专利名称：TGF－β拮抗剂限制免疫抑制剂肾毒性的用途的制作方法
技术领域：
本发明的技术领域涉及器官移植学、临床免疫学和肾脏学的领域。本发明涉及减少某些免疫抑制剂(包括环胞菌素)的肾毒性副作用的方法。
背景技术：
免疫抑制通常被用于减少组织/器官移植中发生排斥的风险以及自身免疫病和炎性疾病的疗法。环胞菌素A(CsA)是目前最广泛使用的免疫抑制剂。他克莫司(TAC)(也称FK506)和西罗莫司(也称雷帕霉素)是其它两种常用的免疫抑制剂。有关各种免疫抑制疗法的综述参见例如Schuurman et al.(2001)Modern Immunosuppressives(Milestonesin Drug Therapy)，Birkhauser，Boston；和Sayegh et al.(2001)Current andFuture Immunosuppressive Therapies Following Transplantation，KluwerAcademic Publishers。
尽管开发出了改进的治疗策略，免疫抑制剂伴随产生的不良副作用仍是一个重大的挑战。肾毒性是许多免疫抑制疗法特别是采用钙调磷酸酶抑制剂的疗法的严重并发症。
急性环胞菌素(CsA)毒性会引起肾炎，其特征是肾小球滤过率(GFR)和肾血流减少、低镁血症和肾小管损伤。同样，慢性CsA毒性会导致渐进的肾功能障碍，其特征是肾间质纤维化、肾小管腔萎缩和血管变化如动脉局部缺血。这些变化最终导致晚期肾病和肾衰竭。肾毒性例如在用他克莫司(参见例如English et al.(2002)Am.J.Transplant.，2769-273)和西罗莫司(参见例如Fervenza et al.(2004)Nephrol.Dial.Transplant.，19(5)1288-1292)治疗的移植接受者中观察到。
最近的研究已暗示转化生长因子-β(TGF-β)是某些免疫抑制剂的免疫抑制活性和/或肾毒性的介体，这些免疫抑制剂包括CsA、他克莫司和雷帕霉素(Khanna et al.(2000)Transplantation，70(4)90-694)。在CsA肾毒性的非移植模型中通过给予抗TGF-β抗体来阻断TGF-β，已证实能极大地减少总体的组织纤维化(Khanna et al.(1999)Transplantation，67882-889；Islam(2001)59498-506；Ling et al.(2003)J.Am.Soc.Nephrol.，14377-388)，但是，该抗体也会使药物的免疫抑制作用受到抑制。
已研究了许多实验策略，目的在于减少这类药物的肾毒性，同时保持其免疫抑制作用。可通过与TGF-β相关但间接的机制调节肾毒性的药物包括麦考酚酸莫酯(MMF)(Shihab et al.(2003)Am.J.Transplant.，31550-1559)、螺内酯(Feria et al.(2003)Kidney Int.，6343-52)、氯沙坦(Yang et al.(2003)Transplantation，75309-315)、维生素E(Jenkins et al.(2001)Transplantation，71331-334)、吡非尼酮(Shihab(2002)Am.J.Transplantation，2111-119)和血管紧张素受体阻断(Boffaet al.(2003)J.Am.Soc.Nephrol.，141132-1144)。但是，它们并非完全令人满意。
因此，需要有这样的治疗方式，它能让CsA或其它免疫抑制剂肾毒性减少，同时又能保持这些免疫抑制剂的免疫抑制活性。
发明概述TGF-β介导某些免疫抑制剂的免疫抑制作用和肾毒性作用。由于这种双重活性，在本发明之前，不清楚使用直接的TGF-β拮抗剂(例如抗TGF-β抗体)的辅助疗法是否能充分减少这些药物的肾毒性作用，同时又基本上不干扰它们的免疫抑制活性。
本发明提供减少免疫抑制剂肾毒性，特别是在器官移植或自身免疫病情形下减少免疫抑制剂肾毒性的方法和组合物。因此，所述方法可用于治疗正进行免疫抑制疗法的患者，以预防移植排斥或者治疗自身免疫病。
本发明在部分基于以下发现和实证，即按同种异体移植存活率来判断，低剂量而不是高剂量的抗TGF-β抗体能减轻CsA介导的肾毒性，而基本上不干扰CsA的免疫抑制活性。
在所进行的与本发明有关的实验中，给予接受心脏移植的CsA免疫抑制大鼠抗TGF-β抗体。用较低剂量(1mg/kg)的抗TGF-β抗体治疗的大鼠显示出肾毒性作用减少，而它们的移植存活率与只用CsA治疗的对照相似。在相同的条件下，较高剂量的(2.5mg/kg)的抗TGF-β抗体则几乎完全破坏CsA的免疫抑制作用。
因此，本发明提供用以改善免疫抑制剂肾毒性副作用的辅助疗法，该免疫抑制剂至少部分通过TGF-β的上调介导其免疫抑制活性。通常，这种免疫抑制剂在给药后会诱导TGF-β的表达。这种免疫抑制剂的实例包括但不限于环胞菌素、他克莫司和西罗莫司。本发明提供治疗或预防由这种免疫抑制剂所诱导的肾炎的方法。
本发明的方法包括给予需要免疫抑制而用免疫抑制剂治疗的哺乳动物TGF-β拮抗剂。TGF-β拮抗剂以治疗有效量给予，其足以减轻免疫抑制剂肾毒性作用而又基本上不干扰其免疫抑制活性。
TGF-β拮抗剂给予的剂量要使得免疫抑制剂肾毒性作用减少，同时保持免疫抑制剂的治疗功效。通常，TGF-β拮抗剂给予的剂量比不用免疫抑制剂时会被给予以治疗肾炎的建议剂量要低(例如低20％)。
在一些实施方案中，TGF-β拮抗剂是直接TGF-β拮抗剂，例如抗TGF-β抗体、抗TGF-β受体抗体或可溶性TGF-β受体。在具体的实施方案中，TGF-β拮抗剂是抗TGF-β抗体1D11、抗TGF-β抗体CAT192或抗TGF-βCAT152或者任何这些抗体的衍生物。在非限制性的优选实施方案中，TGF-β拮抗剂是美国临时申请号60/651,343中所公开的人泛特异性抗体(pan-specific antibody)如PET1073G12、PET 1074B9或PET1287A10。
本发明进一步提供检测免疫抑制剂肾毒性的方法，以及评估试验化合物或组合物减少免疫抑制剂肾毒性作用的能力的方法。这些方法包括从用免疫抑制剂治疗的哺乳动物获得生物样品，并测定一种或多种选自TGF-β、NOX-1、p22phox、RAC-1、SOD和TRX的分子的表达水平。表达水平预示着免疫抑制剂肾毒性和/或所述化合物或组合物减少免疫抑制剂肾毒性的有效性。
附图简述
图1显示的Kaplan-Meier图说明了高剂量的抗TGF-β抗体对CsA的免疫抑制作用的负面影响，及较低剂量的该抗体对肾毒性的有利影响。在用CsA的同时，接受者还每周三次用抗TGF-β抗体或对照抗体治疗(各为2.5或1.0mg/kg)。包括以下组别同基因移植物(isograft)、未治疗的同种异体移植物(allograft)、CsA治疗的同种异体移植物、CsA+对照抗体(2.5mg/kg)、CsA+抗TGF-β抗体(2.5mg/Kg)、CsA+对照抗体(1.0mg/kg)、CsA+抗TGF-β抗体(1.0mg/Kg)和同种型抗体(isotype)对照。抗TGF-β抗体在2.5mg/kg剂量消除CsA的免疫抑制作用，但在1.0mg/kg下却不会。CsA+对照抗体治疗的接受者没有显示移植排斥，但加以处死以与抗TGF-β抗体治疗的接受者进行比较。
图2显示图1所述的各治疗组中TGF-β、胶原和纤连蛋白mRNA的肾内表达水平。结果以TGF-β、胶原和纤连蛋白与持家基因β-肌动蛋白的比率表示。与同基因移植物相比，可看到CsA治疗的接受者中TGF-β、胶原和纤连蛋白mRNA的表达统计学显著增加。与CsA治疗的动物组相比，可看到CsA+抗TGF-β抗体组中TGF-β、胶原和纤连蛋白mRNA的表达统计学显著减少，而与CsA+对照抗体组却没有差别。(P值如下TGF-β*p＜0.02和**p＜0.003；胶原！p＜0.0001和！！p＜0.008；纤连蛋白#p＜0.0001和##p＜0.002.)。
图3显示MMP-2和TIMP-2 mRNA的肾内表达。结果以MMP-2和TIMP-2与持家基因β-肌动蛋白的比率表示。与同基因移植物相比，可看到CsA治疗的接受者中MMP-2和TIMP-2的表达统计学显著增加。与CsA治疗的动物组相比可看到，CsA+抗TGF-β抗体组中MMP-2的表达统计学显著减少，而与CsA+对照抗体组却没有差别。对于TIMP-2，与CsA治疗的动物组相比可看到CsA+抗TGF-β抗体组中其表达减少(尽管统计学不显著)。(P值如下MMP-2*p＜0.0002和**p＜0.004；TIMP-2！p＜0.03和！！p＜0.18)。
图4显示如图1所述用1mg/kg抗TGF-β抗体治疗的动物中TGF-β的血浆水平。与同基因移植物对照相比，用CsA治疗的动物中观察到血浆TGF-β水平统计学显著增加。与CsA治疗的动物组相比可看到，CsA+抗TGF-β抗体组中TGF-β水平统计学显著减少。(P值如下p＜0.0001和**p＜0.003)。
图5证明了TAC和/或抗TGF-β抗体对肾移植接受者中肾功能的影响。图5A显示了用0.25mg/kg TAC治疗90天的动物中或同基因移植物对照中的BUN水平。接受者在用TAC治疗的同时，还每周两次用抗TGF-β抗体或对照抗体治疗(各为1mg/kg)。包括以下组别同基因移植物对照、TAC治疗的同种移植、TAC+对照抗体和TAC+抗TGF-β抗体。与同基因移植物对照(p＜0.0001)或对照抗体相比观察到，TAC治疗的动物中BUN水平统计学显著增加。与只用TAC治疗相比，用抗TGF-β抗体治疗减少BUN水平(p＜0.01)。用对照抗体治疗也稍微减少BUN水平，但该减少没有统计学显著性。图5B显示了用TAC治疗的动物中或同基因移植物对照中的肌酸酐水平。动物按图5A所述进行治疗。与同基因移植物对照(p＜0.04)或对照抗体相比观察到，只用TAC治疗的动物中肌酸酐水平统计学显著增加。与只用TAC治疗相比，用抗TGF-β抗体治疗减少BUN水平(p＜0.02)。用对照抗体治疗也稍微减少肌酸酐水平，但减少没有统计学显著性。
图6显示抗TGF-β抗体对TGF-β、NOX-1、p22phox和Rac-1 mRNA的肾内表达的影响。动物按图5A所述进行治疗。抗TGF-β抗体抑制TAC诱导的肾内TGF-β、NOX-1、p22phox和Rac-1 mRNA表达，而对照抗体不行。
图7显示TAC对大鼠肾移植物中TGF-β、SOD和TRX mRNA表达的影响。动物按图5A所述进行治疗。在TAC治疗的大鼠移植接受者中，发现TGF-β mRNA与SOD和TRX mRNA的表达情况相反。抗TGF-β抗体抑制肾内TGF-β，但能部分恢复SOD和TRX mRNA表达。
图8显示按图5A所述治疗的动物中p22phox和NOX-1表达的蛋白质印迹分析的结果。与未处理同种异体移植(最后两泳道)和同基因移植物对照(前面两泳道)两者相比，用TAC治疗后p22phox和NOX-1的肾内表达升高。
图9显示了TAC和/或抗TGF-β抗体对肾移植接受者中TGF-β蛋白质的循环水平的影响。动物按图5A所述进行治疗。血浆样品中的TGF-β蛋白质的循环水平用ELISA进行定量。TAC治疗的接受者与同基因移植物对照相比显示出TGF-β表达的统计学显著增高。与TAC治疗的动物组相比，观察到TAC+抗TGF-β抗体组中TGF-β水平统计学显著减少；而与TAC+对照抗体治疗的接受者相比，只用TAC治疗的接受者中没有观察到TGF-β表达的统计学显著差异。(P值如下*p＜0.01和**p＜0.01)。
序列简述SEQ ID NO1-12表示如实施例所述用以评估肾脏中的基因表达水平的PCR引物。
发明详述本发明的方法包括给予用免疫抑制剂治疗的哺乳动物TGF-β拮抗剂。本发明的方法减少用免疫抑制剂治疗所伴随产生的肾毒性，但基本上不减少免疫抑制剂的免疫抑制活性。
TGF-β拮抗剂TGF-β是二硫键连接的二聚体，作为约400氨基酸(aa)的前蛋白原合成，经切割分泌产生为成熟的TGF-β。称为“潜活相关肽”(latency-associated peptide，LAP)的N末端切割片断可保持与二聚体的非共价结合，从而使TGF-β失活。体内分离出的TGF-β主要以这种失活的“潜活”形式即与LAP结合的形式存在。潜活TGF-β复合物可用几种方式来激活，例如通过结合到名为阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸/胰岛素样生长因子II接受者的细胞表面接受者来激活。结合是通过甘露糖-6-磷酸残基连接到LAP当中的糖基化位点而发生的。与接受者结合后，TGF-β即以其成熟形式释放出来。然后成熟有活性的TGF-β就可自由地结合其接受者而发挥其生物功能。II型TGF-β接受者中的主要TGF-β结合结构域已作图至19氨基酸序列(Demetriou et al.(1996)J.Biol.Chem.，27112755)。
本文所用术语“TGF-β”指TGF-β的任何一种或多种同种型(isoform)。同样，术语“TGF-β接受者”指能结合至少一种TGF-β同种型的任何接受者，除非另外指明。目前已知有五种TGF-β同种型(TGF-β1～TGF-β5)，它们相互同源(60-80％同一性)，都能形成约25kDa的同型二聚体，且都对共同的TGF-β接受者(TβR-I、TβR-II、TβR-IIB和TβR-III)起作用。TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3见于哺乳动物。TGF-β及TGF-β接受者的结构和功能情况是本领域公知的(参见例如Cytokine Reference，eds.Oppenheim et al.，Academic Press，San Diego，CA，2001)。TGF-β在各物种中非常保守。例如，大鼠和人的成熟TFG-β1的氨基酸序列近乎相同。因此，预计TFG-β的拮抗剂具有很高的物种交叉反应性。
术语“TGF-β拮抗剂”及其相关词如“抑制剂”、“中和”和“下调”是指充当TGF-β生物活性的拮抗剂的化合物(适当时指化合物的性质)。TGF-β拮抗剂可例如结合并中和TGF-β的活性；降低TGF-β表达水平；影响前体分子的稳定性和向有活性的成熟形式的转化；干扰TGF-β与一种或多种接受者的结合；或者可干扰TGF-β接受者的胞内信号转导。术语“直接TGF-β拮抗剂”一般指直接下调TGF-β的生物活性的任何化合物。某种分子如果通过与TGF-β基因、TGF-β转录物、TGF-β配体或TGF-β接受者发生相互作用来下调TGF-β的生物活性，则它就是“直接下调”TGF-β的生物活性。
用以评估TGF-β和TGF-β拮抗剂的中和生物活性的方法是本领域公知的。一些较为常用的体外生物测定法的实例包括以下(1)在软琼脂中于EGF存在下诱导NRK细胞的集落形成(Roberts et al.(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，785339-5343)；(2)诱导原代间叶细胞分化以表达软骨表型(Seyedin et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，822267-2271)；(3)抑制MvlLu貂肺上皮细胞(Danielpour et al.(1989)J.Cell.Physiol.，13879-86)和BBC-1猴肾细胞(Holley et al.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，775989-5992)的生长；(4)抑制C3H/HeJ小鼠胸腺细胞的有丝分裂发生(Wrann et al.(1987)EMBO J.，61633-1636)；(5)抑制大鼠L6成肌细胞的分化(Florini et al.(1986)J.Biol.Chem.，26116509-16513)；(6)测量纤连蛋白产生(Wrana et al.(1992)Cell，711003-1014)；(7)诱导融合到荧光素酶报道基因的纤溶酶原激活物抑制剂I(PAI-1)(Abe et al.(1994)Anal.Biochem.，216276-284)；(8)夹心酶联免疫吸附测定法(Danielpour et al.(1989)GrowthFactors，261-71)；(9)Singh et al.(2003)Bioorg.Med.Chem.Lett.，13(24)4355-4359中描述的细胞测定法。
可用于本发明方法的TGF-β拮抗剂的实例包括但不限于抗一种或多种TGF-β同种型的单克隆和多克隆抗体(美国专利第5,571,714号；WO 97/13844；WO 00/66631)；显性阴性和可溶性TGF-β接受者或抗TGF-β接受者的抗体(Flavell et al.(2002)Nat.Rev.Immunol.，2(1)46-53；美国专利第5,693,607号；美国专利第6,001,969号；美国专利第6,008,011号；美国专利第6,010,872号；WO 92/00330；WO93/09228；WO 95/10610和WO 98/48024)；LAP(WO 91/08291)；LAP结合的TGF-β(WO 94/09812)；TGF-β结合糖蛋白/蛋白聚糖如胎球蛋白(美国专利第5,821,227号)；饰胶蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖、纤调蛋白聚糖、腔蛋白聚糖和内皮糖蛋白(美国专利第5,583,103号；美国专利第5,654,270号；美国专利第5,705,609号；美国专利第5,726,149号；美国专利第5,824,655号；美国专利第5,830,847号；美国专利第6,015,693号；WO 91/04748；WO 91/10727；WO 93/09800和WO94/10187)；甘露糖-6-磷酸或甘露糖-1-磷酸(美国专利第5,520,926号)；促乳素(WO 97/40848)；胰岛素样生长因子II(WO 98/17304)；植物、真菌和细菌的提取物(EU 813875；JP8119984和美国专利第5,693,610号)；反义寡核苷酸(美国专利第5,683,988号；美国专利第5,772,995号；美国专利第5,821,234号；美国专利第5,869,462号和WO94/25588)；参与TGF-β信号转导的蛋白质，包括SMAD和MAD(EP874046；WO 97/31020；WO 97/38729；WO 98/03663；WO 98/07735；WO 98/07849；WO 98/45467；WO 98/53068；WO 98/555 12；WO98/56913；WO 98/53830；WO 99/50296；美国专利第5,834,248号；美国专利第5,807,708号和美国专利第5,948,639号)；Ski和Sno(Vogel(1999)Science，286665和Stroschein et al.(1999)Science，286771-774)；以及保留有直接抑制TGF-β生物活性能力的上述分子的任何突变体、片断或衍生物。
可用于本发明方法的TGF-β拮抗剂的实例包括小分子抑制剂，如丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，例如WO 04/21989；WO 03/87304；WO04/26871；WO 04/26302；WO 04/24159；美国专利第6,184,226号；WO 03/97639和WO 04/16606中描述的丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂。
在一些实施方案中，TGF-β拮抗剂是直接TGF-β拮抗剂，例如阻断TGF-β与其接受者结合的抗体。
本文所用的术语“抗体”指免疫球蛋白或其部分，涵括包含抗原结合位点的任何多肽，而不论来源、生产方法和其它特性如何。该术语包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体、人源化抗体、人抗体、单链抗体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗体、杂合抗体、突变抗体和CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)。术语“抗原结合结构域”指包含能与抗原的一部分或全部特异性结合或互补的区域的抗体分子部分。在抗原较大的情况下，抗体可只结合抗原的特定部分。“表位”或“抗原决定簇”是抗原分子中负责与抗体的抗原结合结构域发生特异性相互作用的部分。抗原结合结构域可包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。抗原结合结构域可由一个或多个抗体可变结构域(例如由VH结构域组成的Fd抗体片断、由VH结构域和VL结构域组成的Fv抗体片断及由VH结构域和VL结构域通过接头连接组成的scFv抗体片断)提供。术语“抗TGF-β抗体”或“抗至少一种TGF-β同种型的抗体”指特异性结合TGF-β的至少一个表位的任何抗体。术语“TGF-β接受者抗体”和“抗TGF-β接受者的抗体”指特异性结合TGF-β接受者(例如I型、II型或III型接受者)的至少一个表位的任何抗体。
可用于本发明方法的抗体要能特异性结合至少一种TGF-β同种型或结合至少一种TGF-β接受者的胞外结构域。本文所用的术语“特异性相互作用”或“特异性结合”或它们的相关词，意思是两个分子形成在生理条件下相对稳定的复合物。特异性结合的特征是高亲合力和低至中等的容量。非特异性结合通常具有低亲合力和中等至高的容量。通常，当亲合常数大于106M-1或优选大于108M-1时，则认为结合是特异性的。
在一些其它实施方案中，抗TGF-β抗体特异性结合至少一种选自以下的TGF-β同种型TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。在还其它的实施方案中，抗TGF-β抗体特异性结合至少(a)TGFβ1、TGF-β2和TGF-β3(“泛中和抗体‘)；(b)TGF-β1和TGF-β2；(c)TGF-β1和TGF-β3；(d)TGF-β2和TGF-β。在各种实施方案中，TGF-β抗体对至少一种其特异性结合的TGF-β同种型的亲合常数Ka优选大于106MU-1、107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1或1012M-1。在另外的实施方案中，本发明的抗体特异性结合与人TGF-β1、TGF-β2和/或TGF-β3基本相同的蛋白质。还设想用于人类的是所引用参考文献中描述的来自任何脊椎动物物种的非人抗体的人源化形式和完全人形式及衍生物。产生这种变体完全在技术人员的平常技艺范围内(参见例如Antibody Engineering，ed.Borrebaeck，2nd ed.，OxfordUniversity Press，1995)。
在非限制性示例性实施方案中，抗TGF-β抗体是杂交瘤1D11.16(ATCC保藏命名号HB 9849，也描述于美国专利第5,571,714号；第5,772,998号和第5,783,185号中)所产生的鼠单克隆抗体1D11。可以检索号AAB46787获得1D11重链可变区的序列。因此，在相关的实施方案中，抗TGF-β抗体是1D11的衍生物，例如所包含的CDR序列与AAB46787中相同的抗体，如人源化抗体。在另外的实施方案中，抗TGF-β抗体是通过噬菌体展示产生的完全人重组抗体，如WO00/66631、美国专利第6,492,497号及美国专利申请出版物2003/0091566和2003/0064069中所描述的CAT192和CAT152，或者是包含本文所公开的CDR序列的抗体。在还更多的实施方案中，抗TGF-β抗体是通过导向选择从1D11、CAT192或CAT152产生的抗体。
在非限制性的优选实施方案中，抗TGF-β抗体是美国临时申请号60/651,343中公开的人泛特异性抗体，如PET1073G12、PET1074B9或PET1287A10。
1D11抗体特异性结合TGF-β的所有三种哺乳动物同种型，而CAT192只特异性结合TGF-β1。1D11和CAT192的抗原亲合力分别是大约1nM和8.4pM。针对1D11(Dasch et al.(1998)J.Immunol.，1421536-1541)和CAT192的表位已作图至成熟TGF-β的C末端部分。
免疫抑制剂本发明提供用以改善免疫抑制剂肾毒性副作用的辅助疗法，所述免疫抑制剂至少部分通过上调TGF-β介导其免疫抑制活性。本文所用术语“免疫抑制剂”指能诱导免疫抑制的化合物，即它能预防或干扰免疫反应的发展。免疫抑制剂的实例包括但不限于SandimmuneTM(环胞菌素)；PrografTM；ProtopicTM(他克莫司)；RapamuneTM；NeoralTM(西罗莫司)；FTY720；CerticanTM(依维莫司、雷帕霉素)衍生物；CampathTM-1H(阿仑单抗、抗CD52抗体)；RituxanTM(利妥昔单抗、抗CD20抗体)；OKT4；LEA29Y(BMS-224818、CTLA4Ig)；吲哚基-ASC(他克莫司和子囊霉素的32-吲哚醚衍生物)；ImuranTM(硫唑嘌呤)；AtgamTM(抗胸腺细胞/球蛋白)；OrthocloneTM(OKT3；莫罗单抗-CD3)；CellceptTM(麦考酚酸莫酯)；ZenapaxTM(达克珠单抗)、CytoxanTM(环磷酰胺)、泼尼松、泼尼松龙和其它皮质类固醇丙二腈酰胺(MNAs(来氟米特、FK778、FK779))及15-脱氧精胍菌素(DSG)。
用以评估某种药物的免疫抑制活性的方法是本领域公知的。如实施例中所述，在有和没有药理学干预下移植器官在体内的存活时间长度可充当对免疫反应的抑制作用的定量度量。也可使用体外测定，例如混合淋巴细胞反应(MLR)测定法(参见例如Fathman et al.(1977)J Immunol.，118(4)1232-1238)；CD3测定(通过抗CD3抗体特异性激活免疫细胞(e.g.，OKT3))(参见例如Khanna et al.(1999)Transplantation，67(6)882-889 and Khanna et al.(1999)Transplantation，67(7)S58)及IL-2R测定(用外源加入的细胞因子IL-2特异性激活免疫细胞)(参见例如Farrar et al.，(1981)J.Immunol.，126(3)1120-1125)。
本发明对于至少部分通过上调TGF-β介导其免疫抑制活性的肾毒性免疫抑制剂特别有用。这种免疫抑制剂在给予后会诱导急性或慢性肾炎。通常，诱导作用与给予免疫抑制剂后TGF-β的表达升高有关。本发明提供治疗或预防由这种免疫抑制剂诱导的肾炎的方法。
特定的免疫抑制剂是否通过上调TGF-β介导其免疫抑制活性可用本领域公知的方法来确定，例如实施例中所描述的方法。通过上调TGF-β介导其免疫抑制活性的免疫抑制剂的具体实例包括但不限于环胞菌素、他克莫司和西罗莫司(参见例如Khanna(2000)Transplantation，70(4)690-694；Khanna et al.(1999)Transplantation，67(7)S84和Khanna et al.(1999)Transplantation，67(6)882-889)。
环胞菌素A(CAS No.59865-13-3；美国专利第3,737,433号)命名为[R-[RR*(E)}]环(L-丙氨酰-D-丙氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-N-甲基-L-缬氨酰-3-羟基-N，4-二甲基-L-2-氨基-6-辛烯酰-L-α-氨基-丁酰-N-甲基甘氨酰-N-甲基-L-亮氨酰-L-缬氨酰-N-甲基-L-亮氨酰)。自1972年就知道其免疫抑制作用(Borel，J.F.Cyclosporine.InDale et al.(eds.)Textbook of Immunology(3rd ed.)，Blackwell Scient.Publ.Oxford 1994，pp 320-329)。还知道有许多显示免疫抑制活性的其它环胞菌素及其衍生物和类似物。环胞菌素及其制剂描述于例如2004Physicians’Desk Reference(2003)Thomson Healthcare，58th ed.及以下各号美国专利中5,766,629；5,827,822；4,220,641；4,639,434；4,289,851；4,384,996；5,047,396；4,388,307；4,970,076；4,990,337；4,822,618；4,576,284；5,120,710；4,894,235。
他克莫司(FK506)是大环内酯，在其发挥各种作用的分子模式及其临床功效两方面很大程度上类似于CsA(Liu(1993)Immunol.Today，14290-295；Schreiber et al.(1992)Immunol.Today，13136-142)；但是，这些作用是在比CsA低20-100倍的剂量下显示的(Peters et al.(1993)Drugs，46746-794)。在化学上，他克莫司是[3S-[3R*[E(1S*，3S*，4S*)]，4S*，5R*，8S*，9E，12R*，14R*，15S*，16R*，18S*，19S*，26aR*]]-5，6，8，11，12，13，14，15，16，17，18，19，24，25，26，26a-十六氢-5，19-二羟基-3-[2-(4-羟基-3-甲氧基环己基)-1-甲基乙烯基]-14，16-二甲氧基-4，10，12，18-四甲基-8-(2-丙烯基)-15，19-环氧-3H-吡啶并[2，1-c][1，4]氧杂氮杂环二十三烯-1，7，20，21(4H，23H)-四酮，一水合物。他克莫司及其制剂描述于例如2004 Physicians’Desk Reference(2003)Thomson Healthcare，58th ed.及美国专利第4,894,366号；第4,929,611号和第5,164,495号。
西罗莫司(雷帕霉素)是免疫抑制性内酰胺大环内酯，可例如由吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)产生。在化学上，西罗莫司是(3S，6R，7E，9R，10R，12R，14S，15E，17E，19E，21S，23S，26R，27R，34aS)-9，10，12，13，14，21，22，23，24，25，26，27，32，33，34，34a-十六氢-9，27-二羟基-3-[(1R)-2-[(1S，3R，4R)-4-羟基-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙基]-10，21-二甲氧基-6，8，12，14，20，26-六甲基-23，27-环氧-3H-吡啶并[2，1-c][1，4]氧杂氮杂环三十一烯-1，5，11，28，29(4H，6H，31H)-五酮。西罗莫司的结构在例如Kesseler et al.(1993)Helv.Chim.Acta，76117中给出。
有多种西罗莫司衍生物和类似物及它们的制剂是公知的，在例如2004 Physicians’Desk Reference(2003)Thomson Healthcare，58thed.及WO 94/02136、WO 94/09010、WO 92/05179、WO 93/11130、WO 94/02385、WO 95/14023、WO 94/02136及美国专利第5,258,389号；第5,118,677号；第5,118,678号；第5,100,883号；第5,151,413号；第5,120,842号和第5,256,790号中有描述。
用途和给药方法本发明的方法包括将TGF-β拮抗剂与肾毒性免疫抑制剂一起给予哺乳动物。
按本发明的方法进行治疗的哺乳动物包括但不限于人类和其它灵长类动物、啮齿类动物(例如小鼠、大鼠)、兔、猫、狗、牛和猪。
按本发明的方法进行治疗的哺乳动物包括需要免疫抑制的患者，例如患有自身免疫病的患者。适于本发明方法治疗的自身免疫病的实例包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、多发性硬化、克罗恩氏病(炎性肠病)、I型糖尿病、重症肌无力、牛皮癣、格雷夫斯氏病、贝格氏病、硬皮病、斯耶格伦氏综合征、关节强直性脊椎炎、古德帕斯彻氏综合征、自身免疫性溶血性贫血、艾迪逊氏病、桥本甲状腺炎、特发性血小板减少性紫癜、恶性贫血和自发性不育症。
按本发明的方法进行治疗的哺乳动物还包括需要免疫抑制的患者，例如有器官或组织移植物而要进行免疫抑制治疗的患者。“移植物(transplant)”指任何移植物(graft)或组织或者器官的全部或部分，或者对于接受者(宿主)而言外来的细胞。移植物的实例包括但不限于心脏、肾脏、肺、肝脏、角膜、骨髓、血管和胰岛细胞移植物。移植物可来自与接受者相同的物种(同种异体移植物)，或者来自接受者物种以外的物种(异种移植物)。
对移植患者的免疫抑制处理是从围手术期和紧接着移植后的诱导期开始的。诱导治疗是紧接着手术后进行(不过往往紧接在手术前进行)的为期约两周的加强免疫抑制过程，目的是在移植后“切断”免疫系统，以减少发生加速排斥和急性排斥的可能性。然后在同种异体移植物的寿命期间内继续进行维持治疗。诱导策略和维持策略可能使用到特定剂量的不同免疫抑制剂，或者它们的剂量经过调整以便获得能提供最佳移植存活率的治疗水平。在某些实施方案中，TGF-β拮抗剂在免疫抑制治疗的诱导期、在维持期或者在这两期给予患者。
TGF-β拮抗剂以治疗有效量给予，其足以减轻免疫抑制剂肾毒性作用而又基本上不干扰其免疫抑制活性。
术语“足以减轻肾毒性作用”指减慢或逆转因免疫抑制剂造成的肾功能损失或肾结构劣化。“肾功能”指肾脏执行其生理功能如压滤、选择性再吸收、肾小管分泌和/或全身血压调节的能力。
用以评估肾功能的方法是本领域公知的，包括但不限于对全身血压和肾小球毛细血管压、蛋白尿(例如清蛋白尿)、微观和宏观血尿素、血清肌酸酐水平(例如估计人的肾功能的一个准则是把2.0mg/dl的肌酸酐水平等同于50％的正常肾功能，4.0mg/dl则等同于25％)、肾小球滤过率(GFR)(例如肌酸酐清除率)下降及肾小管损害程度的测量。
有关肾功能及疾病状态的详细综述参见The KidneyPhysiologyand Pathophysiology，eds.Seldin et al.，3rd ed.，Lippincott Williams&Wilkins Publishers，2000。通常，每24小时排泄到尿中的蛋白质小于0.15g。几乎所有类型的肾病都会造成轻度(最多500mg/天)至中度(最多4g/天)的蛋白质向尿液的泄漏。清蛋白在尿液中的正常浓度低于1.0mg/dl。通常认为尿清蛋白30-300mg/dl属微量白蛋白尿，300mg/dl及以上属大量白蛋白尿。血清肌酸酐的正常值男人是0.6-1.5mg/dl，女人是0.6-1.1mg/dl。肌酸酐水平、肾功能和肾病的阶段之间的关系在表1中显示。
表1
本发明的方法可特别适用于患有至少部分由免疫抑制剂肾毒性所致的肾功能不全、肾衰竭或晚期肾病的患者。在进行免疫抑制治疗的患者中，其它指征可包括肌酸酐清除水平低于97(男性)和88(女性)ml/min，血尿素20-25mg/dl或更高。此外，本发明治疗法可用于患有微量白蛋白尿、大量白蛋白尿和/或每24小时周期的蛋白尿水平超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10g或以上，和/或血清肌酸酐水平约1.0、1.5、2.0、2.5、3、3.5、4.0、4.5、5、5.5、6、7、8、9、10mg/dl或更高的患者。
本发明的方法可用来减慢或逆转肾功能与对照受验者相比低于正常值达25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或更高的患者中肾病的进展。在一些实施方案中，与对照受验者相比，本发明方法减慢肾功能的损失达至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更高。在其它实施方案中，与对照受验者相比，本发明的方法改进患者的血清肌酸酐水平、蛋白尿和/或尿清蛋白排泄达至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或更高。用以评估肾功能的非限制性示例性方法在本文中和例如WO 01/66140中有描述。
用以评估肾结构劣化的方法也是公知的。示例性方法在实施例中描述。这种方法包括肾显像(例如MRI、超声波)或肾活组织检查的组织学评价。在一些实施方案中，本发明的方法例如按肾小管间质或肾小球损害的范围和/或肾纤维样变性(例如胶原和纤连蛋白的沉积)的程度来判断，可减少肾结构的劣化。在一些实施方案中，本发明的方法改进结构变化达至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或更高。
主治医师须确定TGF-β的准确剂量和确切方案。一般来说，TGF-β拮抗剂的剂量应使得因给予拮抗剂所造成的排斥风险的增加不超过治疗上可接受的程度(即拮抗剂基本上不干扰免疫抑制剂的免疫抑制活性)。此外，剂量应使得免疫抑制剂肾毒性的减少是治疗上可接受的。例如，维持期排斥率的增加不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％可以是治疗上可接受的。
在本发明的方法中，TGF-β拮抗剂通常以治疗有效剂量给予，所述治疗有效剂量比不存在免疫抑制剂时推荐给予的剂量要低。在某些实施方案中，该剂量比不存在免疫抑制剂时推荐治疗肾炎的剂量低至少30％、40％、50％、60％、70％或更多。在某些实施方案中，TGF-β拮抗剂的治疗有效剂量比不存在免疫抑制剂时所给予的最大治疗有效剂量低至少30％、40％、50％、60％、70％或更多。
在某些实施方案中，TGF-β拮抗剂当在啮齿动物中给予，例如在如实施例所述的条件下给予时，所给予的剂量低于相当于1D11抗体的2、1.9、1.8、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2或1.0mg/kg体重的剂量。主治医师须确定TGF-β拮抗剂的准确剂量和确切方案以及辅助疗法。作为起点，抗TGF-β抗体、抗TGF-β接受者抗体、可溶性TGF-β受体或其它TGF-β拮抗剂的治疗有效剂量可在0.005-50、0.05-5或0.5-5mg/kg/天的范围内。
可用本领域公知的换算因子(参见例如Freireich et al.(1966)Cancer Chemother.Reports，50(4)219-244和表2的当量表面积剂量因子)，对在一种动物中获得的治疗有效剂量加以换算，以用于另一种动物，包括人类。
表2
“给予(给药)”并不限于任何具体的制剂、传递系统或途径，可包括例如胃肠外(包括皮下、静脉内、骨髓内、关节内、肌肉内或腹膜内注射)、直肠、局部、透皮或口服(例如用胶囊剂、混悬剂或片剂)给药。给药于个体可以以单剂量或反复给药的方式进行，且可用多种药物组合物的任何一种来进行，所述药物组合物含有生理上可接受的盐形式，和/或具有可接受的药物载体和/或添加剂作为药物组合物的一部分。生理上可接受的盐形式及标准的药物制剂技术和赋形剂是公知的(参见例如Physicians’Desk Reference2003，57th ed.，Medical Economics Company，2002和RemingtonThe Science andPractice of Pharmacy，eds.Gennado et al.，20th ed，Lippincott，Williams&Wilkins，2000)。
也可通过基因治疗的手段实现拮抗剂向个体的给予，在基因治疗中，将编码拮抗剂的核酸序列体内给予患者，或者体外给予细胞后将细胞引入到患者中，拮抗剂(例如反义RNA、可溶性TGF-β受体)就由其编码核酸序列的表达而产生。进行基因治疗以递送TGF-β拮抗剂的方法已有描述，参见例如Fakhrai et al.(1996)Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，932909-2914。如例如美国专利申请出版物2003/0180301中所描述，TGF-β拮抗剂的给予可通过使用包含其编码cDNA的载体进行基因转移来实现，最优选编码TGF-β II型受体(rsTGFBIIR)或III型受体(rsTGFBIIIR)的胞外域的cDNA。
TGF-β拮抗剂和免疫抑制剂可同时给予或依次给予，依次给予的间隔可重叠或不重叠。在依次给予的情况下，TGF-β拮抗剂和免疫抑制剂可按任何顺序给予。拮抗剂可作为单一活性化合物给予，或者与其它化合物或组合物联合给予。可使用Physicians’Desk Reference中指明的免疫抑制剂的具体剂量。
本发明进一步提供在需要免疫抑制并已给予免疫抑制剂进行免疫抑制的哺乳动物中检测免疫抑制剂(例如CsA、TAC、雷帕霉素或其它免疫抑制剂)的肾毒性的方法。该方法包括从哺乳动物获得生物样品，并测定一种或多种选自TGF-β、NOX-1、p22phox、RAC-1、SOD和TRX的分子的表达水平。本发明进一步提供在需要免疫抑制并已给予免疫抑制剂进行免疫抑制的哺乳动物中检测免疫抑制剂(例如CsA、TAC、雷帕霉素或其它免疫抑制剂)的肾毒性的方法。
本发明还进一步提供评估试验化合物或组合物(例如TGF-β拮抗剂如抗TGF-β抗体)减少免疫抑制剂肾毒性作用的能力的方法。这些方法包括从已被给予免疫抑制剂和目标试验化合物或组合物的哺乳动物获得生物样品，并测定一种或多种选自TGF-β、NOX-1、p22phox、RAC-1、SOD和TRX的分子(一种、两种、三种、四种、五种或所有六种)的表达水平。
表达水平超出适当的对照则预示着免疫抑制剂肾毒性和/或所述化合物或组合物减少免疫抑制剂肾毒性的有效性。例如，表达水平与适当的对照相差20％、30％、40％或5％，或者至少2、4、5或10倍，则表明免疫抑制剂已诱导了肾毒性和/或试验化合物或组合物能有效减少该肾毒性。表达水平可例如通过任何合适的方法在蛋白质和/或mRNA水平上测定。
所获得的生物样品可例如是组织样品(例如在一些实施方案中是肾活组织检查样品)、血液或血清。
以下实施例提供本发明的示例性实施方案。本领域普通技术人员会认识到，可作出多种修改和变化而不改变本发明的精神或范围。这种修改和变化涵括在本发明的范围内。实施例并不以任何方式限制本发明。
实施例材料和方法(第1部分)以下材料和方法用于实施例1和2。
实验分组大鼠分成六组(每组n＝6)，包括(1)未处理的对照；(2)2.5mg/kg CsA；(3)2.5mg/kg CsA+2.5mg/kg对照抗体；(4)2.5mg/kg CsA+2.5mg/kg抗TGF-β抗体；(5)2.5mg/kg CsA+1.0mg/kg抗TGF-β抗体；(6)同基因移植物对照。
从移植日起在整个实验过程中，用CsA以2.5mg/kg(肌肉内)的剂量实现免疫抑制。每隔三天通过腹膜内注射给予抗TGF-β抗体或对照抗体，至处死或发生器官排斥时为止。
预备和移植按Hosenpud et al.(2000)Transplantation，692173-2178中的描述，对整个研究群体进行异位心脏移植。供体大鼠进行肝素化(1000单位，腹膜内)，并用戊巴比妥钠(50mg/kg，腹膜内注射)麻醉。作出腹部切口，从胸腔延伸，除去胸壁。对心脏、主动脉和肺动脉进行钝器解剖。将肺静脉和下腔静脉结扎，将移植物切除，放入冰冻的生理盐水中。然后用戊巴比妥钠(50mg/kg，腹膜内注射)将接受者大鼠麻醉。进行中线剖腹手术。将腹部主动脉和腔静脉切开，并用直血管夹夹住，防止出血。进行纵向主动脉切开术和静脉切开术，长度大约5mm。用标准的微血管技术，以8-0脯氨酸缝线进行心脏主动脉与腹部主动脉和肺动脉与下腔静脉的端侧吻合。完成止血，并用3-0 VicrylTM缝线封住切口。
动物监测、处死、组织收获每天监测大鼠同种异体移植的减慢和失败的迹象。然后用戊巴比妥钠(50mg/kg，腹膜内注射)将它们麻醉。通过自然心室内穿刺(native heart intraventricular puncture)给动物放血。用ELISA试剂盒(Promega，Madison，WI)测定血浆样品的TGF-β蛋白质。获取两颗肾脏(一颗用于基因表达，一颗用于组织学和免疫组织化学)。
免疫抑制方案在适当的组别中使用CsA，实现免疫抑制。在整个研究过程中CsA以2.5mg/kg的剂量加或不加抗TGF-β抗体(1D11)或对照抗体来使用。每隔三天通过腹膜内注射给予抗TGF-β抗体或对照抗体进行处理，至处死或发生器官排斥时为止。
对照抗体(13C4)也是能特异性结合志贺毒素的鼠单克隆抗体(IgG1)。两种抗体都由Genzyme Corporation生产和纯化。确认抗体无可检测出的内毒素。
大鼠血浆中TGF-β蛋白质的测量TGF-β蛋白质按先前的描述(Khanna et al.(1999)Transplantation，67882-889)测量。将得自大鼠的血浆分离并保藏于-70℃下。用市售的TGF-β1特异性试剂盒(Promega，Madison，WI)通过夹心ELISA对酸激活样品测定TGF-β蛋白质。
TGF-β1的组织病理学和免疫组织化学每只动物取一颗肾脏用福尔马林固定并植入石蜡。用苏木精、伊红和Masson三色染色评估组织学变化。用标准的免疫组织化学方法(Khanna et al.(1999)Transplantation，67882-889)鉴定TGF-β。将用福尔马林固定并植入石蜡的组织切成5μm切片，用二甲苯脱石蜡，用梯度的(graded)乙醇-PBS复水。用甲醇/过氧化物(18∶1vol/vol)封闭内源过氧化物酶活性30分钟后，用稀释于PBS(补加10％正常马血清和3％BSA)的1.5％亲合素/生物素封闭非特异性结合1小时。然后将组织切片与1D11 mAb(50mg/ml)一起在上述PBS中4℃温育过夜。玻片用PBS多次洗涤后，在室温下与1∶1000稀释的生物素标记抗小鼠IgG马抗血清温育1小时，再在PBS中充分洗涤，接着在ABC溶液中洗涤30分钟。然后将玻片在二氨基联苯胺(DAB)中显影10分钟，用水清洗10分钟。然后用苏木精对玻片进行复染色，接着在梯度的乙醇-二甲苯中脱水。将玻片用PermountTM封片以便进行评估。对每组样品的组织病理学变化和免疫组织化学染色情况进行评级。免疫染色的强度按0(无染色)到4+(最大染色)进行评级。
通过反转录和聚合酶链反应(PCR)检测肾组织中的mRNA用SV TotalTMRNA分离系统(Promega Madison，USA)，从小块的大鼠肾组织分离总RNA，通过260/280-nm比率鉴定RNA的质量。以用于RT-PCR的Superscript First Strand SynthesisTM系统(LifeTechnologies Rockville MD，USA)，将1微克RNA反转录成cDNA。用1μl的cDNA及各2μl的2.5mM编码和非编码寡核苷酸引物及Platinum PCR SupermixTM(Life Technologies，Rockville MD，USA)，进行聚合酶链反应(PCR)扩增。所用的引物序列和对应的参考文献如下所列。
1)TGF-β1(Qian et al.(1990)Nucleic Acid Res.，183059)
编码ACG CCT GAG TGG CTG TCT TTT(SEQ ID NO1)非编码ACG TGG AGT TTG TTA TCT TTG(SEQ ID NO2)2)β-肌动蛋白(Ponte et al.(1984)Nucleic Acids Res.，121687)编码GAT CTG GCA CCA CAC CTT CTA(SEQ ID NO3)非编码GCA GGA TGG CGT GAG GGA GAG(SEQ ID NO4)3)胶原I(Frankel et al.(1988)DNA，7347-354)编码CCC ACG TAG GTG TCC TAA AGT(SEQ ID NO5)非编码CCG TGG TGC TAA AAT AAT AAA(SEQ ID NO6)4)纤连蛋白(Schwarzbauer(1987)EMBO J.，62573-2580)编码ATG ATG AGG TGC ACG TGT GT(SEQ ID NO7)非编码GAT GGG GTC ACA TTT CCA TC(SEQ ID NO8)5)MMP-2(Pollock et al.(1995)J.Biol.Chem.，27018786-18796)编码GTG CTG AAG GAC ACA CTA AA(SEQ ID NO9)非编码TTG CCA TCC TTC TTT TCA AA(SEQ ID NO10)6)TIMP-2(Battaglia et al.(1994)Exp.Cell Res.，213398-403)编码AAA CGA CAC TTA TGG CAA AC(SEQ ID NO11)非编码ACA GGA AGC GTC ACT TCT CT(SEQ ID NO12)为了这种基因表达的半定量估计，要对每个引物对进行循环分析，以确定最佳扩增的循环数。将PCR产物在1％琼脂糖凝胶电泳中拆分。在紫外光下显现溴化乙锭染色的特定条带并拍照。用Alpha-ImagerTM(Alpha Innotech Corp.，San Leandro，CA，USA)对特定条带进行光密度分析，数据以特定基因与β-肌动蛋白的比率表示。
数据分析数据以平均值±SEM表示。然后运用方差分析对适当组别之间的差异进行分析。
实施例1 抗TGF-β抗体对CsA的免疫抑制作用的影响用于这些研究中的大鼠异位心脏移植模型应用了完全错配的株系组合WF(RT1u)到LEW(RT11)，故需要长期进行免疫抑制以防止发生排斥。给予TGF-β中和抗体或同种型(isotype)匹配对照抗体，以确定TGF-β表达是否会影响在前30天内CsA治疗动物中的同种异体移植物存活。
未治疗的动物平均在移植后第11天发生移植物排斥(n＝6，11±1.5)。与此对比，CsA治疗动物的移植物平均存活117天(n＝6，117±9，p＜0.001)。为更好地了解TGF-β在慢性排斥的发病机理中的角色，心脏移植接受者在移植后三天开始，每周三次给予1.0或2.5mg/kg的抗TGF-β抗体。对照抗体以相同的浓度和剂量方案给予。未治疗同种异体移植物组和用CsA+2.5mg/kg抗TGF-β抗体治疗的组之间在存活率上没有观察到统计学显著差异，平均存活时间为12.7±1.2天(图1)。CsA+2.5mg/kg对照抗体没有发生排斥，但为比较组织学变化，该组和CsA+抗TGF-β抗体治疗动物在相近的日期处死。
形成鲜明对比的是，注射1.0mg/kg抗TGF-β抗体的动物不像接受CsA+2.5mg/kg抗TGF-β抗体的动物那样发生排斥，平均存活时间是99±8天。这与更高抗体组相比高度显著(p＜0.01)。此时所得的数据强有力地支持了以下假设CsA的免疫抑制作用是通过TGF-β介导的，因为抗TGF-β抗体在2.5mg/kg的浓度下完全消除CsA的功效。目前所得的数据证明，注射较低剂量的抗TGF-β抗体的大鼠其肾病理学变化较不严重，这大概是因为TGF-β的纤维发生特性被抗TGF-β抗体中和。
实施例2 抗TGF-β抗体对CsA的肾毒性作用的影响进行这些实验是研究TGF-β在CsA肾毒性作用中的角色。接受者在用CsA治疗的同时，也用TGF-β或对照抗体(1.0mg/kg)每周三次进行治疗，直到发生排斥时为止。包括以下组别未治疗的同种异体移植物；CsA治疗的同种异体移植物；CsA+对照抗体(1.0mg/kg)治疗的同种异体移植物和CsA+抗TGF-β抗体(1.0mg/Kg)治疗的同种异体移植物及同种型对照。
肾功能在所研究的所有实验大鼠动物处死后，通过定量获得血浆的肌酸酐和血尿素氮(BUN)水平来测量肾功能。定量用Sigma(St.Louis，USA)的试剂盒来进行。CsA治疗动物与同基因移植物对照相比BUN水平升高(18.6±0.85对比12.6±0.4mg/dl；p＜0.0001)，CsA+抗TGF-β抗体治疗的动物中观察到BUN水平下降(13.8±0.63，p＜0.03)，但CsA+对照治疗的动物却没有下降(17.8±0.45)。观察到CsA治疗的接受者与同基因移植物相比血清肌酸酐显著增加(0.75±0.03对0.43±0.2mg/dl；p＜0.0001)。与BUN水平类似的是，用CsA+抗TGF-β抗体治疗的动物(0.49±0.06.p＜0.003)显示出肌酸酐水平下降，而对照抗体治疗的动物没有(0.68±0.08)。
TGF-β、胶原和纤连蛋白mRNA的肾内表达图2的结果(表示为基因/β-肌动蛋白比率，每组n＝6)显示了加或不加抗TGF-β抗体或对照抗体的CsA长期治疗对TGF-β1、胶原和纤连蛋白的肾内mRNA表达的作用。
TGF-β与同基因移植物相比，CsA长期治疗导致TGF-β mRNA的肾内表达增加(p＜0.01)。在同基因移植物和用CsA+抗TGF-β抗体(1.0mg/kg)治疗的接受者之间TGF-β mRNA表达没有差异(p＝0.12)；但在CsA治疗的接受者和CsA+抗TGF-β抗体(2.5mg/kg)治疗的接受者之间观察到显著差异(p＜0.003)。在CsA治疗的接受者和CsA+对照抗体治疗的接受者之间没有观察到差异。
胶原与同基因移植物相比，CsA长期治疗导致胶原mRNA的肾内表达增加(p＜0.0001)。在CsA治疗的接受者和CsA+抗TGF-β抗体治疗的接受者之间观察到显著差异(p＜0.008)(图2)。在CsA治疗的接受者和CsA+对照抗体治疗的接受者之间没有观察到差异。
纤连蛋白在纤连蛋白mRNA上也获得相似的结果(图2)，与同基因移植物相比，CsA长期治疗导致纤连蛋白mRNA的肾内表达增加(p＜0.0001)。在CsA治疗的接受者和CsA+抗TGF-β抗体治疗的接受者之间观察到显著差异(p＜0.002)。在CsA治疗的接受者和CsA+对照抗体治疗的接受者之间没有观察到差异。
MMP-2和TIMP-2的肾内表达图3的结果显示，与同基因移植物相比，CsA长期治疗导致MMP-2 mRNA的肾内表达增加(p＜0.0002)。在CsA治疗的接受者和CsA+抗TGF-β抗体治疗的接受者之间观察到显著差异(p＜0.004)。在CsA治疗的接受者和CsA+对照抗体治疗的接受者之间没有观察到差异。抗TGF-β抗体治疗的接受者显示出减少的TIMP-2 mRNA肾内表达，但没有统计学差异。在CsA治疗的接受者和CsA+对照抗体治疗的接受者之间没有观察到差异。
抗TGF-β抗体对TGF-β蛋白质的循环水平的影响图4的结果显示，与同基因移植物相比，CsA长期治疗导致TGF-β蛋白质的循环水平显著增加(p＜0.0001)。同基因移植物和CsA+对照抗体治疗的接受者之间TGF-β水平没有差异；但是在CsA治疗的接受者和CsA+抗TGF-β抗体治疗的接受者之间则观察到统计学显著差异(p＜0.003)。
抗TGF-β抗体对TGF-β蛋白质的肾内表达的影响在CsA治疗的接受者中观察到肾内TGF-β蛋白质表达显著更高(3+-4+)的染色，这在用对照抗体+CsA治疗的组中也一样。用CsA+抗TGF-β抗体(1.0mg/kg)治疗的动物中TGF-β蛋白质染色降低，但仍比同基因移植物对照略高。
抗TGF-β抗体对肾组织学的影响用CsA治疗导致的组织病理学变化与接受长期CsA治疗的患者类似。用I)单独CsA；II)CsA+对照抗体；和III)CsA+抗TGF-β抗体(1.0mg/kg)治疗的心脏移植接受者大鼠中，对来自其的肾组织的PAS和H&E染色玻片进行组织病理学分析。在CsA治疗的动物和CsA+对照抗体治疗的动物中发现了肾小管空泡形成和血管变化，包括血管结构的PAS染色增加。尽管不是所有的III组动物都具有完全正常的肾组织学结构，但在这组中变化只是偶然观察到并且不突出。抗TGF-β抗体治疗的接受者中PAS染色也减少。这些结果证实CsA治疗的动物和CsA+对照抗体治疗的动物中发生肾小管变化和血管变化，包括基膜增厚和空泡形成。
材料和方法(第2部分)以下材料和方法用于实施例3-9。
实验分组将Lewis(LEW RT11)大鼠分成以下五组(1)未治疗的同种异体移植对照；(2)未治疗的同基因移植物移植对照；(3)TAC；(4)TAC+抗TGF-β抗体；(5)TAC+对照抗体。
TAC以0.25mg/kg肌肉内给予90天；抗TGF-β抗体1D11以1mg/kg每周给予两次。所用的对照抗体是13C4。
大鼠肾移植将LEW RT1l或Wistar-Furth WF RT1u供体肾脏移植到LEW RT11接受者中分别进行同基因移植(isogeneic transplantation)和同种异体移植(allogeneic transplantation)。(LEW RT11和WF RT1u)大鼠代表了在主要和次要组织相容性基因座上的完全遗传差异。
移植如下进行。肾供体大鼠腹膜内注射50mg/kg戊巴比妥诱导全身麻醉后，进行中线剖腹手术。左肾在其血管蒂上松动，分开输尿管。左肾进行肝素化(1,000U，腹膜内注射)后取出，带大量主动脉和腔静脉血管头(cuff)。然后用冰冻盐水冲洗该肾脏，保存在冰上以备移植。接受者(如上所述进行麻醉)通过中线剖腹手术暴露出肾下主动脉和腔静脉。用标准的微血管外科技术，使供体左肾与接受者血管发生端侧吻合，恢复血液流动。输尿管插入膀胱壁，用一小段PE50管固定。
动物监测、处死、组织收获每天监测关在代谢笼中的大鼠发生移植排斥的迹象(即体重显著增加和排尿量显著减少)。肾功能通过血清肌酸酐和BUN水平的变化来检测。在发生排斥时或者观察期结束时，用戊巴比妥钠(50mg/kg，腹膜内注射)将动物麻醉。通过心脏穿刺放血后，如下所述用常规的组织学方法、免疫组织化学方法、蛋白质印迹法和RT-PCR对同基因移植物和同种异体移植物进行分析。
BUN和肌酸酐水平为评估肾功能，分别用Wako Chemicals，Richmond，VA和OxfordBiomedical Research，Oxford，MI的市售试剂盒测定血清BUN和肌酸酐。
同种异体移植物组织学、免疫组织化学及组织病理学变化的定量每只动物取移植肾脏的一部分用福尔马林固定并植入石蜡。用苏木精和伊红(H&E)及过碘酸希夫(PAS)染色评估组织学变化。用标准的程序对肾组织学变化进行定量。肾小球损伤的严重程度按Khannaet al.(2000)Transplantation，731543-1549的描述进行评分。简言之，每个样本每个视野计数至少50-60个肾小球，按五级分制对损伤进行评分(0，无增殖，组织学结构近乎正常；1，节段损伤约为25％；2，节段损伤大于25％但小于50％；3，纤维化损伤伴弥漫性增殖；4，几乎完全的纤维化变化)。PAS染色用来测定胞外基质蛋白质积累的程度(未评分)。对H&E染色玻片中的小叶间动脉及损伤进行评分。
肾组织中的血浆TGF-β蛋白质和免疫化学血浆TGF-β蛋白质水平按Khanna et al.(1999)Transplantation，67882-889的描述进行测量。TGF-β蛋白质的肾内表达基本上如Khanna et al.(2000)Transplantation，731543-1549；Khanna et al.(2002)Kidney Intl.，622257-63和Khanna et al.(1999)Transplantaion，67614-619所述进行免疫组织化学法检查。将用福尔马林固定并植入石蜡的组织切成细小的切片，用二甲苯脱石蜡，用梯度的乙醇-磷酸缓冲盐水(PBS)复水。用甲醇/H2O2(18∶1vol/vol)封闭内源过氧化物酶活性30分钟后，用稀释于PBS(补加10％正常马血清和3％BSA)的1.5％亲合素/生物素封闭非特异性结合1小时。然后将组织切片与特异性第一抗体(50mg/ml)一起在上述PBS中4℃温育过夜。玻片在PBS中充分洗涤后，在室温下与1∶1000稀释的生物素标记抗小鼠IgG马抗血清温育1小时，再在PBS中充分洗涤，接着在ABC溶液中洗涤30分钟。然后将玻片在二氨基联苯胺(DAB)中显影10分钟，用水清洗10分钟。然后用苏木精对玻片进行复染色，接着在梯度的乙醇-二甲苯中脱水。
将玻片用PermountTM封片以便进行评估。对每组的样品进行组织病理学变化和免疫组织化学染色的评级。免疫染色的强度按0(无染色)到4+(最大染色)进行评级。由两个人按以下各参数对每只动物的肾组织学严重程度进行盲评级肾间质纤维化、动脉变化和肾小球硬化。
通过实时PCR(RT-PCR)检测mRNA用Bio-Rad iCyclerTM系统(Bio-Rad，Hercules，CA)进行RT-PCR。用Promega(Madison，NJ)的试剂盒从肾组织分离出RNA，并用Invitrogen(Carlsbad，CA)的cDNA合成试剂盒反转录成cDNA。对引物运行常规PCR，95℃ 20秒和60℃ 1分钟，共40个循环，然后在含溴化乙锭的琼脂糖凝胶中分离，以检测引物的特异性。实时PCR用SYBR Supermix试剂盒(Bio-RAD)来运行(95℃ 20秒和60℃ 1分钟，共40个循环)。通过系列稀释模板cDNA检查PCR效率。收集解链曲线数据以检查PCR特异性，每次测定中包括适当的阴性对照。将每个样品的每个基因的mRNA水平归一化到β-肌动蛋白mRNA，并按Khanna et al.(2005)Nephron Exp.Nephrol.，101119-126中的描述以2[(Ct/β-肌动蛋白-Ct/目的基因)]表示。
蛋白质印迹将冰冻的组织在用冰预冷的PBS中匀化，所述PBS含1％TritonX-100、1mM苯基甲基磺酰氟、35ng/ml抑胃酶肽A和10ng/ml亮抑蛋白酶肽。离心后，取50μg蛋白质按Khanna et al.(2005)NephronExp.Nephrol.，101119-126的描述进行SDS PAGE电泳。将印迹用多克隆抗p22phox抗体(R5554，由Marsh Lab，Bozeman，MT赠送)或抗NOX抗体(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)的适当稀释液探测，以1∶5,000稀释度与辣根过氧化物酶缀合的第二抗体一起温育，用增强化学发光显示。
统计分析采用ANOVA和Student t检验评估各组TGF-β基因表达和血浆水平的平均值之间的差异。分析是用GraphPad，San Diego，CA的统计软件程序进行的。结果以平均值±SEM表示，按p＜0.05的水平确定双尾显著性。
实施例3抗TGF-β抗体减少TAC对肾功能的影响治疗90天后的TAC治疗的大鼠与移植后90天收获的同基因移植物对照相比，BUN水平升高(29.9±1.3对17.3±1.3mg/dl；p＜0.0001)(图5A)。抗TGF-β抗体(21.3±0.9mg/dl，p＜0.01)而不是对照抗体(26.6±1.1mg/dl)降低BUN水平。类似地，观察到TAC治疗的接受者与时间相配的同基因移植物移植对照相比，血清肌酸酐显著升高(0.83±0.06对0.52±0.09mg/dl；p＜0.04)。类似于BUN水平，抗TGF-β抗体(0.48±0.08mg/dl；p＜0.02)而不是对照抗体(0.78±0.09mg/dl)抑制TAC诱导的肌酸酐水平(图5B)。
实施例4抗TGF-β抗体与TAC诱导的TGF-β、NOX-1、p22phox和RAC-1mRNA肾内表达通过RT-PCR分析来自(1)同基因移植物、(2)TAC、(3)TAC+抗TGF-β抗体和(3)TAC+对照抗体治疗的动物在移植后90天肾组织中TGF-β、NOX-1和p22phox的肾内表达情况。用TAC治疗增加了TGF-β(37倍)、NOX-1(18倍)、p22phox(31倍)和RAC-1(20倍)的mRNA表达。基因表达的增加被抗TGF-β抗体减少(分别为p＜0.01；p＜0.008；p＜0.04和p＜0.03)，而不被对照抗体减少(图6)。结果通过对比同基因移植物对照来表示。
实施例5 TGF-β、SOD和TRX的差异化肾内mRNA表达为进一步研究用TAC长期治疗对抗氧化剂基因的影响，测定了SOD和TRX的肾内mRNA表达情况。数据证实，与同基因移植物对照相比，TAC治疗的大鼠中SOD和TRX mRNA下降，而TGF-βmRNA增加(图7)。用TAC治疗导致TGF-βmRNA增加37倍，而SOD和TRX的mRNA表达分别下降27倍和80倍。SOD mRNA被抗TGF-β抗体部分逆转，而TRX mRNA则完全被逆转。
实施例6 p22phox和NOX-1蛋白质的移植物内表达对来自同基因移植物、未治疗的同种异体移植和用TAC治疗的动物的肾组织中p22phox和NOX-1蛋白质的表达进行分析。蛋白质裂解液(10μg)电泳后转移到硝基纤维素纸，用抗p22phox和抗NOX-1抗体探测。如图8所示，用TAC治疗导致p22phox和NOX-1的移植物内表达增加。
实施例7 用TAC治疗导致肾移植物中的肾毒性特异性组织学变化通过对H&E和PAS染色的肾薄层切片进行组织病理学检查，评估TAC、TAC+对照抗体和TAC+抗TGF-β抗体治疗对形态学变化的作用。
对照大鼠(同基因移植物)的肾脏的光学显微镜检结果显示正常的肾小球、入球小动脉和小管细胞。与此成鲜明对比的是，接受TAC的大鼠的肾组织显示明显的组织学变化，包括严重至中度的epicalblebbing、透明化作用、肾小球基膜增厚、肾小管间质纤维化图案及入球小动脉和叶间动脉末端部分的动脉病。这些变化在共给予TAC和抗TGF-β抗体时没有观察到。但是，在用TAC+对照抗体治疗的动物中看到类似的变化。PAS染色切片还显示基膜增厚现象，而与此对比在抗TGF-β抗体治疗的接受者中则近乎正常。观察到了抗TGF-β抗体对TAC诱导变化的逆转作用。TAC+对照抗体治疗的动物的组织学结构与只用TAC治疗的动物没有不同。在TAC和TAC+对照抗体治疗的接受者中观察到透明化作用、动脉病肾小管间质纤维化和肾小球基膜增厚，但在TAC+抗TGF-β抗体治疗的接受者中却没有观察到。在TAC和TAC+对照抗体治疗的大鼠移植接受者中看到肾毒性特有的近端肾小管上皮细胞特异性变化，但在同基因移植物或TAC+抗TGF-β抗体治疗的大鼠中却没有看到。定量分析证明TAC治疗的接受者与同基因移植物相比有统计学显著(p＜0.036)的差异，而同基因移植物与TAC+抗TGF-β抗体治疗的同种异体移植物之间没有统计学差异。
实施例8 TAC增加TGF-β的肾内表达来自用TAC、TAC+抗TGF-β抗体、TAC+对照抗体治疗的肾移植接受者或者未治疗的同种异体移植接受者的肾组织中TGF-β蛋白质的肾内表达情况用免疫组织化学分析。按Khanna et al.(2004)Circulation，1103822-3829的描述用抗TGF-β抗体对肾切片进行染色。在TAC和TAC+对照抗体治疗的接受者中除观察到透明化作用、动脉病肾小管间质纤维化和肾小球基膜增厚外，还观察到对TGF-β蛋白质的染色增加，但在TAC+抗TGF-β抗体治疗的接受者中却近乎正常(图8)。
实施例9TAC对TGF-β的循环水平的影响图9证明，与同基因移植物对照相比，长期用TAC治疗导致TGF-β蛋白质的循环水平显著增加(9.8±1.7对57±6ng/ml；p＜0.01)。同基因移植物和TAC+对照抗体治疗的接受者之间在TGF-β水平上没有差异(57±6对52±6ng/ml)，但是在TAC和TAC+抗TGF-β抗体治疗的接受者之间观察到统计学显著的差异(9±1.3对57±6ng/ml；p＜0.01)。
根据本说明书中所引用的参考文献的教导，可非常透彻地理解本说明书。本说明书中的实施方案旨在提供本发明实施方案的示例，不应被解释为限制本发明的范围。技术人员很容易就认识到，本发明还涵括许多其它实施方案。本公开中所引述的所有出版物、专利、专利申请和生物序列通过引用整体结合到其中。在本文中引述任何参考文献并不意味着承认这些参考文献是本发明的现有技术。
除非另外指明，说明书包括权利要求书中所用的表示成分数量、细胞培养物、治疗条件等的所有数字，应理解为在所有情况下都被词语“约”所修饰。因此，数字参数都是近似值，可根据本发明期望获得的所需特性加以变动，除非另外指明并非如此。除非另外指明，位于在一系列要素前面的词语“至少”应理解为修饰到该系列的每一个要素。本领域技术人员仅用常规实验，就会确认出或者能够确定本文描述的本发明具体实施方案的许多等同方案。这种等同方案也有意被所附权利要求所涵括。
序列表<110>Genzyme CorporationKhanna，AshwaniLedbetter，Steven<120>TGF-β拮抗剂限制免疫抑制剂肾毒性的用途<130>07680.0043-00304<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>21<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>1acgcctgagt ggctgtcttt t 21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工<220>
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权利要求
1.一种在需要免疫抑制并用免疫抑制剂治疗的哺乳动物中治疗或预防由免疫抑制剂引起的肾炎的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物治疗有效量的TGF-β拮抗剂，所述治疗有效量足以减轻免疫抑制剂肾毒性作用而又基本上不干扰其免疫抑制活性。
2.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物是人类。
3.权利要求1的方法，其中所述免疫抑制剂当给予所述哺乳动物时诱导TGF-β的表达。
4.权利要求1的方法，其中所述免疫抑制剂选自环胞菌素、他克莫司和西罗莫司或它们的药物可接受衍生物。
5.权利要求1的方法，其中所述环胞菌素是环胞菌素A。
6.权利要求1的方法，其中所述TGF-β拮抗剂选自抗TGF-β抗体、抗TGF-β受体抗体和可溶性TGF-β受体。
7.权利要求6的方法，其中所述抗体是1D11或其人或人源化衍生物。
8.权利要求6的方法，其中所述抗体是CAT192或其衍生物。
9.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物患有自身免疫病。
10.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物具有移植物。
11.权利要求10的方法，其中所述移植物是同种异体移植物。
12.权利要求10的方法，其中所述移植物选自心脏、肾脏、肺、肝脏、角膜、骨髓、血管和胰岛细胞移植物。
13.权利要求1的方法，其中所述TGF-β拮抗剂给予的剂量低于不存在免疫抑制剂时推荐治疗肾炎的剂量。
14.权利要求1的方法，其中所述TGF-β拮抗剂给予的剂量比不存在免疫抑制剂时推荐治疗肾炎的剂量低至少20％。
15.权利要求1的方法，其中所述TGF-β拮抗剂给予的剂量比不存在免疫抑制剂时通常给予的最大治疗有效剂量低至少30％。
16.权利要求1的方法，其中所述TGF-β拮抗剂给予的剂量低于与给予大鼠时2mg/kg体重的1D11抗体相当的剂量。
17.权利要求1的方法，其中所述TGF-β拮抗剂给予的剂量与给予大鼠时1mg/kg体重的1D11抗体相当。
18.一种治疗人类的方法，所述方法包括给予人类抗TGF-β抗体，其中所述人类具有移植物并正在经历用免疫抑制剂进行的免疫抑制治疗，所述免疫抑制剂选自环胞菌素、他克莫司和西罗莫司或它们的药物可接受衍生物。
19.权利要求18的方法，其中因给予所述TGF-β抗体造成的排斥风险是治疗上可接受的。
20.权利要求18的方法，其中所述免疫抑制剂肾毒性作用的减少是治疗上可接受的。
21.TGF-β拮抗剂在治疗或预防肾炎中的用途，所述肾炎由给予需要免疫抑制的患者的免疫抑制剂诱导。
22.TGF-β拮抗剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防由给予需要免疫抑制的患者的免疫抑制剂所诱导的肾炎。
23.一种检测免疫抑制剂的肾毒性的方法，所述方法包括(a)从已被给予免疫抑制剂的哺乳动物中获得生物样品；(b)检测一种或多种选自TGF-β、NOX-1、p22phox、RAC-1、SOD和TRX的分子的表达水平，其中所述表达水平指示所述免疫抑制剂是否对所述哺乳动物具有肾毒性。
24.一种评估化合物或组合物减少免疫抑制剂肾毒性的能力的方法，所述方法包括(a)从已被给予免疫抑制剂和试验化合物或组合物的哺乳动物中获得生物样品；(b)检测一种或多种选自TGF-β、NOX-1、p22phox、RAC-1、SOD和TRX的分子的表达水平，其中所述表达水平指示所述试验化合物或组合物是否能有效减少所述免疫抑制剂的肾毒性。
全文摘要
本公开涉及改善通过上调TGF－β介导其免疫抑制活性的免疫抑制剂(例如环胞菌素(CsA))的肾毒性副作用的方法。本公开提供用于需要免疫抑制的患者中的治疗方式，例如具有发生移植排斥的风险或患有自身免疫病的患者。在本发明的方法中，将TGF－β拮抗剂例如抗TGF－β抗体给予用免疫抑制剂进行治疗的患者。这种TGF－β拮抗剂以治疗有效量给予，该量足以减轻免疫抑制剂肾毒性作用而又基本上不干扰其免疫抑制活性。
文档编号A61K38/18GK101084007SQ200580039335
公开日2007年12月5日 申请日期2005年9月22日 优先权日2004年9月22日
发明者A·K·汉纳, S·勒贝特 申请人:金齐姆公司, Mcw研究基金会公司