治疗、预防、抑制或降低心脏组织损伤的方法

专利名称：治疗、预防、抑制或降低心脏组织损伤的方法
技术领域：
本发明的领域涉及治疗、预防、抑制或降低心脏组织损伤。
背景技术：
心脏疾病是新生儿和成人死亡的主要原因。
冠状动脉疾病引起心脏血管急性阻塞，导致依赖性心肌的损失。在西方国家这些事件是死亡的主要原因之一。因为心脏不具备充分的肌再生能力，心肌梗塞的存活者一般发展为慢性心力衰竭，仅美国就有超过一千万的该类病例。虽然一般成人患病更多，但在儿童生命的第一年中，心脏疾病是非感染性死亡的主要原因，其通常涉及心脏细胞分化、迁移或存活的异常。
有多种引起心肌和冠状血管及组织损伤的情况，包括但不限于心肌缺血、凝血、血管阻塞、感染、发育缺陷或异常及其它该类心肌事件。心肌梗塞因心脏血管疾病引起。心肌梗塞发生于心脏某部分的血液供给减少或停止时(例如由冠状动脉阻塞引起)。血液供应减少引起心肌细胞的损伤，甚至可以杀死心肌细胞。心脏血液供应的减少通常由动脉粥样斑导致心外膜血管狭窄引起。这些动脉粥样斑破裂后将引起出血、血栓形成、纤维蛋白和血小板积累及血管狭窄。
最近有证据显示，心外或心内干细胞群可能有助于在正常环境下维持心肌数量。通过引入或补充外源性干细胞以促进心脏修复的作用认为是有希望的，但是，一般包括分离和导入自体同源或供体祖细胞。尽管干细胞群可保持细胞死亡和细胞更新之间的微妙平衡，但尚不足以完成急性冠状动脉闭塞之后的心肌修复。导入分离的干细胞可提高心肌功能，但该方法存在争议，并且需要分离自体同源干细胞或使用供体干细胞以及免疫抑制反应。将多能胚胎干细胞处理为心肌细胞谱系的努力尚未成功。干细胞递送和分化的技术障碍迄今已经阻碍了心脏再生疗法的广泛临床应用。
本领域仍需要改进治疗、预防、抑制或降低冠状组织损伤的方法和组合物。

发明内容
根据本发明的一个方面，提供一种治疗、预防、抑制或降低冠状组织损伤的方法，包括诱导至少一种生理功能，选自在所述冠状组织中上调或增加ILK活性，在所述冠状组织中上调或增加Akt活性，在所述冠状组织中上调或增加磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)活性，下调或减少心肌细胞死亡，以及在所述冠状组织中休眠心肌细胞。该方面包括向需进行该治疗的受试体使用一种诱导药剂，其能够在受试体体内诱导至少一种所述生理功能。
发明详述不受任何特定理论的约束，本发明提供了通过诱导一种或多种生理功能来预防、治疗、抑制或降低冠状组织的损伤的方法，其可以包括涉及有关心脏功能或发育中的调节路径。
为了治疗、预防、抑制或降低冠状组织的损伤，根据本发明可引入的生理机能包括上调或增加整联蛋白连接激酶(ILK)，上调或增加蛋白激酶B(Akt)，上调或增加磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)活性，下调或减少心肌细胞死亡，以及休眠心肌细胞。在一个实施例中，通过给需要治疗的受试体使用能够诱导一种或多种以上所述生理功能的药剂，可以在患者体内诱导至少一种所述生理功能。该患者可以是动物，优选为人类。
根据本发明，通过加入诱导剂，可将ILK的活性上调或增加到大于10％、25％、50％或100％。根据本发明，Akt的活性可上调或增加到大于10％、25％、50％或100％。根据本发明，通过利用诱导剂，心肌细胞死亡可下调或减少大于10％、25％、50％或达到100％。根据本发明，通过诱导作用，心肌细胞的休眠可增加到大于10％、25％、50％或达到100％。根据本发明，通过加入诱导剂，可将PI3K的活性上调或增加到大于10％、25％、50％或100％。
在一个实施例中，该诱导剂为胸腺素β4(Tβ4或TB4)。胸腺素β4最初鉴定为体外内皮细胞迁移和分化期间上调的蛋白质。胸腺素β4由胸腺分离，是一种包含43个氨基酸残基、4.9kDa的普遍存在的多肽，可在多种组织中鉴定。多种作用与该蛋白质有关，包括在内皮细胞分化和迁移、T细胞分化、肌动蛋白隔离和血管生成中的作用。
在另一实施例中，本发明利用胸腺素β4以外的诱导剂，治疗、预防、抑制或降低冠状组织的损伤。该诱导剂可包括，Tβ4异构体、类似物或衍生物，包括氧化Tβ4、Tβ4亚砜、Tβ4N-端变异体、Tβ4C-端变异体和Tβ4拮抗剂。
已经确定了很多Tβ4异构体，并且与已知Tβ4氨基酸序列相比具有约70％、或约75％、或约80％或更多的同源性。该异构体包括，例如，Tβ4ala、Tβ9、Tβ10、Tβ11、Tβ12、Tβ13、Tβ14和Tβ15。这些异构体与Tβ4共同拥有氨基酸序列LKKTET，其涉及预防、治疗、抑制或降低冠状组织的损伤。
此处引用国际申请No.PCT/US99/17282作为参考，其中公开了Tβ4异构体，与本发明的用途一致，同样具有氨基酸序列LKKTET，及其可用于本发明的保守变体。此处引用国际申请No.PCT/GB99/00833(WO99/49883)作为参考，其中公开了可具有本发明用途的氧化胸腺素β4。
因此，特别注意诱导剂如已知的Tβ4异构体、如上文所列、尚未确定的Tβ4异构体，将用于本发明的方法中。
此外，可用于治疗、预防、抑制或降低心脏组织损伤的其它诱导剂分子，同样可在本发明的方法中使用。这样的分子包括凝溶胶蛋白、维生素D结合蛋白质(DBP)、肌动蛋白抑制蛋白、肌动蛋白素、adsevertin、propomyosin、fincilin、蚕食蛋白、DNA聚合酶I、vilin、片段化蛋白、割切蛋白、加帽蛋白、β-辅肌动蛋白和肌动调解蛋白。因为所述方法包含应用于受试体的这些物质，本发明因而进一步提供药物组合物，包括此处所提出的凝溶胶蛋白、维生素D结合蛋白质(DBP)、肌动蛋白抑制蛋白、肌动蛋白素、蚕食蛋白，DNA聚合酶I、vilin、片段化蛋白、割切蛋白、加帽蛋白、β-辅肌动蛋白和肌动调解蛋白。
因此，本发明的一个内容是使用诱导剂，例如包含或基本上由氨基酸序列LKKTET及其保守变体组成的肽或肽片段，包括，氨基酸侧序列KLKKTET和/或LKKTETQ(有时称其为LKKTET多肽)。
此处所使用的术语“保守变体)”及其语法变化，表示氨基酸残基由其它生物学上相似的残基置换。保守变异的实例包括异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸疏水性残基的置换，极性残基的置换，例如精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸，或谷氨酰胺取代天冬氨酸等等。
本发明还利用诱导剂刺激心脏组织中一种或多种在此所述的诱导剂的产生。该药剂还称为“诱导起始剂”。因此，根据一个实施方案，使用可刺激受试体体内产生此处所述诱导剂的药剂治疗受试体。因而本发明所使用的诱导剂可直接或间接地诱导至少一种上述的生理功能，以治疗、预防、抑制或减轻降低冠状组织损伤。在一个实施方案中，间接诱导出至少一种上述的生理功能，以治疗、预防、抑制或减轻冠状组织损伤的诱导剂，可刺激心脏组织中LKKTET肽例如Tβ4的产生，以预防冠状组织的损伤。
不受任何特定理论的约束，其它磷酸腺肌醇3-激酶(PI3K)和整合蛋白连接激酶(ILK)和可用胸腺肽β4(Tβ4)或用其它LKKTET肽上调的AkT信号通路，可以传递生存信号，并因此在肌缺血损伤后对预防心脏组织损伤起重要作用。AkT是丝氨酸-苏氨酸激酶，通过影响许多可抑制细胞凋亡的下游通路，对细胞和组织存活起一定作用。在多种膜受体、激素、细胞因子、趋化因子和其它细胞分子的刺激作用之后，PI3K和ILK激酶也可激活AkT。因此，用于本发明的诱导剂可以是除Tβ4之外的或其它另一种LKKTET肽。该诱导剂的实施例可选自但不局限于膜受体，包括生长因子受体的HER(或Erb B)族和雌激素(ER)受体；胰岛素或与胰岛素联合的结合白蛋白的棕榈酸盐；纤连蛋白；谷胱甘肽；甘露醇；P38-MAPK抑制剂，例如SB-203580；红细胞生成素；和Rho族蛋白质例如Ras、Cdc42和Rac1。其中，Akt的几个下游靶点包括转录因子BAD和Forkhead。作为实例，Tβ4诱导的Akt活性通过磷酰化BAD抑制细胞凋亡，然后BAD抑制线粒体的细胞色素C释放和caspase-9的活性。AkT也可激活IKK，而IKK通过抑制剂NFKB降解，可激活核因子-κB(NF-κ3)。这时NFκB可易位到核并诱导抗细胞凋亡基因的转录。上述分子和其它药物和小分子也可和在此所述的诱导剂起协同作用，抑制心脏组织的损伤。该化合物的实例可选自但不局限于醛糖还原酶抑制剂(ARI)，例如唑泊司他等；ACE抑制剂，例如雷米普利等；山梨醇脱氢酶抑制剂，例如CP-470，711；M-乙酰半胱氨酸(NAC)；酪氨酸磷酸酶抑制剂，例如原钒酸钠；维生素衍生物(RXR激动剂的胰岛素致敏活性)，也就是具有胰岛素致敏活性的核受体配体类，例如LG268；水杨酸盐/酯和c-Jun N末端激酶(JNK)等的药理抑制剂；氯氮平和奥氮平，(非典型antipsychiotics)；ROS抑制剂；和BAX抑制剂。
在一个实施例中，本发明提供了一种用在此所述的有效量的诱导剂接触受试体损伤部位，而治疗、预防、抑制或降低受试体冠状组织损伤的方法。该接触可以是直接的或全身性的。接触损伤部位的实施例包括用在此所述的含有诱导剂的组合物接触损伤部位或在此所述的与增强诱导剂穿透性的至少一种在此所述的药剂结合，或延迟或延缓在此所述的诱导剂释放至治疗部位。
给药可包括，例如，将在此所述的含有诱导剂的组合物直接注射至心脏组织例如心肌组织，静脉给药，腹膜内给药，肌内或皮下注射，或吸入，透皮或口服。
在此所述的诱导剂，可用任意适于治疗、预防、抑制或降低冠状组织损伤的剂量给药。例如，在此所述的诱导剂，给药剂量在约0.001-1,000,000微克，更优选在约0.1-5,000微克，最优选在1-30微克范围内。
本发明的诱导剂可每天、每隔一天等单剂量给药，对于数天、数周或数月等可单剂量给药或每天多剂量给药，例如每天用药2、3、4次或更多次。
Tβ4位于许多类型的组织和细胞中，因此在心脏组织和/或心脏细胞中，在此所述的刺激产生Tβ4、LKKTET肽和/或另外的在此所述的诱导剂的药剂，可加至或含有一种组合物，以产生Tβ4、LKKTET肽和/或另外的诱导剂。该药剂可包括多种生长因子族成员，例如胰岛素样生长因子(IGF-1)、血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子β(TGF-β)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胸腺肽α1(Tα1)和血管内皮生长因子(VEGF)。
另外，可向组合物中加入在此所述的诱导剂和其它辅助治疗、预防、抑制或降低心脏组织损伤的药剂。该药剂包括血管生成素、生长因子、直接分化细胞的药剂。例如但不限于，此处描述的诱导剂能与以下一种或多种药剂组合有效量的VEGF、KGF、FGF、PDGF、TGFβ、IGF-1、IGF-2、IL-1、胸腺素原α和胸腺素α1。
本发明同样包括一种药物组合物，其在药学可接受的载体中，例如注射用水，含有在此所述的治疗有效量的诱导剂。
治疗或预防心脏组织损伤的实际剂量、制剂或组合物依赖于多种因素，包括受试体的体型大小和健康状况。然而，本领域普通技术人员可使用如在申请日之前公开的PCT/US99/17282和引用的参考文献所描述的确定临床剂量的方法和技术，来确定适当的使用剂量。
含有此处所述诱导剂的适当制剂的浓度范围是在约0.001-10％重量，更优选约0.01-0.1％重量，最优选约0.05％重量的范围内。
在此所述的治疗方法涉及多种含有此处所述诱导剂的试剂或组合物的给药或递送途径，包括任何向受试体的常规给药技术。使用或含有此处所述诱导剂的方法和组合物和/或用于本发明的其它组合物，可通过与药学可接受的无毒赋形剂或载体混合，制成药物组合物。
本发明可包括抗体的使用，该抗体与在此所述的诱导剂相互作用，例如LKKTET肽或其功能性片段。可以提供含有或基本由含有不同表位特性的总单克隆抗体的抗体，以及特异的单克隆抗体制剂。通过本领域技术人员公知的方法，如申请日之前公开的PCT/US99/17282中所述，单克隆抗体由含有蛋白质片段的抗原制备。本发明中使用的术语“抗体”的含义包括单克隆抗体和多克隆抗体。
在又一项实施例中，本发明提供一种通过使用有效量的诱导起始剂治疗受试体的方法，其中诱导起始剂诱发此处所述诱导剂的基因表达，例如Tβ4、Tβ4异构体或LKKTET肽。术语“有效量”是指有效的诱发此处所述诱导剂的基因表达，从而进行有效治疗的药剂量。诱发此处所述诱导剂的基因表达的药剂可以是多核苷酸。多核苷酸可以是反义链、三联剂或核酶。例如可使用指向结构基因区域或Tβ4的启动子区域、Tβ4异构体或LKKTET肽的反义链。
在另一实施例中，本发明提供了一种使用组合物的方法，该组合物可诱发此处所述诱导剂的肽活性。影响此处所述诱导剂活性的组合物(例如，拮抗剂和激动剂)，包括肽、拟肽、多肽、化合物、矿物质例如锌以及生物制剂。
本发明还涉及一种筛选能够预防冠状组织损伤的如上所述的化合物的方法，包括用候选化合物与冠状组织接触；在所述冠状组织中测量至少一种所述生理功能的水平，其中与缺乏所述候选化合物的冠状组织中至少一种所述生理功能的水平相比，所述至少一种生理功能的水平增加，表明所述组合物能够治疗、预防、抑制或降低所述冠状组织的损伤。
本发明还涉及一种筛选能够诱导至少一种上述生理功能的化合物的方法，包括用候选化合物接触心脏组织；测量所述组织中的Tβ4活性，其中，与缺乏所述候选化合物的冠状组织中Tβ4活性水平相比，Tβ4活性在所述心脏组织中增加表明所述化合物能够诱导至少一种生理功能。
本申请通过以下非限定性实施例进一步解释。
实例1合成Tβ4和Tβ4抗体获自RegeneRx Biopharmaceuticals，Inc.(3 BethesdaMetro Center，Suite 700，Bethesda，MD 20814)，并在胶原凝胶测试中检测，以确定其将心脏内皮细胞转化为间质细胞的效力。已经确定，心脏瓣膜及其它心脏组织的发育是通过上皮-间质转化形成的，该过程的缺陷会引起个体发育及整个生命期间严重的心血管畸形和损伤。在胶原凝胶测试中，生理浓度的Tβ4明显增强心内膜细胞向间质细胞的转化。而且，抗Tβ4的抗体抑制并阻断该转化。房室心内膜向侵入性间质的转化，是形成和维持正常心脏组织及形成心脏瓣膜的一个方面。
实例2参与心脏发育的调节途径，可用于辅助心脏修复中的心脏细胞重新调整。在心脏形态发生期间的基因表达研究中，发现在发育中的心脏中，有43个氨基酸肽胸腺素β4被表达。胸腺素β4具有多种功能，其最突出的包括，分离G-肌动蛋白单体和之后的对肌动蛋白—细胞骨架组织的作用，这是细胞运动、器官形成和其它细胞生物学事件所必需的。最近的结构域分析显示，基于其对肌动蛋白碳端的亲合力，β4-胸腺素能够影响肌动蛋白装配。除细胞运动之外，胸腺素β4可通过影响Rho-依赖性基因表达或核肌动蛋白调节的染色质重建而影响转录，。
在此表明，胸腺素β4能够刺激心肌细胞和内皮细胞的迁移，并促进心肌细胞的存活。LIM结构域蛋白质PINCH和整联蛋白连接激酶(ILK)，两者均是细胞位移和存或所必需的，与胸腺素β4形成复合物，导致存活激酶Akt/PKB的磷酸化作用。Akt磷酸化作用的抑制与胸腺素β4在心脏细胞上的作用是相反的。冠状动脉结扎后，用胸腺素β4处理成年小鼠，导致心脏中Akt磷酸化作用增加，增强了在24小时内早期肌细胞的存活率，提高了心脏功能。这些结果表明，在心脏形成期表达的内源性蛋白质，在急性冠心病的情况下，可重新调配于保护心肌。
结果胸腺素β4发育表达虽然已经报导了在发育期的大脑中胸腺素β4的表达，就像心血管系统中的表达一样，但是没有重要的细节。胚胎期(E)10.5天的小鼠全胚胎RNA原位杂交，显示胸腺素β4在左心室、右心室的外部弯曲和心脏流出道表达。放射性原位杂交显示，胸腺素β4转录子富集于心脏瓣膜前体区域，通称为心内膜垫。这一区域的细胞源自于内皮细胞，其经过间质转化，从心内膜迁移出并侵入将心肌和心内膜分开的细胞外基质的隆起。除心内膜细胞以外，一种心肌细胞移至并聚集于垫区域，这是心腔分隔和重构所必需的过程。使用免疫组织化学，发现垫中表达胸腺素β4的细胞同样表达心肌肌动蛋白，说明在胸腺素β4存在于侵入心内膜垫的迁移心肌细胞中。最后，胸腺素β4转录子和蛋白质在E9.5-E11.5同样在室间隔和较少分化、较多增生的心肌区域表达，通常称为致密层，该致密层在细胞成熟时移行至小梁区域。由前侧心脏区域移行的流出道心肌，也表达高水平的胸腺素β4蛋白质。
分泌的胸腺素β4刺激心脏细胞迁移和存活尽管胸腺素β4是在细胞液和细胞核中发现以及在细胞内起作用，功但是发现用真菌标记的胸腺素β4转染的Cos1细胞条件培养液，含有可用蛋白质印迹检测的胸腺素β4，与之前报导的伤口液体分泌和存在于其中的胸腺素β4一致。在噬菌体颗粒表面表达胸腺素β4之后，该噬菌体是经胞外加入到胚胎心脏外植体，发现抗噬菌体抗体包裹了细胞表面，并且最终可在细胞内的细胞液和细胞核中检测，而对照噬菌体检测不到。用生物素标记胸腺素β4进行了类似的观察。这些数据表明，分泌的胸腺素β4可以内在化进入细胞，尽管细胞的进入机制仍需测定。
为了检测心脏细胞迁移中分泌的胸腺素β4的作用，设计了一种胚胎心脏外植体系统，用于在三维胶原凝胶中分析细胞迁移和转化。在该分析中，来自瓣膜形成区域的邻近胚胎心肌和心内膜的外植体，与邻近胶原的心内膜一起放置于胶原凝胶上。心肌细胞的信号诱导心内膜细胞迁移，但是心肌细胞并不能正常和大量地移行至胶原。但是，一旦将胸腺素β4加入到原始外植体，就可以观察到大量自然的搏动，心脏肌肉肌动蛋白—阳性细胞从外植体中移行出去。基于TUNEL分析法或磷—组织蛋白酶H3免疫染色，与对照细胞相比，细胞死亡或增生在这些细胞中没有明显不同。
为测试出生后心肌细胞的应答，将原始小鼠新生期心肌细胞培养在涂覆层粘连蛋白的玻璃上，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)或胸腺素β4处理细胞。与胚胎心肌细胞相似，与对照(p＜.05)相比，发现胸腺素β4处理的新生期心肌细胞的移动距离明显增加。除胸腺素β4在心肌细胞迁移中的作用之外，在胚胎心脏外植体分析中的内皮位移发现了类似的作用。将E11.5的外植体暴露于胸腺素β4中，与PBS(p＜.01)相比，导致了内皮细胞移行数量的增加。
在我们实验室中，新生期心肌细胞的原代培养物生长于涂覆层粘连蛋白载玻片上，一般存活大约1至2周，并且某些细胞搏动达到2周。令人惊讶的是，暴露于胸腺素β4的新生期心肌细胞存活时间明显地比较长，肌细胞明显的节律性收缩可达28天。此外，在胸腺素β4处理的新生期心肌细胞中，搏动速率一直比较快(95对50搏动每分钟，p＜.02)，表明细胞间传达的变化以及心肌细胞更有活力胸腺素β4激活ILK和Akt/蛋白质激酶B为研究通过胸腺素β4影响细胞迁移和存活的电位机制，搜索到与蛋白质交互作用的胸腺素β4。胸腺素β4的氨基端与affi-凝胶珠融合，导致碳端暴露以鉴定上述未知交互作用蛋白质，但阻止与肌动蛋白的结合。合成E9.5-12.5小鼠心脏T7噬菌体互补DNA文库并用噬菌体显示筛选，富集胸腺素β4交互作用克隆，并由ELISA确认。PINCH是一种LIM结构域蛋白质.，是该筛选中最为一贯的隔离的，并在不存在肌动蛋白(ELISA)的情况下与胸腺素β4交互作用。PINCH和整联蛋白连接激酶(ILK)作为参与胞外基质交互作用的比较大的复合物的一部分，彼此直接交互作用，并间接地与肌动蛋白细胞骨架反应，所述复合物通常称为局部粘连复合物中。由于PINCH和ILK促进丝氨酸—苏氨酸激酶Akt/蛋白质激酶B磷酸化作用，因而是细胞位移和细胞存活所必需的，所述蛋白质激酶B，为一种存活和生长信号通路中的中枢激酶。编码胸腺素β4的质粒用或不用培养的细胞中的PINCH或ILK转染，并发现胸腺素β4与PINCH或ILK分别共沉淀。更进一步说，尽管和PINCH相比，ILK和胸腺素β4之间的交互作用较弱，但PINCH、ILK和胸腺素β4一直在共有的复合物中进行免疫沉淀。PINCH与胸腺素β4的交互作用对应于图上的PINCH的第四或第五LIM结构域，而ILK氨基末端ankryin结构域足够进行胸腺素β4的交互作用。
由于向局部粘连复合物中补充ILK对其激活很重要，因此分析了胸腺素β4对ILK定位和表达的作用。在将胚胎心脏外植体或C2C12成肌细胞用合成胸腺素β4蛋白质(10ng/100ul)或表达胸腺素β4的质粒处理后，通过免疫细胞化学检测，ILK在细胞周围显著增强。Western分析显示在C2C12细胞中ILK蛋白质水平适度增长，说明增强的免疫荧光可能与胸腺素β4定位改变有关。并发现，在胸腺素β4处理C2C12细胞后，ILK的机能被激活，该结果通过使用Akt的丝氨酸473的磷—特异性抗体使其已知底物的Akt磷酸化作用增加可以证明，同时不改变总Akt蛋白质。细胞外胸腺素β4和转染胸腺素β4给药的相似作用与以前观察到的肽内在化一致，说明对胸腺素β4发信号是细胞内而不是细胞外作用。由于胸腺素β4隔离了G-肌动蛋白单体库，对ILK激活作用的影响有赖于胸腺素β4在调节聚合F-肌动蛋白和单体球形肌动蛋白之间的平衡所起的作用。F-肌动蛋白的聚合作用被C3转移酶抑制，并且F-肌动蛋白的形成被活化的Rho所促进，但是两种干预都没有影响胸腺素β4处理后的COS1或C2C12细胞的ILK活化作用。
为了确定ILK的激活作用对所观察到的胸腺素β4的影响是否必需，使用已经充分公开的ILK抑制剂渥曼青霉素，其抑制ILK上游的激酶、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-激酶)。使用心肌细胞迁移和搏动频率来分析胸腺素β4活性，如上文所述，在胸腺素β4存在下以及有或无渥曼青霉素的情况下，培养胚胎心脏外植体。与ILK介导胸腺素β4的作用一致，在ILK的抑制作用下，心肌细胞迁移和搏动频率明显降低(p＜.05)。同时，这些结果支持生理学上明显的细胞内胸腺素β4-PINCH-ILK的交互作用，说明该复合物可介导某些观察到的相对独立于于肌动蛋白聚合作用的胸腺素β4的作用。
胸腺素β4在心肌梗塞后促进细胞存活和提高心脏功能由于胸腺素β4对心肌细胞体外培养的存活和迁移的作用以及AKT的磷酸化作用，测试了在心肌损伤之后胸腺素β4是否有助于体内心脏修复。通过冠状动脉结扎造成58只成年小鼠心肌梗塞，结扎后，将其中的一半立即在全身、心脏内或全身加心脏内使用胸腺素β4，另一半用PBS处理。用胶原(对照)或胶原与胸腺素β4的混合物进行心脏内注射。存活两周的所有45只小鼠，在梗塞后的第2和第4周用随机盲超声通过心脏收缩多重测量进行心脏功能诊断。梗塞4周后，对照小鼠的左心室平均缩短分数23.2+/-1.2％(n＝22，95％置信区间)；与之对比，用胸腺素β4处理的小鼠平均缩短分数37.2+/-1.8％(n＝23，95％置信区间，p＜.0001)。作为第二种测量心室功能的方法，二维超声心脏图像测量显示，胸腺素β4处理的小鼠左心室输出血液的平均分数(射血分数)为57.7+/-3.2％(n＝23，95％置信区间，p＜.0001)，而冠状动脉结扎后的对照小鼠的平均值为28.2+/-2.5％(n＝22，95％置信区间)。心脏缩短分数或射血分数分别大于60％或100％的提高，说明暴露至胸腺素β4的显著提高，尽管与假手术的动物相比，心脏功能仍有所抑制(～60％缩短分数；-75％射血分数)。最后，对照组的末期舒张度(EDD)和末期收缩度(ESD)明显较高，表明梗塞后胸腺素β4处理导致心脏扩张降低，与改善功能一致。显著的是，当胸腺素β4被腹膜内注射全身给药或仅在心脏梗塞局部给药时，改进的程度在统计学上没有差异，表明胸腺素β4的有益作用可能通过直接作用于心脏细胞而不是通过心脏外源产生的。用相同的胶原赋形剂进行对照心脏注射，使针对心脏修复的注射不产生内在反应。
为确定胸腺素β4提高心脏功能的方式，检查用胸腺素β4处理或未用其处理的心脏的多个连续组织切片。三个水平的三色染色切片显示，用胸腺素β4处理的所有小鼠中的疤痕的大小减小，但没有显示全身或局部胸腺素β4给药的不同，这与上述超声心脏图像数据一致。通过对一组小鼠左心室六个水平的切片进行的疤痕体积的定量分析，证明用胸腺素β4处理的小鼠伤疤体积明显减小(p＜.05)。用PBS或胸腺素β4处理的心脏中，在冠状动脉结扎后第3、6、11或14天，未发现明显的心肌细胞增殖或死亡。然而通过TUNEL测定(绿色)，在结扎24小时后，经过胸腺素β4处理的心肌细胞，其细胞死亡显著减少，并被肌肉—肌动蛋白抗体(红色)双重标记证实。同样是肌细胞的TUNEL阳性细胞在胸腺素β4组中非常稀少，但在对照心脏中大量存在。与该发现一致，发现梗塞三天后，心脏内胸腺素β4处理的左心室缩短分数为39.2+/-2.34％(n＝4,95％置信区间)，对照为28.8+/-2.26％(n＝4,95％置信区间)(p＜.02)；射血分数分别为64.2+/-6.69％或44.7+/-8.4％(p＜.02)，表明获得了胸腺素β4了早期保护。最后，c-kit、Sca-1或Abcg2阳性心肌细胞在处理或未接受处理的心脏中的数量相似，并且胸腺素β4处理动物的心肌细胞体积与成熟的肌细胞相比没有检测到任何不同，表明胸腺素β4诱导的改进不受所称干细胞向心脏细胞系补充的影响。因此，由于胸腺素β4对心肌细胞存活所起的作用以及梗塞后对心肌细胞的早期保护，使用胸腺素β4处理减小鼠少伤疤体积和保存心肌功能是可能的。
由于在培养的细胞中胸腺素β4上调ILK活性和Akt磷酸化作用，所以测试了这些激酶在体内的活性。通过蛋白质印迹，发现冠状动脉梗塞后，与PBS处理的小鼠相比，胸腺素β4处理小鼠的心脏溶溶解产物中蛋白质ILK水平增加。相应地，与上述胸腺素β4对ILK的作用一致，Akt-5473磷—特异性抗体显示出在胸腺素β4处理的小鼠中磷酸化Akt-5473的量上升，这与之前所描述的胸腺素β4对ILK的作用是一致的。Akt蛋白质总数没有增加。这些体内发现与体外所示的胸腺素β4对细胞迁移和存活所起的作用是一致的，这表明ILK激活作用和之后的Akt刺激作用可部分地解释胸腺素β4诱导心肌细胞存活增强，尽管用这个单一机制解释胸腺素β4对细胞所起作用的全部原因是不可能的。
讨论此处提供的证据表明，胸腺素β4，一种在心脏形态发生期间参与细胞迁移和存活的蛋白质，可重新调配从而减少心脏梗塞后的心肌细胞损失。根据PINCH、ILK和Akt的作用，该数据与该复合物所起的作用是一致的，即在胸腺素β4对细胞迁移、存活和心脏修复的影响中起重要作用。在小鼠中观察到，胸腺素β4在冠状结扎后24小时内防止细胞死亡的能力，可能导致疤痕体积的减少和改进心室功能。尽管ILK的胸腺素β4激活作用可能有许多细胞效应，但Akt的激活作用为主要机制，通过该机制，胸腺素β4促进细胞的存活。当心脏损伤后，施用在小鼠中过表达的骨髓干细胞，与预计的Akt心脏修复效果是一致的，尽管这可能发生在非细胞自主模式中。
胸腺素β4预防心脏细胞死亡的早期作用联想到能通过“休眠”经受住组织缺氧损伤的肌细胞。虽然对心肌休眠的基本机制不了解，然而在新陈代谢和能量使用中的改变显示促进细胞的存活。诱导剂，例如胸腺素β4可用类似休眠心肌方法来改变细胞特性，并给出内皮细胞迁移和新血管生成的时间。
在此，胚胎心脏中G-肌动蛋白分离肽胸腺素β4促进心肌和内皮细胞迁移并在出生后的心肌细胞中保留这种特性。培养的胚胎和出生后心肌细胞存活也因为胸腺素β4而增强。发现胸腺素β4与PINCH和整联蛋白连接激酶(ILK)形成一种功能性复合物，引起残存细胞中的激酶Akt/PKB的激活，其对胸腺素β4对心肌细胞施加影响是必需的。小鼠冠状动脉结扎后，用胸腺素β4处理导致心脏ILK的上调和Akt的激活，增强早熟肌细胞的存活并提高心脏功能。这些结果指示，胸腺素β4促进心肌细胞迁移、存活和修复并在急性心肌损伤的情况下是一种新的治疗靶点。
方法RNA原位杂交用洋地黄毒甙配基标记或S-标记的由小鼠胸腺素β4cDNA的3′UTR区合成的反义链核糖核酸探针，进行E 9.5-12.5小鼠胚胎的全胚胎或部分胚胎RNA原位杂交，与紧密关联的胸腺素β10的转录不享有同源性。
免疫组织化学胚胎或成年心脏组织植入用于免疫组织化学的石蜡和切片。胚胎心脏切片用不识别胸腺素β10的抗胸腺素β4孵育。成年心脏从底部到顶部切成十等分。使用连续切片用于三色染色切片并与肉瘤霉素a-辅肌动蛋白、c-kit、Sca-1、Abcg2和BrdU抗体反应，用于TUNEL测定法(Intergen Company#S7111)。
胶原蛋白凝胶迁移测定法如先前所述，从E11.5野生型小鼠胚胎分割流出道并放置于胶原蛋白基质上。经过10小时附着，外植体在含30ng/300ul胸腺素β4的PBS、单一的PBS或胸腺素β4和100nM渥曼青霉素中孵育。在37℃5％CO2培养3-9天，并在室温下固定于含4％聚甲醛的PBS中10分钟。计数细胞对迁移和距离进行定量分析，在内皮迁移的各个条件下使用至少三个单独的外植体和心肌迁移使用八个单独的外植体。
胶原蛋白凝胶外植体的免疫细胞化学聚甲醛固定的外植体在室温下用渗透溶液(10mM PIPES pH6.8；50mMNaCl；0.5％屈立通X-100；300mM蔗糖；3mM MgCl2)渗透10分钟，并在室温下用PBS漂洗2×5分钟。通过一连串的阻滞和漂洗步骤，使用检测抗体且外植体在室温下用平衡缓冲液(Anti-Fade kit)漂洗和孵育10分钟。外植体用勺取于玻璃显微镜载玻片，盖上盖玻片，并用荧光显微镜观察。作为推荐，用ApopTag和荧光素原位细胞凋亡检测试剂盒(Intergen Company # S7111)进行TUNEL测定。
胚胎T7噬菌体展示cDNA文库使用Straight A′s mRNA Isolation System(Novagen，Madison WI)，从E9.5-12.5小鼠胚胎心脏中分离和纯化等量mRNA。使用T7Selectlo-3定向表达cDNA随机引物克隆系统(Novagen，Madison WI)合成cDNA。媒介物T7Selectlo-3用于展示随机准备的cDNA，其位于5-15噬菌体10B外壳蛋白分子的C端。诱导第二外壳蛋白10A的表达。经EcoRl和Hind III消化后，将插入片段结合到T7 selectlo-3媒介物(T7选择系统手册，Novagen)。组装媒介物，并且文库的复杂性为107。组装的噬菌体在0.5L对数期的BLT5615E.coli菌株培养基37℃下扩增4小时。离心除去细胞碎片，用8％聚乙二醇沉淀噬菌体。用1M NaCl/pH8.0的10mMTris-HCl/1mM EDTA从颗粒状沉淀物中提取噬菌体，由CsCI梯度超速离心进行纯化。纯化后的噬菌体在PBS中透析，-80℃存储于10％甘油中。
T7噬菌体的生物淘选参照说明书，将300μl的Affi-凝胶15(Bio-RadLaboratories)经氨基末端赖氨酸残基与12μg合成胸腺素β4蛋白质(RegeneRx)结合。在PBS中用3％BSA阻滞1小时后，将凝胶转移至柱中，用10ml PBS、2ml的1％SDS/PBS和1ml的PBS/0.05％Tween-20(PBST)x4冲洗。在500μl的PBST中，109pfu的T7噬菌体胚胎心脏文库(复合物的100x)用于柱中孵育5分钟以达到低标准生物淘选。用50ml的PBS洗去未结合噬菌体。用2.0ml的1％SDS洗脱结合噬菌体。测定10μl洗脱噬菌体的效价，其余噬菌体立即在0.5L对数期的BLT5651E.coli培养基中扩增直至溶解。离心去除细胞碎片，测定溶解产物的效价，109pfu的噬菌体用于下一轮生物淘选。进行4轮生物淘选，经过第2、3和4轮后，在扩增前挑选出30份单一菌落，分别用于序列分析。对含有多于10个氨基酸的单一菌落进行扩增，用于ELISA证实测定。
ELISA证实测定将Maxi Sorp Nunc-Immuno Plates(Nalgene Nunc International)用1μg/100μl的合成胸腺素β4肽包衣，过夜，然后用PBS冲洗，用3％BSA阻滞。将109pfu扩增的单一噬菌体群落分别加入PBST至每一孔盘，在室温下孵育1.5小时。将T7野生型噬菌体作为阴性对照。用PBS(X4)冲洗以除去未结合的噬菌体，在室温下，加入200μl的1％SDS/PBS到孔盘中洗脱结合噬菌体1小时。
共免疫沉淀反应将COS和10T1/2细胞用胸腺素β4、PINCH和/或ILK转染，按照前述用抗体沉淀溶解产物。用抗靶向各种PINCH的物质包括抗ILK多克隆抗体(Santa Cruz)、抗胸腺素β4多克隆抗体和抗真菌或抗FLAG抗体拮抗剂，进行蛋白质印迹分析。
动物和手术操作按照上文所述，通过结扎左前下行冠状动脉，在16周龄(25-30g)的58只雄性C57BL/6J小鼠中形成心肌梗塞。29只结扎小鼠中在结扎后立即使用胸腺素β4处理，剩余的29只用PBS注射剂处理。处理方法为，心脏内使用胸腺素β4(200μg于10μl胶原)或10μl的胶原；腹腔内使用胸腺素β4(150μg于300μl的PBS)或3000的PBS；或同时通过心脏内和腹膜内注射。每三天进行一次腹膜内注射，直至小鼠死亡。剂量基于在先的胸腺素β4生物分布研究。将心脏移出、称重并固定以用于组织切片。其余的小鼠以同样的方式操作，以用于梗塞后0.5、1、3、6和11天的研究。
通过超声心脏图像分析心脏功能使用M-模式和上文所述的2维测量法，进行用于分析心脏收缩功能的超声波心动描记法。测量显示了随机选自六个选定心脏周期中的平均值，选自至少两个单独的扫描，以随机盲的方式在扫瞄水平中作为一致性参照的乳头肌中进行。末期舒张定义为最大左心室(LV)舒张尺度，并且末期收缩定义为后壁运动的峰值。在统计分析中忽略每组中的单一端值。代表收缩功能的缩短分数(FS)以LV尺度计算如下FS＝EDD-ESD/EDD×100％。射血分数(EF)由二维图计算。EDD，末期舒张度；ESD，末期收缩度。
疤痕体积计算与上文类似，使用通过每只小鼠心脏的六个切片，由Openlab 3.03 software(Improvision)计算疤痕体积。胶原沉积面积的百分比由随机选择的六个切片计算，并算出每只小鼠的平均数。
统计分析用95％置信区间的变量的标准t-test测试进行统计计算。
胸腺素β4增强胚胎心脏中的心肌和内皮细胞迁移，并在出生后心肌细胞中保持该特性。胸腺素β4同样可以增进培养基中的胚胎和出生后心肌细胞的存活。胸腺素β4与PINCH和整联蛋白连接激酶(ILK)一起形成功能性复合物，导致存活激酶Akt的激活(同样称之为蛋白激酶B)。小鼠冠状动脉结扎之后，胸腺素β4的处理可以导致心脏中的ILK上调和Akt激活，增强早期肌细胞存活并提高心脏功能。这些发现表明胸腺素β4增强心肌细胞迁移、存活和修复，其调节路径是一种新的急性心肌损伤的治疗靶点。
权利要求
1.一种治疗、预防、抑制或降低冠状组织损伤的方法，其包括诱导至少一种生理功能，所述生理功能选自在所述冠状组织中上调或增加ILK活性，在所述冠状组织中上调或增加Akt活性，在所述冠状组织中上调或增加磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)活性，在所述冠状组织中下调或减少心肌细胞死亡，以及在所述冠状组织中休眠心肌细胞，通过对需要进行该处理的受试体使用一种诱导剂，其能够在所述受试体体内诱导所述生理功能。
2.根据权利要求1的方法，其中所述诱导剂是胸腺素β4(Tβ4)。
3.根据权利要求1的方法，其中所述诱导剂是LKKTET肽。
4.根据权利要求3的方法，其中所述诱导剂是除Tβ4之外的其它诱导剂。
5.根据权利要求1的方法，其中所述诱导剂是除Tβ4之外的其它诱导剂。
6.根据权利要求5，其中所述多肽包含氨基酸序列LKKTET、氨基酸序列KLKKTET、氨基酸序列LKKTETQ，和Tβ4的N-端变异体、Tβ4的C-端变异体、Tβ4异构体、氧化的Tβ4或Tβ4亚砜。
7.根据权利要求1的方法，其中所述诱导剂直接或间接诱导所述生理功能。
8.根据权利要求6的方法，其中所述诱导剂间接诱导所述生理功能，且所述诱导剂刺激所述冠状组织中LKKTET肽的产生。
9.根据权利要求7的方法，其中所述诱导剂是除LKKTET肽之外的其它诱导剂。
10.根据权利要求9的方法，其中所述诱导剂选自膜受体、HER生长因子受体、Erb B生长因子受体、雌激素(ER)受体、胰岛素、与胰岛素联合的结合白蛋白的棕榈酸盐、纤连蛋白、谷胱甘肽、甘露醇、P38-MAPK的抑制剂、SB-203580、红细胞生成素、Rho族蛋白质、Ras、Cdc42或Rac1的至少一种。
11.权利要求10的方法，其进一步包括对所述受试体给予有效量的至少一种分子，所述分子选自醛糖还原酶抑制剂(ARI)、唑泊司他、ACE抑制剂、雷米普利、山梨醇脱氢酶抑制剂、CP-470、CP-711；M-乙酰半胱氨酸(NAC)、酪氨酸磷酸酶抑制剂，例如原钒酸钠、具有胰岛素致敏活性的rexinoid核受体配体、水杨酸盐/酯、c-Jun N末端激酶(JNK)的药理抑制剂、氯氮平、奥氮平、ROS抑制剂或BAX抑制剂。
12.权利要求1的方法，其进一步包括对所述受试体给予有效量的一种分子，所述分子选自醛糖还原酶抑制剂(ARI)、唑泊司他、ACE抑制剂、雷米普利、山梨醇脱氢酶抑制剂、CP-470、CP-711；M-乙酰半胱氨酸(NAC)、酪氨酸磷酸酶抑制剂，例如原钒酸钠、具有胰岛素致敏活性的rexinoid核受体配体、水杨酸盐/酯、c-Jun N末端激酶(JNK)的药理抑制剂、氯氮平、奥氮平、ROS抑制剂或BAX抑制剂。
13.根据权利要求1的方法，其中所述生理功能包含在所述冠状组织中上调或增加ILK的活性。
14.根据权利要求1的方法，其中所述生理功能包含在所述冠状组织中上调或增加Akt的活性。
15.根据权利要求1的方法，其中所述生理功能包含在所述冠状组织中上调或增加磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的活性。
16.根据权利要求1的方法，其中所述生理功能包含在所述冠状组织中下调或减少心肌细胞的死亡。
17.根据权利要求1的方法，其中所述生理功能包含在所述冠状组织中心肌细胞的休眠。
18.根据权利要求1的方法，其中给予受试体的所述诱导剂的给药剂量在约0.001-1,000,000微克范围内。
19.根据权利要求1的方法，其中所述诱导剂的给予是通过直接注射至所述冠状组织、静脉给药、腹膜内给药、肌内给药、皮下注射、吸入、透皮或口服给药。
20.根据权利要求1的方法，其中所述诱导剂给予受试体的给药剂量在约0.1-5,000微克范围内。
21.根据权利要求1的方法，其中所述诱导剂给予受试体的给药剂量在约1-30微克范围内。
22.根据权利要求21的方法，其中所述诱导剂是Tβ4。
23.根据权利要求8的方法，其中所述LKKTET肽是Tβ4。
24.一种筛选能够按照权利要求1的方法预防冠状组织损伤的化合物的方法，其包括用候选化合物与冠状组织接触；测量所述冠状组织中至少一种所述生理功能的水平，其中与缺乏所述候选化合物的冠状组织中至少一种所述生理功能的水平相比，所述至少一种生理功能的水平增加，表明所述化合物能够治疗、预防、抑制或降低所述冠状组织的损伤。
25.根据权利要求24的方法，其中所述化合物是LKKTET肽而不是Tβ4。
26.一种筛选能够按照权利要求1的方法诱导至少一种上述生理功能的化合物的方法，其包括用候选化合物接触冠状组织；测量所述组织中的Tβ4活性，其中，与缺乏所述候选化合物的冠状组织中Tβ4活性水平相比，Tβ4活性在所述冠状组织中增加，表明所述化合物能够诱导至少一种生理功能。
全文摘要
一种治疗、预防、抑制或降低冠状组织损伤的方法，包括诱导至少一种生理功能，选自上调或增加所述冠状组织中ILK的活性，上调或增加所述冠状组织中Akt的活性，下调或减少所述冠状组织中心肌细胞的死亡，以及心肌细胞在所述冠状组织中的休眠。对需要进行该处理的受试体使用一种诱导药剂，其能够在受试体体内诱导至少一种所述生理功能。
文档编号A61K38/17GK101068562SQ200580028090
公开日2007年11月7日 申请日期2005年8月19日 优先权日2004年8月20日
发明者迪帕克·斯里瓦斯塔瓦, 依尔迪科·勃克马凯特, 安科·萨克塞纳, 阿兰·L·戈尔茨坦 申请人:德克萨斯系统大学评议委员会, 雷金纳克斯生物制药公司