酶稳定化的制作方法

专利名称：酶稳定化的制作方法
专利说明酶稳定化 发明领域 本发明涉及液体组合物中的酶(包括蛋白酶)的稳定化和可逆抑制，更具体而言，涉及液体含酶的制剂，该制剂具有包含由含硼化合物和α-羟基一元-羧酸形成的配合物的酶稳定化体系。

背景技术：
由活细胞(例如，细菌)制备的或者获得的酶已经成为了各种组合物中的一个普通组分，所述组合物包括工业和消费应用和清洁组合物，如洗衣用的洗涤剂，洗衣用的预浸和预处理产品。酶组合物用于将有机物如蛋白、淀粉和脂肪分解成能够更容易地溶解或分散在水性液体中的小分子。清洁用酶组合物的一些应用包括洗衣用的洗涤剂，织物柔软剂，所有类型的擦拭物(wipe)，液体洗盘产品(手工或自动)，和硬质表面清洁剂。用于个人护理制剂的酶包括面部、皮肤和身体护理产品，其中蛋白酶提高了各种大分子熟化和水解功能。酶被用于多种生物处理应用，如将谷物转化成甜味剂，发酵，将生物量转化成用于燃料的乙醇，以及增强家畜和宠物的动物饲料。在纸浆和造纸工业中，将木聚糖酶用于漂白加速，纤维素酶用于精制纸浆和纸的循环，而淀粉酶用于除去和改性淀粉。酶的其它工业应用包括化学产品、塑料和纤维的工业化生物技术生产。还已经将酶开发用于工业和农业废料的生物整治，化学毒素的净化，和通过生物膜清除的维护。
目前，最大量酶被用于洗涤剂和清洁剂，其中洗涤剂酶通常在碱性条件下表现出水解活性。洗涤组合物经常含有活性蛋白酶(即，蛋白水解酶)；它们还可以含有淀粉分解酶，用于分解含淀粉的污物。其它酶组合物使用脂肪酶或纤维素分解酶，典型地与蛋白酶或淀粉酶组合使用。尽管洗涤剂配方设计师因为这些酶在水性洗涤体系中能够保持活性而选择它们，但是洗涤组合物中通常采用的蛋白水解酶、淀粉分解酶和其它酶在储存过程中可能出现活性的损失(即，不稳定性)。
酶活性的损失在液体或凝胶组合物中更加显著。通过酶的三维结构的解折叠或酶的分解，可能使酶去稳定化。常见的去稳定剂包括极性溶剂如水或其它溶剂，微生物攻击，电解质，带电的表面活性剂，温度和极端的pH。加入稳定剂以固定酶的结构，包括硼酸，二元醇，小分子有机酸和氯化钙。另外，蛋白酶具有攻击自身和其它酶，从而在制剂中造成自溶和蛋白分解的趋势。配方设计师采用蛋白酶抑制物抑制蛋白酶，所述的蛋白酶抑制物如硼酸，含硼酸(boronic acid)，蛋白质物质，邻位多元醇的硼酸酯，例如具有硼酸钠的一丙二醇(monopropylene glycol)。
为了补偿储存期间酶活性的损失，配方设计师可以在液体酶组合物如洗涤剂中使用过量的酶。然而，酶是较贵的制剂成分；因此，配方设计师可以在液体组合物中采用酶稳定剂以抑制蛋白酶的自溶和其它酶的去稳定化反应。
已经用于稳定酶的物质包括各种有机和无机化合物，如多元醇，羧酸，羧酸盐，羧酸酯和糖；钙盐；硼化合物，以及它们的各种组合。也可以使用蛋白提取物，通过抑制酶而使酶稳定。
美国专利5,221,495公开了一种用于液体洗涤剂组合物的三组分酶稳定化体系，包括硼化合物，含有两个或三个羧酸基团和1至4个羟基的羟基多元羧酸，和钙盐。所述羟基多元羧酸优选为柠檬酸。
美国专利4,842,758公开了含有酶的洗涤剂组合物，所述的酶通过组合以下成分而被稳定化包括α-羟基-羧酸或α-羟基-多元-羧酸，硼化合物，和蛋白质物质，例如酪蛋白。作为实例，该专利公开了马来酸，酒石酸，乳酸，和柠檬酸，其中最优选柠檬酸。据该专利教导，蛋白质物质对于抑制蛋白酶从而稳定蛋白酶和淀粉酶两者是必不可少的。该专利教导，没有蛋白质物质就不可能使体系中使用的酶稳定。在所述组合物中使用的蛋白质物质的量较高，为1至6重量％，相比之下，α-羟基羧酸为1至5重量％，硼为0.5至2.5重量％，并且酶为0.5至3重量份。据该专利教导，将α-羟基-酸与硼砂(Na2B4O7·10H2O)混合，加入溶解在NaOH溶液中的酪蛋白，然后将该混合物加入到酶中。此外，该专利还教导了磷酸盐助洗剂的用量超过5％。
美国专利5,691,292描述了一种含有活性酶和酶稳定化体系的洗盘用洗涤剂组合物，所述酶稳定化体系包含选自钙离子、硼酸、丙二醇、短链羧酸、含硼酸、多羟基化合物和它们的混合物的至少一种稳定剂。据该专利公开，合适的多元醇含有约2至约6个碳原子和约2至约6个羟基。该专利教导具体实例如丙二醇(优选1，2-丙二醇)，1，2-丁二醇，乙二醇，甘油，山梨糖醇，甘露醇和葡萄糖。该专利还教导向组合物中任选加入羧酸盐，包括甲酸盐，并且优选甲酸钠。该专利还教导向所述洗盘用洗涤剂组合物中任选加入洗涤助剂，如柠檬酸或碱金属柠檬酸盐(例如，柠檬酸钠)。该专利包括柠檬酸钠(作为洗涤助剂)，和由一种或多种以下成分组成的酶稳定化体系硼酸，1，2-丙二醇，甲酸钙和甲酸钠，作为示例性的洗盘用洗涤剂组合物。
美国专利4,462,922描述了一种含有酶稳定化体系的水性酶液体洗涤剂组合物。所述酶稳定化体系包含硼酸或碱金属硼酸盐，多元醇，和作为还原性碱金属盐的抗氧化剂。该专利教导，可使用的多元醇包含2至6个羟基。所列举的多元醇为乙二醇，丙二醇，1，2-丙二醇，丁二醇，己二醇，甘油，甘露醇，山梨糖醇，赤藓醇，葡萄糖，果糖，乳糖和四氢呋喃二醇(erythritan)。
美国专利5,468,414公开了含有α-羟基酸助洗剂、表面活性剂、蛋白水解酶、第二种酶和酶稳定化体系的液体洗涤剂组合物，所述酶稳定化体系包含某些邻位多元醇和硼酸或其衍生物的混合物。该专利教导含有α-羟基酸助洗剂如酒石酸盐单-琥珀酸或柠檬酸的构造液体洗涤剂组合物。该专利教导，α-羟基酸助洗剂对于酶稳定性是有害的，因此，他们教导使用特别选择的邻位多元醇与硼酸或其衍生物组合作为酶稳定化体系。
美国专利5,976,556描述了含有酸性蛋白酶和酸性缓冲剂的皮肤调理组合物，所述酸性蛋白酶在约pH 5.5以下具有酶活性而在pH 5.5或更高pH明显失活，并且所述酸性缓冲剂包含无机酸。该专利教导了使用有机酸，包括α-羟基羧酸如乳酸、柠檬酸、羟基乙酸和苹果酸以降低皮肤pH，但是没有教导酶-稳定化配合物。
发明概述 本发明的发明人发现，将某些硼化合物与α-羟基-一元-羧酸或它们的盐在某些pH范围组合，形成了令人惊奇地、极大地提高了含酶液体组合物稳定性的配合物。优选的配合物是硼与α-羟基比例为1∶1并且具有单独的一个负电荷，由[1∶1]-表示的配合物。本发明的酶稳定化组合物和方法的工作方式包括，提供酶的三维稳定化，从而即使是对于在水中的非常稀的酶组合物，也提高其贮藏期限。另外，本发明的组合物和方法可逆地抑制蛋白水解活性以使酶稳定，从而提高含有蛋白酶的各种液体制剂的贮藏期限。因此，本发明中″酶稳定化″和″酶稳定化的″是指三维稳定化和酶的可逆抑制这两方面。在酶是蛋白酶时，这是特别使人感兴趣的。本发明将稳定液体酶浓缩物(用作原料)以及含酶的液体产品制剂如洗涤剂。本发明的酶稳定化方法可使配方设计师减少酶稳定剂的量，或者减少酶的量，从而提供有意义的成本节约。另外，本发明在不加入蛋白化合物，以及使用少量或不使用二元醇材料的情况下也是有效的。
本发明的含酶液体组合物包括含约0.01至25重量％活性酶的酶原料和具有少到0.0001重量％活性酶的含酶液体制剂。酶浓缩物被配方设计师用作原料，而含酶液体制剂包括，例如，个人护理产品，医疗产品，家用产品，公共机构或工业产品。本发明的一个方面通过稳定三维结构提供提高的内在酶活性，从而提供例如洗涤剂制剂的提高的清洁作用。本发明的另一方面在于，酶稳定化组合可以防止酶组合物中蛋白酶的自溶，并且通过抑制蛋白酶的蛋白水解活性防止蛋白水解。
本发明的另一方面在于，所述的方法和组合物在含酶液体制剂还含有硼清除剂时是有用的，所述硼清除剂如甘油，一丙二醇(mono-propyleneglycol)，一些表面活性剂如多羟基脂肪酰胺，和α-羟基-多元-羧酸如柠檬酸。由α-羟基-一元-羧酸与硼形成的配合物在低含量时也是有活性的。配方设计师在液体含酶的制剂中可以使用较少的硼。这在存在降低硼含量的趋势的应用和场所中，例如出于环境考虑时，是有益的。
本发明的另一方面在于，α-羟基-一元-羧酸、硼化合物和α-羟基-一元-羧酸的[1∶1]-配合物的组合，即使在基本上不含非酶的蛋白质物质，如现有技术中教导的酪蛋白的情况下，也使酶稳定。基本上没有是指这样的蛋白质蛋白的含量小于1重量％。
附图简述

图1示出了由0.2∶0.2的硼酸∶乳酸比率形成的四种不同pH溶液的11B-NMR测试中，各种硼化合物的峰。
图2示出了由0.2∶0.4的硼酸∶乳酸比率形成的四种不同pH溶液的11B-NMR测试中，各种硼化合物的峰。
图3示出了由0.2∶0.6的硼酸∶乳酸比率形成的四种不同pH溶液的11B-NMR测试中，各种硼化合物的峰。
图4示出了11B-NMR中饱和H3BO3的峰。
发明详述 本发明的一个方面涉及一种制剂用于稳定酶制剂的应用，该制剂含有α-羟基-一元-羧酸或α-羟基-一元-羧酸盐、含硼化合物和由α-羟基-一元-羧酸和含硼化合物形成的配合物的组合。本发明提供更有效的三维结构酶稳定化，酶(蛋白酶)抑制，以及酶原料浓缩液和含酶产品制剂包括洗涤剂的酶稳定化。本发明的酶稳定化组合可以抑制蛋白酶的蛋白水解活性，特别是，比先前的酶稳定剂更有效。本发明具有以下优点可使配方设计师使用更少量的酶或其它酶稳定剂，因而降低含蛋白酶的液体制剂的成本。
本发明的另一方面是一种酶稳定化的组合物，包含 (a)能够与硼化合物配位形成对酶具有稳定化性能的配合物的α-羟基-一元-羧酸或α-羟基-一元-羧酸盐，和 (b)能够与一元-α-羟基-羧酸(或其盐)配位形成对酶具有稳定化性能的配合物的硼化合物；和 (c)由(a)和(b)形成的阴离子配合物；和 (d)酶。
本发明中，术语α-羟基-一元-羧酸是指含有α-羟基-一元-羧酸或羧酸盐官能团的任何化合物。除非另外声明，术语α-羟基-一元-羧酸也指这种酸的盐。α-羟基-一元-羧酸可以由式R-C(OH)(R′)-C(O)-OH表示；其中R选自氢原子，由C1至C10烷基、芳基、取代的C1至C10烷基、取代的芳基、硝基、酯、醚、胺、胺衍生物、取代的胺组成的组，并且烷基或芳基上的取代基选自芳基或烷基，硝基，硝基衍生物，羟基，羟基衍生物，酯，醚，胺，胺衍生物，取代的胺，酰胺，酰胺衍生物和卤素；并且R′选自氢原子，由C1至C10烷基、芳基、取代的C1至C10烷基、取代的芳基、硝基、酯、醚、胺、胺衍生物、取代的胺组成的组，并且烷基或芳基上的取代基选自芳基或烷基，硝基，硝基衍生物，羟基，羟基衍生物，酯，醚，胺，胺衍生物，取代的胺，酰胺，酰胺衍生物和卤素。优选R和R′各自的分子量小于300。当R与R′不同时，酸官能团α位上的碳原子是旋光的，并且可以考虑不同的旋光异构体(例如D-、L-、DL-α-羟基酸)。
可用于与硼配位以抑制酶活性，例如抑制蛋白水解活性(例如，蛋白酶自溶和/或非蛋白水解酶的蛋白水解)，或者用于稳定含酶液体制剂中的酶的α-羟基-一元-羧酸的非限制性实例包括乳酸，扁桃酸，羟基乙酸，羟基丁酸和羟基异丁酸，以及当适合时它们的任一旋光异构体。在一些环境中，如商品重垢液体洗涤剂组合物中，在α-羟基-一元-羧酸盐和硼酸之间更容易产生这样的配合物。本发明的另一方面在于，对于稳定和抑制酶，一元-α-羟基酸或其盐和硼化合物的配合物比使用例如二元醇与硼酸盐的体系更有效。
可用于本发明的硼化合物是可溶于水的并且当加入到水中时形成硼酸或硼酸的碱金属盐的硼化合物。本发明的合适的而非限制性的硼化合物引自专利申请WO 92/19709中。可采用的硼化合物包括硼酸，氧化硼和/或碱金属硼酸盐。合适的碱金属硼酸盐包括原-、焦-和偏-硼酸钠和钾，多硼酸盐和硼砂(Na2B4O7·10H2O)。优选的含硼化合物包括硼酸，硼酸钠(Na3BO3)，硼的其它无机盐和有机盐，和硼砂。在没有本发明的配合物的情况下使用时，有效提高液体酶浓缩物中或液体洗涤剂组合物中的酶稳定性的含硼化合物的量是等价于0.1重量％至10重量％硼酸的量。然而，本发明中，因为硼化合物与α-羟基-一元-羧酸或其盐形成配合物，硼的量将相对于α-羟基-一元-羧酸或其盐的量，并且考虑制剂中任何硼清除剂和将要稳定的酶的量而确定。结果，与可比的现有技术的组合物相比，液体含酶组合物中的硼化合物总量可以更低。因此，在含酶产品制剂中，含酶组合物中以硼酸表示的硼浓度的优选范围为0.1至5重量％，更优选0.1至1.5重量％。
在本发明的另一方面，含硼化合物与一元-α-羟基羧酸或其盐形成配合物以提高酶稳定性。阴离子配合物可由以下通式表示
其中R选自氢原子，由C1至C10烷基、芳基、取代的C1至C10烷基、取代的芳基、硝基、酯、醚、胺、胺衍生物、取代的胺组成的组，并且烷基或芳基上的取代基选自芳基或烷基，硝基，硝基衍生物，羟基，羟基衍生物，酯，醚，胺，胺衍生物，取代的胺，酰胺，酰胺衍生物和卤素；并且R′选自氢原子，由C1至C10烷基、芳基、取代的C1至C10烷基、取代的芳基、硝基、酯、醚、胺、胺衍生物、取代的胺组成的组，并且烷基或芳基上的取代基选自芳基或烷基，硝基，硝基衍生物，羟基，羟基衍生物，酯，醚，胺，胺衍生物，取代的胺，酰胺，酰胺衍生物和卤素。
含硼化合物和α-羟基-一元-羧酸或其盐之间配合物的形成是一个平衡反应。因此，本发明的酶稳定化组合可以含有α-羟基-一元-羧酸，含硼化合物(能够形成硼酸)，和既含有硼又含有与含硼化合物配位的α-羟基-一元-酸的配合物。pH、温度、形成活性配合物的配位比率、任何二级配合物的配位比率、加入的成分的量，以及硼清除剂的存在和酶的量都是可能影响每种组分的量的一些因素。
所形成的配合物与酶的活性位点和并且与酶的活性位点周围的亚位点(sub-site)具有亲合力。尽管不愿拘于理论，但是据信单-配合物，即具有一摩尔硼和一摩尔α-羟基-单-羧基的阴离子，以[1∶1]-表示，通过吸附在酶表面上而使酶稳定，并且通过结合到酶的活性位点而抑制酶。硼原子与α-羟基-单-羧基比率为的1∶2的二-配合物在酶的稳定化方面效力很小或者没有效力，因为它不附着于酶或者与酶结合。
本发明的一个实施方案包括将乳酸和硼酸加入到pH值在pH 2至10之间、优选在pH 3至pH 9之间，并且更优选的范围在pH 4至pH 9之间的液体酶组合物中，以便形成[1∶1]-配合物。
研究了硼化合物与α-羟基一元羧酸的平衡。配位常数通常用K1和K2表示。例如，Pizer等，″The Boric Acid/Lactic acid System.Equilibria andReaction Mechanism″Inorg.Chem.1984，23，3023-3026研究了硼酸、B(OH)3与乳酸CH3CH(OH)COOH的反应，以得到1∶1和1∶2化学计量比的阴离子配合物。Pizer等，将第一类的两个配位反应的平衡描述如下K1＝1.8×10-3；K2＝6.6×10M-1，式中H2L是完全质子化的乳酸。然而，在pH 4至约pH10，第一类配位反应比与脱去质子的乳酸的第二类配位反应占优势K1’＝9.0M-1。另外，在pH 4至pH 10范围内，形成的[1∶2]-少，因为[1∶1]-将不得不与羟基酸阴离子配位；而两个负的阴离子相互反应的几率低。因此，该工作显示，对于乳酸，[1∶2]-配合物的形成在2至4之间的pH是非常有利的，而[1∶1]-配合物在约pH 2至约pH 10之间形成，并且在约pH 3至pH 9之间最占优势。在约pH 9.15以上，溶液中的硼酸根阴离子B(OH)4-开始占优势，并且趋向于不形成与α-羟基阴离子的配合物。
形成本发明配合物的pH范围的更普通的描述可以表述如下如果一元-α-羟基-羧酸的pKa表示为pKaAHA，并且硼化合物的pKa为pKaB，则理想的是，制剂的pH范围为pKaAHA减2点至pKaB加2点。更优选的pH范围为pKaAHA减1.5点至pKaB加1.5点。更优选的范围为pKaAHA减一点至pKaB加一点。为了简化，因为本发明α-羟基-一元-羧酸的pKaAHA将在约pH 3至pH 4之间变化，并且硼酸的pKaB为约9.14，因此便于查找容易监控的特定pH范围。
决定本发明组合物优选pH的另一因素是酶的pH耐受性和活性域。在大多数情况下，特别是对于大多数液体洗涤剂组合物和加入到洗涤剂制剂的液体酶浓缩物而言，酶在大于5.5的pH具有酶活性，并且更具体而言，在大于pH 5.5，更优选在大于pH 7.0的pH表现出峰值活性。
本发明的发明人还发现，形成的单-或二-配合物的量还取决于制剂中使用的硼化合物与α-羟基-一元-羧酸的比率。如果使用大大过量的乳酸，则可更容易地形成[1∶2]-。在以下的实施例5的NMR样品中证实了这点。在该NMR数据中，单-和二-配合物的区域略有不同，表明二-配合物的形成具有浓度依赖性。
可以基于选择的α-羟基-一元-羧酸(或盐)和硼化合物、液体含酶组合物的pH、存在的酶的水平和硼清除剂的量，估计形成每摩尔[1∶1]-配合物所需的酸的摩尔数。因此，加入的α-羟基-一元-羧酸(或其盐)的量将取决于将要配位的硼化合物的量和将要被抑制或稳定化的酶的量。类似地，由α-羟基-一元-羧酸或其盐的量确定加入的硼化合物的量；另外，可以基于pH和作为硼酸清除剂的物质的量，如二元醇、多羟基脂肪酰胺或α-羟基多羧酸助洗剂(即柠檬酸)的量，调节硼的量。本发明中一元-α-羟基羧酸与硼化合物的摩尔比为1∶100至100∶1。由一元-α-羟基羧酸和硼形成的配合物与酶的摩尔比在1∶1至500∶1的范围内。然而，更经济的是使用较少的配合物，并且优选本发明中配合物的摩尔比与酶的摩尔比在1∶1至100∶1范围内。作为起点，制剂中α-羟基-一元-羧酸的量可以在0.01至25重量％范围内。更优选α-羟基-一元-羧酸为0.1至10重量％。
本发明的另一方面是与现有技术相比，用更少量的硼稳定酶组合物的能力。本发明的[1∶1]-配合物比使用二元醇和硼酸盐组合的体系更有效地稳定酶和/或可逆地抑制酶如蛋白酶。例如，大多数非磷酸盐助洗剂重垢洗涤剂的pH约8-8.5，并且以相对高的含量使用由邻位二元醇和硼化合物制成的酶抑制剂以提供适当的酶稳定化和(蛋白酶)可逆抑制。当使用更少量的硼清除剂如二元醇、基于多羟基的表面活性剂或α-羟基-多元-羧酸时，总的组合物中需要的硼的量也更少。
本发明使用α-羟基-一元-羧酸来络合硼。例如洗涤剂的常用助洗剂，α-羟基-多元羧酸，如柠檬酸，确实与硼形成配合物，并且经常与酶组合物一起使用。然而，在大于约5的pH，柠檬酸盐和硼酸之间的配合物带两或三个负电荷，因而可能过于亲水而不适合酶活性位点的疏水袋，以致不能可逆地抑制酶，特别是蛋白酶。因此，在约5或更高的pH下，柠檬酸是对酶稳定性有害的硼清除剂。
本发明的液体含酶组合物含有至少一种酶。原则上，本发明为任一类的酶，优选可在pH 2和pH 10之间使用的那些酶提供稳定性。酶的非限制性实例包括蛋白酶，脂肪酶，淀粉酶和纤维素酶。可以以现有技术教导的量，例如以供应商如Novozymes、Novo Nordisk和Genencor推荐的量使用酶。本发明的含酶液体组合物包括含有约0.01至25重量％活性酶的酶原料，和具有少到0.0001重量％活性酶的含酶液体制剂。酶浓缩物被配方设计师用作原料，而含酶液体制剂包括，例如，个人护理产品，医疗产品，家用产品，公共机构或工业产品。纯酶在本发明组合物中的典型的量为0.0001％至25％。以组合物重量计，该量对于酶原料而言可以是0.01至25％，或者对于含酶制剂如典型的洗涤剂为0.0001至2.5％。适合结合到本发明的各种组合物中的酶可以选自过氧化物酶，蛋白酶，葡糖淀粉酶，淀粉酶，木聚糖酶，纤维素酶，脂肪酶，磷脂酶，酯酶，角质酶，果胶酶，角质素酶，还原酶，氧化酶，酚氧化酶，脂氧合酶，木质素酶，支链淀粉酶，鞣酸酶，戊聚糖酶，malanases，B-葡聚糖酶，阿拉伯糖苷酶，透明质酸酶，软骨素酶，葡聚糖酶，转移酶，漆酶，甘露聚糖酶，木葡聚糖酶，它们的衍生物和混合物，这些酶来自任何合适的来源，如源自植物，动物，细菌，真菌和酵母。通过定义为相近结构的酶变体，还包含由化学或基因修饰路径(routant)制备的本发明的酶。本发明的含酶组合物的非限制性实例可以含有多种酶，并且它们的类别描述于专利申请US 2005/0059567A1、WO 2004/113484 A1和WO 92/19709中。
本发明的酶稳定化组合抑制了蛋白酶的活性。蛋白酶是指任何一种具有蛋白水解活性，从而引起或者催化蛋白水解成简单的可溶物如肽和氨基酸的酶。本发明中，蛋白酶包括催化在多肽链或蛋白分子内部的肽键的水解的肽链内切酶，和从多肽链的末端开始催化单个氨基酸水解的肽链外切酶。因此，本发明的一个方面是稳定化的含蛋白酶的含酶组合物。蛋白酶可以源自动物，植物或微生物(优选)。更优选是细菌源的丝氨酸蛋白酶。可以使用该酶的纯化或非纯化形式。通过定义为相近结构的酶变体，还包含由化学或基因修饰路径制备的本发明的酶。特别优选获自芽孢杆菌(Bacillus)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)和/或地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)的细菌丝氨酸蛋白水解酶。
合适的蛋白酶包括可商购的Alcalase*，Esperase*，Savinase*(优选)；Maxatase*，Maxacal*(优选)和Maxapem*15(蛋白工程的Maxacal)，以及枯草杆菌蛋白酶BPN和BPN1(优选)。优选的蛋白水解酶还有修饰的细菌丝氨酸蛋白酶，如1987年4月28日提交的欧洲专利申请序列号87303761.8(具体地，17、24和98页)中描述的那些，其在本发明中称作″蛋白酶B″，和在1986年10月29日公布的Venegas的欧洲专利申请199,404中描述的那些，其涉及在本发明中称作″蛋白酶A″的修饰的细菌丝氨酸蛋白水解酶。因此，优选的蛋白水解酶选自Savinase，Esperase，Maxacal，BPN，蛋白酶A，蛋白酶B和蛋白酶C，以及它们的混合物。
用于本发明的合适的脂肪酶包括细菌、动物和真菌源的，包括通过化学或基因修饰路径获得的脂肪酶。
合适的细菌脂肪酶包括由假单胞菌如施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)ATCC 19，154制备的脂肪酶，如在英国专利1,372,034中公开的，该专利在本文引用作为参考。合适的脂肪酶包括与微生物荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)IAM 1057制备的脂肪酶抗体具有阳性免疫交叉反应的脂肪酶。这种脂肪酶及其纯化方法描述于1978年2月24日公开的日本专利申请53-20487中，该专利在本文引用作为参考。这种脂肪酶可以商品名Lipase P″Amano″获得，以下称作″Amano-P″。使用根据Oucheterlon(Acta.Med.Scan.，133，76-79页(1950))的标准和熟知的免疫扩散方法，这种脂肪酶显示出与Amano-P抗体的阳性免疫交叉反应。这些脂肪酶和它们与Amano-P的阳性免疫交叉反应的方法同样描述于1987年11月17日授权的Thom等的美国专利4,707,291中，该专利在本文引用作为参考。其典型实例是Amano-P脂肪酶，出自莓实假单胞菌(Pseudomonas fragi)FERM P 1339的脂肪酶(可以商品名Amano-B获得)，出自硝基还原假单胞菌(Pseudomonas nitroreducens)变体lipolyticum FERM P 1338的脂肪酶(可以商品名Amano-CES获得)，出自粘稠色杆菌(Chromobacter viscosum)变体lipolyticum NRR1b 3673的脂肪酶，以及粘稠色杆菌(Chromobacterviscousm)脂肪酶，和出自唐菖蒲假单胞菌(Pseudomonas gladioli)的脂肪酶。感兴趣的其它脂肪酶是Areario AKG和Bacillis Sp脂肪酶(例如Solvay酶)。
与所述组合物相容的感兴趣的其它脂肪酶是以下专利中描述的脂肪酶1990年11月28日公开的EP A 0339681，1990年9月5日公开的EPA 0385401，1987年4月15日公开的EP A 0218272，和1989年5月18日公开的PCT/DK 88/00177，所有这些专利都在本文引用作为参考。
合适的真菌脂肪酶包括由Humicola lanuginosa和Thermomyceslanuginosus制备的脂肪酶。最优选如欧洲专利申请0258068(该专利在本文引用作为参考)中所述的，通过从Humicola lanuginosa克隆基因并且在Aspergillus oryzae中表达而获得的脂肪酶，该脂肪酶可从Novozymes以商品名Lipolase*商购。另外的实例可在US 2005/0059567、WO 2004/113484A1和WO 92/19709中找到。
可以将任何适合在液体洗涤剂组合物中使用的淀粉酶用于这些组合物中。淀粉酶包括例如，从B.licheniforms的特殊菌株获得的a-淀粉酶，其详细描述于英国专利说明书No.1,296,839中。淀粉分解酶包括，例如，Rapidase*，Maxamyl*，Termamyl*和BAN*。另外的实例可见US2005/0059567，WO 2004/113484A1和WO 92/19709。
可用于本发明的纤维素酶包括细菌和真菌纤维素酶。优选它们具有在5和9.5之间的pH最佳值。合适的纤维素酶公开于Barbesgoard等的美国专利4,435,307中，该专利公开了从Humicola insolens制备的真菌纤维素酶。合适的纤维素酶还公开于GB-A-2.075.028；GB-A-2.095.275和DE-OS-2.247.832中。
这种纤维素酶的实例是由Humicola insolens菌株(Humicola grisea变体thermoidea)，特别是由Humicola菌株DSM 1800制备的纤维素酶。
其它合适的纤维素酶是源自Humicola insolens的分子量约50 KDa、等电点为5.5并且含有415个氨基酸的纤维素酶。这种纤维素酶描述于1993年3月19日提交的共同未决的欧洲专利申请93200811.3中。特别合适的纤维素酶是具有颜色护理益处的纤维素酶。这种纤维素酶的实例描述于1991年11月6日提交的欧洲专利申请91202879.2(Novo Nordisk)中。另外的实例见US 2005/0059567A1，WO 2004/113484A1和WO 92/19709。
制备用于本发明组合物中的酶的方法对于本发明是否起作用不重要。除了基因操作处理外，还可以使用通过诱变制备酶的其它方法，如定位诱变，饱和诱变，盒式诱变，或者通过例如重组或非重组方法的酶定向进化。
由于该组合物的方法在pH 2和10之间最有效，其可用于在该pH范围内操作的应用中，如动物饲料，食品处理和食品加工，家用，包括织物护理和硬质表面护理，以及个人护理。本发明的酶组合物包括含有肌醇六磷酸酶、可用于在农业应用中增加吸收或来自动物饲料的有机磷的酶组合物。类似地，本发明的组合物包括含有木聚糖酶和蛋白酶以提高营养释放和吸收的组合物。
本发明其它稳定化的酶组合物可用于食品行业，用于肉类加工、果类和蔬菜加工领域、淀粉加工、饮料、焙烤或饮食酶。这种组合物中的酶包括用于提味的谷氨酸胺酶，乳糖酶，纤维素酶，淀粉酶和蛋白酶。
本发明其它稳定化的酶组合物可用于个人护理。例如，蛋白酶、脂肪酶和过氧化氢酶可用于隐形眼镜的清洁剂，而葡糖淀粉酶和葡萄糖氧化酶可用于牙膏组合物。酶组合物可用于皮肤护理，包括洗涤和化学去皮。
酶体系另外的用途是用于废料处理部门的化学和环境应用。本发明的含有脂肪酶、淀粉酶、腈水解酶(nitrlase)、水解酶(hydralase)、葡糖合成酶和单-加氧酶的稳定化的酶体系具有提高使用前储存时间的优点。专门的化学方法如手性合成使用通常含有水解酶，特别是脂肪酶的组合物。
可以将本发明的稳定化的含酶组合物配制成含有表面活性剂的液体组合物。表面活性剂可以基于最终组合物的用途选择，包括阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、两性离子表面活性剂以及这些表面活性剂中一种或多种的混合物。可用于本发明的非限制性表面活性剂描述于以下参考文献中WO 92/19709，US2005/0059567A1，WO 2005/049776A1，US 6,803,355B1，WO 2004/113484A1，WO 2005/012474A1。作为一个实例，在作为本发明的一个实施方案的洗涤剂或洗衣制剂中，稳定化的含酶组合物可以含有约1重量％至约60重量％的至少一种表面活性剂。
可用于本发明的阴离子表面活性剂是这样的表面活性化合物，其在它们的分子结构中含有长链烃疏水基团和亲水基团，即水加溶基如磺酸盐或硫酸盐基团。阴离子表面活性剂包括碱金属(例如钠和钾)水溶性高级烷基苯磺酸盐、烷基磺酸盐、烷基硫酸盐和烷基聚醚硫酸盐。
可用于本发明的高级烷基聚醚硫酸盐可以是正链或支链烷基并且含有可含2或3个碳原子的低级烷氧基。优选正链高级烷基聚醚硫酸盐，原因在于它们具有比支链烷基更高程度的生物降解度，并且低级聚烷氧基优选是乙氧基。
可单独或与其它表面活性剂组合用于本发明的非离子合成有机洗涤剂描述如下。众所周知，非离子合成有机洗涤剂的特征在于存在有机疏水基团和有机亲水基团如脂肪酸葡糖酰胺。大多数非离子表面活性剂是典型地通过有机脂肪族或烷基芳族疏水化合物与环氧乙烷(本性亲水)的缩合而制备的。
通常，非离子洗涤剂是聚-低级烷氧基化的亲脂体，其中所需的亲水-亲脂平衡是通过向亲脂部分中加入亲水性聚-低级烷氧基而获得的。采用的一类优选非离子洗涤剂是聚-低级烷氧基化的高级链烷醇，其中链烷醇含有6至18个碳原子并且其中低级烯化氧(含2、3或4个碳原子)的摩尔数为3至12。这种材料中，优选采用其中高级链烷醇是含有9至11或12至15个碳原子的高级脂肪醇并且每摩尔含有5至8或5至9摩尔低级烷氧基的那些。
这种化合物的示例是其中链烷醇含有12至15个碳原子并且每摩尔含有约7摩尔环氧乙烷基团的化合物，例如，由Shell Chemical Company，Inc.制造的产品Neodol 25-7和Neodol 23-6.5。前者是平均约含12至15个碳原子的高级脂肪醇的混合物的缩合产物，其含有约7摩尔环氧乙烷；后者是相应的混合物，其中高级脂肪醇的碳原子含量为12至13并且存在的环氧乙烷基团的数量平均约6.5。高级醇主要是链烷醇。可以使用两种或更多种非离子表面活性剂的混合物。
许多阳离子表面活性剂是本领域中已知的，并且几乎任何含有至少一个约10至24个碳原子的长链烷基的阳离子表面活性剂都适合于本发明。这样的组分描述于″Cationic Surfactants″，Jungermann，1970，其在本文引用作为参考。同样在本文引用作为参考的美国专利4,497,718详细描述了可用作本发明的表面活性剂的特殊的阳离子表面活性剂。当采用非离子和阴离子表面活性剂时，本发明的组合物可以单独使用阳离子表面活性剂或将其与本领域已知的任何其它表面活性剂组合使用。当然，所述组合物可以根本不含阳离子表面活性剂。
两性合成洗涤剂可广义地描述为脂肪族衍生物或者杂环仲或叔胺的脂肪族衍生物，其中脂肪族基团可用是直链或支链，并且其中脂肪族取代基的一个含有约8至18个碳原子且至少一个含有阴离子水加溶基，例如，羧基，磺酸盐，硫酸盐。落入该定义内的化合物的实例是3-(十二烷基氨基)丙酸钠，3-(十二烷基氨基)-丙烷-1-磺酸钠，2-(十二烷基氨基)乙基硫酸钠，2-(二甲基氨基)十八酸钠，3-(N-羧基甲基十二烷基氨基)丙烷1-磺酸二钠，十八烷基-亚氨基二乙酸二钠，1-羧甲基-2-十一烷基咪唑钠，和N，N-二(2-羟乙基)-2-硫酸根合-3-十二烷氧基丙胺钠。优选3-(十二烷基氨基)丙烷-1-磺酸钠。
两性离子表面活性剂可广义地描述为仲和叔胺的衍生物、杂环仲或叔胺的衍生物、或季铵、季鏻或叔鋶化合物的衍生物。季化合物中的阳离子可以是杂环的一部分。在所有这些化合物中，有至少一个含约3至18个碳原子的直链或支链脂肪族基团和至少一个含阴离子水增溶基的脂肪族取代基，所述阴离子水增溶基例如羧基，磺酸盐，硫酸盐，磷酸盐或瞵酸盐。
本发明的组合物还可以含有任何其它的酶稳定剂或抑制剂。稳定剂的非限制性实例包括二元醇(例如一丙二醇)或多元醇(例如，山梨糖醇，甘油)，钙离子和小分子羧酸和盐(例如，甲酸)。当然，一些普通的酶稳定剂的硼-清除性质可能使得它们不宜在本发明中大量使用。其它非限制性实例包括多元醇的硼酸酯，肽醛，氟代甲基酮，含硼酸，肽含硼酸，和抗氧化剂。本发明的组合物可以减少或者消除其它酶稳定剂，因为本发明是改善了的稳定或抑制酶的技术。换言之，本发明的组合物可以不包括或者可以允许更少量的某些其它酶稳定剂，或者包含已知与其它酶稳定剂相互作用从而已知对酶去稳定化的任选成分。例如，强螯合剂如EDTA、DTPA或HEIDA的使用可以与本发明的组合物相容。在没有本发明的化合物的情况下，强螯合剂将络合用于稳定酶三维结构的钙离子。
多元醇，包括邻位二元醇，如一丙二醇(MPG)或甘油，是已知溶剂和酶稳定剂的通用成分。它们是任选成分，可少量用于本发明的制剂。一丙二醇可以以约0.1％至约10％的量用于本发明的组合物中，但是优选更少的量，例如0.1％至5％。二元醇有降低酶活性的趋势；因此优选在制剂中使用少量的二元醇。已经发现，使用本发明的酶稳定剂可以使在组合物如洗涤剂中使用较少的二元醇。例如，在实施例4中，酶稳定化的液体衣物洗涤剂制剂中使用了明显少量的二元醇。污迹清除是酶活性的检验标准，而清洁结果清楚地表明具有高的一丙二醇含量的参考液体衣物洗涤剂的酶的污迹清除能力明显低于本发明的实施例。这显示高含量的一丙二醇(邻位二元醇)提供较低的酶的内在活性。
在不使用非酶蛋白，如先前的现有技术中描述的酪蛋白的情况下，本发明的组合物是有效的。该组合物中由含硼化合物和α-羟基-一元-羧酸或其盐形成的配合物，在没有另外的非酶蛋白的情况下，有效稳定和/或抑制酶。
本发明的组合物还可以含有溶剂。非限制性的和合适的溶剂描述于专利申请WO 2004/113484A1中。这些溶剂包括含少于7个碳原子的低级链烷醇，不含邻位二元醇的多元醇，基于含2至4个碳原子的氧化物和含至多8个碳原子的烷基、芳基或取代的芳基的二元醇醚。这样的溶剂可用于制造基本上不含能够清除本发明化合物之外的硼化合物的化合物的物理稳定的制剂。本发明可使配方设计师通过减少使用作为硼清除剂的稳定剂而降低用于稳定酶的硼化合物的量。
适合结合到本发明的液体含酶产品制剂中的辅料包括但不限于漂白体系，助洗剂，分散剂，污垢释放剂，螯合剂，抑泡剂，软化剂，染料转移抑制剂，非磷酸盐助洗剂，去色斑剂(color speckles)，银护理剂，防失光泽和/或抗腐蚀剂，染料，填料，杀菌剂，碱源，助水溶剂，溶剂，抗氧化剂，香料，加溶剂，载体，加工助剂，颜料，和pH控制剂，如在美国专利5,705,464、5,710,115、5,698,504、5,695,679、5,686,014和5,646,101，以及申请WO 92/19709、US 2005/0059567A1、WO 2005/049776A1、US6,803,355B1、WO 2004/113484A1、WO 2005/012474A1中所述，它们全部在本文引用作为参考。
本发明的酶稳定化组合对于制造以下制剂是特别感兴趣的，所述制剂具有良好的酶稳定性并且还含有趋向于与硼化合物络合不形成可逆蛋白酶抑制剂的成分。这样的成分，也称作硼清除剂，尽管已知它们可能使酶不稳定化，但是对于制剂而言可能是重要的。其实例为含邻位OH基团的碳水化合物和它们的衍生物，α-羟基多元羧酸，能够络合硼化合物的抗皱剂，多羟基脂肪酰胺表面活性剂和含超过2个邻位OH基团的多元醇。本发明的含酶组合物可以容忍硼清除剂的存在，而硼清除剂在所考虑的应用中可能是非常重要的。
用于本发明组合物中的酶稳定化使用较少量的酶稳定剂和酶实现了更有效的酶稳定化。这延长了含酶组合物的贮藏期限并且降低了与使用含酶组合物有关的成本。用于如洗涤剂组合物中的常规的蛋白酶原料含有约4％的活性酶，约60％的一丙二醇(MPG)，约10％的酶稳定剂如氯化钙和碱金属甲酸盐，和约26％的水，而本发明的蛋白酶原料典型地含有较少量的相对昂贵的酶稳定剂和稳定化溶剂。然而，根据本发明，含有约4％活性酶的蛋白酶浓缩物原料还可以包含约1％的硼酸，约1％至5％的α-羟基-一元-羧酸和约90％至约92％的水。类似地，含约1％至约2％酶原料的常规重垢液体洗涤剂组合物含有约5至约13％MPG，约1至约4％硼酸，约35％活性物和约50％水。根据本发明，可比的重垢液体洗涤剂组合物可以含有较少量的相对昂贵的酶稳定剂/抑制剂和酶稳定化溶剂。在含约1％至约2％酶原料的本发明比较重垢液体洗涤剂制剂中，可以含有约1至约5％MPG，约1至约1.5％硼酸，和约1％至约3％的酶稳定化α-羟基-一元-羧酸，以及约35％活性物和约55至57％水。
本发明的含酶液体组合物可用于大多数将酶普遍地加入到制剂中的应用中。目前，家庭护理中最大量使用的酶用于织物护理。本发明的液体织物护理组合物包括衣物洗涤剂，洗衣预除污产品，和织物软化剂制剂。
本发明用于稳定化的含酶液体组合物的其它用途包括其它家庭护理产品，个人护理产品，包括皮肤护理产品，和工业产品。这样的个人护理产品包括但不限于，例如，洗手皂，手消毒剂，沐浴露，漱口剂，牙膏，沐浴胶，洗发剂，润肤露，除臭剂，鼻喷雾剂和它们的组合。皮肤护理产品可以结合皮肤学上可接受的载体以促进酶向皮肤的安全转移。在本发明的另一方面，本发明的皮肤护理产品包含某些辅助成分。所述辅料包括但当然不限于抗菌和抗真菌活性物，表面活性剂，脱屑活性物，抗粉刺活性物，抗皱活性物，抗萎缩活性物，抗氧化剂，自由基清除剂，螯合剂，类黄酮，抗炎剂，抗脂肪团剂，局部麻醉剂，变褐活性物，防晒活性物，调节剂，增稠剂，去粘剂，解臭剂，皮肤感觉物(sensate)，止汗剂和它们的混合物。合适的家庭护理产品，除织物护理外，用于本发明目的的包括但不限于硬质表面清洁剂，除臭剂，手工洗盘洗涤剂，自动洗盘洗涤剂，地板护理组合物，厨房清洁剂或消毒剂，浴室清洁剂或消毒剂和它们的组合。工业用途的非限制性实例是工业系统中的生物膜清除部分，食品和饲料工业酶应用。另外的工业应用包括医疗或专门酶和如材料清洁或消毒的应用。
在本发明的另一方面，可以将本发明的稳定化的含酶液体组合物嵌入或浸渍到纤维、纸张或织物中使用。例如，可以将组合物加入到适合擦拭或干燥脸或手的个人护理擦拭物上。其它的这种浸渍的个人护理产品包括卫生巾或尿布，受刺激、受伤或受粉刺影响的皮肤的首次消毒助剂，和用于术前或术后使用的擦拭物。家庭护理产品还可以是适合家庭清洁或护理的手帕或毛巾形式。
在本发明的另一方面，此处公开的家庭护理产品包含某些辅助成分。所述辅料包括但不限于增效剂，漂白剂，漂白活化剂，过渡金属漂白催化剂，氧转移剂和前体，污物释放剂，粘土清除和/或抗再沉淀剂，聚合分散剂，增白剂，聚合染料转移抑制剂，螯合剂，防泡剂，烷氧基化的聚羧酸盐，织物软化剂，香料，载体，助水溶物，加工助剂，染料或颜料，溶剂固体填料，清洁表面活性剂和它们的组合。
在本发明的另一优选方面，将根据本发明配制的包含酶浓缩物的产品结合到皮肤护理产品中。在本发明的一个方面，皮肤护理产品结合了皮肤学上可接受的载体以促进含有根据本发明配制的酶混合物的产品安全转移到皮肤的所需区域。在本发明的另一方面，本发明的皮肤护理产品包含某些辅助成分。所述辅料包括但当然不限于抗菌和抗真菌活性物，表面活性剂，脱屑活性物，抗粉刺活性物，抗皱活性物，抗萎缩活性物，抗氧化剂，自由基清除剂，螯合剂，类黄酮，抗炎剂，抗脂肪团剂，局部麻醉剂，变褐活性物，防晒活性物，调节剂，增稠剂，去粘剂，解臭剂，皮肤感觉物(sensate)，止汗剂和它们的混合物。实际上，上述辅助成分中每一个的完整描述和实例陈述于美国专利6,294,186中，该专利转让给TheProcter and Gamble Company，Cincinnati，Ohio，并且在本文引用作为参考。
实施例 以下优选的和说明性的实施方案的实施例不意在限制本发明的范围，本发明的范围由权利要求书限定。本领域技术人员和制造或使用本发明的人可对本发明进行修改。
实施例1 在该实施例中，对几种含酶(脂肪酶和蛋白酶)的洗涤剂组合物分析其储存后的残余酶活性。
根据本发明的几种重垢液体洗涤剂组合物的成分列于下面的表1中。
表1中使用的缩写的解释和成分的来源如下 MEA LAS含有一乙醇胺的C10-13直链烷基苯磺酸盐。
Marlon AMX获自Huels AG(Schweiz) 油酸获自Hydrior AG 椰子酸C12-14脂肪酸，获自HydriorAG Dobanol 45 E 7C14-15烷基乙氧基化物(7)，获自Shell ChemicalCompany 柠檬酸获自Fluka 硼酸获自Fluka 乙醇获自Fluka MPG一丙二醇，获自Fluka CaCl2氯化钙，获自Fluka Lipolase脂肪酶-Lipolase 100L，获自Novozymes Savinase 16L型EX蛋白酶，获自Novozymes DL-乳酸获自Fluka 扁桃酸DL-扁桃酸，获自Malinckrodt Baker bv MEA一乙醇胺，获自Fluka 水去离子水 表1.HDL基组合物 用于测定残余蛋白酶活性的方法 按照以下方法测量残余蛋白酶活性，用相对于初始蛋白酶水平的百分比表示测定洗涤剂中蛋白水解活性的手工方法(偶氮酪蛋白底物)，NovoNordisk，Biochem NH9194943485. 用于测定残余脂肪酶活性的方法 使用pH-静态滴定仪测量初始脂肪酶活性。制备滴定水性混合物，其含有10mM氯化钙，20mM氯化钠，5mMtris缓冲液和10％的三油精甘油酯底物(Sigma脂肪酶试剂盒底物800，含50％三油精甘油酯)。加入HCl将滴定混合物的pH调节到约pH 8.3至8.6。将10至100微升的实施例的洗涤剂组合物加入到50ml的上述滴定混合物中。将通过脂肪酶催化的三油精甘油酯底物水解形成的脂肪酸(油酸)对标准氢氧化钠溶液(0.025标准)滴定。滴定时间最长为8分钟。取滴定曲线的斜率作为脂肪酶活性的度量。在制备洗涤剂组合物之后立即测量初始脂肪酶活性。然后将洗涤剂样品在35℃老化，并且在储存一星期后测量残余脂肪酶活性。表1中的残余脂肪酶活性以初始活性的百分比形式表示。
将上述组合物与常规重垢液体洗涤剂基组合物(HDL)HDL 1和2比较，HDL 1和2类似于常规的衣物洗涤剂并且用作参考。HDL 3和4是要求保护的技术的非限制性制剂实例。衣物洗涤剂HDL 3和HDL 4在储存后的残余蛋白酶和脂肪酶稳定性均比HDL 1高，而HDL 1含有与HDL 3&4相同的酶稳定剂百分比含量。HDL 2与第一种参考物HDL 1不同，前者的MPG(一丙二醇)含量较高(12％对5％)。由于MPG的更高含量，HDL 2比HDL 1具有更好的蛋白酶和脂肪酶残余活性。HDL 2的脂肪酶和蛋白酶残余稳定性略好于HDL 4。然而，这主要是由于其高的MPG含量。HDL 3具有与HDL 2相等的残余脂肪酶稳定性，以及比HDL 2更高的残余蛋白酶稳定性。因此，本发明的液体洗涤剂HDL 3在整体上比HDL 2(高MPG含量)更强。
实施例2 该实施例证实了酶预混物中储存后的残余脂肪酶和蛋白酶活性。根据本发明的酶组合物的成分列于下面的表2中。表2中使用的缩写的解释和成分的来源如下 Lipolase 100L脂肪酶，获自Novozymes Savinase 16L型EX蛋白酶，获自Novozymes 硼酸获自Fluka DL-乳酸获自Fluka 测量残余蛋白酶和脂肪酶活性相对时间变化的方法描述于实施例1中。
制备含蛋白酶和脂肪酶的酶预混物。该预混物含有高含量的加入的水(超过70％)。在来自酶液体原料的预混物总共有约7.5％的一丙二醇。用少量的苛性碱将酶预混物的pH调节到pH 6。尽管作为极性溶剂的水的含量高，并且存在蛋白酶，该预混物的脂肪酶在35℃显示出优良的储存稳定性。这证实蛋白酶被非常好地抑制了，因而蛋白酶不能降解酶预混物存在的已经稳定化的脂肪酶。其还证实本发明的阴离子配合物使酶稳定。
表2.酶预混物组成 实施例2中的残余脂肪酶活性是在乳酸和硼酸含量比实施例3高4倍的情况下获得的。蛋白酶负载存在下的残余脂肪酶活性比以下实施例3低约10倍。
实施例3 在储存后测量蛋白酶浓缩物的残余蛋白水解活性，与本发明结合的蛋白酶浓缩物的成分列于下面的表3中。表3中使用的缩写的解释和成分的来源如下 Na甲酸盐甲酸钠 CaCl2氯化钙 MPG一丙二醇 蛋白酶蛋白酶浓缩物，获自GENENCOR INTERNATIONAL 硼酸获自Fluka D，L-乳酸DL-乳酸，获自Fluka 扁桃酸DL-扁桃酸，获自Malinckrodt Baker bv 将本发明的化合物评价蛋白酶的稳定性和与通常用于这种蛋白酶的更传统的MPG基稳定化体系相比。采用Genencor International评价三种不同样品的残余蛋白酶活性，结果示于表3中。本发明稳定了在含有约90％水的液体原料样品2和3中的蛋白酶。酶通常在高含量水的情况下不稳定。表3中显示的样品2和3的蛋白酶残余活性与水含量为约28％的样品1中的蛋白酶残余活性一起比较。样品1还含有占组合物接近70％的酶稳定剂。
表3 实施例4 基于根据本发明的各种酶稳定化/抑制体系，比较了三种重垢液体衣物洗涤剂制剂的清洁效果。与一丙二醇相比，L-乳酸和D，L-乳酸显示出更好的酶的污迹清除力，并且可以归因于更高的酶活性。
下面解释三种制剂间的不同 -样品1含2％D，L-乳酸。
-样品2含2％L-乳酸。
-样品3是参考样品，不含α-羟基-一元-羧酸，而是另含9％的一丙二醇。
下面的表6和表7中的结果显示，样品1和2比样品3具有更好的污迹清除效率。而且，样品2(基于L-乳酸)平均给出比样品1(基于D，L-乳酸)更好的清洁结果，特别是在酶的污迹清除方面。因此，在本发明的酶稳定化/抑制体系中L-乳酸比D，L-乳酸优选。目前，L-乳酸已经成为了主要的乳酸来源，并且如今比D，L-乳酸更便宜。
下面的表4给出了样品1、2和3的组成 表4 根据本发明的几种重垢液体洗涤剂组合物的成分列于下面的表4中。
表4中使用的缩写的解释和成分的来源如下 LASC10-13直链烷基苯磺酸 Marlon AS3获自Huels AG(Schweiz) 油酸获自Hydrior AG 椰子油酸C12-14脂肪酸，获自Hydrior AG Dobanol 45E 7C14-15烷基乙氧基化物(7)，获自Shell ChemicalCompany 柠檬酸获自Fluka 硼酸获自Fluka 乙醇获自Fluka MPG一丙二醇，获自Fluka CaCl2氯化钙，获自Fluka Lipolase脂肪酶-Lipolase 100 L，获自Novozymes SavinaseSavinase 16L型EX蛋白酶，获自Novozymes D，L-乳酸DL-乳酸获自Fluka L-乳酸获自Fluka MEA一乙醇胺，获自Fluka 水去离子水 按照如下准则/方案进行清洁测试，进行测量，比较它们并且获得结果的统计相关性 在40℃的棉布洗涤程序的10个洗涤循环中比较液体重垢洗涤剂，每个循环液体重垢洗涤剂的剂量为100mL。
比较以下洗涤性能标准18件人为染污的测试织物(12件在棉布上，6件在聚酯/棉布上)的主要洗涤效果 测试条件 在5个洗衣机Miele Novotronic W 985 WPS中进行洗涤试验。采用在不预洗的情况下使用″加水按钮″的改进的40℃棉布洗涤程序。为了避免洗涤机器的个体差异，每个产品的测试在洗衣机中交替进行(测试过程中周期性地改变洗衣机)。在硬度为2,5mmol/L(即14°d德国水硬度)的水中进行试验。总的载量是4,0kg。表5给出了10次洗涤循环中装载的组成。
表5.10次洗涤循环中装载的组成 主要洗涤效果 为测定洗涤性能，采用人工染污的测试织物(10×10)cm2，每个循环周期使用四个新的测试织物组。以下的测试织物，其固定在四个载体织物上，用于 普通去污力 ●wfk-CO-颜料/皮脂(代码10D) ●EMPA-CO-烟灰/矿物油(代码106) 脂肪清除力 ●wfk-CO-用过的机油(代码10GM) ●wfk-PES/CO-用过的机油(代码20GM) 漂白性能 ●wfk-CO-红葡萄酒(代码90LI) ●wfk-CO-蕃茄酱(代码10T) ●wfk-PES/CO-蕃茄酱(代码20T) ●wfk-CO-茶(代码10J) ●wfk-CO-陈化的血液(代码10PB) ●wfk-PES/CO-陈化的血液(代码20PB) 酶性能 ●wfk-CO-原料/油/牛奶(代码10PPM) ●wfk-PES/CO-原料/油/牛奶(代码20PPM) ●wfk-PES/CO-唇膏(代码20LS) ●EMPA-CO-草(代码164) ●EMPA-CO-牛奶可可(cacoa)(代码112) ●wfk-PES/CO-牛奶可可(代码20MF) ●wfk-CO-陈化的蛋黄(代码10EG) ●wfk-淀粉/原料(代码10R) 将样品在单个洗涤循环中洗涤(单次洗涤评价)，干燥并且在左侧(不倾向于进行仪器测量的一侧)小心烫平。使用自动反射计(DatacolorSpectraflash SF 500，10°观察器，D 65，无光泽，采用420nm的UV-滤光器)，通过反射测量对清洁性能进行定量，测量Y-值。每个织物测量4次。对于每个污物监测物，计算160次测量的平均和标准偏差。根据ISO标准2854-1976，采用T-检验(双边情况)进行统计计算。
主要洗涤效果 主要洗涤效果的结果示于表6中。
表6.以Y-值-带标准偏差的10个洗涤循环的算数平均-表示的主要洗涤效果 主要洗涤效果的统计评价结果示于表7中。
表7.主要洗涤效果的统计评价结果(T-测试；双边情况，95％统计可信度) 用于理解表7中比较样品A和B的数据的另外解释 +＝产品A在统计学上明显好于产品B 0＝两种产品在统计学上相等 -＝产品A在统计学上明显差于产品B 实施例5 在水溶液中测定pH对乳酸与硼酸的配位作用的影响。改变加入到溶液中的乳酸与硼酸的摩尔比。在pH 8.5使用的制剂示于表8中。在表9-11的每个表中，对于在给定pH下的每个原料比率，示出了由硼和乳酸形成的每个配合物中测量的硼百分比。
通过11B-NMR测量每个配合物的百分比，每个加入组分的比率的结果示于图1-3中。图4为单独的硼酸的11B-NMR谱图。在pH＜3时，属于[1∶2]-配合物的峰令人惊奇地首次出现。这暗示着由于[1∶1]-配合物和[1∶2]-配合物在谱图中交换位置，pH对峰的可能影响。然而，化学位移与pH＝8.5的谱图一致。
表8.pH 8.5的样品信息 样品数3 对于在其它pH的硼NMR实验，类似地用HCl或NaOH调节pH。
表9.三种硼酸与乳酸比率在pH＝8.5时存在的硼百分比 表10.三种硼酸与乳酸比率在pH＞12.5时存在的硼百分比 表11.三种硼酸与乳酸比率在pH＜3时存在的硼百分比 *Alcalase、Esperase和Savinase是Novo Industries的商标。Maxatase是PfizerInc.的一个商标。Maxacal是Gist-Brocades N.V.的一个商标。Maxapen是Gist-Brocades N.V.的一个商标并且在U.S.ofInternational Biosynthetics中。Lipolase和Termamyl是Novozymes的商标。Rapidase和Maxamyl是DSMIP Assets B.V.的商标。
权利要求
1.一种稳定液体含酶组合物的方法，该方法包括向组合物中加入
(a)α-羟基-一元-羧酸或α-羟基-一元-羧酸盐，其能够与硼化合物配位形成使酶性质稳定的配合物，和
(b)硼化合物，其能够与一元-α羟基-羧酸或其盐配位，在促进具有稳定酶性质的配合物的形成的pH下形成使酶性质稳定的配合物。
2.权利要求1所述的方法，其中所述含酶组合物中的酶包含蛋白酶。
3.权利要求1所述的方法，其中加入到所述组合物中的一元-α羟基-羧酸与硼化合物的摩尔比是1∶100至100∶1。
4.权利要求1所述的方法，其中所述液体含酶组合物的pH范围在所述α-羟基-一元-羧酸的pKa之下2个pH单位和所述硼化合物的pKa之上2个pH单位之间。
5.权利要求1所述的方法，其中所述液体含酶组合物的pH范围在约2和约10之间。
6.权利要求1所述的方法，其中所述液体含酶组合物的pH范围在约3和约9之间。
7.权利要求1所述的方法，其中所述液体含酶组合物的pH范围在约4和约9之间。
8.权利要求1所述的方法，其中首先将所述α-羟基-一元-羧酸或α-羟基-一元-羧酸盐和硼化合物在水中混合在一起形成混合物，然后将混合物与所述液体含酶组合物结合。
9.权利要求1所述的方法，其中所述α-羟基-一元-羧酸由下式表示，
R-C(OH)(R′)-C(O)-OH，
其中R选自氢原子，由C1至C10烷基、芳基、取代的C1至C10烷基、取代的芳基、硝基、酯、醚、胺、胺衍生物、取代的胺组成的组，并且所述烷基或芳基上的取代基选自芳基或烷基，硝基，硝基衍生物，羟基，羟基衍生物，酯，醚，胺，胺衍生物，取代的胺，酰胺，酰胺衍生物和卤素；并且R′选自氢原子，由C1至C10烷基、芳基、取代的C1至C10烷基、取代的芳基、硝基、酯、醚、胺、胺衍生物、取代的胺组成的组，并且所述烷基或芳基上的取代基选自芳基或烷基，硝基，硝基衍生物，羟基，羟基衍生物，酯，醚，胺，胺衍生物，取代的胺，酰胺，酰胺衍生物和卤素，并且其中在适合时，所述的酸可以选自这些酸的旋光异构体。
10.权利要求9所述的方法，其中R和R′各自具有小于300的分子量。
11.权利要求9所述的方法，其中所述α-羟基一元羧酸选自羟基乙酸，乳酸，羟基丁酸，羟基异丁酸，扁桃酸，当适合时这些酸的旋光异构体，以及这些酸的组合。
12.权利要求1所述的方法，其中所述硼化合物选自硼酸，氧化硼，碱金属硼酸盐，和硼酸的无机或有机盐。
13.权利要求12所述的方法，其中所述碱金属硼酸盐选自原硼酸钠，焦硼酸钠，偏硼酸钠，多硼酸钠，原硼酸钾，焦硼酸钾，偏硼酸钾，多硼酸钾，和硼砂(Na2B4O7·10H2O)。
14.权利要求1所述的方法，其中所述含硼化合物选自硼酸，硼酸钠(Na3BO3)，和硼砂。
15.权利要求1所述的方法，其中所述α-羟基-一元-羧酸和所述硼化合物形成以下结构的阴离子配合物
其中R选自氢原子，由C1至C10烷基、芳基、取代的C1至C10烷基、取代的芳基、硝基、酯、醚、胺、胺衍生物、取代的胺组成的组，并且所述烷基或芳基上的取代基选自芳基或烷基，硝基，硝基衍生物，羟基，羟基衍生物，酯，醚，胺，胺衍生物，取代的胺，酰胺，酰胺衍生物和卤素；并且R′选自氢原子，由C1至C10烷基、芳基、取代的C1至C10烷基、取代的芳基、硝基、酯、醚、胺、胺衍生物、取代的胺组成的组，并且所述烷基或芳基上的取代基选自芳基或烷基，硝基，硝基衍生物，羟基，羟基衍生物，酯，醚，胺，胺衍生物，取代的胺，酰胺，酰胺衍生物和卤素。
16.权利要求15所述的方法，其中所述α-羟基-一元-羧酸选自乳酸，羟基乙酸，羟基丁酸，羟基异丁酸，扁桃酸，当适合时这些酸的旋光异构体，和这些酸的组合，并且所述硼化合物选自硼酸，氧化硼，碱金属硼酸盐，和硼酸的无机和有机盐。
17.权利要求15所述的方法，其中形成的配合物与所述组合物中总的活性酶的摩尔比为1∶1至500∶1。
18.权利要求15所述的方法，其中形成的配合物与总的活性酶的摩尔比为1∶1至100∶1。
19.权利要求1所述的方法，其中在0.1％至10％(以硼酸表示)的范围内加入所述硼化合物。
20.权利要求1所述的方法，其中在0.1％至5％(以硼酸表示)的范围内加入硼化合物。
21.权利要求1所述的方法，其中在0.1％至1.5％(以硼酸表示)的范围内加入硼化合物。
22.权利要求1所述的方法，其中所述液体含酶组合物基本上没有具有蛋白酶抑制性质的非酶蛋白质物质。
23.权利要求1所述的方法，进一步包括以所述含酶组合物的0.1至10重量％的量加入多元醇。
24.权利要求1所述的方法，进一步包括以所述酶组合物的0.1至5重量％的量加入多元醇。
25.权利要求23或权利要求24所述的方法，其中所述多元醇选自1，2-二元醇，1，3-二元醇，和1，2，3-三元醇以及它们的混合物。
26.权利要求1所述的方法，其中所述液体含酶组合物还包含1至60重量％的表面活性剂，所述表面活性剂选自非离子表面活性剂，阴离子表面活性剂，阳离子表面活性剂，两性离子表面活性剂和两性表面活性剂。
27.权利要求1所述的方法，其中所述含液体酶的组合物是包含含有至少两个或更多个羧基的α-羟基-多元-羧酸助洗剂的洗涤剂。
28.权利要求1所述的方法，其中所述液体含酶组合物是包含小于5重量％的磷酸盐助洗剂的洗涤剂。
29.一种酶稳定化的组合物，包含
(a)能够与硼化合物配位形成具有酶稳定化性质的配合物的α-羟基-一元-羧酸或α-羟基-一元-羧酸盐，和
(b)能够与α-羟基-一元-羧酸或其盐配位形成具有酶稳定化性质的配合物的硼化合物，
(c)由(a)和(b)形成的配合物，和
(d)酶。
30.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其中所述组合物基本上不包含非酶蛋白。
31.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其中所述组合物基本上不含酪蛋白。
32.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其中基于总的产品制剂重量，所述组合物含有小于5重量％的磷酸盐。
33.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其中所述α-羟基-一元-羧酸由式RC(OH)(R′)-C(O)-OH表示，其中R选自氢原子，由C1至C10烷基、芳基、取代的C1至C10烷基、取代的芳基、硝基、酯、醚、胺、胺衍生物、取代的胺组成的组，并且所述烷基或芳基上的取代基选自芳基或烷基，硝基，硝基衍生物，羟基，羟基衍生物，酯，醚，胺，胺衍生物，取代的胺，酰胺，酰胺衍生物和卤素；并且R′选自氢原子，由C1至C10烷基、芳基、取代的C1至C10烷基、取代的芳基、硝基、酯、醚、胺、胺衍生物、取代的胺组成的组，并且所述烷基或芳基上的取代基选自芳基或烷基，硝基，硝基衍生物，羟基，羟基衍生物，酯，醚，胺，胺衍生物，取代的胺，酰胺，酰胺衍生物和卤素，并且其中当适合时所述的酸选自这些酸的旋光异构体。
34.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其中所述α-羟基-一元-羧酸选自羟基乙酸，乳酸，羟基丁酸，羟基异丁酸，扁桃酸，当适合时这些酸的旋光异构体，和这些酸的组合。
35.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其中所述配合物(c)具有1∶1的一元-α-羟基-羧基阴离子与硼的比率。
36.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其中所述酶(d)是蛋白酶。
37.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其中所述配合物(c)是以下结构的阴离子
其中R选自氢原子，由C1至C10烷基、芳基、取代的C1至C10烷基、取代的芳基、硝基、酯、醚、胺、胺衍生物、取代的胺组成的组，并且所述烷基或芳基上的取代基选自芳基或烷基，硝基，硝基衍生物，羟基，羟基衍生物，酯，醚，胺，胺衍生物，取代的胺，酰胺，酰胺衍生物和卤素；并且R′选自氢原子，由C1至C10烷基、芳基、取代的C1至C10烷基、取代的芳基、硝基、酯、醚、胺、胺衍生物、取代的胺组成的组，并且所述烷基或芳基上的取代基选自芳基或烷基，硝基，硝基衍生物，羟基，羟基衍生物，酯，醚，胺，胺衍生物，取代的胺，酰胺，酰胺衍生物和卤素。
38.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其中以硼酸计，所述硼化合物以0.1至10重量％的量存在。
39.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其中以硼酸计，所述硼化合物以0.1至5重量％的量存在。
40.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其中以硼酸计，所述硼化合物以0.1至1.5重量％的量存在。
41.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其中所述α-羟基-一元-羧酸以所述组合物的0.01至25重量％的量存在。
42.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其中所述α-羟基-一元-羧酸以所述组合物的0.1至10重量％的量存在。
43.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其中所述的酶以0.0001至25重量％活性酶的量存在。
44.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其中所述的酶以0.0001至2.5重量％活性酶的量存在。
45.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其中所述的酶以0.01至25重量％活性酶的量存在。
46.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其具有从所述α-羟基-一元-羧酸的pKa之下2个pH单位到所述硼化合物的pKa之上2个pH单位的pH。
47.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其具有约2至约10的pH。
48.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其具有约3至约9的pH。
49.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其具有约4至约9的pH。
50.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其另外包含不能形成酶稳定化配合物的硼清除剂。
51.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其另外包含硼清除剂，所述硼清除剂选自表面活性剂，糖，二元醇，和多元醇。
52.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其中所述组合物是洗涤剂并且包含含有两个或更多个羧基的α-羟基-多元-羧酸助洗剂。
53.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其中所述组合物用于家庭或工业清洁应用，并且所述组合物中的酶选自纤维素酶，蛋白酶，脂肪酶，和淀粉酶。
54.权利要求29或53所述的酶稳定化的组合物，其中液体含酶组合物用作衣物洗涤剂。
55.权利要求29或53所述的酶稳定化的组合物，其中所述液体含酶组合物用作硬质表面清洁剂。
56.权利要求29或53所述的酶稳定化的组合物，其中所述液体含酶组合物用作织物软化剂。
57.权利要求29或53所述的酶稳定化的组合物，其中所述液体含酶组合物用作洗盘制剂。
58.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其中所述组合物用于动物饲料，并且所述组合物中的酶选自肌醇六磷酸酶，木聚糖酶，和蛋白酶。
59.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其中所述组合物用于人类食品生产，并且所述组合物中的酶选自谷氨酸胺酶，乳糖酶，纤维素酶，淀粉酶，和蛋白酶。
60.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其中所述组合物用于化学或废物处理，并且所述组合物中的酶选自脂肪酶，淀粉酶，腈水解酶，水解酶，葡糖合成酶，和单-加氧酶。
61.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其中所述组合物用于手性合成，并且所述组合物中的酶选自水解酶和脂肪酶。
62.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其中所述组合物用于隐形眼镜的清洁，并且所述组合物中的酶选自蛋白酶，脂肪酶，和过氧化氢酶。
63.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其中所述组合物用于牙膏组合物，并且所述组合物中的酶选自葡糖淀粉酶和葡糖化酶。
64.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其中所述组合物用于面部、皮肤和身体护理产品，并且所述组合物中的酶选自蛋白酶。
65.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其中所述组合物用于织物护理应用，并且所述组合物中的酶选自纤维素酶，蛋白酶，脂肪酶，和淀粉酶。
66.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其中所述组合物是酶原料浓缩物，用于洗涤剂、工业和医疗用酶制剂。
67.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其中所述组合物还包含加入所述含酶组合物的0.1至10重量％的多元醇。
68.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其中所述组合物还包含加入所述含酶组合物的0.1至5重量％的多元醇。
69.权利要求67或权利要求68所述的酶稳定化的组合物，其中所述多元醇选自1，2-二元醇，1，3-二元醇，和1，2，3-三元醇以及它们的混合物。
70.权利要求29所述的酶稳定化的组合物，其中所述液体含酶组合物还包含1至60重量％的表面活性剂，所述表面活性剂选自非离子表面活性剂，阴离子表面活性剂，阳离子表面活性剂，两性离子表面活性剂和两性表面活性剂。
全文摘要
本发明公开了一种用于稳定液体含酶的液体制剂的方法，该方法包括加入能够形成酶稳定化化合物的至少一种硼化合物和至少一种α－羟基－一元－羧酸或α－羟基－一元－羧酸盐。公开了一种酶稳定化的制剂，其包含α－羟基－一元－羧酸或α－羟基－一元－羧酸盐，能够与α－羟基－一元－羧酸配位的含硼化合物，由硼化合物和α－羟基－一元羧酸形成的配合物，以及酶。本发明适用于酶浓缩原料和有用的产品制剂。
文档编号A61K8/365GK101072872SQ20058004235
公开日2007年11月14日 申请日期2005年12月8日 优先权日2004年12月9日
发明者皮埃尔·玛丽·勒努瓦 申请人:陶氏环球技术公司