专利名称：包含唯bh3域蛋白中bh3结构域的融合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及融合蛋白，更具体地说，涉及一种包含唯BH3域蛋白中BH3结构域的融合蛋白。
背景技术：
多细胞机体的细胞是具有高度组织性群体的组成部分。该群体的细胞数量受细胞区分率和细胞死亡率的严格控制。当不再需要细胞，他们就通过激活细胞内的死亡程序来进行自毁。这个重要的过程叫做凋亡。凋亡也被当作程序化死亡，由蛋白级联来告知凋亡。相关蛋白的突变隐藏了正常的程序化细胞死亡，这种变在很多疾病，尤其在癌症方面起着很重要的作用。因此，癌细胞的增长率通常取决于细胞死亡的有缺陷控制。另外，凋亡的存在是能使恶性细胞增加数量和存活的主要特征。
凋亡的线粒体依赖性通路是由Bcl-2家族蛋白所支配。Bcl-2家族的Bcl-2、Bcl-xL、Bak和很多其他的部分都有一个靠近羧基端的氨基酸疏水端，能在外部线粒体膜内锚定Bcl-2家族蛋白。相反地，其他Bcl-2家族部分，如Bid，Bim，Bad，都缺乏这些锚定膜的领域，而对蛋白本身却是关闭的，直到受到刺激才能暴露出来(如Bax)。
Bcl-2家族蛋白通过多细胞动物的进化与在脊椎动物及无脊椎动物中发现的同源染色体一起保存。一些动物病毒在基因组中也留有Bcl-2家族基因，包括癌症中的单纯疱疹病毒，如Epstein-Barr病毒(EBV)和Kaposi sarcomaherpes病毒(KSHV)。促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白都已有过描述。抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的Bcl-2家族蛋白的相对比率指示了对多种多样的刺激细胞凋亡的敏感性或存在，包括增长因素缺失，组织缺氧，辐射，抗癌药，氧化剂和钙超载。
在凋亡过程中，Bcl-2家族蛋白特定调节(促进或抑制)线粒体中蛋白质的释放，如细胞色素C，Smac/DIABLO，凋亡诱导因子，HtrA2和核酸内切酶。某些Bcl-2家族蛋白(促凋亡部分)是承担在线粒体中已经经过程序化细胞死亡和死亡信号执行者的主要调整者。总之，Bcl-2家族包含引发线粒体膜释放的促凋亡部分和抑制线粒体膜释放的抗凋亡部分。进一步地，该家族可划分为3个子类[(a)，(b)和(c)]。子类(a)和(b)在结构上与细菌酶素的孔道形成域极其相似，如大肠杆菌系和白喉毒素。这些螺旋状的象毛孔的蛋白包括抗凋亡蛋白(子类(a)和多域的促凋亡蛋白(子类(b)。抗凋亡部分(a)，如Bcl-2和Bcl-xL，显示了通过全部4个Bcl-2同源的BH结构域蛋白(BH1-4也被称为多域的抗凋亡蛋白)。有些促凋亡部分(b)，如Bax和Bak，支配着BH1-3域中(BH1-3也被称为多域促凋亡蛋白)的序列同族。与之对照的，子类(c)中有一些促凋亡部分，如Bid，Noxa，Bik，Bim，Bad，Bmf，DP5/HrK和Bok，支配着唯一一个被称为α螺旋BH3域(为唯BH3域蛋白)中的序列同族。BH3域代表性地包含一个有15至20个氨基酸长度的两系α螺旋和16个氨基酸。
唯BH3蛋白(子类(c)作为多种促凋亡和抗凋亡信号的传入效应物发挥作用(Hunt A.et al(2001)Science 293，1784-1785)。所有的唯BH3蛋白都能凝固并在功能上对抗抗凋亡的Bcl-2家族蛋白(Hunt A，et al，supra).它们的BH3领域进入了抗凋亡蛋白表面的不易被水沾湿的裂缝里，如Bcl-XL。它们通过抗凋亡的Bcl-2家族蛋白之间的相互转换来刺激一个要求有至少含有一个多域的促凋亡Bcl-2家族蛋白的Bax或Bak，进行促凋亡的机制来成倍转换死亡信号。进一步地，有一些但不是所有的唯BH3蛋白有能力凝固成多域的促凋亡部分Bax或Bak。
比如，唯BH3蛋白Bid能促进促凋亡蛋白的集合和Bax及Bak自身的功能，反之，其他的唯BH3蛋白不能发挥这样的功能。通过使用短的缩氨酸来表现唯BH3蛋白Bid的α螺旋BH3域，所呈现出的Bid缩氨酸能够导致Bax和Bak的低聚反应(oligomerization)释放细胞色素c.这个特性归因于唯BH3蛋白Bim(Korsmeyer S.J.et al(2000)细胞死亡不同7，1166-1173)。概括地说，Bid捆绑了(多域的)促凋亡的Bax和Bak，也捆绑了抗凋亡的Bcl-2和Bcl-xL，并能直接激活Bax和Bak。
相对应的，显示唯BH3蛋白Bad Bik的BH3域的缩氨酸缺乏直接激活Bax和Bak的能力，但能捆绑抗凋亡的Bcl-2家族蛋白(Letai A et al(2002)癌细胞2，183-192)。使用来自唯BH3蛋白Bad的BH3域的缩氨酸只能在Bcl-xL存在的条件下刺激Bax的活性，这在另一篇论文上也有过描述(Moreau P F.et al(2003)The Journal of Biological Chemistry，vol.278，no.21，19426-19435)。因而，唯BH3蛋白的BH3域支配着独特的功能。“Bad-like”的BH3域激活了促凋亡的Bax和Bak，其特征在于，“Bad-like”的BH3域通过占有抗凋亡的Bcl-2家族部分的口袋“敏化”了促凋亡的Bax和Bak。概括地说，唯BH3蛋白的BH3域表现为两种通过使用遗传决定的通路来开始细胞死亡的工具化合物。
如上所述，各种研究论文都有描述过唯BH3蛋白，分析它们的功能和机制。结果表明它们的BH3域能有效地通过控制来自所述的抗凋亡蛋白中的活性多域促凋亡蛋白，引起细胞凋亡从而表现为抗凋亡的Bcl-2家族部分。
另外，唯BH3蛋白的BH3域是一个值得注意的研究课题，能形成有效的工具针对由于各种各样的程序化细胞死亡而导致的有缺陷控制疾病的治疗。然而，之前的技术没有提供直接运输所述的蛋白或他们的BH3域的方法，也没有对期望的有机体或细胞定位。主要的问题之一是细胞内膜的渗透性。有研究论文包含了最初的多精氨酸转换的方法。(Wang et al，(2000)，Cancer Res.60，1498-1502)；Holinger et al.(1999)，J.Biol.Chem，274，13298-13304)。然而，各种各样的两性分子α螺旋缩氨酸，特别是阳离子缩氨酸，可以被吸引到阴性负荷膜上，包括线粒体膜，在这里它们能非特定地打断油脂矩阵和膜障碍物功能(Matsuzaki(2001)Biochem.Soc.Trans.29，598-601；Ellerby etal(1999)，Nat.Med.5，1032-1038)。另外一种方法是使用ANT-BH3BAD结构结合antennepedia(ANT)作为内在化半族，由此得来的BAD的BH3域是有毒的。然而，毒性与Bcl-2通路无关(Vieira et al.(2002)，Oncogene 21，1963-1977；Schimmer et al.(2001)，细胞死亡差异8，725-733)。
发明内容
因此，本发明的目标就是提供一个能直接运输唯BH3蛋白的BH3域到期望生物体部位的系统。
根据本发明，所提供的融合蛋白包含至少一个第一部分(I)和至少一个第二部分(II)，所述的第一部分(I)包含一个载体序列，所述的第二部分(II)包含唯BH3域蛋白中BH3结构域序列的部分或者全长，所述融合蛋白在其第一部分(I)和其第二部分(II)中包含一个逆序的右旋氨基酸。
本发明的融合蛋白包含(至少在部分(I))逆序的右旋肽(也称逆序蛋白或逆序融合蛋白)。逆序蛋白与线性肽的异构体有关，在该异构体中常规或天然的左旋肽序列方向是是颠倒的，每个氨基酸残基的手性(与自然发生的左旋肽相对照，因归于右旋肽的手性特征)是颠倒的。根据本发明，术语“融合蛋白”和“蛋白”是指同一意思。根据本发明，逆序融合蛋白可被构造，如通过合成与相应的天然左旋肽序列相反的肽序列来构成。与常规的左旋肽序列相比，右旋异构体(融合)蛋白中每个单氨基化合物中的酰胺基无活性，因此确保了位于α碳中侧链群的位置被保留。本发明的逆序融合蛋白拥有很多有用的特性。比如，他们更有效地进入细胞，更稳定(尤其在体内)，比相应的左旋肽显示更低的免疫原性。天然肽包含L氨基酸，几乎所有的分解酶如蛋白酶或肽酶都粘附在相邻的左旋氨基酸的肽链上。因此，由逆序形式右旋肽组成的蛋白在很大程度上能抵抗蛋白水解的破坏。与常规的非颠倒的左旋肽相似物比较，融合蛋白细胞的保持时间明显增加了。
本发明的融合蛋白部分(I)作为载体或载体序列。“载体或载体”序列(作为本发明的融合蛋白的一部分)是能够引导融合蛋白或融合蛋白部分(II)分别进入细胞质或者进一步进入到特殊的细胞内靶点的氨基酸序列。这个载体序列能引导融合蛋白进入细胞内期望的位置，如细胞核、核糖体、内质网、溶酶体或过氧物酶体。因此，在首选的实施例中，本发明的融合蛋白的载体序列引导融合蛋白到细胞内一个预定的位置。总之，载体序列能引导本发明的融合蛋白通过胞浆膜，如从细胞外的细胞环境通过胞浆膜进入细胞质，从而提高融合蛋白的细胞举起能力或药物部分(II)(被载物部分)，各自单独地提高细胞渗透性或提高细胞内的保持时间。
总之，本发明的包含所述的载体序列的融合蛋白的功能有效部分(I)限定了包含至少4个(连续的)右旋氨基酸作为氨基酸序列。由部分(I)组成的功能有效氨基酸序列应显示强烈的基本特性。所述的功能有效氨基酸序列优选包含至少60％的碱性氨基酸，至少65％的更好，甚至至少80％的，甚至至少85％的，甚至至少90％的，至少96％的最好，甚至是精氨酸和/或赖氨酸。本发明的融合蛋白的功能有效部分(I)优选由长4-50个右旋氨基酸的氨基酸序列构成，优选4-40个，4-30个更好，4-20个还要好一些，4-约10个最好。
图1A显示对应于Tat蛋白碱性区域的氨基酸序列是逆序的D形式。因而，所有显示的氨基酸是D对映异构体的氨基酸。图1A的序列就是一个D-TAT的实例(SEQ ID NO1)。
图1B显示了基因的D-TAT(SEQ ID NO.2)的氨基酸序列。在图1A中有提到。
图2A显示了人类异构重组产物Bid(转录变量1，SEQ ID NO.3)的母体L氨基酸序列。
图2B显示了人类异构重组产物Bad(SEQ ID NO.4)的母体L氨基酸序列；强调了BH3域；BH3域不仅包含已强调的部分，还包含在任何两端的两个额外的氨基酸。这四个额外的氨基酸是以粗体字显示的。
图2C显示了人类异构重组产物Noxa(SEQ ID NO.5)的氨基酸序列。
图2D显示了人类异构重组产物Puma(SEQ ID NO，6)的氨基酸序列。
图2E显示了人类异构重组产物Bim(转录变量1，SEQ ID NO，7)的氨基酸序列。
图2F显示了人类异构重组产物Bik(SEQ ID NO.8)的母体L氨基酸序列；强调了BH3域；BH3域不仅包含已强调的部分，还包含在任何两端的两个额外的氨基酸。这四个额外的氨基酸是以粗体字显示的。
图3A显示了D-TAT-Bid(转录变量1，SEQ ID NO.9)的氨基酸序列——本发明融和蛋白的一个实例，其特征在于，根据本发明，本发明的融和蛋白的部分(II)的Bid全长序列在随后的图3B-3F&由D氨基酸(D-Tat)组成的部分(I)中的母体L形式序列中有描述。为了描述作为逆序的所有右旋氨基酸序列的本发明的融和蛋白，必须转化部分(II)。
图3B显示了D-TAT-Bad(SEQ ID NO.10)的氨基酸序列；强调了BH3域；BH3域不仅包含已强调的部分，还包含在任何两端的两个额外的氨基酸。这四个额外的氨基酸是以粗体字显示的。
图3C显示了D-TAT-Noxa(SEQ ID NO.11)的氨基酸序列。
图3D显示了D-TAT-Puma(SEQ ID NO.12)的氨基酸序列。
图3E显示了D-TAT-Bim(转录变量1，SEQ ID NO.13)的氨基酸序列。
图3F显示了D-TAT-Bik(SEQ ID NO.14)的氨基酸序列；强调了BH3域；BH3域不仅包含已强调的部分，还包含在任何两端的两个额外的氨基酸。这四个额外的氨基酸是以粗体字显示的。
图4A显示了Bik的BH3域(Bik BH3)的母体L氨基酸序列；图4B显示了Bad的BH3域(Bad BH3)的母体L氨基酸序列；图4C显示了Bid的BH3域(Bid BH3)的母体L氨基酸序列；
图4D显示了Bmf的BH3域(Bmf BH3)的母体L氨基酸序列；图4E显示了DP5/Hrk的BH3域(DP5/Hrk BH3)的母体L氨基酸序列；图4F显示了Bim的BH3域(Bim BH3)的母体L氨基酸序列；图4G显示了Noxa的BH3域(Noxa BH3)的母体L氨基酸序列；图4H显示了PUMA的BH3域(PUMA BH3)的母体L氨基酸序列；图4I显示了Bax的BH3域(Bax BH3)的母体L氨基酸序列；图4J显示了Bak的BH3域(Bak BH3)的母体L氨基酸序列；图4K显示了Bok的BH3域(Bok BH3)的母体L氨基酸序列；图5 显示了由BH3导致的HeLa细胞死亡结果的曲线图。所使用的本发明的融和缩氨酸包含了作为第一个部分(I)的载体序列D-TAT&作为第二个部分(II)的唯BH3蛋白的BH3域序列的Bim，Bok，Bax，DP5[Hrk]，Bid，Noxa，PUMA&Bak(在图5中都分别有描述)。融合缩氨酸分别通过在培养基中与Hela细胞一起在为1μm，10μm，50μm，100μm的浓度中经过24小时的培养。这种控制包括不含治疗作用的Hela细胞，即不包含于本发明的融合缩氨酸的培养。该控制也在培养基中与Btc-3细胞一起经过24小时的培养。在Hoechst/PI着色(Bonny et al，J Biol，Chem.(2000)27516466-16472)，之后再计算凋亡细胞。凋亡细胞的百分比在图5中作为“细胞死亡％”的横轴上有显示。如在图5中所显示的，包含Bim，Bok或Bax的融合缩氨基显示了最好的结果，也就是在包含PUMA(大约23％的细胞死亡率)的融合缩氨酸之后，大约98％&68％的最高细胞死亡率。必须注明的是，包含Bim的融合缩氨酸导致了最好的结果，也就是在50μm浓度的缩氨酸中大约98％的细胞死亡率，其特征在于包含Bok或Bax的融合缩氨酸导致了所显示的在100μm缩氨酸浓度中大约98％&大约68％的细胞死亡率。
图6显示了由BH3导致的βTC-3细胞死亡结果的曲线图。所使用的本发明的融和缩氨酸包含了作为第一个部分(I)的载体序列D-TAT&作为第二个部分(II)的唯BH3蛋白的BH3域序列的Puma，Noxa，Bak Bim，Bok，Bax&DP-5(在图6中都分别有描述)。融合缩氨酸分别通过在培养基中与βTC-3细胞一起在浓度为1μm&10μm中经过24小时的培养(浓度为1μm的表示为”Puma 1”，浓度为10μm的表示为”Puma 10”).一个样本包含10μm浓度的载体序列L-Tat。另一个样本包含了作为有毒控制的物质毒胡萝卜素(thapsigargin)。这种控制包括不含治疗作用的βTC-3细胞，即不包含于本发明的融合缩氨酸的培养。该L-Tat样本&该控制也在培养基中与βTC-3细胞一起经过24小时的培养。在Hoechst/PI着色(如上)之后再计算凋亡细胞。凋亡细胞的百分比在图6中作为“细胞死亡％”的横轴上有显示由于在图5中有显示。如在图5中所显示的，在10μm浓度中Noxa&Bax显示之后，在10μm浓度中包含Bim，Bok的融合蛋白显示了最好的结果，(各自显示细胞死亡率为大约99％&大约86％)。
如图5&图6中显示的，如在Bonny C.et al.中所描述的，完成了Hoechst/PI着色。IB1减少了能分泌胰岛素的细胞的引起细胞浆移动的凋亡，J.Biol.Chem.(2000)27516466-16472.HeLa细胞线(人类子宫颈癌)(图5)&胰岛素分泌细胞线βTC-3(Efrat S.et al.，衍生于能显示转基因的胰岛素基因--致癌基因相混血的老鼠的Beta细胞线，Proc Natl Acad SciUSA(1998)859037-9041)(图6)，以上这两条细胞线在RPMI-1640媒介中进行培养，该媒介中补充有10％的胎儿小腿血清，100μg/ml的链霉素，100U/ml的青霉素，1mmol/l的钠丙酮酸盐&2mmol/l的谷氨酸盐。
图7显示了为本发明而得到的所有D融合缩氨酸(来自Bid，Bax和Bad的D-BH3-D-Tat)结果。由D氨基酸组成的BH3域序列域与图4所给的序列相符合，但与氨基酸序列相反。包括Cis-Pl的所有使用的浓度，都是培养细胞的10μM(Hela(上一排)和C33A(下一))，持续时间为48小时。还要应用以下条件RPMI-1640媒介，补充有10％的胎儿小腿血清，100μg/ml的链霉素，100U/ml的青霉素，1mmol/l的钠丙酮酸盐&2mmol/l的谷氨酸盐。与Hoechst和Propidium Iodide(PI)(参看上述)(每5分钟1μg/ml，然后在荧光显微镜下人工计数或拍照)一起进行着色。在该化验中，能养活的细胞沾染了蓝色，死细胞沾染了黑红色(黑色)。很清楚地看到所有本发明的所有D融合缩氨酸都导致了细胞死亡。
具体实施例方式
根据本发明，载体序列起源于众所周知的膜置换序列。在本发明特别首选的实施例中，本发明的融合蛋白的载体序列是人类免疫缺陷病毒(HIV)的TAT蛋白的逆序的右旋氨基酸序列。TAT是HIV感染循环不可缺少的滤过性毒菌蛋白。该蛋白在WO94/04686，US.Pat.Nos.5,674,980等中有描述，每个都可合并作为参考。然而，本发明的融合蛋白的部分(I)与部分(II)相连接，其特征在于，在逆序的D构型中，部分(I)包含部分或所有的86个Tat全长序列的氨基酸。特别是拥有少于86个氨基酸的本发明的融合蛋白的功能有效部分(I)可被使用，其特征在于仍然展示了很好的细胞举起活性，随意进入细胞核额外的定位信号。作为进入细胞的媒介和负责举起的Tat序列段可被限定，使用众所周知的技术(参看Franked et al，Proc.Natl Acad.Sci.USA 867397-7401(1989).本发明的融合蛋白的部分(I)优选包含TAT的碱性区域(关于氨基酸aa 57-48或57-49)，不包含TAT的富含半胱氨酸区域(氨基酸22-36)和天然TAT缩氨酸的exon 2编码的羧基终端域(氨基酸73-86)。TAT的碱性区域的反面(关于氨基酸aa 57-48或57-49)可作为本发明的融合蛋白的部分(I)或部分(I)的一部分来使用。包含Tat的碱性区域或其反面的序列是关于D-Tat序列的。
因此，根据基因的D-TAT规则NH2-XXXAXXXXX-COOH，本发明的融合蛋白的功能有效部分(I)优选包含一个D-TAT序列，如NH2-RRRQRRKKRG-COOH或NH2-RRRQRRKKR-COOH(其特征在于，两个都有以上所述的天然Tat基础域的逆序)，或包含序列变量NH2-XXXAXXXXX-COOH，其特征在于，X与氨基酸精氨酸或赖氨酸有关，A与任何非基础氨基酸有关。A优选放在以上所给出的基因规则的第四个位置上。然而，A可二者选一地放在任何其他序列的位置上，如第2，3，5，6，7或8的位置上，而不是第4。进一步地，以上所给出的基因规则可被修饰，通过替换一个或更多来传入额外的非基础残基，部分(I)序列只由右旋氨基酸组成，其目的在于作为由左旋氨基酸组成的相应的非反向序列展示同样的结构侧链的专利。
在本发明优选的具体实施例中，部分(I)包含带有图1A或图1B的氨基酸的载体序列。
在另一个实施例中，本发明融合蛋白的功能有效部分(I)包含以下基因规则的基因氨基酸序列NH2-AmXAoXAn-COOH，NH2-AmXXXAn-COOH，NH2-AmXXAXAn-COOH，NH2-AmXAXXAn-COOH或NH2-XAAX-COOH，X与氨基酸基因或赖氨酸有关，A与任何非基础的氨基酸有关，m是一个从0到14的整数，n是一个不受m约束的0-14的整数，o是一个不受m和n约束的0-14的整数。根据本发明，必须要注明的是，以上的载体序列等基因规则是只由右旋氨基酸组成的。
本发明融和蛋白功能有效部分(I)的特定例子包含或可能包含以下强烈碱性序列NH2-KTRR-COOH，NH2-RLKR-COOH，NH2-KPRR-COOH，NH2-KRFQR-COOH，NH2-GRIRR-COOH，NH2-NIGRRRN-COOH，NH2-RAGRNGR-COOH，NH2-RPRR-COOH，NH2-GKRRG-COOH，NH2-KRRE-COOH，NH2-RQKRGGS-COOH，NH2-RKSR-COOH，NH2-RGSRR-COOH，NH2-RRQK-COOH，NH2-RARKG-COOH，NH2-RGRK-COOH，NH2-RRRLS-COOH，NH2-RPRRLSP-COOH，NH2-RGRKY-COOH，NH2-RPKRGMG-COOH，NH2-GVRRR-COOH，NH2-GYKKVGFSR-COOH，NH2-KFSRLSK-COOH，NH2-RRVR-COOH，NH2-RRSRP-COOH，NH2-RRRM-COOH，NH2-KSMALTRKGGY-COOH，NH2-RSRRG-COOH，NH2-KMNPLPY-COOH。根据本发明，必须要注明的是，以上载体序列只由右旋氨基酸组成。
部分(I)可能只包含一个(即连续性的)基础细胞膜置换序列(D逆序形式)，类似于相应的(天然的)置换序列，也就是以上所述的D-Tat序列。另外，部分(I)在逆序中可能包含两个或更多的氨基酸序列，该序列带有强烈的碱性特征，对应于相同的或不同的置换序列相。这些逆向的D形式置换图形是通过使用D氨基酸和回复氨基酸序列在天然蛋白的基础上进行合成的。换而言之，本发明的融合蛋白可能包含如在部分(I)中的两个或更多的置换序列的化合物，这些序列都是作为逆序的D形式序列进行合成的。很明显地，置换图形的化合物没有在任何母体蛋白序列中发生(如L形式)。这些两个或更多的部分(I)置换序列是与连接序列或没有与之连接的。连接序列要求优选的长度是2-20个氨基酸。
正如上面所透露的，部分(I)可能包含一个或更多右旋氨基酸置换图形(与母体序列相比为逆序)，这些氨基酸置换图形在相应的天然L形式同系物的基础上合成而来。另外，部分(I)可能包含L形式序列的D氨基酸串，这些D氨基酸串与天然蛋白序列相比是被作了有序的修饰。这些部分(I)的衍生物(由逆序D形式提供，也就是说D形式的衍生物是L形式衍生物的同系物)明显地支配进入细胞中(甚至优选进入细胞核)发挥举起作用的载体特性，这与对应的天然蛋白极其相似，尽管它们的序列与天然蛋白序列不一样。
此外，糖基部分和/或脂部分，如胆固醇或其它油脂，可以加到本发明的融合蛋白上，特别是本发明融合蛋白的部分(I)，或甚至是其它部分，目的在于进一步提高融合蛋白的膜溶性，如加到部分(I)一端或两端提供局部亲脂性。另外糖基部分或脂部分还可能被连接到氨基酸侧链上，尤其是羟基和氨基的侧链。
本发明的融合蛋白的部分(I)必须保持它的细胞渗透性和/或细胞内驻留功能。然而，通过对到部分(I)进行修饰可增加许多其它的功能。因此，可以修饰部分(I)来引导本发明的融合蛋白进入细胞内特定靶点。相应地，修饰部分(I)使其到达指定的细胞内位置而不损失增强的细胞渗透性。通常，将本发明的融合蛋白靶向导入特定的细胞区(如内质网，线粒体，gloom器官，溶酶体囊泡)，常规序列可导入到部分(I)。另外，可以添加确保本发明的融合蛋白细胞质定位的特异序列，如部分(I)可包含至少一个深层次序列，该序列绑定到一个或多个的细胞质结构，使本发明的融合蛋白保持在细胞质中。，碱性区域的修饰对于核定位很重要(参考Dang and Lee(1989)，J.Virol.Chem.26418019-18023；Hauber et al.(1989)，J.Virol.631181-1187；Rubenet al.(1989)，J.Virol.631-8)，可能导致本发明的融合蛋白部分(I)的细胞质定位或部分细胞质定位。因此，部分(I)可能包含可替换的核定位信号，该信号导致了本发明的融合蛋白的细胞质定位。
如上所述的，唯BH3蛋白通过使Bcl-2家族成员与其它Bcl-2家族成员的相互作用揭示了凋亡的调整。本发明的融合蛋白的部分(II)是一个氨基酸序列，包含一个或多个唯BH3蛋白的BH3域序列的部分或全长(作为Bcl-2家族蛋白的子类进行限定)。部分(II)也可能包含天然BH3域序列(全长或部分的)的D逆序形式，从而确保了D氨基酸侧链在全部母体L氨基酸序列中的定位，或者包含全部母体L氨基酸序列，这两者能通过与至少1个Bcl-2家族蛋白相互作用或激活或敏化至少一个Bcl-2家族的促凋亡成员来引起凋亡。
如果本发明的融合蛋白的部分(II)包含部分的BH3域序列，它就应该在母体序列方向或逆序方向拥有(目的是功能有效)至少4个右旋或左旋氨基酸(反映了至少4个唯BH3蛋白的BH3域的L氨基酸的片断)。在优选的具体实施例中，部分(II)只包含右旋氨基酸。本发明的融合蛋白的功能部分(II)包含逆序氨基酸的部分或全长，该逆序氨基酸的范围首选4-20，4-18亦为优选，4-15甚至更加优选，4-13还要好一些，4-10甚至更好，最为优选的是4-8。用作部分(II)的全部或部分的BH3域序列必须保持其功能，即保持其促凋亡的活性。通过适当的化验方法，如凝固化验(将本发明的融合蛋白的部分(II)或本发明的融合蛋白本身凝固到母体凝固伙伴中)或通过凋亡化验来化验促凋亡活动，以此来测试它们的功能活性。
更适宜地说，部分(II)包含唯BH3蛋白的BH3域的部分或全长，该蛋白选自于母体L形式或逆序的D形式中由Bid，Noxa，Puma，Bim，Bik，Bmf，DP5/Hrk和Bok组成的群。BH3群(全长或部分)可选自于任何哺乳动物的唯BH3蛋白，特别是来自人类的异形体(isoform)。相应地，本发明的融合蛋白的部分(II)包含附图2A，2B，2C，2D，2E或2F的氨基酸序列(或者是在图2A-2F中展示组成的母体L氨基酸形式或逆序D形式(由右旋氨基酸组成))，即图2A-2F的序列必须通过回复端来转化母体C端转化为形式的N端，母体N端转化为形式的C端。本发明的融合蛋白的部分(II)包含母体唯BH3蛋白序列全长的片断(以L或D形式)，该片断优选少于50个的氨基酸，更优选少于40个的氨基酸，最优选的是少于30个的氨基酸。这些母体序列的片断明显或部分地(至少7个BH3域的序列氨基酸)包含BH3域的序列。
本发明的融合蛋白的部分(II)包含一个或多个唯BH3蛋白的BH3域的序列的部分或全长，或者是以母体氨基酸的形式，或者是由右旋氨基酸组成的转化形式。由左旋氨基酸组成的部分(II)可通过熟练掌握重组细胞方法或缩氨酸合成方法的人进行人工合成，如固态合成。而部分(II)的左旋氨基酸序列是后来与部分(II)的右旋氨基酸序列相连接的(通过第二步)。另外，化学合成允许直接合成(没有导入第二连接步骤)部分(I)中的右旋氨基酸和部分(II)中由左旋氨基酸组成的本发明的融合蛋白。而部分(II)也是由右旋氨基酸组成，融合蛋白通过运用逆序的右旋氨基酸进行化学合成并转化成母体BH3域序列的部分或全部(使用与合成左旋氨基酸序列的同样方法)，如天然的载体序列，天然的基础Tat序列。
天然的唯BH3蛋白或片断的氨基酸序列包含BH3域，相应地，作为部分(II)的一部分，由右旋氨基酸组成的逆序同系物可被修饰，如通过对母体蛋白至少一个氨基酸的增加、删除或置换来提供非天然序列。修饰尤其是保守修饰，能改变部分(II)的凝固性或稳定性，如增加或减少稳定性。带有修饰的初级序列的部分(II)(与天然BH3域或唯BH3蛋白序列相比)可通过同样的技术来对未修饰的左旋氨基酸或右旋氨基酸序列进行修饰而达到合成的目的。
本发明的融合蛋白至少由部分(I)和部分(II)组成。而且根据本发明，融合蛋白进一步地可能由部分(III)，(IV)，(V)组成。这些额外的部分是可选择的，并可能为本发明的融合蛋白带来额外的功能。。至少有一个部分可能是氨基酸、寡肽或多肽、或小的有机化合物，而且能够与本发明的融合蛋白结合在合适的位置上，如N-末端或C-末端或中心。这些额外的部分(如HA，HSV-Tag，His6)可能使本发明的融合蛋白服得到纯化和/或分离。如有要求的话，融合体在生产过程即将结束时即能够从本发明的融合蛋白中被去除(如通过溶蛋白性裂解或已知的其他方法)。另外，特定细胞间隔的载体序列或其他功能序列可以通过一个额外的部分被融合到发明的分子中或者掺合到部分(I)或部分(II)中。额外的部分(如部分(III)允许本发明的融合蛋白与一定的细胞型特异结合，如免疫细胞，肝细胞，特别是器官的瘤细胞，如淋巴细胞，神经细胞等。这个目的可以通过将有特定细胞标志的天然配体(如膜蛋白细胞外部分配体，像受体，或导向膜蛋白细胞外部分作了瘤细胞标记的抗体)融合到本发明的融合蛋白来达成。因此，本明的共轭分子可能被。因此，本发明的融合蛋白可被选择性地导入待治疗动物一定的细胞或组织中。
在另一个优选的实施例中，不只一个，最好由两个或三个同样的或不一样的BH3域序列的部分或全部，被合并到本发明的融合蛋白或部分(II)的部分或作为额外的部分(如部分(III)中。尤其是不同的唯BH3蛋白的BH3域序列的部分或全长可与本发明的融合蛋白进行结合，如Bid和Bad，Bim和Bad，Bik和Bad，Puma和Bad，Noxa和Bad，Bmf和Bad，DP5/Hrk和Bad，Bok和Bad，Bik和Bim Bik和Bid，Bik和Puma，Bik和Noxa Bik和Bmf，Bik和DP5/Hrk，Bik和Bok，Bid和Puma，Bid和Noxa，Bid和Bim Bid和Bmf，Bid和DP5/Hrk，Bid和Bok，Bim和Noxa，Bim和Puma，Bim和Bmf，Bim和DP5/Hrk，Bim和Bok，Puma和Noxa，Puma和Bmf，Puma和DP5/Hrk，Puma和Bok，Noxa和Bmf，Noxa和DP5/Hrk，Noxa和Bok.如果本发明的融合蛋白拥有不止一个BH3域的话，本发明的融合蛋白将优选包含(部分或全长)像唯BH3蛋白的BH3域。显然，如果在本发明的融合蛋白中不止一个BH3域，他们中的两个或更多将呈现逆序D形式或常规的母体L形式。所以本发明的融合蛋白结合了D形式和L形式的BH3域。
根据本发明，融合蛋白通常有一个至少12-200个甚至更多(额外的部分或部分(III)的全长)氨基酸的范围，优选的范围是12-150个氨基酸，20-100个氨基酸还要好一些，20-75个氨基酸还要更好，20-50个氨基酸为最好。根据本发明，如果部分(II)是由L氨基酸组成的话，根据附图3A，3B，3C，3D，3E或3F融合蛋白有一个序列(在部分(I)中有显示这些数据)和片断(在部分(I)中有包含)，显然，在所显示的数据中唯BH3蛋白序列的全长少于50个氨基酸，片断至少包含在唯BH3蛋白的BH3域序列中。在本发明的另一实施例中，在这些数据中所显示的每一个部分(II)序列均由D氨基酸组成，并通过颠倒逆序端点从而导致部分(II)中所有的D氨基酸发生逆序。
在本发明的优选的实施例中，本发明的至少一个第一部分(I)和至少一个第二部分(II)通过共价键结合。“共价键”是两个原子通过共享一对或多对共用电子而形成的稳定的化学键。正如前面所述，部分(III)、(IV)、(V)亦可通过共价键与部分(I)或部分(II)连结。
一般来说，部分(I)和部分(II)可通过连接器或N终端和C终端之间形成氨基化合物进行结合。部分(I)的C端氨基化合物可被连接到部分(II)的N端氨基化合物，或者部分(I)的N端氨基化合物可被连接到部分(II)的C端氨基化合物。例如，本发明的融合蛋白有独立的C端或N端运输序列，部分(I)被共价连接到部分(II)中的，具体表现是，在包含D-TAT序列的部分(I)和作为包含蛋白的BH3域序列的部分或全长之间被加入。
如果存在的话，如上面提到的，更多的部分(III)，(IV)，(V)等以类似的方式或随意地与部分(I)或部分(II)相连接，连接序列在有至少一个其它下面所提到的半分子的前提下同样也能用于融合本发明的融合蛋白。随意部分(III)，(IV)等通过D氨基酸的侧链连接到本发明的融合蛋白，或被附着在部分(I)或(II)的终端上。侧链的连接优选的是侧链的氨基或羟基群，例如通过酯或醚连接。根据本发明必须要强调的是，所有的氨基酸(任何部分(I)，(II)，(III)，(IV)，(V)中的)都由右旋氨基酸组成，通过连接该氨基酸的逆序最终摹拟了天然同系物。
如果连接序列用于融合的部分(I)和(II)或其它的融合部分，如部分(III)到部分(I)和/或部分(II)，这些连接序列可以优先形成一条含有5-50个残基的可变形的序列，有5-15个残基的更好。在优选的实施例中，连接序列(一个全是D或全是L氨基酸的序列)包含至少20％，甚至至少40％，至少50％的Gly残基。通过本技术的方法可以较容易地选择和制备适当的连接序列。
部分(I)和部分(II)也能通过本技术中众所周知的适当方式来进行化学连接。然而必须要注意的是，许多众人皆知的化学连接是非特异性，也就是说他们并非是与传输蛋白(或多缩氨酸)或被栽物半分子的特异点连接的。因此，非特异性连接的物质可以进攻功能位点或者一些空间阻碍的活动位点，致使融合蛋白在生物学上变得非活性。正如前面所描述的，更多的部分(III)、(IV)(V)等可以以类似的方式彼此或与部分(I)和/或(II)进行连接。
与部分(I)的功能基团一次或几次的化学直接连接能提高连接特异性，这些功能基团交叉连接的蛋白/缩氨酸/多缩氨酸中的一个或两个中只发现过一次或两次。其中一个例子就是半胱氨酸，它是唯一的包含巯基且在很多蛋白中只发生过几次的氨基酸。还举例说明一下，如果蛋白/缩氨酸/多缩氨酸没包含赖氨酸，而是专指最初的胺交联试剂，将为那个蛋白/缩氨酸/多缩氨酸提供氨基端的选择性。然而，要成功地使用这个方法增加连接特异性，要求蛋白/缩氨酸/多缩氨酸在分子区域中拥有合适的稀少的起反作用的残基，且该分子在改变过程中没有丢失分子的生物活性。
当蛋白/缩氨酸/多缩氨酸序列发生过程中交叉连接反应时，半胱氨酸可被替换，否则将很可能妨碍生物活性。半胱氨酸残基被置换显然是蛋白(或多缩氨酸)最小化折叠反应的结果。当置换化学结构和空间结构类似于半胱氨酸的蛋白/缩氨酸/多缩氨酸时，折叠反应变化也会变小。因此，比较于置换半胱氨酸，丝氨酸是是取代反应的优选残基。然而，对于生成的半胱氨酸残基，优选的置换位点是N端或者C端或靠近的地方。不管受影响的蛋白/缩氨酸/多缩氨酸是被化学生成的还是DNA重组的，常规的方法对每一个氨基酸序列修饰都是可取的。
两个要素的连接，如部分(I)中的D形式与部分(II)中的L形式的连接，都能通过连接或共轭来完成。有几种分子间交联试剂可以用，可参考Meansand Feeney，Chemical Modification of Proteins，Holden-Day，1974，pp 39-43.中的举例。在这些举例的试剂中，如N-琥珀酰-3-2-联硫基吡啶-丙酸盐(SPDP)、N，N′-(1，3-苯烯)二马来酰亚胺、N，N-乙烯-二碘乙酰胺或或其他含有6～11个亚甲基的有机物和和1，5-二氟-2，4-二硝基苯。其他有这种交联作用的试剂还包括p，p′-二氟-m，m′-二硝基二苯砜、乙二酸二甲酯、1，4-二磺酰氯苯酚、己二异氰酸酯、二异硫氰酸酯、偶氮苯-p二异氰酸盐、二马来酰亚胺己烷和disdiazobenzidine。交联试剂可以提供同性双功能，也就是可以进行同样反应的两个功能基。优选的一种具有同性双功能的交联试剂是二马来酰亚胺己烷(BMH)，BMH含有两个马来酰亚胺功能基团，马来酰亚胺在中性条件下(pH 6.5-7.7)与巯基内含(sulfhydryl-containing)发生特异性反应，这两个马来酰亚胺通过一个碳链连接，因此，BMH可用于含有半胱氨酸残基的蛋白质或多肽的不可逆的交联反应。交联试剂可以提供异性双功能，异性双功能交联试剂有两个不同功能的基团，如一个活性氨基和一个活性巯基可以交联分别含有自由胺和自由硫醇的两个蛋白质分子，异性双功能的交联试剂有琥珀酰亚胺基-4-(N-甲基马来酰亚胺)-环己烷-1-羧酸盐(SMCC)、m-马来亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、和琥珀酰亚胺-4-(p-苯基马来亚胺)丁酸盐(SMPB)及MBS的同系物。交联试剂的丁二酰亚胺基(succinimidyl)基能与胺发生反应，马来酰亚胺的活性巯基能与半胱氨酸的巯基以共价键结合于一起。因为交联试剂通常在水中都有低的水溶性，将一个亲水基团譬如磺酸基连接到交联试剂上就可以增加它的水溶性，Sulfo-MBS和sulfo-SMCC交联试剂水溶性改变的实例。很多交联试剂能使本来处于细胞环境下不分裂的情况发生了变化。于是，一些交联试剂就捆绑有一个共价键，如在细胞环境下发生分裂的二硫化物。比如Traut′s reagent，、dithiobis(succinimidylpropionate)(简称DSP)、和N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionate(简称SPDP)都是已经知道的可分裂的交联试剂。可分裂的交联试剂允许被载物半分子被运送到目标细胞后单独地从运输多肽中分离出来。基于这个目的，直接的二硫化物也可以运用。化学交联也包括了定距离装置的用途，这种定距离装置提供分子的柔韧性或调节共轭分子之间的距离，这样有助于生物活性的保护。定距离装置可以是由包含有定距离的氨基酸(如脯氨酸)的蛋白质或多肽组成，另外，定距离装置也可以是交联试剂的一部分，如long-chain SPDP″(见Pierce Chem.Co.，Rockford，Ill.，cat.No.21651 H)。许多包括前面提到过的交联试剂都已经上市使用，有关它们详细的介绍都能从它们的供应商那儿获得。一本涉及到蛋白质交联和共轭制备的书是Wong，Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking，CRCPress(1991)。
本发明同样也包含了那些模拟天然功能序列的或它们的D形式同系物序列的已经被修饰过的的融合蛋白。这些修饰后的变量定义为衍生物，也是本发明的融合蛋白。衍生物包含部分(I)和/或部分(II)的派生物，也可以是部分(III)，部分(IV)，部分(V)等的衍生物，(如果存在的话)也可以是天然L序列或相应的逆序D形式的衍生物。本文有意指出的是，融合蛋白是通过取代L或D形式氨基酸序列一个或多个位点的一个或多个氨基酸而来，或是通过使自然母体的任何位点的一个或多个氨基酸缺失而来，和/或是在自然肽序列的一个或多个位点插入一个或多个氨基酸而来，以此来达到保持其特有活性的目的。氨基酸的取代反应优选与传统的取代反应。传统的取代反应有以下代表甘氨酸和丙胺酸；缬氨酸，异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺酸和谷酰胺；丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；苯基丙氨酸和酪氨酸。此外，可优选传统的取代反应基团有门冬氨酸-谷氨酸；天门冬酰胺-谷酰胺；缬氨酸--亮氨酸--异亮氨酸；丙胺酸--缬氨酸；苯基丙氨酸-酪氨酸和赖氨酸-精氨酸。通过部分(I)和/或部分(II)的这些序列变更(如果存在的话，也可以是部分(III)，部分(IV)，部分(V))，使本发明的融合蛋白的稳定性和/或有效性可被改变，如加强。与它们的母体L形式(或D形式类似物，表现母体序列的D形式和L形式也都被称成“双亲序列”)相比，被修饰的本发明的融合蛋白必须与拥有相应双亲序列的蛋白保持同源性，如在序列，功能，抗原特性或其它特征方面。特别优选的是包含于部分(I)中的母体运输序列的衍生物保持其相应的功能(主要是细胞半分子可渗透方面的特性)，然而包含在部分(II)的母体BH3域蛋白序列的衍生物保持了它们细胞凋亡前的特性。衍生于母体双亲序列的本发明的融合蛋白所改变的特性，比双亲序列的特性更有优势(比如增加pH的适宜性，提高温度的稳定性等)。本发明的融合蛋白的部分(I)要么是母体L形式同系物的逆序D形式，要么是通过对序列修饰的所导入的逆序D形式(母体L形式同系物)的衍生物。
母体的D形式或L形式序列的衍生物(构成本发明的融合蛋白)与母体氨基酸有明显坚固的序列属性，如部分(II)中图2A——2F中所揭露的。特别优选的是保持有至少60％的氨基酸序列属性，甚至是保持有至少75％的序列属性，甚至是保持有至少80％的，甚至保持有至少90％的，甚至是保持有至少95％的。序列属性是能被测定，如通过使用合适的默认值参数和序列分析软件(Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group，University of Wisconsin Biotechnology Center，1710 University Avenue，Madison，Wis.53705)。
合成衍生物已经知道并且可以根据下面的标准方法来实行，这个标准方法是在本技术中描述过的一种熟练的技术(参考SambrookJ，Maniatis T(1989)supra).根据本发明的一个具体实施例，运用重新结合技术可将包含有母体的或衍生的L形式的序列用于制备本发明的融合蛋白的某些蛋白，如部分(II)。如上面所描述的，这些L形式的部分(II)通过单独的步骤被连接到D形式的部分(I)上。一般来说，要做好本发明的融合蛋白的蛋白重新结合准备，可通过选择预定的母体DNA序列或修饰母体DNA序列，或将DNA序列转化到适当的宿主上，表达(修饰后的)的DNA序列要形成所要求的蛋白序列。通过标准方法可以实现对蛋白序列的分离，这些方法包括将溶媒中细胞进行离心或过滤分离出来，必要时还要破坏细胞，通过盐(硫酸铵)来使蛋白质沉淀，取上清液或滤过液，进一步通过色谱方法来提纯，比如离子交换柱色谱、亲和性色谱或者其他经过验证的相似的方法(参看SambrookJ，Maniatis T(1989)supra)。
更详细地，重新结合技术包括借助于核酸或编码融合蛋白的部分(II)的左旋肽并培育成重组微生物的载体使宿主细胞转化，优选大肠埃希菌为例，大肠埃希菌在适于宿主细胞生长和核酸表达的环境下，如诱导剂、盐适当补充的媒介、生长因素、抗体、营养补充等。因此核酸实现了表达，并生成了编码后的融合蛋白。
包含本发明的融合蛋白部分(II)中母体L形式的核酸的载体，详细阐明了如部分(II)中的L形式序列的一个或更多核酸序列的核酸序列。因为能变成适宜的宿主细胞，载体能用于促使核酸的表达。载体可以是质粒，噬菌体微粒或或者只是染色体的植入。一旦变形成为适宜的宿主细胞，载体就可以开始复制或者独立运行染色体，或者在适宜条件下，结合到自身的染色体上，根据本发明可优选的载体是大肠埃希菌E.coli XL-Blue MRF`和pBK-CMV质体。
之前所提到的载体的“其他序列”涉及如下通常，合适的载体包括如Ori p，colEl Ori复制的起点和允许核酸插入序列，这些插入的核酸有表达作用(录制和/或翻译)和有可选择的遗传标志，如编码了荧光蛋白的GFP遗传因子，赋予了抗体的遗传因子，这些抗体来源于Tn3的P-内酰胺酶遗传因子，来源于Tn903的抵抗卡那徽素的或来源于Tn9的抵抗氯霉素。
术语“质粒”意思是在染色体外通常能自我复制的遗传单元。质粒一般都用较低的p放在字母和/或数字之前或之后。然而此处所说的最开始的质粒在一个无限制的基础上是很容易得到利用的，或根据从已公布的程序，从可得到的质粒中进行构造。另外，该领域内熟练的人员都知道那些已描述的相等质粒。用来制备现在发明的载体的质体是可以分离的，如来源于含有质体的适宜的大肠埃希菌可用如氯化铯DNA分离的标准程序来分离。
适宜的载体涉及到编码型载体也等同于表达型载体的DNA的重组。编码型载体涉及到自主复制因子，包括但不受限制的质粒和噬菌体，包含融合蛋白部分(II)的一个或多个左旋肽段的一个或多个附加核酸的DNA分子已经被补充。表达型载体涉及到编码型载体重组构造的所有DNA，这些DNA包含了共轭分子的一个或多个左旋肽段的核酸序列，共轭分子连接于适宜的支配序列能够实现表达和控制插入进适宜主体的核酸的转录。如此一来质粒就可以轻松改变构造表达型载体以致于制备了许多生物体的共轭分子的左旋肽段，这些生物体包括了大肠杆菌Sf9(一种杆状病毒)、酵母菌。U.S.Pat.No.4,992,373文献中也包括了构造AV12表达媒介和变换AV12宿主细胞的技术，这里的介绍仅是文献里所描述的众多技术中的一种，仅供参考。
“可操作连接”意思就是核酸序列以一种允许核酸序列表现(如翻译和/或转录)的方式被连接到一个控制序列。“翻译”意思就是包含在DNA核酸序列中的信息被转化成补充的RNA序列的过程。
“控制序列”于本技术中已经获悉并且可以选择来表达左旋肽段的核酸和控制转录。这样的控制序列包括了，但不仅仅限定于此的多腺苷酸化信号、启动子(天然或合成的启动子)、或可实现准录的加强因子、控制转录的可选的操作序列、组织特异性的基因位点、编码了合适的捆绑核糖体的mRNA序列、能使控制转录和翻译末端的mRNA和和核酸序列稳定的序列等，这些控制序列是可以改变的，如通过染色体的缺失或增加，插入或取代一个或多个核酸，于是保存他们的控制功能。本技术的其它适宜的控制序列也已获悉并且有作描述，可参考Goeddel(1990)，Gene Expression TechnologyMethods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，CA。
尤其是已经知道了很多用作不同生物体的不同的启动子，如用于枯草芽孢杆菌的优先启动子是AprE，用于E.coli中优先的启动子是T7/Lac启动子，用于酿酒酵母中启动子则是PGK1(磷酸甘油酸酯激酶1)，glaA则是用于黑曲霉素的优先启动子并且cbhI是木霉素的优先启动子。适合用于原核宿主细胞的启动子还包括β-内酰胺酶(含有复制子和B-内酰胺酶基因的载Pgx2907(ATCC39344))和乳糖启动子系统，碱性的磷酸酯酶，色氨酸启动子系统(在trp启动子的控制下作为trpE融合蛋白并设计用于促进开放式阅读框表达的pATH1(ATCC 37695)的载体)以及杂和启动子比如tac启动子(从pDR540ATCC-37282质粒中分离)。但是，已知核苷酸序列的其他功能性的细菌启动子，通过使用连接子或者适配器来补给任何必需的限制性酶切位点使人们能够熟练地连接它们到现已编码出来的左旋的DNA肽段。细菌系统的启动子将同样会包含连接到现已编码出来的左旋的DNA肽段上的S-D序列。
有用的表达型载体，比如可能会包括染色体的片段、非染色体的片段和合成的DNA序列的片段，合成的DNA序列的片段则例如各种已知的SV40的引物或者片段和已知的细菌质粒，例如大肠杆菌中的质粒，包括col E1，pBK，pCR1，pBR322，pMb9，pUC 19以及其变种，广阔的数组范围的质粒，例如RP4，噬菌体DNAs，各种衍生出来的噬菌体λ例如NM989，和其它DNA噬菌体，例如M13和菌丝状的单链的DNA噬菌体，酵母质粒，真核细胞中有用的载体，例如动物照射室中的载体和从质粒制品和噬菌体DNAs中得到的载体，这样的载体例如使其可以利用噬菌体DNA或者其它表达控制序列的改良的质粒。用于上述表达载体的表达技术在生物技术中是有名的和普遍的，例如Sambrook J，Maniatis T(1989)supra。
包括前面提到的载体或者已发明的融合蛋白部分(II)的左旋肽段的核苷酸的相配细胞或者宿主细胞有能力为上述的核苷酸或者载体去充当宿主和表达型载体。宿主细胞可以是原核的，真核的或古核生物(archaeon)细胞。宿主细胞包括(例如，由于转化，转染或转导)质粒或者核苷酸，但是不是仅限于此处，细菌细胞(如R.marinus，E.coli，Streptomyces，Pseudomonas，Bacillus，Serratia marcescens，Salmonella typhimurium)，真菌包括酵母(例如酵母菌属，毕赤酵母属)和霉(例如曲霉)，昆虫细胞(例如Sf9)或者哺乳动物细胞(例如COS，CHO)。完美的宿主细胞表示大肠杆菌。一般而言，在能够想得到的特殊方法中，一个宿主细胞可能被筛选出来去调整有关插入序列或者修饰或者处理用序列已编码的表达蛋白。选择合适的细胞或者细胞系或者宿主系统来确保得到期望的变体和异种蛋白的处理算是完成了。例如，在细菌系统中的蛋白质表达可以用于产生非糖基化的核心蛋白，然而哺乳动物细胞中的蛋白质表达则产生异性蛋白的糖基化。
真核宿主细胞不是限用于特殊的真核宿主细胞。真核细胞的多样性是可用的，例如从美国标准菌库中的和上述的载体都是可以用的。一个特殊宿主细胞的选择在一定程度上依赖那些促进已发现的左旋肽段的核苷酸表达的特殊表达载体。真核宿主细胞包括哺乳动物细胞和酵母细胞。尽管许多其它菌种是常用的，但半知菌类的酿酒酵母是最常用的真核微生物。为了酵母菌的表达，例如酵母复制型质粒(ATCC-40053)，是常用的。(见Stinchcomb L.et al.(1979)Nature，28239；Kingsman J.al.(1979)，Gene，7141；S.Tschemper etal.(1980)，Gene，10157)。这种质粒已包含可以为那些不能在色氨酸中生长的酵母突变株提供可选标记的色氨酸基因。
用于酵母宿主的合适的启动序列包括3-磷酸甘油酸酯激酶(在pAP12BD质粒(ATCC 53231)可以找到和在文献U.S.Pat.No.4,935,350，issued Jun.19，1990，中描述的)或者例如烯醇酶(pAC1质粒(ATCC 39532)可以找到)，甘油酸酯-3-磷酸脱氢酶(pHcGAPC1质粒(ATCC 57090，57091)中分离得到)，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，6-磷酸葡萄糖异构酶，3-磷酸甘油酸变位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖异构酶，磷酸葡糖异构酶和葡萄糖激酶，同样还有酵单菌目属的乙醛脱氢酶和丙酮酸脱羧酶(见文献U.S.Pat.No.5,000,000 issued Mar.19，1991)等其它的糖酵解酶。具有在各种生长条件下可控的诱导型启动子转录附加优点的其它的酵母启动子是乙醛脱氢酶2，异细胞色素C，酸性磷酸酯酶，与氮代谢有关的降解酶，金属硫蛋白(在pCL28XhoLHBPV质粒载体上含有(ATCC 39475)和在文献U.S.Pat.No.4,840,896有所描述)，3-磷酸甘油醛脱氢酶和用于麦芽糖和半乳糖发酵的酵素(例如pRY121质粒(ATCC 37658)上发现的GAL1)的启动子区。酵母增强子例如来源于酿酒酵母的UAS Ga1(在YEpsec--hI1beta质粒(ATCC 67024)上发现的与CYC1启动子相结合)也是有效的利用酵母启动子。
前面提到的载体可以用适当的方法(例如转化，电穿孔，用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、二乙氨基乙基葡聚糖或者其他物质转染，微粒轰击，脂质转染，感染或转导)引入宿主细胞的。转化归因于DNA进入一个有机体以致于DNA是可复制的，或者是染色体外的遗传因子或者染色体整合。在生物技术中转化入细菌和真核宿主的方法也是已知的。很多方法，例如核注射，原生质体融合或者利用在Sambrook J，Maniatis T(1989)supra中总结了的钙试剂盒，仅由是否任何编码序列的与质粒接纳有关的转染，实际上都是可以表达的。当任何指征或者操作或者载体出现在宿主细胞中时成功的转染是公认的。
在本发明的另外一个具体实施例中，本发明的融合蛋白的部分(II)与母体L形式或其衍生物不相应，但与由D氨基酸组成并是反方向的逆序D形式序列相对应。这些部分(II)的D形式序列(与部分(I)的D形式序列一起)在重组技术方面不是很明显，通过缩氨酸合成技术进行合成，如固态阶段合成，使用D氨基酸而非L氨基酸来得到D氨基酸序列。然而，必须注明的是，氨基酸顺序必须在合成上是颠倒的(与L形式的同系物相比较)。
众所周知，所有发明的氨基酸序列都可以通过化学方法合成，包括固相蛋白质的合成，包括固态阶段蛋白合成或重新结合方法。这两种方法在U.S Pat.No.4617149中有描述，其整体性则要结合参考文献，固相化学合成多肽的原理在生物技术中是很有名的并且Dugas H和PenneyC在1981年生物有机化学杂志的54-92页有描述，例如蛋白质和氨基酸可以通过利用适用的生物系统430A肽合成器和适用的生物系统提供的合成循环来合成。被保护的氨基酸，如t-乙醇醚化碳酰基保护的氨基酸和其它反应试剂都可从化学供应机构中取得。为了产生羧基末端的羧酰胺，用双偶连记录的的连续的p-甲基二本甲基胺树脂化学合成是被应用到4-metylbenzhydrylamine树脂化的起始。为了产生成C端酸，要使用相应的嘧啶-2-醛肟甲碘化物树脂。通过使用预成型的氢氧根的苯并三唑脂来结合天门冬酰胺，谷氨酸和精氨酸。以下的要用侧链保护精氨酸，甲苯磺酰基；天冬氨酸，环己基；葡萄糖，环己基；丝氨酸，苯甲基；苄基；苏氨酸；苄基；酪氨酸，4-溴苄酯基。在丁氧基肼基甲酸酯策略中，一部分丁氧基肼基甲酸酯的保护在二氯甲烷溶剂中伴随着三氟醋酸来完成。接下来蛋白质或者多肽合成的完成就是脱保护和用包含10％甲酚的无水氟化氢的树脂中分离出来。从树脂中分离支链的保护基团和融合蛋白的侧链是在不高于0℃，最好是-20℃的条件下保持30min，然后再在0℃的条件下30min进行的。在去掉氟化氢后，融合蛋白和侧链都要用乙醚洗涤，然后融合蛋白用冰乙酸提取，接着低压冻干。通过交联葡聚糖-10为固定相的色谱柱，用10％乙酸洗脱完成净化。
本发明的另一个表现提供了一种药剂学上的合成物，该合成物包含本发明的融合蛋白和药物合适的基质，佐剂或者赋型剂。这个药剂学上的合成物是为了治疗那些至少有部分是由正常的程序化细胞死亡(凋亡)的变化而引起的疾病。优选可治疗的疾病包括癌症，如霍奇金淋巴癌，非霍奇金淋巴癌，组织淋巴癌，脑癌，卵巢癌，泌尿生殖器管道癌，大肠癌，肝癌，结肠直肠管道癌，胰腺癌，乳癌，前列腺癌，淋巴系统癌，胃癌，喉癌和肺癌，包括肺腺癌，细小细胞肺癌和/皮肤癌，如黑素瘤或非黑素瘤的皮肤癌，包括基部细胞和鳞片状细胞的癌和牛皮癣，白塞(Behcet)综合病症和寻常性天疱疮。
依照发明提及，一种药物合适的基质，佐剂或者赋型剂是无毒的并且不能破坏按配方制造的作为治疗的本发明的融合蛋白的药理学活性。用于药物合剂中的合适赋型剂包括，但也不仅仅限于这些，比如离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白(例如人血清蛋白)，缓冲物质(例如磷酸盐)，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，部分饱和脂肪酸的甘油酯混合物，水，盐或者电解质(例如硫酸鱼精蛋白，磷酸二氢钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶质硅酸酐，三硅酸镁)，聚乙烯吡咯烷酮，基本纤维素，聚乙烯乙二醇，羧甲基纤维素(钠)，聚丙烯酸盐，蜡，聚乙烯-聚氧丙烯-封闭聚合物，聚乙二醇和羊毛脂。
现已发明的药物制剂可以注射的或者非注射的给药(例如口服)。
术语注射用于此处包括皮下的，静脉的，肌内的，关节内的，滑膜腔内的，向腹膜的，胸骨内的，鞘膜内的，肝内的，内伤的和颅内的注射或者输注技术。如果注射给药，药物制剂选择皮下或者静脉给药更好。发明的药物制剂的无菌的注射形式可以是水或者油状的混悬液。这些混悬液可以用合适的分散或者湿润剂和悬浮剂依照制药技术来按配方制造。无菌的注射剂在无毒的合适的注射稀释剂或者溶媒中也可能是无菌的注射溶液或者混悬液，例如在1，3-二丁醇中的注射溶液。在这些可以使用的赋型剂和溶剂中有水，林格溶液和等渗的氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发的油按照惯例都可以作为溶媒或者混悬介质。
为了这个目的，任何温和的油都可以使用，包括合成的单双甘油酯。脂肪酸，例如油酸和其甘油酯衍生物在注射剂的制备中都是有用的，像一些天然的药用的油，例如橄榄油或者蓖麻油，特别是在聚氧乙醇环境中都是有用的。这些油剂或者混悬剂也可能包含长链的乙醇稀释剂或者分散剂，例如羧甲基纤维素或者那些通常用于合适的药物制剂(乳剂和混悬剂)中的相似的分散剂。其它常用的表面活性剂，例如吐温，司盘类和其它的乳化剂或者经常用于药物制剂中合适的固体，液体，或者其它的剂型的生物利用度增强剂。
不仅限于这些，胶囊剂，片剂，水制混悬液或者溶液。至于用于口服的片剂，辅料一般包括乳糖和玉米淀粉。润滑剂像硬脂酸镁都是有代表性的加入。用于口服的胶囊，常用的稀释剂包括乳糖和干燥的淀粉。当口服水制的混悬液时，有效成分常常与乳化剂和混悬剂结合在一起。如果要的得到的话，一定的甜味剂，调料或者着色剂都是要加的。另外，标准的药物制剂方法都可以用于控制作用持续时间。这在制药技术中都是很有名的，包括控制药物释放和合适的大分子，例如聚合物，多元酯，聚合的氨基酸，聚乙烯吡咯烷酮，乙烯-醋酸乙烯酯，甲基纤维素，羧甲基纤维素或者硫酸鱼精蛋白。大分子的浓度同样可以作为控制药物释放的整合方法。另外，媒介物可以与大分子片段融合在一起，例如多元酯，聚合的氨基酸，水凝胶，多聚的乳酸或者乙烯基乙腈共聚物的共聚物。除了融合以外，这些媒介物在微粒体中用于饱和化合物。
此外的一些给药形式，例如喷雾吸入，局部地，经直肠地，经鼻地，向颊地，阴道地或者经由一个植入型药盒，这其中的一些形式将在下面仔细的介绍。
相应地，已发明地药物制剂可以以栓剂的形式用于直肠给药。这些栓剂通过混合一些没有刺激性的辅料制成的，辅料要求在室温下是固体而在直肠的温度下是液态的，为此其可以在直肠中溶解来释放药物。这些辅料包括可可脂，蜂蜡和聚乙二醇。
已发明的药物制剂也可以局部的给药，特别是当治疗目标包括容易接近的区域或者器官时包括眼部，皮肤或者下部的肠道疾病。相应的局部制剂为这些区域或者器官制备。用于下部的肠道的局部制剂可以以栓剂的形式起作用(见上)或者用合适的灌肠剂。经皮的局部制剂也是可用的。为了局部应用，药用的化合物可以配成包含有效成分混悬或者溶解在辅料中的软膏剂。用于这个发明的共轭分子的局部给药的辅料包括但不仅限于此，例如矿物油，液状石蜡，白蜡，丙烯乙二醇，聚氧乙烯，聚氧丙烯化合物，乳化蜡和水。有时，药用的化合物可以配成包含有效成分混悬或者溶解在辅料中的洗剂或者乳膏剂。合适的辅料包括矿物油，司盘-60，吐温-60，十六烷基酯蜡，2-辛基月桂醇，苄醇和水，但是不仅限于此。
为了眼部药用，药用的化合物可以按配方在等渗，合适的PH的无菌盐溶液中制成微粒化的混悬液，或者更好的是溶液，可以添加防腐剂或者不添加例如氯化苯甲基酮。有时，眼部用药也可以按配方制成软膏剂例如凡士林。
本发明地药物制剂可以以鼻腔气溶剂或者吸入剂的形式给药。这种药用化合物可以依照药物制剂配方中的技术制备和，在盐，苯甲醇或者其它合适的防腐剂，为了增加生物利用度的吸收促进剂，碳氟化合物和其它的增溶或者分散剂中制成溶液。
更好的话，这个发明的药物制剂可以口服给药。
在单剂量的形式下结合用于药物合剂的基质，佐剂和赋型剂已发明的共轭分子的量会是不同的，其取决于宿主，特殊的给药模式。更好地，为了给一个病人每天0.01--100mg/kg(体重)的药量的抑制剂，药用的合剂应该按配方制成。首选的药物剂量范围是每天0.1-5mg/kg(体重)甚至于每天1-5mg/kg(体重)。
胶囊剂其是将100mg的活性成分，175mg的乳糖，24mg的滑石粉和6mg的硬脂酸镁灌装于由动物明胶做成的胶囊中制成的。软胶囊在大豆油中制成药物活性成分的混合物并且通过正电压排出泵将其注入到明胶中形成含100mg活性成分的软胶囊。接着在洗涤和干燥即得软胶囊剂。片剂通过传统的程序来制备片剂，以至其剂量单位为100mg的活性成分，0.2mg的二氧化硅，5mg的硬脂酸镁，275mg的微晶纤维素，11mg的玉米淀粉和98.8mg的乳糖。合适的包衣可以用于增加可口性或者用于延缓吸收。注射剂适合给药的注射用合剂是通过将1.5％活性成分(按重量计)搅拌入10％丙二醇(按体积计)和水中。溶液是由无菌的等渗的氯化钠制成。混悬剂用于口服给药的水制混悬液的制备，每5mm含有100mg完全分散好的活性成分，200mg羧基纤维素钠，5mg苯甲酸钠，1.0g山梨醇溶液和0.025mm的香草醛。
值得注意的是用于任何病人的特定剂量和治疗服法将依赖很多因素，包括特定融合蛋白的活性，年龄，体重，一般健康状态，性别，饮食，给药次数，排泄频率，药物并用和治疗医生的决定和正在治疗的特殊疾病的严重性。在药物制剂中已发明的融合蛋白的量也将依赖于制剂中的特殊融合蛋白。
本发明的进一步实施例与本发明的融合蛋白的使用有关。本发明的融合蛋白可用于治疗疾病或预防疾病或控制有缺陷的凋亡，如霍奇金淋巴癌，非霍奇金淋巴癌，脑癌，卵巢癌，泌尿生殖器管道癌，大肠癌，肝癌，结肠直肠管道癌，胰腺癌，乳癌，前列腺癌，淋巴系统癌，胃癌，喉癌和肺癌，包括肺腺癌，细小细胞肺癌和/皮肤癌，如黑素瘤或非黑素瘤的皮肤癌，包括基部细胞和鳞片状细胞的癌和牛皮癣，Behcet的综合病症和寻常性天疱疮。
下面的材料和例子用于解释发明，但不应该限于上面的构建的发明范围。现在申请公开引用的所有文献也是通过文献整合完整的。
序列表<110>Xigen S.A.
<120>包含Bcl-2家族蛋白中唯BH3域蛋白中BH3结构域的融合蛋白<130>CX01P002WO<140>
<141>
<150>EP 04028278.245<151>2004-11-29<160>25<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<220>
<221>MISC_FEATURE<223>序列描述D-Tat的氨基酸序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>Xaa＝甘氨酸或删除<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(10)<223>氨基酸1至10是右旋氨基酸<400>1Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Xaa1 5 10<210>2<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>
<222>(1)..(9)<223>Xaa＝处于1-3位以及5-9位的精氨酸或赖氨酸，以及Xaa＝处于4位的非基本氨基酸<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(9)<223>氨基酸1至9是右旋氨基酸<400>2Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa1 5
<210>3<211>241<212>PRT<213>Homo sapiens<220>
<221>MISC_FEATURE<223>序列描述Bid的氨基酸序列(人类)(转录变量1)<400>3Met Cys Ser Gly Ala Gly Val Met Met Ala Arg Trp Ala Ala Arg Gly1 5 10 15Arg Ala Gly Trp Arg Ser Thr Val Arg Ile Leu Ser Pro Leu Gly His20 25 30Cys Glu Pro Gly Val Ser Arg Ser Cys Arg Ala Ala Gln Ala Met Asp35 40 45Cys Glu Val Asn Asn Gly Ser Ser Leu Arg Asp Glu Cys Ile Thr Asn50 55 60Leu Leu Val Phe Gly Phe Leu Gln Ser Cys Ser Asp Asn Ser Phe Arg65 70 75 80Arg Glu Leu Asp Ala Leu Gly His Glu Leu Pro Val Leu Ala Pro Gln85 90 95Trp Glu Gly Tyr Asp Glu Leu Gln Thr Asp Gly Asn Arg Ser Ser His100 105 110Ser Arg Leu Gly Arg Ile Glu Ala Asp Ser Glu Ser Gln Glu Asp Ile115 120 125Ile Arg Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Val Gly Asp Ser Met Asp130 135 140Arg Ser Ile Pro Pro Gly Leu Val Asn Gly Leu Ala Leu Gln Leu Arg145 150 155 160Asn Thr Ser Arg Ser Glu Glu Asp Arg Asn Arg Asp Leu Ala Thr Ala165 170 175Leu Glu Gln Leu Leu Gln Ala Tyr Pro Arg Asp Met Glu Lys Glu Lys180 185 190Thr Met Leu Val Leu Ala Leu Leu Leu Ala Lys Lys Val Ala Ser His195 200 205Thr Pro Ser Leu Leu Arg Asp Val Phe His Thr Thr Val Asn Phe Ile210 215 220Asn Gln Asn Leu Arg Thr Tyr Val Arg Ser Leu Ala Arg Asn Gly Met225 230 235 240Asp<210>4<211>168<212>PRT<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE<223>序列描述Bad的氨基酸序列(人工序列)<400>
Met Phe Gln Ile Pro Glu Phe Glu Pro Ser Glu Gln Glu Asp Ser Ser1 5 10 15Ser Ala Glu Arg Gly Leu Gly Pro Ser Pro Ala Gly Asp Gly Pro Ser20 25 30Gly Ser Gly Lys His His Arg Gln Ala Pro Gly Leu Leu Trp Asp Ala35 40 45Ser His Gln Gln Glu Gln Pro Thr Ser Ser Ser His His Gly Gly Ala50 55 60Gly Ala Val Glu Ile Arg Ser Arg His Ser Ser Tyr Pro Ala Gly Thr65 70 75 80Glu Asp Asp Glu Gly Met Gly Glu Glu Pro Ser Pro Phe Arg Gly Arg85 90 95Ser Arg Ser Ala Pro Pro Asn Leu Trp Ala Ala Gln Arg Tyr Gly Arg00 105 110Glu Leu Arg Arg Met Ser Asp Glu Phe Val Asp Ser Phe Lys Lys Gly115 120 125Leu Pro Arg Pro Lys Ser Ala Gly Thr Ala Thr Gln Met Arg Gln Ser130 135 140Ser Ser Trp Thr Arg Val Phe Gln Ser Trp Trp Asp Arg Asn Leu Gly145 150 155 160Arg Gly Ser Ser Ala Pro Ser Gln165<210>5<211>483<212>PRT<213>Homo sapiens<220>
<221>misc_feature<223>序列描述Noxal的氨基酸序列(人工序列)<400>
Met Ala Ser Leu Gly Asp Leu Val Arg Ala Trp His Leu Gly Ala Gln1 5 10 15Ala Val Asp Arg Gly Asp Trp Ala Arg Ala Leu His Leu Phe Ser Gly20 25 30Val Pro Ala Pro Pro Ala Arg Leu Cys Phe Asn Ala Gly Cys Val His35 40 45Leu Leu Ala Gly Asp Pro Glu Ala Ala Leu Arg Ala Phe Asp Gln Ala50 55 60Val Thr Lys Asp Thr Cys Met Ala Val Gly Phe Phe Gln Arg Gly Val65 70 75 80Ala Asn Phe Gln Leu Ala Arg Phe Gln Glu Ala Leu Ser Asp Phe Trp85 90 95
Leu Ala Leu Glu Gln Leu Arg Gly His Ala Ala Ile Asp Tyr Thr Gln100 105 110Leu Gly Leu Arg Phe Lys Leu Gln Ala Trp Glu Val Leu His Asn Val115 120 125Ala Ser Ala Gln Cys Gln Leu Gly Leu Trp Thr Glu Ala Ala Ser Ser130 135 140Leu Arg Glu Ala Met Ser Lys Trp Pro Glu Gly Ser Leu Asn Gly Leu145 150 155 160Asp Ser Ala Leu Asp Gln Val Gln Ar9 Arg Gly Ser Leu Pro Pro Arg165 170 175Gln Val Pro Arg Gly Glu Val Phe Arg Pro His Arg Trp His Leu Lys180 185 190His Leu Glu Pro Val Asp Phe Leu Gly Lys Ala Lys Val Val Ala Ser195 200 205Ala Ile Pro Asp Asp Gln Gly Trp Gly Val Arg Pro Gln Gln Pro Gln210 215 220Gly Pro Gly Ala Asn His Asp Ala Arg Ser Leu Ile Met Asp Ser Pro225 230 235 240Arg Ala Gly Thr His Gln Gly Pro Leu Asp Ala Glu Thr Glu Val Gly245 250 255Ala Asp Arg Cys Thr Ser Thr Ala Tyr Gln Glu Gln Arg Pro Gln Val260 265 270Glu Gln Val Gly Lys Gln Ala Pro Leu Ser Pro Gly Leu Pro Ala Met275 280 285Gly Gly Pro Gly Pro Gly Pro Cys Glu Asp Pro Ala Gly Ala Gly Gly290 295 300Ala Gly Ala Gly Gly Ser Glu Pro Leu Val Thr Val Thr Val Gln Cys305 310 315 320Ala Phe Thr Val Ala Leu Arg Ala Arg Arg Gly Ala Asp Leu Ser Ser325 330 335Leu Arg Ala Leu Leu Gly Gln Ala Leu Pro His Gln Ala Gln Leu Gly340 345 350Gln Leu Ser Tyr Leu Ala Pro Gly Glu Asp Gly His Trp Val Pro Ile355 360 365Pro Glu Glu Glu Ser Leu Gln Arg Ala Trp Gln Asp Ala Ala Ala Cys370 375 380Pro Arg Gly Leu Gln Leu Gln Cys Arg Gly Ala Gly Gly Arg Pro Val385 390 395 400Leu Tyr Gln Val Val Ala Gln His Ser Tyr Ser Ala Gln Gly Pro Glu405 410 415Asp Leu Gly Phe Arg Gln Gly Asp Thr Val Asp Val Leu Cys Glu Glu420 425 430Pro Asp Val Pro Leu Ala Val Asp Gln Ala Trp Leu Glu Gly His Cys435 440 445Asp Gly Arg Ile Gly Ile Phe Pro Lys Cys Phe Val Val Pro Ala Gly
450 455 460Pro Arg Met Ser Gly Ala Pro Gly Arg Leu Pro Arg Ser Gln Gln Gly465 470 475 480Asp Gln Pro<210>6<211>193<212>PRT<213>人类<220>
<221>MISC_FFATURF<223>序列描述美洲狮的氨基酸序列(人工序列)<400>
Met Ala Arg Ala Arg Gln Glu Gly Ser Ser Pro Glu Pro Val Glu Gly1 5 10 15Leu Ala Arg Asp Gly Pro Arg Pro Phe Pro Leu Gly Arg Leu Val Pro20 25 30Ser Ala Val Ser Cys Gly Leu Cys Glu Pro Gly Leu Ala Ala Ala Pro35 40 45Ala Ala Pro Thr Leu Leu Pro Ala Ala Tyr Leu Cys Ala Pro Thr Ala50 55 60Pro Pro Ala Val Thr Ala Ala Leu Gly Gly Ser Arg Trp Pro Gly Gly65 70 75 80Pro Arg Ser Arg Pro Arg Gly Pro Arg Pro Asp Gly Pro Gln Pro Ser85 90 95Leu Ser Leu Ala Glu Gln His Leu Glu Ser Pro Val Pro Ser Ala Pro100 105 110Gly Ala Leu Ala Gly Gly Pro Thr Gln Ala Ala Pro Gly Val Arg Gly115 120 125Glu Glu Glu Gln Trp Ala Arg Glu Ile Gly Ala Gln Leu Arg Arg Met130 135 140Ala Asp Asp Leu Asn Ala Gln Tyr Glu Arg Arg Arg Gln Glu Glu Gln145 150 155 160Gln Arg His Arg Pro Ser Pro Trp Arg Val Leu Tyr Asn Leu Ile Met165 170 175Gly Leu Leu Pro Leu Pro Arg Gly His Arg Ala Pro Glu Met Glu Pro180 185190Asn<210>7<211>198<212>PRT<213>人类<220>
<221>MISC_FEATURE<223>序列描述Bim的氨基酸序列(人类)
(转录变量1)<400>7Met Ala Lys Gln Pro Ser Asp Val Ser Ser Glu Cys Asp Arg Glu Gly1 5 10 15Arg Gln Leu Gln Pro Ala Glu Arg Pro Pro Gln Leu Arg Pro Gly Ala20 25 30Pro Thr Ser Leu Gln Thr Glu Pro Gln Gly Asn Pro Glu Gly Asn His35 40 45Gly Gly Glu Gly Asp Ser Cys Pro His Gly Ser Pro Gln Gly Pro Leu50 55 60Ala Pro Pro Ala Ser Pro Gly Pro Phe Ala Thr Arg Ser Pro Leu Phe65 70 75 80Ile Phe Met Arg Arg Ser Ser Leu Leu Ser Arg Ser Ser Ser Gly Tyr85 90 95Phe Ser Phe Asp Thr Asp Arg Ser Pro Ala Pro Met Ser Cys Asp Lys100105 110Ser Thr Gln Thr Pro Ser Pro Pro Cys Gln Ala Phe Asn His Tyr Leu115 120 125Ser Ala Met Ala Ser Met Arg Gln Ala Glu Pro Ala Asp Met Arg Pro130 135 140Glu Ile Trp Ile Ala Gln Glu Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Phe Asn145 150 155 160Ala Tyr Tyr Ala Arg Arg Val Phe Leu Asn Asn Tyr Gln Ala Ala Glu165 170 175Asp His Pro Arg Met Val Ile Leu Arg Leu Leu Arg Tyr Ile Val Arg180 185 190Leu Val Trp Arg Met His195<210>8<211>160<212>PRT<213>人类<220>
<221>MISC_FEATURE<223>序列描述Bik的氨基酸序列(人工序列)<400>8Met Ser Glu Val Arg Pro Leu Ser Arg Asp Ile Leu Met Glu Thr Leu1 5 10 15Leu Tyr Glu Gln Leu Leu Glu Pro Pro Thr Met Glu Val Leu Gly Met20 25 30Thr Asp Ser Glu Glu Asp Leu Asp Pro Met Glu Asp Phe Asp Ser Leu35 40 45Glu Cys Met Glu Gly Ser Asp Ala Leu Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile50 55 60
Gly Asp Glu Met Asp Val Ser Leu Arg Ala Pro Arg Leu Ala Gln Leu65 70 75 80Ser Glu Val Ala Met His Ser Leu Gly Leu Ala Phe Ile Tyr Asp Gln85 90 95Thr Glu Asp Ile Arg Asp Val Leu Arg Ser Phe Met Asp Gly Phe Thr100 105 110Thr Leu Lys Glu Asn Ile Met Arg Phe Trp Arg Ser Pro Asn Pro Gly115 120 125Ser Trp Val Ser Cys Glu Gln Val Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu130 135 140Ala Leu Leu Leu Pro Leu Leu Ser Gly Gly Leu His Leu Leu Leu Lys145 150 155 160<210>9<211>251<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<223>序列描述D-Tat-Bid的氨基酸序列(人工序列)(转录变量1)<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>Xaa＝甘氨酸或删除<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(10)<223>氨基酸1至10是右旋氨基酸<400>
Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Xaa Met Cys Ser Gly Ala Gly1 5 10 15Val Met Met Ala Arg Trp Ala Ala Arg Gly Arg Ala Gly Trp Arg Ser20 25 30Thr Val Arg Ile Leu Ser Pro Leu Gly His Cys Glu Pro Gly Val Ser35 40 45Arg Ser Cys Arg Ala Ala Gln Ala Met Asp Cys Glu Val Asn Asn Gly50 55 60Ser Ser Leu Arg Asp Glu Cys Ile Thr Asn Leu Leu Val Phe Gly Phe65 70 75 80Leu Gln Ser Cys Ser Asp Asn Ser Phe Arg Arg Glu Leu Asp Ala Leu85 90 95Gly His Glu Leu Pro Val Leu Ala Pro Gln Trp Glu Gly Tyr Asp Glu100 105 110Leu Gln Thr Asp Gly Asn Arg Ser Ser His Ser Arg Leu Gly Arg Ile115 120 125Glu Ala Asp Ser Glu Ser Gln Glu Asp Ile Ile Arg Asn Ile Ala Arg
130 135 140His Leu Ala Gln Val Gly Asp Ser Met Asp Arg Ser Ile Pro Pro Gly145 150 155 160Leu Val Asn Gly Leu Ala Leu Gln Leu Arg Asn Thr Ser Arg Ser Glu165 170 175Glu Asp Arg Asn Arg Asp Leu Ala Thr Ala Leu Glu Gln Leu Leu Gln180 185 190Ala Tyr Pro Arg Asp Met Glu Lys Glu Lys Thr Met Leu Val Leu Ala195 200 205Leu Leu Leu Ala Lys Lys Val Ala Ser His Thr Pro Ser Leu Leu Arg210 215 220Asp Val Phe His Thr Thr Val Asn Phe Ile Asn Gln Asn Leu Arg Thr225 230 235 240Tyr Val Arg Ser Leu Ala Arg Asn Gly Met Asp245 250<210>10<211>178<212>PRT<213>人类<220>
<221>MISC_FEATURE<223>序列描述D-Tat-Bad的氨基酸序列(人工序列)<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>Xaa＝甘氨酸或删除<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(10)<223>氨基酸1至10是右旋氨基酸<400>10Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly Met Phe Gln Ile Pro Glu1 5 10 15Phe Glu Pro Ser Glu Gln Glu Asp Ser Ser Ser Ala Glu Arg Gly Leu20 25 30Gly Pro Ser Pro Ala Gly Asp Gly Pro Ser Gly Ser Gly Lys His His35 40 45Arg Gln Ala Pro Gly Leu Leu Trp Asp Ala Ser His Gln Gln Glu Gln50 55 60Pro Thr Ser Ser Ser His His Gly Gly Ala Gly Ala Val Glu Tle Arg65 70 75 80Ser Arg His Ser Ser Tyr Pro Ala Gly Thr Glu Asp Asp Glu Gly Met85 90 95Gly Glu Glu Pro Ser Pro Phe Arg Gly Arg Ser Arg Ser Ala Pro Pro100 105 110
Asn Leu Trp Ala Ala Gln Arg Tyr Gly Arg Glu Leu Arg Arg Met Ser115 120 125Asp Glu Phe Val Asp Ser Phe Lys Lys Gly Leu Pro Arg Pro Lys Ser130 135 140Ala Gly Thr Ala Thr Gln Met Arg Gln Ser Ser Ser Trp Thr Arg Val145 150 155 160Phe Gln Ser Trp Trp Asp Arg Asn Leu Gly Arg Gly Ser Ser Ala Pro165 170 175Ser Gln<210>11<211>493<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>序列描述D-Tat-Noxal的氨基酸序列(人工序列)<220>
<221>misc_feature<222>(10)..(10)<223>Xaa＝甘氨酸或删除<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(10)<223>氨基酸1至10是右旋氨基酸<400>11Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly Met Ala Ser Leu Gly Asp1 5 10 15Leu Val Arg Ala Trp His Leu Gly Ala Gln Ala Val Asp Arg Gly Asp20 25 30Trp Ala Arg Ala Leu His Leu Phe Ser Gly Val Pro Ala Pro Pro Ala35 40 45Arg Leu Cys Phe Asn Ala Gly Cys Val His Leu Leu Ala Gly Asp Pro50 55 60Glu Ala Ala Leu Arg Ala Phe Asp Gln Ala Val Thr Lys Asp Thr Cys65 70 75 80Met Ala Val Gly Phe Phe Gln Arg Gly Val Ala Asn Phe Gln Leu Ala85 90 95Arg Phe Gln Glu Ala Leu Ser Asp Phe Trp Leu Ala Leu Glu Gln Leu100 105 110Arg Gly His Ala Ala Ile Asp Tyr Thr Gln Leu Gly Leu Arg Phe Lys115 120 125Leu Gln Ala Trp Glu Val Leu His Asn Val Ala Ser Ala Gln Cys Gln130 135 140Leu Gly Leu Trp Thr Glu Ala Ala Ser Ser Leu Arg Glu Ala Met Ser145 150 155 160
Lys Trp Pro Glu Gly Ser Leu Asn Gly Leu Asp Ser Ala Leu Asp Gln165 170 175Val Gln Arg Arg Gly Ser Leu Pro Pro Arg Gln Val Pro Arg Gly Glu180 185 190Val Phe Arg Pro His Arg Trp His Leu Lys His Leu Glu Pro Val Asp195 200 205Phe Leu Gly Lys Ala Lys Val Val Ala Ser Ala Ile Pro Asp Asp Gln210 215 220Gly Trp Gly Val Arg Pro Gln Gln Pro Gln Gly Pro Gly Ala Asn His225 230 235 240Asp Ala Arg Ser Leu Tle Met Asp Ser Pro Arg Ala Gly Thr His Gln245 250 255Gly Pro Leu Asp Ala Glu Thr Glu Val Gly Ala Asp Arg Cys Thr Ser260 265 270Thr Ala Tyr Gln Glu Gln Arg Pro Gln Val Glu Gln Val Gly Lys Gln275 280 285Ala Pro Leu Ser Pro Gly Leu Pro Ala Met Gly Gly Pro Gly Pro Gly290 295 300Pro Cys Glu Asp Pro Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ser305 310 315 320Glu Pro Leu Val Thr Val Thr Val Gln Cys Ala Phe Thr Val Ala Leu325 330 335Arg Ala Arg Arg Gly Ala Asp Leu Ser Ser Leu Arg Ala Leu Leu Gly340 345 350Gln Ala Leu Pro His Gln Ala Gln Leu Gly Gln Leu Ser Tyr Leu Ala355 360 365Pro Gly Glu Asp Gly His Trp Val Pro Ile Pro Glu Glu Glu Ser Leu370 375 380Gln Arg Ala Trp Gln Asp Ala Ala Ala Cys Pro Arg Gly Leu Gln Leu385 390 395 400Gln Cys Arg Gly Ala Gly Gly Arg Pro Val Leu Tyr Gln Val Val Ala405 410 415Gln His Ser Tyr Ser Ala Gln Gly Pro Glu Asp Leu Gly Phe Arg Gln420 425 430Gly Asp Thr Val Asp Val Leu Cys Glu Glu Pro Asp Val Pro Leu Ala435 440 445Val Asp Gln Ala Trp Leu Glu Gly His Cys Asp Gly Arg Tle Gly Ile450 455 460Phe Pro Lys Cys Phe Val Val Pro Ala Gly Pro Arg Met Ser Gly Ala465 470 475 480Pro Gly Arg Leu Pro Arg Ser Gln Gln Gly Asp Gln Pro485 490<210>12<211>203<212>PRT
<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<223>序列描述D-Tat-Puma的氨基酸序列(人工序列)<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>Xaa＝甘氨酸或删除<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(10)<223>氨基酸1至10是右旋氨基酸<400>
Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly Met Ala Arg Ala Arg Gln1 5 10 15Glu Gly Ser Ser Pro Glu Pro Val Glu Gly Leu Ala Arg Asp Gly Pro20 25 30Arg Pro Phe Pro Leu Gly Arg Leu Val Pro Ser Ala Val Ser Cys Gly35 40 45Leu Cys Glu Pro Gly Leu Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Thr Leu Leu50 55 60Pro Ala Ala Tyr Leu Cys Ala Pro Thr Ala Pro Pro Ala Val Thr Ala65 70 75 80Ala Leu Gly Gly Ser Arg Trp Pro Gly Gly Pro Arg Ser Arg Pro Arg85 90 95Gly Pro Arg Pro Asp Gly Pro Gln Pro Ser Leu Ser Leu Ala Glu Gln100 105 110His Leu Glu Ser Pro Val Pro Ser Ala Pro Gly Ala Leu Ala Gly Gly115 120 125Pro Thr Gln Ala Ala Pro Gly Val Arg Gly Glu Glu Glu Gln Trp Ala130 135 140Arg Glu Ile Gly Ala Gln Leu Arg Arg Met Ala Asp Asp Leu Asn Ala145 150 155 160Gln Tyr Glu Arg Arg Arg Gln Glu Glu Gln Gln Arg His Arg Pro Ser165 170 175Pro Trp Arg Val Leu Tyr Asn Leu Ile Met Gly Leu Leu Pro Leu Pro180 185 190Arg Gly His Arg Ala Pro Glu Met Glu Pro Asn195 200<210>13<211>208<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<223>序列描述D-Tat-Bim的氨基酸序列(人工序列)
转录变量1<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>Xaa＝甘氨酸或删除<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(10)<223>氨基酸1至10是右旋氨基酸<400>
Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly Met Ala Lys Gln Pro Ser1 5 10 15Asp Val Ser Ser Glu Cys Asp Arg Glu Gly Arg Gln Leu Gln Pro Ala20 25 30Glu Arg Pro Pro Gln Leu Arg Pro Gly Ala Pro Thr Ser Leu Gln Thr35 40 45Glu Pro Gln Gly Asn Pro Glu Gly Asn His Gly Gly Glu Gly Asp Ser50 55 60Cys Pro His Gly Ser Pro Gln Gly Pro Leu Ala Pro Pro Ala Ser Pro65 70 75 80Gly Pro Phe Ala Thr Arg Ser Pro Leu Phe Ile Phe Met Arg Arg Ser85 90 95Ser Leu Leu Ser Arg Ser Ser Ser Gly Tyr Phe Ser Phe Asp Thr Asp100 105 110Arg Ser Pro Ala Pro Met Ser Cys Asp Lys Ser Thr Gln Thr Pro Ser115 120 125Pro Pro Cys Gln Ala Phe Asn His Tyr Leu Ser Ala Met Ala Ser Met130 135 140Arg Gln Ala Glu Pro Ala Asp Met Arg Pro Glu Ile Trp Ile Ala Gln145 150 155 160Glu Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Phe Asn Ala Tyr Tyr Ala Arg Arg165 170 175Val Phe Leu Asn Asn Tyr Gln Ala Ala Glu Asp His Pro Arg Met Val180 185 190Ile Leu Arg Leu Leu Arg Tyr Ile Val Arg Leu Val Trp Arg Met His195 200 205<210>14<211>170<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>MISC_FEATURE<223>序列描述D-Tat-Noxal的氨基酸序列(人工序列)<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(10)..(10)<223>Xaa＝甘氨酸或删除
<220>
<221>MOD_RES<222>(1)..(10)<223>氨基酸1至10是右旋氨基酸<400>
Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly Met Ser Glu Val Arg Pro1 5 10 15Leu Ser Arg Asp Ile Leu Met Glu Thr Leu Leu Tyr Glu Gln Leu Leu20 25 30Glu Pro Pro Thr Met Glu Val Leu Gly Met Thr Asp Ser Glu Glu Asp35 40 45Leu Asp Pro Met Glu Asp Phe Asp Ser Leu Glu Cys Met Glu Gly Ser50 55 60Asp Ala Leu Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile Gly Asp Glu Met Asp Val65 70 75 80Ser Leu Arg Ala Pro Arg Leu Ala Gln Leu Ser Glu Val Ala Met His85 90 95Ser Leu Gly Leu Ala Phe Ile Tyr Asp Gln Thr Glu Asp Ile Arg Asp100 105 110Val Leu Arg Ser Phe Met Asp Gly Phe Thr Thr Leu Lys Glu Asn Ile115 120 125Met Arg Phe Trp Arg Ser Pro Asn Pro Gly Ser Trp Val Ser Cys Glu130 135 140Gln Val Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu Leu Pro Leu145 150 155 160Leu Ser Gly Gly Leu His Leu Leu Leu Lys165 170<210>15<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>序列描述Bik的BH3域的原始L型氨基酸序列<400>15Ala Leu Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile Gly Asp Glu Met Asp Val Ser1 5 10 15Leu Arg<210>16<211>18<212>PRT
<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>序列描述Bak的BH3域的原始L型氨基酸序列<400>16Arg Tyr Gly Arg Glu Leu Arg Arg Met Ser Asp Glu Phe Val Asp Ser1 5 10 15Phe Lys<210>17<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>序列描述Bid的BH3域的原始L型氨基酸序列<400>17Asn Ile Ala Arg His Leu Ala Gln Val Gly Asp Ser Met Asp Arg Ser1 5 10 15Ile Pro<210>18<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>序列描述Bmf的BH3域的原始左旋氨基酸序列<400>18Gln Ile Ala Arg Lys Leu Gln Cys Ile Ala Asp Gln Phe His Arg Leu1 5 10 15His Val<210>19<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>序列描述DP5Hrk的BH3域的原始L型氨基酸序列
<400>19Leu Thr Ala Ala Arg Leu Lys Ala Ile Gly Asp Glu Leu His Gln Arg1 5 10 15Thr Met<210>20<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>序列描述Bim的BH3域的原始左旋氨基酸序列<400>20Trp Ile Ala Gln Glu Leu Arg Arg Ile Gly Asp Glu Phe Asn Ala Tyr1 5 10 15Tyr Ala<210>21<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>Description of sequencenative L-amino acid sequence of theBH3-domain of Noxa(Noxa BH3)<400>序列描述Noxal的BH3域的原始左旋氨基酸序列Glu Cys Ala Thr Gln Leu Arg Arg Phe Gly Asp Lys Leu Asn Phe Arg1 5 10 15Gln Lys<210>22<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>序列描述Puma的BH3域的原始左旋氨基酸序列<400>22
Glu Ile Gly Ala Gln Leu Arg Arg Met Ala Asp Asp Leu Asn Ala Gln1 5 10 15Tyr Glu<210>23<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>序列描述Bax的BH3域的原始左旋氨基酸序列<400>23Lys Leu Ser Glu Cys Leu Lys Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp Ser Asn1 5 10 15Met Glu<210>24<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>序列描述Bak的BH3域的原始L型氨基酸序列<400>24Gln Val Gly Arg Gln Leu Ala Ile Ile Gly Asp Asp Ile Asn Arg Arg1 5 10 15Tyr Asp<210>25<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>序列描述Bok的BH3域的原始左旋氨基酸序列Glu Val Cys Thr Val Leu Leu Arg Leu Gly Asp Glu Leu Glu Gln Ile1 5 10 15Arg Pro
权利要求
1.一种融合蛋白，其特征在于，其包含至少一个第一部分(I)和至少一个第二部分(II)，所述第一部分(I)包含一个载体序列，所述第二部分(II)包含唯BH3域蛋白中BH3结构域序列的部分或者全长，所述融合蛋白在其第一部分(I)中包含一个逆序的右旋氨基酸。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述至少一个第一部分(I)和至少一个第二部分(II)通过共价键相连。
3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其特征在于，所述第一部分(I)包含一个载体序列，所述载体序列能够将所述融合蛋白引导至确定的细胞位置。
4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的融合蛋白，其特征在于，所述第一部分(I)包含一个载体序列，所述载体序列能够增强细胞渗透性从而增强融合蛋白的细胞摄取性能。
5.根据权利要求1至4中任一权利要求所述的融合蛋白，其特征在于，所述第一部分(I)包含一个载体序列，所述载体序列是人类免疫缺陷病毒TAT蛋白中的一个D-TAT序列。
6.根据权利要求1至5中任一权利要求所述的融合蛋白，其特征在于，所述第一部分(I)包含一个氨基酸序列，所述氨基酸序列为图1A所示的氨基酸序列(D-TAT的氨基酸序列RRRQRRKKRG)，或者为图1B所示的氨基酸序列(D-TAT的同属氨基酸序列Xn-RRRQRRKKR-Xn)。
7.根据权利要求1至6中任一权利要求所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二部分(II)包含部分或者全长的BH3结构域序列，能够诱导细胞凋亡。
8.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二部分(II)包含部分或者全长的BH3结构域序列，其与至少一个Bc1-2家族蛋白相结合。
9.根据权利要求1至8中任一权利要求所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二部分(II)包含部分或者全长的BH3结构域序列，其用于激活或者敏化所述Bcl-2家族蛋白的至少一个促凋亡蛋白。
10.根据权利要求1至9中任一权利要求所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二部分(II)包含部分或者全长的BH3结构域序列，其来自于一个唯BH3域蛋白，所述唯BH3域蛋白选自包含Bid、Bad、Noxa、Puma、Bim、Bik、Bmf、DP5/Hrk和Bok的族群。
11.根据权利要求1至10中任一权利要求所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二部分(II)包含部分或者全长的BH3结构域序列，其以由左旋氨基酸所组成的形式存在，或者以由右旋氨基酸所组成的形式存在。
12.根据权利要求1至11中任一权利要求所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二部分(II)包含如图2A、2B、2C、2D、2E、2F所示的氨基酸序列(Bid、Bad、Noxa、Puma、Bim和Bik的氨基酸序列)，或其一个包含部分或者全长的BH3结构域序列的片段。
13.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1至12中任一权利要求所述的融合蛋白，以及可选地包括可生理接收的载体、佐剂和/或赋形剂。
14.利用如权利要求1至12中任一权利要求所述的融合蛋白治疗和/或预防由缺陷性细胞凋亡导致的疾病，如癌症，所述癌症包括霍杰金淋巴瘤、非霍杰金淋巴瘤、组织细胞淋巴瘤、脑瘤(成胶质细胞瘤)、卵巢癌、泌尿生殖器癌症、结肠癌、肝癌、直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴癌、胃癌、喉癌和肺癌，所述肺癌包括肺腺癌和小型细胞肺癌，和/或皮肤癌，例如黑素瘤或者非黑素瘤的皮肤癌症，包括基底细胞瘤和扁平细胞癌，以及牛皮癣、白塞氏病、寻常性天疱疮。
15.利用如权利要求1至12中任一权利要求所述的融合蛋白，制备用于治疗和/或预防由缺陷性细胞凋亡导致的疾病如癌症的药物组合物，所述癌症包括霍杰金淋巴瘤、非霍杰金淋巴瘤、组织细胞淋巴瘤、脑瘤(成胶质细胞瘤)、卵巢癌、泌尿生殖器癌症、结肠癌、肝癌、直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴癌、胃癌、喉癌和肺癌，所述肺癌包括肺腺癌和小型细胞肺癌，和/或皮肤癌，例如黑素瘤或者非黑素瘤的皮肤癌症，包括基底细胞瘤和扁平细胞癌，以及牛皮癣、白塞氏病、寻常性天疱疮。
全文摘要
本发明涉及融合蛋白，其包括至少一个第一部分(I)和至少一个第二部分(II)，所述第一部分(I)包含一个载体序列，所述第二部分(II)包含唯BH3域蛋白中BH3结构域序列的部分或全长，所述融合蛋白在其第一部分(I)中包含一个逆序的右旋氨基酸。此外，本发明还涉及包含所述融合蛋白的药物组合物及其用途。
文档编号A61K38/17GK101068832SQ200580040812
公开日2007年11月7日 申请日期2005年11月18日 优先权日2004年11月29日
发明者克里斯托夫·邦尼, 迪迪尔·科夸兹 申请人:希根有限责任公司