组织材料和肌肉来源的基质的制作方法

专利名称：组织材料和肌肉来源的基质的制作方法
背景技术：
发明领域总的来说，本发明涉及对促进或利于细胞和组织的生长、发育和分化有用的组织制剂，包括组织细胞及其提取物。更具体而言，本发明提供了包括完整的或提取的细胞外基质和/或细胞以及细胞因子、生长因子及其他组分的肌肉来源的材料。本发明的肌肉制剂类似基底膜并且来源于基于细胞的材料。该肌肉制剂可以在体外或体内使用，尤其是在各种组织工程应用中作为细胞支架并在其他细胞培养系统中用于营养并富集一系列细胞类型，包括但不限于，前体和干细胞例如前脂肪形成细胞(pre-adipogenic ceu)。该肌肉制剂还在例如化妆品和局部治疗剂工业中用作乳膏的基础并在食品工业中用作基质或添加剂。
现有技术描述本说明书中的参考文献的目录细节也列在本说明书的结尾处。
本说明书中对任何现有技术的参考不是也不应被视为承认或任何形式的暗示所述现有技术构成任何国家的公知常识的一部分。
基底膜是将上皮细胞与基质及周围的神经、肌纤维、平滑肌细胞以及脂肪细胞分开的连续的薄片。电子显微镜分析表明基底膜的组分是网状结构的细丝，所述细丝相互作用形成膜。这个网状结构部分地由胶原IV分子的存在引起，所述胶原IV分子由分子间的二硫键互相连接(Inoue等人，J Cell Biol，971524-1539，1983)。
已知基底膜的各种组分彼此相互作用。例如，基底膜的组分之一，层粘连蛋白，与胶原蛋白IV以及硫酸乙酰肝素蛋白聚糖结合。
基底膜制剂可以提供具有细胞生长、发育和分化特征的生理学相关环境。这些制剂通常在组成和活性上是异质的。例如，某些制剂是可溶性的并缺乏作为细胞基质的适合性(Terranova等人，Cell22719-726，1980)。
一种来源于Engelbreth Holm-Swarm(EHS)鼠肉瘤的制剂是以商品名“Matrigel”[商标，BD Biosciences]出售的富含基底膜的基质并由Kleinman等人，Biochem 218188-6193，1982描述。Matrigel已成为促进细胞生长、发育和分化的有用产品。然而，在某些情况下，某些细胞与鼠类来源的Matrigel在互相作用的水平上可能存在种属特异性差异，这使得这种产品不适合用于非鼠科动物细胞例如人细胞。它还可以在非鼠科动物宿主中不正当的引发免疫应答。
依照本发明，提供在一系列细胞包括人细胞中具有特别有用的生长、形态学和分化促进活性的新型富含基底膜的组织制剂。
发明概述本说明书自始至终，除非上下文以别的方式要求，单词“包括”或“包含”将被理解为暗示包含所陈述的元件或整体或一组元件或整体但不排除其他任何元件或整体或一组元件或整体。
本发明提供细胞的以及完整的和提取的细胞外基质材料，它用作支架以支持细胞的生长、发育和分化并支持或实现细胞的形态学改变。组织材料优选来源于肌肉组织并包括包含基底膜组分的制剂。这些组分包括一种或多种下列成分，所述成分例如但不限于，层粘连蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、触觉蛋白/巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖以及一种或多种的细胞因子或生长因子，所述细胞因子或生长因子例如但不限于，表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、神经生长因子(NGF)、血小板来源的生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、转化生长因子-β(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)。一般地，组织材料包括基于细胞的制剂或完整的或提取的细胞外基质。一般利用例如尿素或SDS提取或冷冻/融解或冷冻干燥随后洗涤的方法来制备完整的或提取的无细胞制剂。一般利用例如切碎、戊二醛固定和/或在二甲基亚砜(DMSO)或其他冷冻保存剂中冷冻的技术来制备基于细胞的制剂。冷冻干燥不能保存完整的细胞但临界点干燥可以。
为了方便起见，组织材料在本文中也称为肌肉基质、肌肉基底膜基质、myomatrix、myotrix、肌肉支架、myogel和细胞培养组合物。术语“肌肉基质”为了方便简洁而使用，应理解它涵盖了基于细胞的制剂和无细胞的制剂。无细胞制剂包括完整的和提取的细胞外基质。
本发明的肌肉基质具有各种用途，例如在组织工程中促进大量组织产生用于组织修复、增加和/或替代疗法。该肌肉基质也用作工程化组织的支架，所述组织例如但不限于肌肉和脂肪。它也用作富集并营养来自适当干细胞部位的适当前脂肪形成细胞的手段。作为研究工具，本发明的肌肉基质用于细胞的生长、发育和分化研究，所述细胞例如内皮细胞、上皮细胞、神经胶质、神经元、肌细胞和前脂肪细胞。在化妆品和食品工业，该肌肉制剂用作乳膏的基础和作为食品添加剂以及在治疗上作为细胞修复组合物。
本发明的肌肉基质特别优于其他基底膜制剂，因为它诱导或以其他方式促进更加广泛范围的细胞活性并可以种类保守方式应用。
本文所使用的缩写定义于表1中。
表1缩写
附图简述附

图1的照片显示了Matrigel与各种其他组织基质的SDS PAGE比较。(从左往右)泳道1和2代表预先染色的分子量标准；泳道3和4代表商购的Metrigel(BD Biosciences)；泳道5代表大鼠肌肉基质；泳道6代表猪肌肉基质；泳道7代表人肌肉基质。所有样品均以大约10μg总蛋白浓度上样。
附图2的照片显示了(a)来自人骨骼肌的肌肉基质制剂。图(b)和(c)举例说明了肌肉基质的一种其它形式，即肌肉基质经TIPS处理形成的海绵状物。图(c)是附图2(b)中海绵状物的扫描电子显微照片。
附图3的照片是(a)猪肌肉来源的粗肌肉基质和(b)Matrigel。
附图4的显微照片显示了组织(包括脂肪组织)在大鼠中的成功产生。附图4(a)和(b)是来自大鼠组织工程腔室模型的代表性切片，所述模型在植入前用MyoGel覆盖。
附图5A的照片显示了在组织培养塑料制品上的对照前脂肪细胞，显示有分化。5B显示在Myogel上的前脂肪细胞，显示脂质积聚以及向成熟脂肪细胞的分化。插入的图显示单个细胞积聚脂质的高倍放大图像。5C显示小鼠腔室的低倍显微照片，所述腔室已充满诱导脂肪形成的肌肉提取物。
附图6的照片是不同MyoGel种类中各种ECM组分的蛋白质印迹的代表性实例。所有的箭头和数字代表分子量(MW)水平。6A涉及大鼠肌肉提取物中胶原蛋白I的免疫印迹，标记3条链(100、200、300kD)。泳道1-10是十种不同的大鼠肌肉提取物制剂。6B显示大鼠肌肉提取物中的层粘连蛋白α4(180kD)和α2(80kD片段以及在300kD处的少许弥散)。泳道1为Matrigel对照而泳道2-11为相同的大鼠肌肉提取物制剂，显示特别是关于α4链的强带。6C显示在大鼠MyoGel硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)凝胶中的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖结合，泳道1为分子量标准，泳道2为Matrigel，在200kD条带上有基底膜蛋白聚糖染色而泳道3-11为大鼠肌肉提取物。6D显示在大鼠肌肉提取物样品中结合的纤连蛋白片段，泳道1为Matrigel对照而泳道2-11为相同的大鼠肌肉提取物。
优选实施方案的详细描述本发明提供了尤其是对脂肪形成应用以及与组织工程、增加、修复和研究相关的其他应用有用的组织制剂。该制剂还在局部治疗剂、化妆品和食品工业中有着应用。材料的一种优选形式包括溶解的、提取的来源于肌肉的基底膜材料。另一形式包括含溶解的细胞和基底膜材料的完整基质。再一优选形式包括完整组织和细胞。因此，组织材料以不同的方式被称为肌肉提取物材料、肌肉基质、myomatrix、myotrix、肌肉基底膜基质、肌肉支架、myogel和细胞组合物或制剂。这些术语在本说明书自始至终互换使用但由术语“肌肉基质”涵盖。
因此，肌肉基质制剂可以是基于细胞的或完整的或提取的细胞外基质。一般利用例如尿素或SDS提取方法来制备无细胞提取物。一般通过冷冻/融解随后洗涤来制备完整的细胞提取物材料，但可以包括提取后的残渣。一般利用例如切碎、戊二醛固定和/或冷冻干燥技术来制备基于细胞的制剂。还可采用其他类似方法并且所有此类方法均由本发明涵盖。这些方法包括临界点干燥、利用除戊二醛以外的固定剂的蛋白质交联以及机械破碎新鲜肌肉。此外，存在各种提取前提取后技术，所述技术可以用于进一步增强产品或可以单独使用。这些技术包括通过各种物理化学程序(例如研磨、粉碎、TIPS等)处理材料、在冷冻且漂洗后和改变的冷冻后洗涤固定组织。甚至可以改变起始组织例如使用平滑肌或心肌。所有此类改变均在本发明的范围之内。
本发明的优选组织材料一般包括一种或多种下列组分，所述组分例如但不限于，层粘连蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、触觉蛋白/巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖以及其他组分，包括细胞因子和生长因子例如，但不限于，一种或多种EGF、bFGF、NGF、PDGF、IGF-1、TGF-β、VEGF和TNF-α。组织材料富含肌肉基底膜组分。本发明的组织材料具有一系列的效用，包括特别是组织研究和组织工程，所述组织包括但不限于脂肪、肌肉、肝脏和胰腺。它还为体外生物测定来源材料的脂肪形成潜力提供了基础，所述材料即来自不同部位的脂肪和脂肪前体细胞。该制剂进一步在局部治疗剂、化妆品和食品工业中有着应用。
相应地，本发明提供了物质组合物用于促进细胞或组织中的细胞生长，包括分化、增殖、分裂和/或形态学改变，所述组合物包括基于细胞的或无细胞提取物的肌肉组织制剂，这种制剂提供了下列组分的来源，所述组分例如但不限于，层粘连蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、触觉蛋白/巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖以及其他组分，包括细胞因子和生长因子例如，但不限于，一种或多种EGF、bFGF、NGF、PDGF、IGF-1、TGF-β、VEGF和TNF-α或其同源物。
在一个优选实施方案中，组织材料包含层粘连蛋白、触觉蛋白/巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、胶原蛋白IV、bFGF、PDGF、TGF-β、VEGF和TNF-α。
为了方便起见，术语“细胞效应”将用于涵盖细胞分化的生长和分裂、增殖以及形态学改变。
组织材料的来源可以来自任何动物并优选哺乳动物，例如，但不限于，人、非人灵长类(例如大猩猩(gorilla)、狨猴(marmoset)或猩猩(orangoutang))、家畜类动物(例如奶牛、绵羊、猪、马、驴、山羊、骆驼)、实验室试验动物(例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、仓鼠)或伴侣动物(例如狗、猫)。本发明还扩展至鸟类来源，例如鸡、鸭、鹅、火鸡以及其他家禽或猎禽，爬行动物来源例如蛇和蜥蜴以及两栖动物来源例如青蛙和蟾蜍。
在一个特别优选的实施方案中，使用来自猪、小鼠、大鼠或人的肌肉组织。
相应地，本发明的另一方面提供了包括来自哺乳动物的肌肉制剂的物质组合物，所述组合物包括(i)基于细胞或无细胞的材料；
(ii)选自列表的组分，所述列表包括一种或多种，但不限于，层粘连蛋白、胶原蛋白IV、触觉蛋白/巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖；(iii)选自列表的细胞因子或生长因子，所述列表包括一种或多种，但不限于，EGF、bFGF、NGF、PDGF、IGF-1、TGF-β、VEGF和TNF-α或其同源物；以及(iv)约1μg/ml-约100mg/ml的总蛋白含量。
提到上述组分例如层粘连蛋白、胶原蛋白IV、触觉蛋白/巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖或EGF、bFGF、NGF、PDGF、IGF-1、IGF-2、TGF-β、VEGF和TNF-α应被认为是那些组分，但不必限于那些组分，换句话说，该制剂可以包含未列出的其他组分。
组织材料的组分可以完全来源于肌肉组织或者可以在制备过程中加入额外因子，例如但不限于，额外的胶凝剂(例如盐溶质和/或糖)、细胞因子、抗生素、生长强化因子、基因表达增强子、增殖抑制剂和/或干细胞分化促进因子。
在一个实施方案中，组织材料可以被认为是在体外或体内促进细胞培养、细胞分化、去分化或生长的组合物。
在一个特别优选的实施方案中，组织材料促进细胞生长和分化，所述细胞选自特别是干细胞、上皮细胞、皮肤细胞、器官细胞和内皮细胞。
“无细胞材料”包括单独的提取基质或细胞已被溶解并大部分去除的制剂。
本发明进一步提供细胞培养组合物用于促进细胞生长和分化或实现细胞或组织形态学改变，其中所述细胞培养组合物包括一种或多种下列组分，所述组分例如但不限于，层粘连蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、触觉蛋白/巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖以及其他组分，包括细胞因子和生长因子，例如但不限于，一种或多种EGF、bFGF、NGF、PDGF、IGF-1、IGF-2、TGF-β、VEGF和TNF-α或其同源物，并且细胞培养组合物聚合成凝胶。
“细胞因子”包括选自所提供列表的单个或多个细胞因子。当然，也可存在或包括其它细胞因子。同样地，可以存在层粘连蛋白、胶原蛋白IV、触觉蛋白/巢蛋白和/或硫酸乙酰肝素蛋白聚糖之一或可以存在这些组分的两种或多种。还可存在或添加其它细胞外基质材料。
聚合作用一般发生在约15℃-约50℃的温度，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50℃。还可以采用波动温度。
术语“凝胶”以其最广泛的含义使用并包括半流体、半硬式材料、可变形的材料、稠密的液体、乳膏、固体支持体或其组合，包括适合用作食品添加剂的材料。
在一个优选的实施方案中，存在的细胞因子的量如下bFGF约0.3ng/ml-约4ng/ml例如0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0ng/ml。
PDGF约1pg/ml-约3000pg/ml例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1110、1120、1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190、1200、1210、1220、1230、1240、1250、1260、1270、1280、1290、1300、1310、1320、1330、1340、1350、1360、1370、1380、1390、1400、1410、1420、1430、1440、1450、1460、1470、1480、1490、1500、1510、1520、1530、1540、1550、1560、1570、1580、1590、1600、1610、1620、1630、1640、1650、1660、1670、1680、1690、1700、1710、1720、1730、1740、1750、1760、1770、1780、1790、1800、1810、1820、1830、1840、1850、1860、1870、1880、1890、1900、1910、1920、1930、1940、1950、1960、1970、1980、1990、2000、2010、2020、2030、2040、2050、2060、2070、2080、2090、2100、2110、2120、2130、2140、2150、2160、2170、2180、2190、2200、2210、2220、2230、2240、2250、2260、2270、2280、2290、2300、2310、2320、2330、2340、2350、2360、2370、2380、2390、2400、2410、2420、2430、2440、2450、2460、2470、2480、2490、2500、2510、2520、2530、2540、2550、2560、2570、2580、2590、2600、2610、2620、2630、2640、2650、2660、2670、2680、2690、2700、2710、2720、2730、2740、2750、2760、2770、2780、2790、2800、2810、2820、2830、2840、2850、2860、2870、2880、2890、2900、2910、2920、2930、2940、2950、2960、2970、2980、2990、3000pg/ml。
TGF-β约1pg/ml-约2000pg/ml例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1110、1120、1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190、1200、1210、1220、1230、1240、1250、1260、1270、1280、1290、1300、1310、1320、1330、1340、1350、1360、1370、1380、1390、1400、1410、1420、1430、1440、1450、1460、1470、1480、1490、1500、1510、1520、1530、1540、1550、1560、1570、1580、1590、1600、1610、1620、1630、1640、1650、1660、1670、1680、1690、1700、1710、1720、1730、1740、1750、1760、1770、1780、1790、1800、1810、1820、1830、1840、1850、1860、1870、1880、1890、1900、1910、1920、1930、1940、1950、1960、1970、1980、1990、2000pg/ml。
EGF约0ng/ml-约100ng/ml例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100ng/ml。
VEGF约1pg/ml-约3000pg/ml例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1110、1120、1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190、1200、1210、1220、1230、1240、1250、1260、1270、1280、1290、1300、1310、1320、1330、1340、1350、1360、1370、1380、1390、1400、1410、1420、1430、1440、1450、1460、1470、1480、1490、1500、1510、1520、1530、1540、1550、1560、1570、1580、1590、1600、1610、1620、1630、1640、1650、1660、1670、1680、1690、1700、1710、1720、1730、1740、1750、1760、1770、1780、1790、1800、1810、1820、1830、1840、1850、1860、1870、1880、1890、1900、1910、1920、1930、1940、1950、1960、1970、1980、1990、2000、2010、2020、2030、2040、2050、2060、2070、2080、2090、2100、2110、2120、2130、2140、2150、2160、2170、2180、2190、2200、2210、2220、2230、2240、2250、2260、2270、2280、2290、2300、2310、2320、2330、2340、2350、2360、2370、2380、2390、2400、2410、2420、2430、2440、2450、2460、2470、2480、2490、2500、2510、2520、2530、2540、2550、2560、2570、2580、2590、2600、2610、2620、2630、2640、2650、2660、2670、2680、2690、2700、2710、2720、2730、2740、2750、2760、2770、2780、2790、2800、2810、2820、2830、2840、2850、2860、2870、2880、2890、2900、2910、2920、2930、2940、2950、2960、2970、2980、2990、3000pg/ml。
TNF-α约0pg/ml-约1000pg/ml例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000pg/ml。
在一个实施方案中，缺少IGF-1。
因此本发明提供了基于细胞或无细胞制剂形式的组织来源的材料，用于细胞生长和发育并用于实现细胞或组织形态学改变，所述材料来源于人、非人灵长类、家畜动物、伴侣动物、鸟类、爬行动物或两栖动物的肌肉并包括一种或多种选自列表的细胞因子和/或生长因子，所述列表包括，但不限于，约1.0ng/ml-约4ng/ml bFGF、约1pg/ml-约3000pg/ml PDGF、约1pg/ml-约2000pg/ml TGF-β、约1pg/ml-约3000pg/ml VEGF、约0pg/ml-约1000pg/ml TNF-α以及约0ng/ml-约100ng/ml EGF，所述材料进一步包括一种或多种组分，所述组分选自，但不限于，层粘连蛋白、胶原蛋白IV、触觉蛋白/巢蛋白和/或硫酸乙酰肝素蛋白聚糖。
组织材料优选为具有类似基底膜和/或其组分的层状结构的凝胶形式。组织材料可以是凝胶形式或者它可以是可聚合为凝胶形式的“前体”形式或者它可以是基于细胞的。便利地，当组织材料是前体形式时，它是可重建为凝胶或基质形式的。甚至更便利地，重建前体的基质形式在本文中被称为“肌肉基质”。凝胶形式或前体形式(包括基于细胞制剂)的本发明肌肉基质也可被制成或掺合到珠、海绵、乳膏等中。尽管凝胶形式是制剂的一种优选形式，本发明还预期了具有与凝胶类似“胶凝作用”特征的基于细胞的制剂。
相应地，本发明的肌肉基质用于促进各种细胞的细胞生长和分化并实现细胞或组织形态学改变。上皮细胞、内皮细胞、神经细胞和干细胞特别响应肌肉基质而生长和分化。它还帮助细胞粘附以及帮助细胞生长、发育、分化和/或增殖，所述细胞选自，但不限于，神经元、肝细胞、支持细胞、毛囊、甲状腺细胞等。如上所述，“肌肉基质”应被理解为涵盖基于细胞的制剂和无细胞的制剂。
细胞可以在体外的肌肉基质上进行培养并随后回到它们所源自的动物或免疫抑制或组织相容的动物中。在这个上下文中，“动物”包括人、非人哺乳动物、家畜动物、伴侣动物或鸟类、爬行类或两栖类。同样地，肌肉基质可在特定位点或在腔室内或其他植入身体的支架中单独用于体内促进细胞生长或组织生长。
本发明的肌肉基质一般在低温下制备，例如约1℃-约10℃例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10℃或在这个范围内的非整数温度。4℃的温度特别有用。收集新鲜肌肉。约10-约100g便于处理。从肌肉上剪去可见脂肪并让组织在缓冲液中(例如NaCl缓冲液)接触蛋白酶抑制剂。为了制备无细胞提取物，对所得到的组织进行匀浆处理并随后进行离心以去除上清液。将组织沉淀重悬浮在缓冲液(例如NaCl)中并重新进行匀浆处理。重复这两个洗涤步骤。在最后一次洗涤后，在尿素缓冲液中重悬浮沉淀。组织匀浆搅拌过夜并完成一系列洗涤，每次收集上清液。随后用纱布过滤上清液以去除游离的漂浮脂肪。随后对溶剂(例如氯仿)透析过夜以灭菌材料。将溶剂换成缓冲液并继续透析以去除溶剂。最后一次透析后，使用的最终缓冲液是DMEM或其等同物。将所得到的前基质材料进行分配并保存在-20℃。
需要时，取回前基质材料的样品并在约20-约50℃例如大约37-42℃进行孵育，在所述温度下基质聚合成凝胶状形式。还可以加入帮助胶凝作用的添加剂，包括但不限于血浆。
利用SDS也可制备提取物。可替代地，可以利用冷冻干燥/融解随后洗涤来制备制剂。这被称为完整基质。利用切碎、冷冻干燥和/或戊二醛固定可以很方便地制备基于细胞的制剂(即完整组织)。
本发明的组织提取物材料或肌肉基质可以被包装为前基质或基质的形式出售，并且可以与关于如何使用的说明书一起供应。附加组分可以在包装或试剂盒内并且在使用前被包括或在使用时被混合。
如上所述，肌肉基质特别适合于培养各种细胞，所述细胞包括但不限于脂肪细胞、3T3-L1细胞、HUVEC、MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞、PC-12细胞和NG-108神经细胞以及一系列通过标准程序分离的前脂肪细胞。
肌肉基质还用于体外生物测定来源材料的脂肪形成潜力。该制剂还具有体外生物测定其他基底膜响应细胞类型的分化以及许多发病状态例如癌症和糖尿病的能力，所述细胞例如上皮细胞、神经元、内皮细胞。
根据这个方面，对肌肉基质实施体外测定以测定诱导脂肪形成的组成成分，包括细胞和/或分子组分。测定包括用一层或多层待测的潜在脂肪形成组分例如肌肉基质的提取物覆盖在容器表面，接种具有潜力以经历脂肪形成分化的细胞并随后检查脂肪形成。可替代地，将肌肉基质覆盖在表面上并添加其他化合物并随后检查该系统中增强或减少的脂肪形成。在另一实施方案中，将具有潜力经历脂肪形成分化的细胞维持在悬浮培养中并向培养基中补充待测的潜在脂肪形成组分例如肌肉基质的提取物或级分。细胞悬浮的优点是允许从培养基中快速分离细胞以测定它们是否已经历分化。可替代地，测定包括产生包含潜在脂肪形成组分或提取物的三维支架，接种具有潜力经历脂肪形成分化的细胞并随后检查脂肪形成。因此，本发明的测定系统还可具有附加优点，所述优点为提供或选择或开发用于组织工程的最优化前脂肪细胞群体。测定可以方便地在体外适当的容器中进行。在这种情况下，可以用细胞材料制剂覆盖在基质的表面。容器还可与使用说明书一起被包装出售。
相应地，本发明预期体外测定调节脂肪形成的组分、提取物或细胞系统，所述测定包括检查肌肉制剂以鉴别具有脂肪细胞分化倾向的细胞群，产生或获得潜在调节脂肪形成的组分或提取物或细胞系统，将所述具有脂肪细胞分化倾向的细胞群接种在所述组分或提取物上，将所述细胞孵育足够时间使脂肪形成产生，并随后在所述细胞中检查脂肪细胞的分化。在这个上下文中的“细胞系统”具有与基于细胞的制剂相同的含义。
在某些实施方案中，潜在调节脂肪形成的组分或提取物或细胞系统促进脂肪形成。在其他实施方案中，调节脂肪形成的组分或提取物或细胞系统抑制脂肪形成。
“调节”是指直接或间接地增加或减少脂肪形成水平。
可以获得或产生潜在调节脂肪形成的组分或提取物或细胞系统层。可替代地，可以获得或产生包含潜在调节脂肪形成的组分或提取物或细胞系统的三维支持基质。在某些实施方案中，可以将具有潜力经历脂肪细胞分化的细胞维持在悬浮培养中并向培养基中补充潜在调节脂肪形成的组分或提取物。术语“层”包括两层或多层。本方法扩展至向肌肉基质中加入潜在脂肪形成促进剂。
本发明的再一方面提供了产生适合移植到受体内的供体血管化组织的方法，所述方法包括制造包含功能循环系统的血管蒂并且有组织或组织提取物或其组分注入、附着或以其他方式与所述血管蒂关联；将血管蒂结合在支持基质内部和/或上方；在支持基质中接种被分离的细胞或组织碎片，所述细胞或组织利用体外测定鉴别为促进脂肪形成；或某些其他有用的端点，将包含血管蒂的支持基质植入到受体某个部位，在所述部位上功能循环系统与局部的动脉或静脉吻合；并将支持基质留在植入部位足够的时期以允许血管化新组织生长，其中根据特定的标准选择注入材料或接种材料，例如，通过测定法测定时它促进脂肪形成，所述测定法包括检查组织或组织提取物以鉴别具有脂肪形成分化倾向的细胞群，产生或获得潜在促进脂肪形成的组分或提取物，将具有脂肪细胞分化倾向的细胞群接种在所述组分或提取物上，将所述细胞孵育足够时间使脂肪形成发生并随后在所述细胞中检查脂肪细胞的分化。
在一个优选实施方案中，血管蒂包括附着脂肪或其他脂肪组织或包含下列细胞的组织，所述细胞有成肌细胞、成纤维细胞、前脂肪细胞和脂肪细胞、心肌细胞、角质化细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、软骨细胞、周细胞、骨髓来源的基质前体细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞或造血干细胞、许旺(Schwann)细胞及外周和中枢神经系统的其他细胞、嗅细胞、肝细胞及其他肝脏细胞、肾小球系膜及其他肾细胞、胰岛β细胞及导管细胞、甲状腺细胞、其他内分泌器官的细胞以及上述细胞的球状体。在选择之前，所有这些细胞在体外测试其在基质上生长/存活的潜力或分化成其他有用组织的能力例如脂肪形成潜力。血管蒂上附着组织的存在进一步促进新脂肪组织在支持基质内部或周围生长。在一个替代实施方案中，组织提取物或组织的重组、合成或纯化组分与血管蒂相联。例如，在一个优选实施方案中，这些组分和提取物来源于基质材料并在体外检查脂肪形成潜力。
基质被允许设定并且在完全培养基(例如含FCS的DMEM)或分化培养基(补充有1μM地塞米松、胰岛素、吲哚美辛和IBMX的完全培养基)的存在下将有脂肪细胞分化能力的细胞覆盖在单层基质上。经过14天的时间段观察到脂肪形成。适当的脂肪细胞的实例包括3T3-L1细胞或通过标准程序分离的前脂肪细胞。
因此，本发明预期体外测定促进脂肪形成的组分或提取物，所述测定包括在容器表面产生或获得来自肌肉基质的潜在脂肪形成提取物层，在所述层上接种具有脂肪细胞分化倾向的细胞群，将所述细胞孵育足够时间使脂肪形成发生并随后在所述细胞中检查脂肪细胞的分化。
在另一实施方案中，测定在三维支持基质中进行，所述三维支持基质可以基本上由肌肉基质构成或包含由肌肉基质覆盖的支架，关于这点执行本领域技术人员已知的三维细胞培养技术，例如转瓶技术(Mueller-Klieser J Cancer Res Clin Oncol 13101-122，1986)、流体镀层技术(Yuhas，等人，Cancer Res 373639-3643，1977)。三维细胞培养技术的另一实例是经过特别改造的旋转培养瓶，通过围绕水平轴旋转流体填充的培养瓶以使重力矢量随机化，同时用最小的流体剪切力悬浮细胞和细胞团块。这些装置已在美国专利号5,153,131；5,153,132；5,153,133；5,153,034,和5,155,035中得到描述。
三维基质的优点之一是它维持培养细胞活性增殖的时期比单层系统更长。这可能部分由于三维基质的面积增加导致细胞活性增殖周期延长。基质提供维持培养细胞长期活性增殖所需的支持物、生长因子和调节因子。通过向支持物本身加入蛋白质、糖蛋白、糖胺聚糖、细胞基质以及其他材料或通过用这些材料覆盖支持物可进一步增强在该支持物存在下的细胞生长。基质的三维性允许形成有助于细胞成熟和迁移的微环境。当生长在这种三维系统中时，增殖细胞成熟并适当地分离以形成类似于体内的成熟组织组分。
为了使三维结构能够维持活细胞的活性，三维基质应当展示适当的空间和组成特性。此类基质包括水凝胶或多孔基质例如基于纤维的或海绵样基质。三维基质中常用材料为天然聚合物或“生物基质”、合成聚合物以及无机合成物。在本实施方案中，该方法预期三维基质用于体外测定时，基质的生物相容性不是特别重要。
生物基质的优选实例是从肌肉基质提取的那些或与肌肉基质相似的那些或具有包含肌肉基质的细胞系统。
本发明进一步预期了肌肉基质在促进细胞生长的组合物产品中的用途。本发明的肌肉制剂还有利于基于所选择的对肌肉制剂特异的生长和形态学特征对复杂的细胞混合物选择性纯化具体细胞类型(例如前脂肪细胞)。
冠词“a”和“an”在本文中用来指超过一个(即至少一个)语法目标的物品。例如，“组分”指一个和超过一个的组分。
通过下列非限制性实施例来进一步描述本发明。
实施例1基质提取I收集来自新近宰杀的动物(大鼠和猪)或来自经历整形外科手术的患者的肌肉样品。所有的样品均在适当的伦理委员会批准下并完全征得同意进行收集。所有程序步骤均在冰上或在4℃进行。
肌肉被收集、称重并在提取基质前剪去脂肪。样品随后被洗涤并在加入蛋白酶抑制剂(0.5mM PMSF、2mM EDTA、0.1M EACA、2mM NEM)的冰冷的3.4M NaCl缓冲液中匀浆。组织匀浆随后在4℃ 10,000rpm离心15分钟，随后弃去上清液并且在3.4M NaCl缓冲液中重悬浮沉淀。这个步骤重复2-3次。
沉淀随后在与原始组织体积相等体积的2M尿素缓冲液中重悬浮，匀浆并在4℃搅拌过夜。这之后，提取物在4℃ 14,000RPM离心30分钟并保存上清液。沉淀在原始体积一半的2M尿素缓冲液中重新匀浆随后重复离心步骤。随后将上清液与以前保存的上清液合并并进行过滤。
提取物随后在0.05M Tris/0.15M NaCl缓冲液(TBS)中4℃对0.5％ v/v氯仿透析过夜作为灭菌步骤。提取物随后只对TBS进行几次透析，随后为DMEM进行透析。等分量的提取物保存于-20℃。
实施例2基质提取II所有步骤均在4℃或在冰上进行。收集尽可能新鲜的肌肉组织(优选最少约20-30g)并称重。在钢制解剖盘中尽可能快地从肌肉上剪去所有可见脂肪。以2∶1的体积比(例如100ml缓冲液对50g肌肉)往冰上的烧杯中加入含蛋白酶抑制剂的冷的3.4M NaCl缓冲液并加入肌肉。样品随后彻底匀浆。肌肉组织匀浆在4℃ 10,000RPM离心15分钟。随后弃去上清液并在等量的3.4M NaCl缓冲液中将沉淀重悬浮且重新匀浆。这个步骤重复2次，使得在NaCl中总共洗涤3-4次。第3次洗涤后沉淀在1∶1体积含0.5M NaCl、蛋白酶抑制剂的50mMTris-HCl(pH7.4)中重悬浮并匀浆(例如50ml对50mg肌肉)。在4℃利用磁力搅拌器将样品旋转过夜。样品随后在4℃ 14,000RPM离心30分钟，弃去上清液并保存样品。沉淀随后在含2.0M盐酸胍)、0.2mM二硫苏糖醇的50mM Tris-HCl(pH7.4)中进行匀浆。将组织匀浆搅拌过夜并在4℃ 14,000rpm离心30分钟并去除上清液并保存。
所有下述步骤均在两种上清液中进行，所述两种上清液在这些步骤中自始至终保持分离。
通过纱布过滤上清液以去除游离的漂浮脂肪等。提取物在磁力搅拌器上4℃对1-2升的TBS缓冲液(5mls/升)中的0.2％ v/v氯仿透析过夜。这是一个灭菌步骤。将缓冲液换成干净的TBS并透析至少8小时。这个步骤重复3次。更换透析缓冲液时，将管末端旋转数次以确保混匀。最后一次TBS透析后，将缓冲液换成DMEM并透析过夜。较稠的溶液例如猪肌肉基质需要更长时间。随后将这两种提取物混合在一起产生不同结构的基质以便改进胶凝作用。随后将样品等分至无菌试管中。在流通橱内在冰上执行这个操作。样品随后保存于-20℃。
实施例3SDS-PAGE通过二喹啉甲酸(BCA蛋白质测定试剂盒)测量蛋白质浓度。基质样品在SDS-PAGE凝胶上分离之前在Laemmli溶液(Laemmli，Nature227680-685，1970)中制备成0.5-1.0mg/mL并煮沸5分钟。在4-12％w/v梯度的聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)上，将15μL体积的样品加入泳道中并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。凝胶在200V的恒压下电泳50分钟，这之后取下凝胶并用考马斯亮蓝(BrilliantBlue)染色或转移用于免疫印迹分析。
实施例4免疫印迹分析如实施例3所述在SDS-PAGE凝胶上分离蛋白质并将未经染色的凝胶转移至硝酸纤维素膜片。依照湿法转移程序通过施加100V恒压1小时，起始电流为220mA，进行转移。首先在含5％w/v脱脂干乳粉、0.1％v/v Tween 20的Tris缓冲盐水(TBS)(TTBS)中将印迹孵育过夜以减少非特异性反应。第一抗体在室温下孵育1小时，用TTBS漂洗3次并随后用结合过氧化物酶的第二抗体(1∶5000-1∶10000)孵育1小时。在免疫活性蛋白通过增强化学发光型免疫印迹检测系统(Amersham Pharmacia)显现之前，印迹再次在TTBS中漂洗3次。使用六种第一抗体HSPG 1∶5000(Seikagaku Corporation)、层粘连蛋白1∶5000(Dako)、巢蛋白1∶10000(Chemicon)、以及胶原蛋白IV 1∶10000(Dako)、纤连蛋白1∶10000以及SPARC 1∶10000。
实施例5肌肉基质分析对肌肉基质与来自BD Biosciences的制剂(Matrigel)进行组分比较分析且结果显示于表2、3和4中。
生长因子的鉴定利用QuantikineELISA试剂盒(R&D System)并根据试剂盒说明书测量生长因子/细胞因子水平。待测的生长因子包括血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、白血病抑制因子(LIF)以及神经生长因子(Chemicon试剂盒)(NGF)。简言之，将提取物进行稀释(1∶5-1∶10)并与标准和对照一起在抗体涂层板中孵育2-3小时。对板进行洗涤并加入结合辣根过氧化物酶(HRP)的多克隆第二抗体。孵育后，去除多余结合物并且用颜色底物对板进行第3次孵育。加入终止溶液后，利用微板阅读器(Axion，Mutliskan，USA)来读板，所述微板阅读器的吸光度设定在λ450nm处、校正读数设定在λ550nm处。利用Genesis 2.0板阅读软件(详细的)执行所有的测量和计算，并将数值转化成pg/mg基质。表2包含如厂商所报告的以及按照ELSA测量的Matrigel(注册商标)中的生长因子水平。
表2
BD Full＝商购Matrigel(注册商标)BD GFR＝生长因子减少的Matrigel(注册商标)KK Full＝我们自己的Matrigel(注册商标)制剂KK GFR＝我们自己的生长因子减少的制剂NR＝未记录表3和表4包含按照ELISA测量的由大鼠、猪和人制成的肌肉基质中的生长因子水平。表3代表数值范围。表4代表数据的平均值和平均标准误(SEM)。
表3
表4
#＝一个非常高的读数-其他所有读数均低于339pg/mg。
##对这些样品进行检验并察看跨种结合是否存在NB使用这些ELISA在这些样品中没有观察到结合NM未测量总蛋白浓度的测量利用二喹啉甲酸测定(Amersham Biosciences Corporation NewJersey，USA)来测量基质的总蛋白水平。样品以1∶10稀释进行测量并依照试剂盒说明书对照一系列BSA标准进行测定。孵育后利用分光光度计t在562nm波长处分析样品。大鼠和猪肌肉基质每种分析10个样品，而人肌肉基质则分析6个。表5显示按照BCA总蛋白测定测量的肌肉基质和Matrigel(注册商标)中的总蛋白水平表5
附图1至4中也描述了肌肉基质。附图1提供了Matrigel与其他组织基质的SDS-PAGE比较。附图2是来自骨骼肌的肌肉基质的照片。附图3是猪肌肉来源的肌肉基质的照片。附图4的显微照片显示了大鼠中组织的成功产生。附图5。
ECM组分的测量1，9-二甲基亚甲基蓝、Direct Red 80(Sirius Red)、硫酸软骨素A、木瓜蛋白酶、二硫苏糖醇和胶原蛋白I全部购自Sigma-Aldrich。硫酸化糖胺聚糖(GAGs)通过与染料1，9-二甲基亚甲基蓝(DMMB)的沉淀作用在MyoGel样品中被定量。通过加入等体积的包含0.6mg/ml木瓜蛋白酶、2mM EDTA和4mM DTT的40mM磷酸钠缓冲液(pH6.8)来消化干扰蛋白，随后在60℃孵育60分钟。(Farndale等人Biochimica ET Biophysica Acta 882173-177，1986)。等分量(100uL)的每种样品随后与1mL的DMMB溶液(在0.2M盐GuHCl、1g/L甲酸钠和1ml/L甲酸中的16mg/L DMMB)孵育30分钟，并在旋转轮上连续混合。GAG-DMMB复合物沉淀后，通过离心(10,000×g 10分钟)将不可溶解的材料与上清液分开并去除上清液。通过添加1mL的解络缓冲液(50mM 乙酸钠缓冲液，pH6.8，含10％正丙醇和4M GuHCl)从沉淀中释放出染料(Barbosa等人Glycobiology 13647-653，2003)。随后在微板阅读器(Multiskan RC；Labsystems)中测定缓冲液的吸光度(λ650nm)。采用硫酸软骨素A作为标准。
将层粘连蛋白从1mL肝素亲和层析柱(Amersham Biosciences；Uppsala，Sweden)中洗脱后对其进行评估(Talts等人EMBO J18863-870，1999)(Talts等人J Biol Chem 27535192-35199，2000)。简言之，通过与等体积的含4M GuHCl+2mM DTT的50mMTris-HCl(pH7.4)在4℃孵育24小时来溶解MyoGel样品。对50mMTris-HCl(pH7.4)+0.15M NaCl透析过夜后，将1mL的等分量应用于亲和层析柱。用5mL的50mM Tris-HCl(pH7.4)+0.15M NaCl从柱中冲洗出非层粘连蛋白，并用5mL的含0.5M NaCl的50mMTris-HCl(pH7.4)洗脱出层粘连蛋白。随后用Bio-Rad蛋白质测定法利用如上所述的微板微测定程序来评估层粘连蛋白通过其与多偶氮染料Sirius Red的沉淀作用来测定胶原蛋白(Marotta and Martino Analytical Biochemistry 15086-90，1985)。等分量的MyoGel(100μL)与1mL的含50μM Sirius Red的0.5M乙酸在室温下孵育30分钟。离心(10,000×g 10分钟)后，在微板阅读器中测定上清液的吸光度(λ550nm)。使用来自大鼠尾部的胶原蛋白I作为标准。
通过ELISA(Echelon，UT，USA)按照试剂盒说明书来测量透明质素的水平。
表6和7显示由大鼠、猪和人制成的肌肉基质的细胞外基质组分。表6代表数值范围，而表7代表数据的平均值和平均标准误(SEM)。
表6
表7
SDS-PAGE/免疫印迹分析基质样品在SDS-PAGE凝胶上分离之前在Laemmli溶液(Laemmli，1970，)中制备成0.5-1.0mg/mL并煮沸5分钟。在3-8％或4-12％梯度的聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)上，将10μL体积的样品加入泳道中并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。凝胶在200V的恒压下电泳45分钟，这之后取下凝胶并用考马斯亮蓝染色或转移用于免疫印迹分析。
对于免疫印迹，如上所述在SDS-PAGE凝胶上分离蛋白质并将未经染色的凝胶转移至硝酸纤维素膜片。通过湿法转移程序施加30V恒压1小时进行转移。转移后，在含5％脱脂干乳粉(Homebrand，SafewaysAUS]、0.1％ Tween 20的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(TPBS)中将印迹孵育过夜以减少非特异性结合。印迹在室温下在第一抗体中孵育1小时，用TPBS漂洗3次并随后与适合于所用一抗的使用适当的红外标记的第二抗体(Molecular Probes，UT，USA或Rocklands，CA，USA)(1∶10000)孵育1小时。在免疫活性蛋白通过Odyssey红外检测系统(Licor Biosciences，USA)显现之前，印迹再次在TPBS中漂洗3次。使用的第一抗体包括抗HSPG 1∶5000(Seikagaku Corporation，Japan)、层粘连蛋白α4和α2 1∶1000(Dr Lydia Soroken友情赠与)、巢蛋白1∶3000(Chemicon，USA)、纤连蛋白1∶5000、胶原蛋白I 1∶10000、胶原蛋白IV 1∶10000以及SPARC 1∶10000(Dr HKleinman友情提供，NIH USA)。
附图6是不同MyoGel种类中各种ECM组分的蛋白质印迹的代表性实例。所有的箭头和数字代表分子量水平。6A涉及大鼠肌肉提取物中胶原蛋白I的免疫印迹，标记3条链(100、200、300kD)。泳道1-10是十种不同的大鼠肌肉提取物制剂。6B显示大鼠肌肉提取物中的层粘连蛋白α4(180kD)和α2(80kD片段以及在300kD处的少许弥散)。泳道1为Matrigel对照而泳道2-11为相同的大鼠肌肉提取物制剂，显示特别是关于α4链的强带。6C显示在大鼠MyoGel HSPG凝胶中结合的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，泳道1为分子量标准，泳道2为Matrigel，在200kD条带上有基底膜蛋白聚糖染色而泳道3-11为大鼠肌肉提取物。6D显示大鼠肌肉提取物样品中结合的纤连蛋白片段，泳道1为Matrigel对照而泳道2-11为相同的大鼠肌肉提取物。
体外细胞分化测定利用大鼠附睾的前脂肪细胞开展测定。在24孔板中执行用于形态学分析的测定。在24孔板中加入300μl细胞外基质(ECM)/孔。基质处于37℃ 20-30。随后，向每个孔中加入细胞(对于24孔培养板为0.3×106细胞/孔)。37℃/5％CO2下过夜允许细胞附着在基质上。经过14天的时间段(伴随每4-5天照相)观察到分化。使用单独接种在组织培养塑料制品上的细胞作为对照。
附图5显示了在组织培养塑料制品上的对照前脂肪细胞，显示无分化。5B显示在MyoGel上的前脂肪细胞，显示脂质积聚以及向成熟脂肪细胞的分化。插入的图显示单个细胞积聚脂质的高倍放大图像。5C显示小鼠腔室的低倍显微照片，所述腔室已充满诱导脂肪形成的肌肉提取物。
本领域技术人员将理解本文所述的本发明容许除具体描述的那些之外的改变和修改。还应当理解本发明包括所有此类改变和修改。本发明还包括本说明书中个别或共同提及或暗示的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何及所有任何两种或多种所述步骤或特征的组合。
BIBLIOGRAPHYBarbosa et al.Glycobiology 13647-653，2003Farndale et al.Biochimica ET Biophysica Acta 882173-177，1986Inoue et al.，J Cell Biol，971524-1539，1983Kleinman et al.，Biochem 216188-6193，1982Laemmli，Nature 227680-685，1970Marotta and Martino Analytical Biochemistry 15086-90，1985Mueller-Klieser，J Cancer Res Clin Oncol 13101-122，1986Talts et al.EMBO J 18863-870，1999Talts et al.J Biol Chem 27535192-35199，2000Terranova et al.，Cell 22719-726，1980Yuhas，et al.，Cancer Res 373639-3643 197权利要求
1.一种用于促进细胞效应的物质组合物，所述组合物包括基于细胞的或无细胞的肌肉组织制剂提取物，所述制剂提供了下列组分的来源，所述组分例如但不限于，层粘连蛋白、胶原蛋白I、胶原蛋白IV、触觉蛋白/巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖以及其他组分，包括细胞因子和生长因子，例如但不限于，EGF、bFGF、NGF、PDGF、IGF-1、TGF-β、VEGF和TNF-α或其同源物中的一种或多种。
2.权利要求1的组合物，其中所述制剂是层粘连蛋白、触觉蛋白/巢蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、胶原蛋白IV、bFGF、PDGF、TGF-β、VEGF和TNF-α的来源。
3.权利要求1的组合物，其中所述细胞来自肌肉组织。
4.权利要求3的组合物，其中所述肌肉组织来自人、非人灵长类、家畜动物、实验室试验动物、伴侣动物、鸟类、爬行动物或两栖动物。
5.权利要求3的组合物，其中所述肌肉组织来自人、猪或大鼠。
6.权利要求1的组合物，其中所述制剂是基于细胞的制剂。
7.权利要求1的组合物，其中所述制剂包括完整的细胞外基质。
8.权利要求1的组合物，其中所述制剂包括提取的细胞外基质。
9.权利要求1的组合物，其中所述制剂包含约1μg/ml-约100mg/ml的总蛋白含量。
10.权利要求1-9中任何一项的组合物，其中所述制剂聚合成凝胶。
11.权利要求1的组合物，其进一步包括一种或多种外源性细胞因子、抗生素、生长强化因子、基因表达增强子、增殖抑制剂和/或干细胞分化促进因子。
12.权利要求1的组合物，其中所述组合物促进细胞效应，所述细胞选自干细胞、上皮细胞、皮肤细胞、器官细胞和内皮细胞。
13.权利要求1的组合物，其中存在的bFGF为约0.3ng/ml-约4ng/ml；PDGF为约1pg/ml-约3000pg/ml；TFG-β为约1pg/ml-约2000pg/ml；EGF为约0ng/ml-约100ng/ml；VEGF为约1pg/ml-约3000pg/ml；以及TNF-α为约0pg/ml-约1000pg/ml。
14.权利要求1-13中任何一项的组合物在对某些材料的脂肪形成潜力进行生物测定中的用途。
15.权利要求14的用途，用于体外测定调节脂肪形成的组分、提取物或细胞系统，所述测定包括筛查肌肉制剂以鉴别具有脂肪细胞分化倾向的细胞群，产生或获得潜在调节脂肪形成的组分或提取物或细胞系统，将所述具有脂肪细胞分化倾向的细胞群接种在所述组分或提取物上，将所述细胞孵育足够时间使脂肪形成发生并随后在所述细胞中检查脂肪细胞的分化。
16.权利要求15的用途，用于产生适合移植到受体内的供体血管化组织的方法，所述方法包括制造包含功能循环系统的血管蒂，所述血管蒂有组织或组织提取物或其组分注入、附着或以其他方式与所述血管蒂相联；将所述血管蒂结合在支持基质内部和/或上面；在所述支持基质中接种被分离的细胞或组织碎片，所述细胞或组织碎片利用体外测定鉴别为促进脂肪形成；或某些其他有用的端点，将包含所述血管蒂的所述支持基质植入到受体某个部位，在所述部位所述功能循环系统与局部的动脉或静脉吻合；并将所述支持基质留在所述植入部位足够的时期以允许血管化新组织生长，其中根据特定的标准选择所述注入材料或接种材料，例如，通过测定法测定时它促进脂肪形成，所述测定法包括检查组织或组织提取物以鉴别具有脂肪细胞分化倾向的细胞群，产生或获得潜在促进脂肪形成的组分或提取物，将具有脂肪细胞分化倾向的细胞群接种在所述组分或提取物上，将所述细胞孵育足够时间使脂肪形成发生并随后在所述细胞中检查脂肪细胞的分化。
17.权利要求16的方法，其中所述血管蒂包括附着的脂肪或其他脂肪组织或包含下列细胞的组织，所述细胞为成肌细胞、成纤维细胞、前脂肪细胞和脂肪细胞、心肌细胞、角质化细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、软骨细胞、周细胞、骨髓来源的基质前体细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞或造血干细胞、许旺细胞及外周和中枢神经系统的其他细胞、嗅细胞、肝细胞及其他肝脏细胞、肾小球系膜及其他肾细胞、胰岛β细胞及导管细胞、甲状腺细胞、其他内分泌器官的细胞以及上述细胞的球状体。
18.权利要求17的方法，其中所述血管蒂构成对于促进脂肪形成的组分或提取物的体外测定，所述测定包括在容器表面产生或获得来自肌肉基质的潜在脂肪形成提取物层，在所述层上接种具有脂肪细胞分化倾向的细胞群，将所述细胞孵育足够时间使脂肪形成发生并随后在所述细胞中检查脂肪细胞的分化。
全文摘要
本发明一般涉及对促进或利于细胞和组织的生长、发育和分化有用的组织制剂，包括组织细胞及其提取物。更具体而言，本发明提供了包括完整的或提取的细胞外基质和/或细胞以及细胞因子、生长因子和其他组分的肌肉来源的材料。本发明的肌肉制剂类似基底膜并且来源于基于细胞的材料。该肌肉制剂可以在体外或体内使用，尤其是在各种组织工程应用中作为细胞支架并在其他细胞培养系统用于营养和富集一系列细胞类型，包括但不限于，前体细胞和干细胞例如前脂肪形成细胞。该肌肉制剂还在例如化妆品和局部治疗工业中用作乳膏的基础并且在食品工业中用作基质或添加剂。
文档编号A61K35/34GK1969039SQ200580019143
公开日2007年5月23日 申请日期2005年6月10日 优先权日2004年6月11日
发明者S·K·博托罗托, A·梅西纳, K·M·阿伯顿 申请人:伯纳德·奥布赖恩显微外科研究院