该处理方法把一层羊膜上皮完全刮除去除了。
2.表皮角化细胞的调制2-1.皮肤的采取事先对采取部位用聚乙烯吡咯酮碘预防性消毒及进行抗真菌剂的外用涂布约3天左右后，按照皮肤活检采取小皮肤片。
2-2.表皮角化细胞的无血清培养法用剪刀从皮肤片中尽量去除脂肪组织和真皮，在杜氏磷酸缓冲液(PBS)中清洗数次。浸入70％乙醇中1分钟进行灭菌。用PBS清洗后，切成宽3mm长10mm左右的长方条，在分散酶液(分散酶II、合同酒精社、250单位/ml杜氏改良MEM培养基；DMEM)中浸泡，在4℃下静置一晚(18～24小时)。第二天用镊子把表皮与真皮剥离。剥离的真皮用于成纤维细胞的培养。把剥离的表皮用DMEM清洗，接着用PBS清洗后，在0.25％胰蛋白酶溶液中浸泡，在37℃下处理10分钟。把表皮移到装有胰蛋白酶中和液的塑料培养皿中用镊子揉搓表皮片，然后移到50ml的灭菌试管中。添加PBS，调配表皮角化细胞浮游液。计数细胞数，在1000rpm下离心5分钟，使细胞沉淀。吸出上清，把细胞用作为无血清培养基的MCDB153培养基悬浮，每100mm胶原被覆培养皿(ASAHI TECHNO GLASS、I型胶原被覆试皿4010-010)中以2～3×106细胞/10ml培养液的比例进行播种。第二天更换培养液，以后每隔1天更换培养液。细胞密度达到70～80％左右时进行传代培养。
3.成纤维细胞的调制将剥离的真皮用DMEM清洗后，用手术刀细切使一边为1～2mm。把细切得到的真皮片在I型胶原被覆试皿中以约1cm的间隔使其附着。在CO2孵育箱中静置30分钟，使其完全附着。其后，添加含有10％胎牛血清的DMEM培养基约5ml，静置7天。第7天进行第一次培养液更换。确认成纤维细胞从真皮片上游走。细胞增殖，当游走到真皮片周围5mm的阶段进行传代。用PBS清洗后，添加3ml含有0.125％胰蛋白酶、0.05％EDTA的溶液，在37℃下处理3分钟。用显微镜确认细胞从试皿底面剥离后，添加3ml胰蛋白酶抑制剂，回收细胞，移到50ml的试管里。用PBS回收残余细胞，以1000rpm离心处理5分钟使细胞沉淀，吸出上清后，添加含10％胎牛血清的DMEM培养基，调配细胞悬浮液，播种于细胞培养用试皿中。传代细胞的密度设为大约1∶3左右。适宜地冻存细胞。使用含10％甘油、20％FCS、70％DMEM的冻存液，在液氮中保存。
4.中和胶原凝胶的制作相对于I型胶原溶液(细胞基质型1A3mg/ml新田明胶)6体积，以0.1N的NaOH∶1体积、8倍浓度DMEM∶1体积、20％FCS/DMEM∶10体积的比例在4℃下制作中和胶原液(胶原的最终浓度1mg/ml)，向直径24mm的培养嵌套(Corning-Costar公司)中各添加1ml，在室温下静置10分钟，使其凝胶化。将予先培养好的对数增殖期的成纤维细胞(由经分散酶处理、剥离表皮的残存真皮，用outgrowth法培养，使用传代5-10代的细胞)调配为5×105细胞/ml、10％FCS/DMEM的浓度，相对于细胞悬浮液2体积，以中和胶原液8体积的比例进行混合，调制包含细胞的中和胶原溶液(胶原的最终浓度0.8mg/ml)。每培养嵌套中各添加该溶液3.5ml，在CO2孵育箱内(37℃、5％CO2)中静置。约30分钟后确认凝胶化。其后，加入10％FCS/DMEM到凝胶浸泡的程度(培养嵌套内侧加3ml，培养嵌套外侧加3ml)，静置培养5天。培养第2天起凝胶开始收缩，在相差显微镜下可以观察到成纤维细胞的增殖。
5.羊膜的粘附培养开始5天后胶原凝胶的底面附着于膜，但胶原凝胶上部收缩，其厚度变成2～3mm。将保存的羊膜(去除上皮的羊膜)用PBS清洗2次，再用角化细胞用培养液清洗1次。把羊膜的实质细胞侧朝下移到培养嵌套中，用镊子使其与胶原凝胶附着。用镊子展平以防止起皱，在培养嵌套的侧壁上附着羊膜的周边。移到CO2孵育箱内，在37℃下静置30分钟。
6.角化细胞的播种将2-2.中调制成的角化细胞用胰蛋白酶·EDTA从试皿上剥离、回收。以1000rpm离心5分钟，吸出上清，以200万个/0.25ml的浓度悬浮细胞。在培养嵌套内侧的羊膜上播种0.25ml的细胞懸浮液，移到CO2孵育箱内，为使角化细胞在羊膜附着，在孵育箱中静置1.5～2.0小时，然后将1ml表皮细胞增殖用培养基缓缓地添加到培养嵌套内侧，进一步向培养嵌套外侧添加1ml。第二天把表皮细胞增殖用培养基缓慢地追加到培养嵌套内侧，进一步向培养嵌套外侧追加1ml。
7.气相下培养将表皮细胞播种于羊膜后第3天实施空气曝露(空气-上举)。在用于空气曝露的维持容器中设置灭菌的滤纸，把多层化用培养基添加到浸没滤纸的程度(约9ml)。非常仔细地去除在培养嵌套内侧的培养液，把培养嵌套移到滤纸上，在CO2孵育箱中进行培养。每隔一天更换培养液。经7～14天的空气曝露完成三维培养皮肤。多层化所用培养液的调配如下。杜氏改良MEM培养基∶F-12培养基＝1∶1、钙浓度1.95mM、乙醇胺0.1mM、邻磷酸乙醇胺0.1mM、胰岛素5ug/ml、氢化可的松0.4ug/ml、L-谷氨酰胺4mM、腺嘌呤0.18mM、转铁蛋白5ug/ml、亚硒酸53nM、三碘甲状腺原氨酸20pM、丝氨酸1mM、氯化胆碱0.64mM、亚油酸2ug/ml、FCS2％。
以上操作结果所得到的培养表皮片容易从试皿底面或从胶原基质上剥离。在以往的技术中发生片收缩，因此有必要将壳制膜(Bas-ChitinW)作为支持体使用，还有发生很多破损情况，通过以上的方法可制作坚固的片，也看不到片的收缩，因不需要使用支持体。
8.组织学检查用以上的方法制作培养表皮片时，空气曝露后第7天表皮成为5～8层，可见角质层的形成，呈现出与正常人皮肤几乎一样的结构。多层化的角化细胞的组织所见是一层基底细胞样的细胞及其上面5～8层的多层化、可看到分化了的细胞结构(图1)。用3代传代的细胞制作培养表皮片时，采取皮肤后约4周可以使用培养表皮片，计算培养面的表面积，增加到数千倍。
另一方面，在空气曝露前后经时制作标本，进行HE染色。空气曝露后第9天用标本制作冻结组织切片，使用NICHIREI公司的HistofineSAB-AP试剂盒进行免疫组织化学染色，基质采用Newfuchsine。使用的抗体如下。单克隆抗体昆布氨酸5(GB3、Sera Lab)、IV型胶原(MAB1910、Chemicon)、VII型胶原(LH7.2、YLEM)、β4整合蛋白(MAB1964、Chemicon)、β1整合蛋白(P4ClO、Gibco BRL)、桥粒芯糖蛋白1(DG3.10、Progen)、γ-钙紧张素(PG5.1、Progen)、桥粒斑蛋白(DP-2.15、Progen)、E钙粘素(HECD-1、Takara)、Pan-角蛋白(Dako)、EGF受体(Ab3、Oncogene Science)；多克隆抗体インポルクリン(Biomedical Technologies Inc.)、桥粒芯糖蛋白3(Serotec)。在类天疱抗原的确认上使用类天疱疮患者血清，使用以FITC标记的抗人IgG抗体，在荧光显微镜下观察。电子显微镜检查是把空气曝露后第9天的标本用通用的方法固定、包埋，用日立公司制的透射显微镜进行观察。
在空气曝露前的HE染色所见中，角化细胞为1～2层，看不到角质层的形成，空气曝露后第4天中见到角化细胞的多层化，看到3～4层的棘层和清晰的角质层的形成。7天后棘层约增至5～8层左右，这种状态确切地维持到第14天左右。与以往培养表皮片相比，明显形成坚固的片，认为即使不使用支持物也容易操作、非常易于处理。在免疫组织学中昆布氨酸5、IV型胶原、VII型胶原、β4整合蛋白是以基底层的表皮基底细胞为中心来表达的，与体内表皮的表达形式不同。作为细胞间粘附分子E钙粘素、桥粒芯糖蛋白1、桥粒芯糖蛋白3、作为其内部蛋白的桥粒斑蛋白、γ-钙紧张素由基底层到棘层均有表达。EGF受体、β1整合蛋白从基底层到旁基底层均有表达。可见类天疱疮抗原在基底膜部中呈线状表达。归纳免疫组织所见，可见细胞间粘附分子、分化的标记几乎与体内表皮同样表达，但认为基底层的构成成分的表达不充分。电子显微镜所见是桥粒的形成良好。在基底膜部中半桥粒的形成大致良好，虽然观察到一部分基底板形成，但是片断的。可见锚纤维是片断形成的。
9.片的保存制作的培养表皮片可以使用少量的保存液与载体一同或者不含载体冻存。具体来说，首先用-80℃的冷冻装置冻存，第二天用-150℃的超低温冷冻装置保存。在-150℃下的保存可以长期保持片的形状，实际上得到很好的治疗效果。此外，也可以使用活体组织保存中使用的保存液在4℃下进行保存，这种情况优选添加抗氧化物质。
10.培养表皮片的移植以平皿上附着有剥离的片的面覆盖创面的方式进行移植，进行压迫、固定。通常用胶带固定和用绷带进行压迫即可。培养片移植也与通常的皮肤移植一样，可分类为用自身细胞的自体移植和用他人细胞的异体移植。自体移植虽然存活性优异但制作时间长。异体移植虽然没有存活性但有生物敷料的效果，也有一看就像存活的样子。由于片的保存成为可能，一旦大量制作异体培养片，则具有必需时可以立即使用的优点。由于这些理由，异体培养片主要应用于急性期的烫伤患者。在临床应用中，烫伤、下肢溃疡、先天性表皮水泡症、兽皮状母斑、斑痕、分层采皮部位的覆盖等都成为应用对象。
实施例2三维培养皮肤片(培养表皮片)的制作(不使用胶原凝胶的情况)1.羊膜、表皮角化细胞的调制与实施例1同样的步骤调制羊膜和表皮角化细胞。
2.角化细胞的播种将保存的羊膜用PBS清洗2次，再用角化细胞用培养液清洗1次。把羊膜的实质细胞侧朝下使其粘附到培养嵌套的底面上。将事先培养好的角化细胞使用胰蛋白酶·EDTA从试皿中剥离回收。以1000rpm离心5分钟，去除上清，以200万个/0.25ml浓度悬浮细胞。在培养嵌套内侧的羊膜上播种0.25ml的细胞悬浮液，移到CO2孵育箱内，在孵育箱内静置1.5～2.0小时，使得角化细胞附着于羊膜，然后把1ml的表皮细胞增殖用培养基缓慢地添加到培养嵌套内侧，进一步向培养嵌套外侧添加1ml。第二天把表皮细胞增殖用培养基向培养嵌套内侧缓慢追加，再向培养嵌套外侧也追加1ml。
3.气相下培养在羊膜上播种表皮细胞后第3天进行空气曝露(空气-上举)。在用于空气曝露的维持容器内设置灭菌的滤纸，添加多层化用培养基加到浸没滤纸的程度(约9ml)。非常仔细地去除培养嵌套内侧的培养液，把培养嵌套移到滤纸上，在CO2孵育箱内进行培养。培养液每隔一天更换。经过7～14天的空气曝露，完成三维培养皮肤。多层化所用培养基按如下调配。杜氏改良MEM培养基∶F-12培养基＝1∶1、钙浓度1.95mM、乙醇胺0.1mM、邻磷酸乙醇胺0.1mM、胰岛素5ug/ml、氢化可的松0.4ug/ml、L-谷氨酰胺4mM、腺嘌呤0.18mM、转铁蛋白5ug/ml、亚硒酸53nM、三碘甲状腺原氨酸20pM、丝氨酸1mM、氯化胆碱0.64mM、亚油酸2ug/ml、FCS2％。
4.组织学的检查用以上方法制作的培养表皮片在空气曝露后7天，表皮变为5～8层，可看到角质层的形成，呈现出与正常人皮肤大致相同的结构(图2)。
实施例3使用羊膜的三维角膜上皮片的制作1.羊膜的调制用与实施例1同样的步骤调制羊膜。
2.角膜上皮细胞的调制2-1.角膜的筹备角膜是从Northwest Lions Eye Bank(西雅图、美国)购入的供体用角膜。
2-2.角膜上皮细胞的无血清培养法把角膜移到盛有杜氏磷酸缓冲液(PBS)的培养皿中，在实体显微镜下用手术刀把缘部细切成一边为2～3mm。细切得到的缘部用PBS清洗数次，用70％乙醇浸泡1分钟进行灭菌。用PBS清洗后，用分散酶液(分散酶II、合同酒精社、250单位/ml杜氏改良MEM培养基DMEM)浸泡，在4℃下静置一晚(18～24小时)。第二天在实体显微镜下用镊子从实质上剥离上皮。将剥离的角膜上皮用DMEM清洗，接着用PBS清洗后浸入0.25％胰蛋白酶溶液中，37℃下进行10分钟处理。把表皮移到装有胰蛋白酶中和液的塑料培养皿中，用镊子拆开表皮片，移到15ml灭菌试管中。添加PBS，调配角膜上皮细胞浮游液。计数细胞数，以1000rpm离心5分钟，使细胞沉淀。吸出上清，用作为无血清培养基的EpiLife培养基悬浮细胞，每60mm胶原被覆培养皿(ASAHI TECHNOGLASS、I型胶原被覆试皿4010-020)以1～2×106细胞/5ml培养液的比例进行播种。第二天更换培养液，以后每隔一天更换培养液。细胞密度达到70～80％左右时进行传代培养。
应说明的是，在以上的方法中使用无血清培养基培养角膜上皮细胞，但也可以如下所示的步骤使用含有血清的培养基。
(1)从角膜缘部组织剥离去除内皮细胞，切除结膜。
(2)在分散酶液(分散酶I、合同酒精社、250单位/ml杜氏改良MEM培养基DMEM)中浸泡，4℃下静置一晚(18～24小时)。
(3)在0.25％胰蛋白酶溶液中浸泡，37℃下处理10分钟。
(4)显微镜下在胰蛋白酶溶液中只剥离上皮。
(5)作吸管操作，添加同量的30％FCS/DMEM进行悬浮。
(6)用PBS(-)进一步回收残留细胞，进行离心处理。
(7)用适量的培养液制作单一细胞悬浮液。
调制好的角膜上皮细胞的冻结保存条件(包括保存液组成)以及融解条件的一例如下所示。
冻结保存条件以1℃/小时的速度降低温度至-20℃，然后在氮罐中保存。
保存液的组成20％FCS/10％DMSO/DMEM融解条件尽可能快地在37℃下融解，用PBS稀释10倍。
3.成纤维细胞的调制将剥离好的真皮用DMEM清洗后，用手术刀细切成一边为1～2mm。细切得到的真皮以约1cm的间隔附着于I型胶原被覆试皿上。在CO2孵育箱中静置30分钟，使其完全附着。其后，添加含有10％胎牛血清的DMEM培养基约5ml，静置7天。第7天进行第一次的培养液更换。确认成纤维细胞从真皮中游走出来。细胞增殖，在游走到真皮片周围5mm的时候，进行传代。用PBS清洗后，添加含有0.125％胰蛋白酶、0.05％EDTA的溶液3ml，在37℃处理3分钟。用显微镜确认细胞从试皿底面剥离后，添加3ml的胰蛋白酶抑制剂，回收细胞，移到50ml的试管中。用PBS回收残留的细胞，以1000rpm离心处理5分钟，使细胞沉淀，吸出上清后，添加含有10％胎牛血清的DMEM培养基，调配细胞浮游液，向细胞培养用试皿上播种。传代的细胞密度设为大致1∶3左右。适当地冻结保存细胞。冻存液使用10％甘油、20％FCS、70％DMEM，在液氮中保存。
4.中和胶原凝胶的制作相对于I型胶原溶液(细胞基质型1A3mg/ml新田明胶)6体积，以0.1N的NaOH∶1体积、8倍浓度DMEM∶1体积、20％FCS/DMEM∶10体积的比例，在4℃下制作中和胶原液(胶原的最终浓度1mg/ml)，向直径24mm的培养嵌套(Corning-Costar公司)中各添加1m1，在室温中静置10分钟进行凝胶化。把事先培养的对数增殖期的成纤维细胞(使用经分散酶处理、由剥离了表皮的残留真皮用outgrowth法培养5-10代传代的细胞。)调配成5×105细胞/ml、10％FCS/DMEM的浓度，相对于该细胞悬浮液∶2体积，以中和胶原凝胶液∶8体积的比例进行混合，调制含有细胞的中和胶原溶液(胶原的最终浓度0.8mg/ml)。将该溶液向各培养嵌套中各添加3.5ml，放入CO2孵育箱中(37℃、5％CO2)静置。约30分钟后确认凝胶化。然后添加10％FCS/DMEM使凝胶处于浸泡的程度(培养嵌套内侧加3ml、培养嵌套外侧加3ml)，静置培养5天。培养第2天起凝胶开始收缩，成纤维细胞的增殖可在相差显微镜下观察到。
5.羊膜的粘附培养开始后5天起胶原凝胶的底面附着到膜上，但胶原凝胶上部收缩成2～3mm的厚度。将保存的羊膜用PBS清洗2次，再用角化细胞用培养液清洗1次。羊膜的实质细胞侧朝下移到培养嵌套中，用镊子使其与胶原凝胶附着。用镊子平展以防止起皱，使羊膜的周边与培养嵌套的侧壁附着。移到CO2孵育箱中，37℃下静置30分钟。
6.角膜上皮细胞的播种将2-2.中调制成的角膜上皮细胞使用胰蛋白酶·EDTA从试皿中剥离、回收。以1000rpm离心5分钟，去除上清，把细胞悬浮成200万个/0.25ml的浓度。在培养嵌套内侧的羊膜上播种0.25ml的细胞悬浮液，移到CO2孵育箱内，为使角化细胞附着到羊膜上，在孵育箱内静置1.5～2.0小时，然后缓慢添加表皮细胞增殖用无血清培养基(培养嵌套内侧加3ml、培养嵌套外侧加3ml)，进一步在液相下继续培养14天。角膜上皮细胞播种第3天将培养液更换为多层化用培养液(参照下述)，之后每2天更换培养液1次。
多层化用培养基按如下所述调配。杜氏改良MEM培养基∶F-12培养基＝1∶1、钙浓度1.95mM、乙醇胺0.1mM、邻磷酸乙醇胺0.1mM、胰岛素5ug/ml、氢化可的松0.4ug/ml、L-谷氨酰胺4mM、腺嘌呤0.18mM、转铁蛋白5ug/ml、亚硒酸53nM、三碘甲状腺原氨酸20pM、丝氨酸1mM、氯化胆碱0.64mM、亚油酸2ug/ml、FCS2％。
7.气相下培养将角膜上皮细胞播种后第14天进行空气曝露(空气-上举)。在空气曝露用维持容器中设置灭菌的滤纸，添加多层化用培养液到浸没滤纸的程度(约9ml)。非常仔细地去除培养嵌套内侧的培养液，把培养嵌套移到滤纸上，在CO2孵育箱内进行培养。第3天更换培养液。通过3天的空气曝露，完成培养角膜。
8.组织学检查空气曝露后第3天角膜上皮变为3～4层，可见角质层的形成，呈现出与正常人角膜大致相同的结构。
实施例4羊膜作为细胞培养基质的特性评价1.羊膜上的表皮角化细胞的增殖和游走试验1在含有成纤维细胞的胶原凝胶上，使其上皮存在的一侧朝上，以平展去除了上皮的羊膜的状态使其载置、附着。接着，在羊膜上放置不锈钢制的花生状环(内径6mm、高2mm)，在内部(6mm孔空穴的部分)播种表皮角化细胞悬浮液。此外，羊膜和表皮角化细胞悬浮液均按实施例1中记载的方法进行调制。
2天后取出环，用空气曝露方法开始多层化。多层化1天后和10天后观察表皮角化细胞向周围的游走。除了不使用羊膜以外，把设成相同条件的情况作为比较对象(对照组)。
多层化后第1天和第10天的培养皿内的状态示于图3中。图3的右栏为实验组(在附着于含有成纤维细胞的胶原凝胶上的羊膜上培养表皮角化细胞的情况)的结果(从上依次为第1天、第10天)。左栏为对照组(在含有成纤维细胞的胶原凝胶上培养表皮角化细胞的情况)的结果。培养皿的中央区域中观察到的圆形、点状是细胞(细胞层)。
在试验组(左栏)中，从第1天到第10天细胞层大幅度扩大。即，可知细胞良好地增殖，而且向周边的游走加快。另一方面，在对照组中，第1天和第10天中看不到细胞层的大小有明显的变化。从以上的结果明确，在羊膜上细胞的增殖率高，而且游走明显加快。
2.羊膜上的表皮角化细胞的增殖及游走试验2(与三维培养法组合)首先，按实施例1中记述的步骤实施三维培养(在粘附于胶原凝胶上的羊膜上进行表皮角化细胞的培养及其后续的空气曝露)，制作羊膜上形成细胞层的培养表皮细胞片(因空气曝露而多层化开始后第7天的物质)。另一方面，在含有成纤维细胞的胶原凝胶上，使存在其上皮的一侧朝上，以把去除上皮的羊膜展平的状态使其载置、附着。接着，把培表皮片挖出直径约8mm的圆形，载置到含有成纤维细胞的胶原凝胶上的羊膜上，静置。然后，观察表皮角化细胞层向周围扩散1天后、7天后、10天后以及14天后的情况。把以下两种情况作为比较对象即除了不使用羊膜以外设为同样条件的情况(对照组1)；以及把不使用羊膜进行三维培养而得到的细胞层(在胶原凝胶上直接播种表皮角化细胞，其后培养得到的细胞层)直接载置到含有成纤维细胞的胶原凝胶上的情况(对照组2)。在此，羊膜和表皮角化细胞悬浮液均用实施例1中记载的方法调制。
从培养开始第1天、第7天、第10天以及第14天的培养皿内的状态示于图4中。图4的左栏为实验组(在附着于含有成纤维细胞的胶原凝胶上的羊膜上载置培养表皮片，进行培养的情况)的结果(从上依次为第1天、第7天、第10天以及第14天)。中间栏为对照组1(在含有成纤维细胞的胶原凝胶上载置培养表皮片，进行培养的情况)的结果。同样，右栏为对照组2(将不使用羊膜进行三维培养而获得的细胞层载置到含有成纤维细胞的胶原凝胶上，进行培养的情况)的结果。
在图4中，在培养皿的大致中央处观察到的是细胞(细胞层)。试验组(左栏)中，随着时间的经过细胞层明显地扩大。即，可知细胞良好地增殖，而且向周边游走加快。另外，对照组1(中间栏)中可见到随着时间的经过细胞层稍许扩大，但其程度与实验组相比相差很大。此外，对照组2(右栏)中观察期间在细胞层的大小方面没有发生明显变化。如上可知，即使对于构成通过三维培养而获得的培养表皮片的细胞，由于在羊膜上培养可获得高的细胞增殖率，而且细胞向周边的游走明显加快。
3.小结从1.和2.的结果明确，在羊膜上表皮角化细胞的增殖良好，而且细胞的游走能力也良好发挥。此外，根据2.的结果，认为把在含有成纤维细胞的胶原凝胶上载置的羊膜上培养的表皮角化细胞与羊膜一起回收，把它移植到事先移植到皮肤缺损部的另外的羊膜上的方法是优异的表皮再建术。这种情况的移植技术的具体例如下所示。
(1)对于皮肤全层及至皮下组织的缺损创伤，首先进行清创(debridement)，去除坏死组织。详细地说，在缺损创伤周围注射1％Xylocaine E之后，用手术刀或剪子去除坏死组织，使溃疡面平坦化。然后移植人工真皮，进行包扎(tie over)固定。
(2)1～2周后去除植皮纱布，确认人工真皮存活。具体来说，用目视确认人工真皮附着于溃疡底面，用手指左右揉动确认没有移动。此外，目视确认人工真皮的下面没有渗出液、血液贮留。接着，在存活的人工真皮上移植羊膜(确认去除上皮成分、细菌呈阴性，把冻结保存的羊膜加温到37℃后，用灭菌生理盐水清洗2次后的羊膜)，用绷带、胶带、植皮纱布等固定。
(3)以固定状态保持数天后，确认羊膜在人工真皮上存活。具体来说，目视确认羊膜与人工真皮之间没有渗出液、血液贮留。而且确认用手指左右揉动也不移动。
(4)将预先准备好的三维培养表皮片(用羊膜和细胞层构成的物质，或只有细胞层构成的物质)以小片植皮进行移植(例如一个小片的直径为15mm)。固定3天，之后以2天1次的频率进行消毒处理(0.05％洗必泰水、消毒用聚乙烯吡咯烷酮碘液)。
(5)由于被移植到羊膜上，认为构成三维培养表皮片的细胞具有良好的增殖和游走。其结果是，细胞层迅速扩大，期待发挥更好的治疗效果。
产业上的利用可能性本发明提供的活体组织片的用途广，能够用于皮肤表皮、角膜上皮、口腔粘膜上皮、气管粘膜上皮以及肠管粘膜上皮等的再生(再建)中。其中，可以优选用于皮肤表皮或角膜上皮的再生中。
此外，还可以将本发明的活体组织片用于基因治疗中。基因治疗中大体有体内(in vivo)法和体外(ex vivo)法，前者是把基因直接导入到机体内的方法，后者是先取出细胞，导入基因后再重新回到体内的方法。鉴于目前基因治疗的技术水平，只要向培养皮肤、培养角膜上皮、培养肠管粘膜上皮片中导入基因立即向体外法发展。各种病毒载体向角质化细胞的基因导入的有效性被显实出来，特别是使用腺病毒载体的情况几乎100％地可以导入到角质化细胞中。皮肤科领域中的基因治疗中，对于以VII型胶原、昆布氨酸5等的异常为原因的先天性皮肤疱疹等的遗传病的治疗，预想用在自体培养表皮片中导入正常基因的方法将获得极有效的治疗效果。此外，对于糖尿病、血友病等缺乏体内分子而引起的全身性疾患，向角质化细胞中导入基因，使其产生缺乏分子，培养皮肤可以被用作补充的、所谓的传递体系，预计今后培养活体组织的应用会进一步发展。
应说明的是，在日本，有关异体移植由于伦理性及安全性的确认方面存在问题而一般没有普及，专注发展自体移植是目前的现状，由此认为，今后会推动三维培养活体组织的自体移植。
本发明并不限于上述发明的实施方式和实施例的说明。不脱离权利要求的范围的记述，在本领域技术人员能够想到的范围内的各种改变方式也包括在发明中。
本说明书中所示的论文、公开专利公报以及专利公报等的内容，通过援用其全部内容而引用。
权利要求
1.活体组织片，其含有在不存在异种动物细胞的情况下，于羊膜上增殖的来自于活体的细胞。
2.根据权利要求1所述的活体组织片，其特征为，在含有人成纤维细胞的胶原凝胶上载置有所述羊膜的状态下，使所述来自于活体的细胞增殖。
3.根据权利要求1或2所述的活体组织片，其特征为，使用无血清培养基，使所述来自于活体的细胞增殖。
4.根据权利要求1或2所述的活体组织片，其特征为，使用只包含来自于受者的血清作为血清成分的培养基，使所述来自于活体的细胞增殖。
5.根据权利要求1～4中的任一项所述的活体组织片，其特征为，所述来自于活体的细胞为来自于角膜上皮、结膜上皮、皮肤表皮、毛囊上皮、口腔粘膜、气管粘膜或肠管粘膜的细胞。
6.根据权利要求1～5中的任一项所述的活体组织片，其特征为，所述羊膜是去除上皮的羊膜。
7.根据权利要求1～6中的任一项所述的活体组织片，其特征为，除了增殖的细胞之外，还含有作为培养基质的所述羊膜。
8.根据权利要求7所述的活体组织片，其特征为，其是通过第2羊膜而被移植到组织缺损部的移植材料。
9.根据权利要求1～6中的任一项所述的活体组织片，其特征为，含有如下细胞，即将在不存在异种动物细胞的情况下、于载置于含有人成纤维细胞的胶原凝胶上的羊膜上增殖的来自于活体的细胞与所述羊膜一起载置于第2羊膜上，进一步使其增殖而得到的细胞。
10.活体组织片的制作方法，其包括以下步骤(a)调制来自于活体的细胞的步骤；(b)在羊膜上播种所述来自于活体的细胞的步骤；(c)在不存在异种动物细胞的情况下，培养所述来自于活体的细胞而使其增殖的步骤。
11.根据权利要求10所述的制作方法，其特征为，所述步骤b包括以下步骤(b-1)在胶原凝胶内培养人成纤维细胞的步骤；(b-2)在所述胶原凝胶上载置羊膜后，把所述来自于活体的细胞播种到该羊膜上的步骤。
12.根据权利要求10或11所述的制作方法，其特征为，进一步包括以下步骤(d)所述来自于活体的细胞增殖后，使最表层与空气接触的步骤。
13.根据权利要求11或12所述的制作方法，其特征为，进一步包括以下步骤(e)把所述来自于活体的细胞和所述羊膜一起回收的步骤；(f)把回收的所述来自于活体的细胞和所述羊膜以羊膜侧朝下载置在第2羊膜上之后，培养所述来自于活体的细胞而使其增殖的步骤。
14.根据权利要求10～13中的任一项所述的制作方法，其特征为，所述步骤c是使用无血清培养基来实施的。
15.根据权利要求10～13中的任一项所述的制作方法，其特征为，所述步骤c是使用只含有来自于受者的血清作为血清成分的培养基来实施的。
16.根据权利要求10～15中的任一项所述的制作方法，其特征为，所述来自于活体的细胞是来自于角膜上皮、结膜上皮、皮肤表皮、毛囊上皮、口腔粘膜、气管粘膜或肠管粘膜的细胞。
17.根据权利要求10～16中的任一项所述的制作方法，其特征为，所述羊膜是去除上皮的羊膜。
18.皮肤表皮细胞的调制方法，其包括以下步骤(A)把皮肤表皮细胞播种到羊膜上的步骤；(B)培养所述皮肤表皮细胞而使其增殖的步骤；(C)回收增殖的皮肤表皮细胞的步骤。
19.移植方法，其使用权利要求1～9中的任一项的活体组织片作为移植材料。
全文摘要
本发明提供有望高治疗效果而且移植时安全性高的活体组织片。通过如下方式制作活体组织片(a)调制来自于活体的细胞；(b)在羊膜上播种上述来自于活体的细胞；(c)在不存在异种动物细胞的情况下，通过培养上述来自于活体的细胞而使其增殖。作为来自于活体的细胞，使用如来自于角膜上皮、结膜上皮、皮肤表皮、毛囊上皮、口腔粘膜、气管粘膜或肠管粘膜的细胞。
文档编号A61L27/38GK1929878SQ20058000777
公开日2007年3月14日 申请日期2005年2月16日 优先权日2004年3月11日
发明者桥本公二, 白方裕司, 大桥裕一, 羽室淳尔 申请人:阿如布勒斯特有限公司, 桥本公二