鞭毛蛋白在肿瘤免疫疗法中的用途的制作方法

专利名称：鞭毛蛋白在肿瘤免疫疗法中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及鞭毛蛋白佐剂、肿瘤抗原和其融合蛋白用于产生肿瘤的免疫应答(例如，在预防或者治疗方法中)的用途。
背景技术：
当前接受的治疗乳腺癌的治疗包括手术、化学疗法和放射疗法。免疫疗法代表相对新的疗法，人们对其已经产生了极大兴趣(Ribas等人(2003)J.Clin.Oncol.212415-2432；Scanlan等人(2001)BreastCancer Res.395-98；Jager等人(2002)Curr.Opin.Immunol.14178-182；Ko等人(2003)Clin.Cancer Res.93222-3234)。免疫学方法的主要优点是它不是侵入性的并且它选择性靶定乳腺癌细胞，不伤害正常的细胞。近年来，研究人员已经确定了许多突变的或者被乳腺癌细胞不适当表达的蛋白质，它们可以作为免疫疗法的有用靶标。例如，已经用粘蛋白(MUC-I)、HER-2/neu、CEA和hTERT疫苗启动了I/II期临床试验(综述见Ko等人(2003)Clin.Cancer Res.93222-3234)。尽管许多这些研究已经揭示了增强的免疫反应性的例子，例如，T细胞增殖或者细胞毒性T细胞活性，但是临床结果已经局限于相对小部分患者。
对肿瘤疫苗缺少强的临床应答可能是由于几种因素的组合。因为多数靶标肿瘤抗原过表达，但不是突变的，可能自身耐受性阻碍了强烈应答。然而，对于这些抗原的突变形式，可能不是这样的情况。备选地，已经用于免疫患者的方案可以促进产生低亲合力而非高亲合力(avidity)的T细胞(讨论见Ko等人(2003)Clin.Cancer Res.93222-3234)；高亲合力细胞在肿瘤细胞清除中最有效。最后，肿瘤细胞过量产生转化生长因子β(TGF-β)可以显著限制可能有效的接种策略的有效性。
在其它系统中的工作已经建立了佐剂在增强弱免疫应答中的价值。从而，可能需要有效的佐剂来允许免疫系统不仅克服肿瘤来源的TGFβ的免疫抑制作用，而且促进产生高亲合力抗肿瘤T细胞、NK细胞、或者抗体。应该注意到许多疫苗方案已经使用了多种佐剂从各细胞因子(例如，IL-2、IL-12、γ干扰素、或者GM-CSF)到微生物细胞组分(例如，Detox B或者BCG)。尽管各细胞因子具有一定的佐剂活性，但是它们的有效性可能受到它们各自的生物活性范围的限制。明显需要开发和测试促进更有效的抗肿瘤应答的新的佐剂。
人们希望提供用于产生针对癌症的免疫应答的改进的试剂、药物制剂和方法。
发明概述本发明的第一方面是融合蛋白，其组成为或者基本上为(a)鞭毛蛋白佐剂，该鞭毛蛋白佐剂组成为或者基本上为(i)鞭毛蛋白N-末端恒定区；(ii)鞭毛蛋白C-末端恒定区；和(b)在N-末端恒定区和C-末端恒定区之间的肿瘤抗原(例如，插入到或者代替鞭毛蛋白高变区的部分或者全部，该鞭毛蛋白高变区任选被部分或者完全缺失)。
本发明的另一方面是编码如上文所述的融合蛋白的核酸。在一些实施方案中，核酸可操作地连接启动子。
本发明的另一方面是包含如上文所述的核酸的载体。
本发明的另一方面是包含如上文所述的核酸或者载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞表达所编码的融合蛋白。
本发明的另一方面是制备如上文所述的融合蛋白的方法，该方法包括将包含编码如上文所述的融合蛋白的核酸的宿主细胞在合适的培养基中足够产生所述融合蛋白的条件下培养。任选地，从宿主细胞或者培养基收集融合蛋白。
本发明的另一方面是组合物，其包含、组成为或者组成基本上为(a)鞭毛蛋白佐剂，和(b)肿瘤抗原(肿瘤抗原和鞭毛蛋白佐剂是分开的，或者相互连接的，即融合蛋白的形式，例如，如本文描述的融合蛋白)。
本发明的另一方面是药物制剂，其包含可药用载体中的如上文所述的融合蛋白或者组合物。
本发明的另一方面是在受试者中产生对肿瘤抗原的免疫应答(例如，产生抗体和/或诱导细胞介导的免疫应答)的方法，其包括以在所述受试者中诱导对肿瘤抗原的免疫应答有效量对所述受试者施用如上文所述的融合蛋白、组合物或者药物制剂。
本发明的再一方面是治疗受试者的肿瘤的方法，该方法包括对所述受试者施用治疗有效量的如上文所述的融合蛋白、组合物或者药物制剂。
在本发明方法的具体实施方案中，受试者是哺乳动物受试、灵长类受试者或者人类受试者。
本发明的另一方面是如本文所述的融合蛋白或者组合物用于制备进行如本文所述的治疗方法的药物的用途。
本发明的这些和其它方法在下面本发明的描述中给出。
附图简述

图1描绘了通过鞘内滴注给予鞭毛蛋白或者突变的鞭毛蛋白229的BALB/c小鼠的肺中TNFα表达。
图2描绘了鞭毛蛋白对肿瘤生长的影响。空心圆圈代表给予Fra-1抗原和失活形式的鞭毛蛋白的小鼠。实心圆圈代表给予Fra-1抗原和活性形式的鞭毛蛋白的小鼠。
图3显示用鼠疫耶尔森氏菌的鞭毛蛋白和F1抗原免疫导致大量的抗-F1抗体产生。(图a)用10μg F1+1μg鞭毛蛋白(FliC)气管内(i.t.)或者鼻内(i.n)免疫雌性BALB/c小鼠。对照动物仅用10μg F1或者1μg 229突变的鞭毛蛋白气管内免疫。在4周时对小鼠用相同的方式强化并且在2周后通过ELISA分析收集血浆。条形内的数字表示IgG1/IgG2a同种型的比例。*指出相对于对照的统计学显著性，**指出鼻内效价在统计学上大于气管内(p＜0.007)。(图b)从用10μgF1+1μg鞭毛蛋白鼻内免疫的小鼠得到的抗-F1抗体效价。每条线代表一只小鼠并且箭头指出强化免疫。(图c)用10μgF1和增加量的FliC或者5μg229气管内对雌性BALB/c小鼠加以免疫，并在第4周时强化。在强化后2周测定血浆抗-F1IgG效价。(图d)仅用5μg鞭毛蛋白鼻内免疫一组雌性BALB/c小鼠，并在第4周时以相同的方式强化。在2周后测定抗-Flic抗体效价(平均抗-Flic效价＝8.5×105)然后用10μgF1+1μg Flic对经鞭毛蛋白免疫的小鼠进行鼻内免疫和强化。强化后2周，测定抗-F1效价并与用10μgF1+1μgFlic或者229免疫的未接触鞭毛蛋白的动物的效价比较。条形代表平均抗体效价±s.e.m。每个免疫组使用7只雌性BALB/c小鼠。
图4显示鞭毛蛋白刺激抗原特异性应答并且需要T细胞。(图a)用10μgF1抗原+1μg鞭毛蛋白(Flic)鼻内免疫7只雌性BALB/c小鼠的组，并在第4周时用PBS、仅1μgFlic、仅10μgF1或者10μg F1+1μg FliC强化。*指出相对于用PBS或者仅FliC强化的动物的统计学显著性，**指出用F1+FliC强化导致抗体效价在统计学上大于仅F1抗原(p＜0.01)。条形代表平均抗体效价±s.e.m。(图b)用10μg F1+1μg FliC对一组7只无胸腺的裸鼠(BALB/cAnNCr-nu/nu)进行鼻内免疫和强化。在强化后2周收集血浆，用于通过ELISA进行抗F1 IgG效价的分析。*指出与以相同方式免疫的正常BALB/c小鼠相比的统计学显著性(p＜0.001)。
图5描绘了对于鞭毛蛋白的佐剂效果的需要。用10μgF1抗原+1μg鞭毛蛋白(FliC)或者突变的鞭毛蛋白(229)对TNFR-/-(图a)或者IL6-/-(图b)和野生型B6；129对照小鼠进行气管内免疫。*指出TNFR-/-效价在统计学上小于B6；129对照(p＜0.001)。用10μgF1+1μgFliC或者229(图c)免疫C3H/HeJ(Tlr4 P712H突变体)和野生型C3H/HeN小鼠。用10μgF1+1μgFHC或者229对IFNα/βR-/-(图d)和IFNγ-/-(图e)小鼠和对应的野生型对照进行鼻内免疫。每个免疫组中用7只雌性小鼠。在4周以相同的方式强化小鼠，并在2周后收集血浆，用于通过ELISA分析抗-F1效价。条形代表平均抗体效价±s.e.m。
图6显示鞭毛蛋白促进对于用鼠疫耶尔森氏菌CO92鼻内感染的保护性应答。用10μgF1抗原+1μg鞭毛蛋白(FliC)或者仅PBS免疫15只雌性BALB/c小鼠(图a)的组，并在4周用相同的方式强化。强化后2周收集血浆，用于通过ELISA分析抗体效价(平均抗-F1效价＝ 9.4×105)。1周后用等于100xLD50的鼠疫耶尔森氏菌CO92剂量对小鼠进行鼻内攻击(challenge)。攻击后监视小鼠30天。用10μgF1+1μgFliC或者仅PBS对10只抗体缺乏的IgH-/-小鼠(图b)组进行鼻内免疫，并在4周时以相同的方式强化。2周后用等于155xLD50的鼠疫耶尔森氏菌剂量进行鼻内攻击。用10μgF1+1μg FliC对10只野生型C57BL/6小鼠(组c)和雌性IFNγ-/-小鼠(图d)的组进行鼻内免疫和强化。强化后2周收集血浆，用于通过ELISA分析抗体效价(抗-F1效价≥1×106)。1周后用等于150xLD50的鼠疫耶尔森氏菌剂量进行鼻内攻击并在攻击后监视16天。
图7显示鞭毛蛋白是非人灵长类动物的有效佐剂。用150μgF1/V融合蛋白+50μg鞭毛蛋白鼻内(n＝6)或者肌内(n＝6)免疫雌性猕猴(Macaca fascicularis)。仅用PBS对对照动物(n＝3)进行鼻内或者肌内免疫。在12小时内体温没有显著改变，并在免疫后4h、12h和24h收集血浆中的TNF-α。在4周以相同的方式对动物进行强化，并在2周后收集血浆，用于通过ELISA进行分析。条形指出平均的抗-F1/V抗体效价±s.e.m，*表示相对于鼻内免疫的统计学显著性(p＜0.006)。
图8显示含有鞭毛蛋白和鼠疫耶尔森氏菌F1和V蛋白质的融合蛋白保留鞭毛蛋白生物学活性。
优选实施方案详述本发明部分是基于发现鞭毛蛋白和其片段可以作为佐剂用来增强在受试者中产生的抗肿瘤免疫应答。
除非另外指出，本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域技术人员通常理解的相同的含义。本发明说明书中使用的术语仅用于描述具体的实施方案并且不意在限制本发明。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都通过引用完整并入本文。
除非上下文中明确指出不同，在本发明说明书和所附的权利要求书中使用的单数形式的“a”、“an”和“the”意在包括复数形式。
本文使用的“组成基本为”(consisting essentially of)指所指出的肽、蛋白质、融合蛋白、核酸、化合物、组合物等等不包括任何其它物质成分(即，实质上影响所述肽、蛋白质、融合蛋白、核酸、化合物或者组合物的结构和/或功能的成分)。
在本发明的一些代表性实施方案中，本发明的肽、蛋白质、融合蛋白、核酸和/或细胞是“经分离的”。“经分离的”指肽、蛋白质、融合蛋白、核酸和/或细胞至少从其它组分部分纯化。
1.肿瘤抗原本文使用的术语“肿瘤抗原”指肿瘤细胞表达的分子(例如，蛋白质或者肽)，并且(a)在性质上与它的正常细胞中表达的副本(counterpart)不同，或者(b)在肿瘤细胞中以比在正常细胞中更高的水平表达。从而，肿瘤抗原可以与它在正常细胞中的副本不同(例如，当分子是蛋白质时，通过一个或多个氨基酸)或者它可以与所述副本相同。一些肿瘤抗原不被正常细胞表达，或者在肿瘤细胞中以在肿瘤细胞的正常副本中的至少2倍高的水平表达(例如，约2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、40倍、100倍、500倍、1000倍、5000倍或者15000倍高)。
任何合适的肿瘤抗原可以用于实施本发明。肿瘤抗原包括但不限于天然存在的肿瘤抗原和其在受试者中诱导免疫应答的修饰形式，还包括与肿瘤细胞结合的抗原，和对肿瘤细胞特异的抗原，和前述在受试者中诱导免疫应答的经修饰的形式。术语肿瘤抗原还包括对应于与肿瘤的诱导相关的蛋白质的抗原，如癌基因病毒抗原(例如，人乳头瘤病毒抗原)。示例性肿瘤抗原包括但不限于，乳腺癌的HER2/neu和BRCA1抗原、MART-1/MelanA(黑素瘤抗原)、Fra-1(乳腺癌)、NY-BR62、NY-BR85、hTERT、gp100、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、NY-ESO-1、CDK-4、β-连环蛋白、MUM-1、胱天蛋白酶-8、KIAA0205、SART-1、PRAME，和p15抗原，MAGE家族(黑素瘤抗原)、BAGE家族(黑素瘤抗原)、DAGE/PRAME(如DAGE-1)、GAGE家族(黑素瘤抗原)、RAGE家族(如RAGE-1)、SMAGE家族的成员、NAG、TAG-72、CA125、突变的原癌基因，如p21ras、突变的肿瘤抑制基因，如p53、肿瘤相关的病毒抗原(如HPV E6和E7)、SSX家族HOM-MEL-55、NY-COL-2、HOM-HD-397、HOM-RCC-1.14、HOM-HD-21、HOM-NSCLC-11、HOM-MEL-2.4、HOM-TES-11、RCC-3.1.3、NY-ESO-1、和SCP家族的成员。MAGE家族的成员包括，但不限于，MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-11和MAGE-12。GAGE家族的成员包括，但不限于，GAGE-1、GAGE-6。见例如，Van den Eynde和van der Bruggen，(1997)Curr.Opin.Immunol.9684-693；和Sahin等人，(1997)Curr.Opin.Immunol.9709-716的综述。
肿瘤抗原还可以是但不限于，人上皮细胞粘蛋白(Muc-1；Muc-1糖蛋白的20个氨基酸核心重复，存在于乳腺癌细胞和胰腺癌细胞上)、MUC-2、MUC-3、MUC-18、癌胚抗原(CEA)、raf癌基因产物、CA-125、GD2、GD3、GM2、TF、sTn、gp75、EBV-LMP1&2、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、GnT-V内含子V序列(N-乙酰葡糖胺转移酶V内含子V序列)、甲胎蛋白(AFP)、CO17-1A、GA733、gp72、β-HCG、gp43、HSP-70、p17mel、HSP-70、gp43、HMW、HOJ-1、黑素瘤神经节苷酯、TAG-72、突变的原癌基因，如p21ras、突变的肿瘤抑制基因，如p53，雌激素受体、乳脂球蛋白、端粒酶、核基质蛋白、前列腺酸性磷酸酶、蛋白质MZ2-E、多形上皮粘蛋白(PEM)、叶酸结合蛋白LK26、截短的上皮生长因子受体(EGFR)、Thomsen-Friedenreich(T)抗原、GM-2和GD-2神经节苷酯、多形上皮粘蛋白、叶酸结合蛋白LK26、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、胰癌胚抗原、癌抗原15-3、19-9、549、195、鳞状细胞癌抗原(SCCA)、卵巢癌抗原(OCA)、胰腺癌相关抗原(PaA)、EBNA(EB病毒核抗原)1-6、gp75、嵌合蛋白P210BCR-ABL、肺抗性蛋白(LRP)Bcl-2和Ki-67。见例如，美国专利号6,537,552；也见美国专利号6,815,531、6,773,707、6,682,928和6,623,739。
肿瘤抗原还可以是B细胞肿瘤(例如，B细胞淋巴瘤；B细胞白血病；骨髓瘤；毛细胞性白血病)产生的抗体，这种抗体的片段，其包含抗体的独特型(idiotype)的表位、恶性B细胞抗原受体、恶性B细胞免疫球蛋白独特型、免疫球蛋白的可变区、免疫球蛋白的高变区或者可变区的互补决定区(CDR)、恶性T细胞受体(TCR)、TCR的可变区和/或TCR的高变区。在一种实施方案中，本发明的肿瘤抗原可以是单链抗体(scFv)，其包含连接的VH和VL结构域，其保留了抗体的天然独特型的构象和特异结合活性。
某些称作“癌/睾丸”抗原的肿瘤抗原在多种不同的肿瘤上相对占优势。从而，使用本发明施用一种或多种癌/睾丸抗原可以引起针对多种肿瘤的应答。例如，包含鞭毛蛋白佐剂和一系列(例如，两种或多种，例如6-12)癌/睾丸抗原的混合物(例如，本发明的融合蛋白的形式)可以用于治疗多种肿瘤，可能避免基于个体鉴定受试者的肿瘤表达的特定肿瘤抗原的需要。癌/睾丸抗原的非限制性例子包括但不限于MAGE-A、MAGE-B、BAGE、GAGE-A、SSX-2、NY-ESO-I、SCP-I、CT7/MAGE-C1 HOM-TES-85、CT/BRDT、CTIO、CTpI 1/SPAN-X-C1、SAGE、OY-TES-1、cT AGE-1、CT15/Fertilinβ、CT16、CT17、MMA-1和CAGE，它们可以单独使用或者相互组合和/或与其它肿瘤抗原组合使用。
本发明还包括上述肿瘤抗原的经修饰的形式，其在受试者中诱导免疫应答。天然存在的肿瘤抗原的经修饰的形式与天然存在的抗原相比具有降低的免疫原性和/或增强的免疫原性。
天然存在的肿瘤抗原的在受试者中诱导免疫应答的片段可以根据本发明使用。片段可以包含一个或多个表位，并且可以还包含全长蛋白质的6、10、15、20、30、40、50、75、100、250、500或者更多连续氨基酸。在本发明的实施方案中，片段包含蛋白质的所有或者基本上所有(例如，几乎约1、2、3、5、10、15、20、25或50个氨基酸)的细胞外结构域，任选地没有跨膜和/或细胞质部分。在其它一些实施方案中，片段包含蛋白质的细胞外部分的至少约6、10、15、20、30、40、50、75、100、250、500或者更多的连续氨基酸，任选没有跨膜或者细胞质部分。
此外，对“NY-ESO-1抗原”或者任何其它指定的肿瘤抗原的引用(recitation)包括但不限于，天然存在的Her2/neu抗原(或者其它指定的肿瘤抗原)，和其修饰形式，该修饰形式在受试者中诱导免疫应答。
例如，任何合适的NY-ESO-1抗原可以用于本发明，包括全长蛋白质和其片段。例如，抗原可以包含一个或多个表位，并且可以还包含NY-ESO-1蛋白质的6、10、15、20、30、40、50、75、100、250、500或者更多连续氨基酸。在一些具体实施方案中，NY-ESO-1抗原如美国专利公布号2004/0203051A1中所述。在其它一些实施方案中，NY-ESO-1抗原包含该蛋白质的所有或者基本上所有(例如，几乎约1、2、3、5、10、15、20、25或50个氨基酸)的细胞外结构域，任选地没有跨膜和/或细胞质部分。在其它一些实施方案中，NY-ESO-1抗原包含NY-ESO-1蛋白质的细胞外部分的至少约6、10、15、20、30、40、50、75、100、250、500或者更多的连续氨基酸，任选没有跨膜或者细胞质部分。如本领域技术人员将明白的，NY-ESO-1抗原可以以融合肽(单独或者作为本发明的融和蛋白的部分)的形式存在。例如，可以递送包含NY-ESO-1抗原和细胞因子(例如，γ干扰素、IL-2[包括IL-2免疫毒素，如IL-2-白喉毒素]、IL-12、或者GM-CSF)的融合肽。(参见，例如，Dela Cruz et al.，(2003)Vaccine211317)本发明还包括前面的任一种的修饰形式，其在受试者中诱导免疫应答。
任何合适的Her2/neu抗原可以用于本发明，包括全长蛋白质和其片段。例如，抗原可以包含一个或多个表位，并且可以还包含Her2/neu蛋白质的6、10、15、20、30、40、50、75、100、250、500或者更多连续氨基酸。在一些具体实施方案中，Her2/neu抗原如美国专利公布号20040241686中所述。在其它一些实施方案中，Her2/neu抗原包含如美国专利公布号20040121946中描述的表位。在其它一些实施方案中，Her2/neu抗原包含该蛋白质的所有或者基本上所有(例如，几乎约1、2、3、5、10、15、20、25或50个氨基酸)的细胞外结构域，任选地没有跨膜和/或细胞质部分。见例如，美国专利号6,333,169。在其它一些实施方案中，Her2/neu抗原包含Her2/neu蛋白质的细胞外部分的至少约6、10、15、20、30、40、50、75、100、250、500或者更多的连续氨基酸，任选没有跨膜或者细胞质部分。如本领域技术人员将明白的，Her2/neu抗原可以以融合肽(单独或者作为本发明的融和蛋白的部分)的形式存在。例如，可以递送包含Her2/neu抗原和细胞因子(例如，IL-12、IL-2[包括IL-2免疫毒素，如IL-2-白喉毒素]、或者GM-CSF)的融合肽。本发明还包括前面的任一种的修饰形式，其在受试者中诱导免疫应答。
可以根据本发明使用的肿瘤抗原绝不限于本文列出的肿瘤抗原。通过本领域中已知的方法，如美国专利号4,514,506中公开的方法可以鉴定、分离和克隆其它肿瘤抗原。
最近已经表明调节性(regulatory)T细胞在限制抗肿瘤疫苗的有效性中起主要作用。阻断(一般暂时性地)调节性T细胞活性(例如，通过IL-2免疫毒素，如IL-2-白喉毒素，或者γ干扰素)的策略可以用于增强本发明的融合蛋白、组合物和方法的有效性。可以配制IL-1免疫毒素或者γ干扰素，并将其与本发明的融合蛋白和免疫原性组合物一起施用。备选地，它们可以被单独配制，并且任选与本发明的蛋白质和免疫原性组合物同时施用。本文使用的术语“同时”指时间上足够接近以产生组合效果(即，同时可以是同时的，或者它可以是在相互之前和之后的短时间期间[例如，几分钟或者小时]内发生的两个或多个事件)。在一些具体实施方案中，鞭毛蛋白/肿瘤抗原融合蛋白包含IL-2免疫毒素或者γ干扰素。在鞭毛蛋白佐剂和肿瘤抗原不作为融合蛋白提供的其它一些实施方案中，IL-2免疫毒素或者γ干扰素与鞭毛蛋白或者肿瘤抗原融合。
术语“肿瘤”在本领域中被理解为例如，在多细胞生物内未分化细胞的异常的团块。肿瘤可以是恶性或良性的。通常，本文公开的本发明的方法可以用于治疗恶性肿瘤。将治疗或者对其免疫(即，预防性治疗)的肿瘤可以是但不限于，骨髓瘤中存在的肿瘤、血液癌，如白血病和淋巴瘤(如B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤)、造血赘生物(hematopoietic neoplasmas)、胸腺瘤、头颈癌、肉瘤、肺癌、肝癌、泌尿生殖器癌、膀胱癌、睾丸癌、前列腺癌或者阴茎癌)、腺癌、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、肾癌、肝癌、原发或者转移性黑素瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、神经肿瘤，包括脑瘤，如星形胶质细胞瘤和成胶质细胞瘤、血管肉瘤、血管肉瘤、头颈癌、甲状腺癌、软组织肉瘤、骨癌，如骨肉瘤、血管癌、胃肠癌(如胃癌、胃或者结肠癌)，和现在已知的或者以后鉴定的任何其它肿瘤(见，例如，Rosenberg(1996)Ann.Rev.Med.47481-491)。
2.鞭毛蛋白发明人已确定鞭毛蛋白可以发挥佐剂的功能，以增强宿主产生的对肿瘤抗原的主动免疫应答。本文使用的术语“佐剂”具有本领域技术人员通常理解含义。例如，可以将佐剂定义为增强抗原在受试者中刺激针对该抗原的免疫应答的能力的物质。在一些具体实施方案中，佐剂将针对抗原的免疫应答增强至少约2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、75、100、150、500、1000倍或者以上。在其它一些实施方案中，佐剂减少实现特定水平的免疫应答(细胞和/或体液和/或粘膜的)所需的抗原的量，例如，减少至少约15％、25％、35％、50％、65％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或以上。佐剂还可以是延长免疫应答持续的时间、任选地保护性免疫应答持续的时间(例如，至少约2倍、3倍、5倍、10倍、20倍更长的时间或者以上)的物质。在一些情况中，不存在佐剂的情况下，宿主中不能引起显著免疫应答。
鞭毛蛋白是已知的，并且例如在美国专利号6,585,980、6130,082、5,888,810、5,618,533、4,886,748和美国专利公布号US 2003/0044429 A1和Donnelly等人、(2002)J Biol.Chem.4340456中有所描述。多数革兰氏阴性细菌表达鞭毛蛋白，其是提供运动性的表面结构。从基体、丝体(filament)和连接两者的钩子(hook)形成鞭毛蛋白。丝体由单种蛋白--鞭毛蛋白的长的多聚体形成，在末端具有小的帽蛋白。鞭毛蛋白的聚合由N和C末端的保守区介导，而鞭毛蛋白的间插区(intervening region)在物种之间非常不同。
在本发明的一些说明性实施方案中，提供了融合蛋白，其包含鞭毛蛋白佐剂和一种或多种肿瘤抗原。通常，本发明的融合蛋白包含、组成基本上为、或者组成为(a)鞭毛蛋白佐剂，该佐剂包含(i)鞭毛蛋白N-末端恒定区；和(ii)鞭毛蛋白C-末端恒定区；和(b)肿瘤抗原，其中该肿瘤抗原在N-末端恒定区和C-末端恒定区之间。在一些实施方案中，恒定区之间的鞭毛蛋白高变区被缺失(全部或者部分)；在其它一些实施方案中，存在高变区。当存在高变区(全部或者部分)时，抗原可以插入到(i)高变区内，(ii)鞭毛蛋白N-末端恒定区和高变区之间，或者(iii)鞭毛蛋白C-末端恒定区和高变区之间。
此外，N-末端恒定区和C-末端恒定区可以通过铰链区连接。高变区或者肿瘤抗原可以作为铰链区发挥作用。此外，或者备选地，约2、3、4、6、8、10、15、20、30、50或者更多氨基酸的区段可以作为铰链区发挥作用。
鞭毛蛋白的保守区是本领域中公知的并且已经例如在Mimori-Kiyosue等人，(1997)J.Mol.Virol.270222-237；lino等人，(1977)Ann.Rev.Genet.11161-182；和Schoenhals等人，(1993)J Bacteriol1755395-5402中有所描述。如本领域技术人员理解的，恒定区的大小将在一定程度上依赖于鞭毛蛋白蛋白质的来源而变。通常，N-末端恒定区包括蛋白质的约170或180个N-末端氨基酸，而C-末端恒定区通常跨越约85到100个C-末端氨基酸。中心高变区随着细菌中的大小和序列而有很大变化，并且是分子量差异的主要原因。来自多种细菌的鞭毛蛋白蛋白质的N-和C-末端恒定区是已知的，其它的可以由本领域技术人员使用已知的比对技术容易地鉴定，鞭毛蛋白单体的晶体结构的阐明方便了所述比对技术(Samatey等人，(2001)Nature41331)。
本文使用的术语“鞭毛蛋白N-末端恒定区”和“鞭毛蛋白C-末端恒定区”包括活性片段(例如，长为至少约50、100或者120个氨基酸的片段)和前述任一种增强对肿瘤抗原的免疫应答的修饰(例如，通过激活TLR5途径)。例如，可对天然的鞭毛蛋白区加以修饰，以增强安全性和/或免疫应答。在一些实施方案中，鞭毛蛋白N-末端和/或C-末端恒定区包含全长区域或者备选地，可以仅包含一个或两个区域的片段。
在一些具体实施方案中，N-末端和/或C-末端恒定区包含TLR5识别位点并且能够激活TLR5途径。在一些代表性实施方案中，N-末端恒定区包含如Eaves-Pyles等人(2001)J Immunology 1677009-7016描述的N-末端RINSA结构域(S.dublin鞭毛蛋白的氨基酸31-52)，或者其同源物或者增强肿瘤抗原的免疫原性的修饰形式。在其它一些实施方案中，N-末端恒定区包含D1和D2结构域，并且C-末端恒定区包含D1和D2结构域(Eaves-Pyles等人(2001)JImmunology 1677009-7016)或者其增强肿瘤抗原的免疫原性的修饰形式。
在其它一些实施方案中，鞭毛蛋白N-末端和/或C-末端恒定区包含、组成为、或者组成基本上为如美国专利公布号US 2003/0044429A1或者Alderem等人描述的肽GAVQNRFNSAIT(SEQ ID NO4)，或者其同源物或者增强肿瘤抗原的免疫原性的修饰形式。
在再一些实施方案中，N-末端恒定区包含Kanneganti等人，(2004)J Biol.Chem.2795667-5676鉴定的基序N”(例如，S.muenchen鞭毛蛋白的氨基酸98-108)和/或C-末端恒定区包含“基序C”(例如，S.muenchen鞭毛蛋白的氨基酸441-449)，或者其同源物或者增强肿瘤抗原的免疫原性的修饰形式。
在其它一些阐明性实施方案中，N-末端恒定区包含铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)鞭毛蛋白的氨基酸88-97(见例如Verma等人，(2005)Infect.Immun.738237-8246)或者其同源物或者增强肿瘤抗原的免疫原性的修饰形式。
Smith等人(2003)Nat.Immunol.41247-1253已经鉴定了鞭毛蛋白的参与TLR5信号传递的区域(例如，S.typhimurium鞭毛蛋白的氨基酸78-129、135-173和394-444或者其同源物或者修饰形式)。
鞭毛蛋白N-末端恒定区、C-末端恒定区和高变区可以来自任何合适来源的鞭毛蛋白，这些区域的一些或者全部来自相同生物或者来自不同的生物。已经克隆并测序了许多鞭毛蛋白基因(见例如，Kuwajima等人，(1986)J Bact.1681479；Wei等人，(1985)J Mol.Biol.186791-803；和Gill等人，(1983)J Biol.Chem.2587395-7401)。鞭毛蛋白的非限制性来源包括但不限于，S.enteritidis、S.typhimurium、S.dublin、幽门螺旋杆菌(H.pylori)、V.cholera、S.marcesens、S.flexneri、S.enterica、T.pallidum、L.pneumophila、B.burgdorferei、C.difficile、A.tumefaciens、R.meliloti、B.clarridgeiae、R.lupine、P.mirabilis、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)和大肠杆菌(E.coli)。
在本文的工作实施例中提供了本发明的融合蛋白的非限制性例子。
任选地，融合蛋白可以包含任何其它肽或者蛋白质。例如，融合蛋白可以还包含来自其它生物的一种或多种抗原。在一些代表性实施方案中，融合蛋白还包含免疫调节化合物。例如，本领域已知可以通过免疫调节性细胞因子或者趋化因子可以增强免疫应答(如α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素、ω-干扰素、τ-干扰素、白介素-1α、白介素-1β、白介素-2、白介素-3、白介素-4、白介素-5、白介素-6、白介素-7、白介素-8、白介素-9、白介素-10、白介素-11、白介素-12、白介素-13、白介素-14、白介素-18、B细胞生长因子、CD40配体、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、单核细胞趋化蛋白-1、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、淋巴细胞毒素、CCL25[MECK]和CCL28[TECH])增强免疫应答。
在具体实施方案中，融合蛋白包含γ-干扰素和/或IL-2免疫毒素(例如，IL-2-白喉毒素)。本发明还提供了包含鞭毛蛋白佐剂和肿瘤抗原的组合物。根据该实施方案，鞭毛蛋白佐剂可以是全长鞭毛蛋白或者可以是包含如上文更详细描述的N-末端和/或C-末端恒定区的鞭毛蛋白肽。此外，还如上文描述的，鞭毛蛋白佐剂可以与肿瘤抗原偶联(例如，融合)，以形成融合蛋白。在一些示例性实施方案中，肿瘤抗原是肿瘤F1蛋白质、肿瘤V蛋白质或者其融合蛋白。组合物可以包含与鞭毛蛋白佐剂融合的一种或多种肿瘤抗原，任选地，组合物中存在的一种或多种肿瘤抗原不与鞭毛蛋白佐剂融合。在其它实施方案中，鞭毛蛋白佐剂不偶联到肿瘤抗原。
除非另外指出，融合蛋白本身作为蛋白质(或者编码蛋白质的核酸)施用，而不作为活的、杀死的或者重组细菌或者病毒载体疫苗的部分施用。
4.重组核酸和融合蛋白的产生除了另外指出，可以本领域技术人员已知的标准方法可以用于克隆基因、扩增和检测核酸、产生融合构建体、在宿主细胞或者生物中表达肽，等等。此类技术是本领域技术人员已知的。见例如，Sambrook等人，“Molecular Cloning”A Laboratory Manual第二版(Cold SpringHarbor，NY，1989)；F.M.Ausubel等人Current Protocols in MolecularBiology(Green Publishing Associates，Inc.and John Wiley & Sons，Inc.，New York)。
如本文使用的，“核酸”包括RNA和DNA，包括cDNA、基因组DNA、合成的(例如，化学合成的)DNA和RNA和DNA的嵌合体。核酸可以是双链或单链的。可以使用寡核苷酸类似物或者衍生物(例如，次黄苷或者硫代磷酸酯核苷酸)合成核酸。此类寡核苷酸可以例如用于制备具有改变的碱基配对能力或者对核酸酶的增加的耐受性的核酸。
可以在表达编码用于多种目的(例如，产生免疫原性组合物，作为诊断或者研究试剂等等)的融合蛋白的异源核酸的培养的细胞或者生物中产生本发明的融合蛋白，并任选从所述细胞或者生物对其进行纯化。
在一些实施方案中，可以从宿主细胞收集并任选纯化融合蛋白。例如，可以从条件培养基收集融合蛋白。根据该实施方案，表达可操作连接分泌信号序列的融合蛋白可能是有利的。备选地，可以从宿主细胞分离融合蛋白(例如，可以裂解宿主细胞并从中分离融合蛋白)。
在其它一些实施方案中，收集宿主细胞并并且不从中分离融合蛋白。
通常，将异源核酸掺入到表达载体(病毒或者非病毒的)中。合适的表达载体包括但不限于，质粒、噬菌体、细菌人工染色体(bacs)、酵母人工染色体(yacs)、粘粒、病毒载体等等。与多种宿主细胞相容的表达载体是本领域中公知的，并且含有用于核酸的转录和翻译的合适元件。典型地，表达载体含有“表达盒”，其在5’到3’方向包括启动子、编码与启动子可操作的连接的融合蛋白的编码序列，和任选地，终止序列，其包括针对RNA聚合酶的终止信号和多聚腺苷酸酶(polyadenylase)的多聚腺苷酸化信号。
可以对表达载体加以设计，用于在原核或真核细胞中表达多肽。例如，可以在细菌细胞(如大肠杆菌)、昆虫细胞(例如，杆状病毒表达系统)、酵母细胞、哺乳动物细胞、或者植物细胞中表达多肽。用于在酿酒酵母中表达的载体的例子包括pYepSecl(Baldari等人，(1987)EMBO J.6229-234)，pMFa(Kurjan and Herskowitz，(1982)Cell30933-943)，pJRY88(Schultz等人，(1987)Gene 54113-123)，和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，Calif.)。可用于在培养的昆虫细胞(例如，Sf9细胞)表达核酸以产生蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等人，(1983)Mol.Cell.Biol.32156-2165)和pVL系列(Luckiow，V.A.，和Summers，M.d.(1989)Virology 17031-39)。
此外，表达载体将通常包括表达控制序列(例如，转录/翻译控制信号和多聚腺苷酸化信号)，其可操作地连接编码本发明的融合蛋白的核酸序列。应当理解，取决于所希望的水平和组织特异性表达，可以使用多种启动子/增强子元件。启动子可以是组成型的或者诱导型的(例如，金属硫蛋白启动子或者激素诱导型启动子)，这取决于所希望的表达模式。启动子可以是本来天然有的或者外源的并且可以是天然或者合成的序列。外源指启动子不在该启动子所导入的野生型宿主中发现。选择启动子使得它在目标靶细胞中发挥功能。此外，一般提供特异性起始信号以有效翻译插入的蛋白质编码序列。这些翻译控制序列(可以包括ATG起始密码子和相邻序列)可以是多种来源的，可以是天然和合成的。其中表达载体包含将两个将被转录的可读框的本发明实施方案中，可读框可以可操作地连接单独的启动子或者单个上游启动子和一个或多个下游内部核糖体进入位点(IRES)序列(例如，细小核糖核酸病毒EMC IRES序列)。
哺乳动物表达载体的例子包括pCDM8(Seed，(1987)Nature 329840)和pMT2PC(Kaufman等人(1987)，EMBO J.6187-195)。当用于哺乳动物细胞中时，表达载体的控制功能通常通过病毒调节元件提供。例如，常用的启动子来自多瘤、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。
本发明还提供了(暂时或稳定)包含编码本发明的融合蛋白的核酸的宿主细胞。合适的宿主细胞是本领域中公知的，并且包括原核和真核细胞。见，例如，Goeddel，Gene Expression TechnologyMethodsin Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990)。公知蛋白质可以在细菌细胞如大肠杆菌、昆虫细胞(例如，杆状病毒表达系统)、酵母细胞、植物细胞或者哺乳动物细胞(例如，人、大鼠、小鼠、仓鼠、牛、猪、绵羊、山羊、马、猫、狗、兔形目动物、猿等等)中表达。宿主细胞可以是培养的细胞，如原代细胞或者永生化细胞系的细胞。宿主细胞可以是基本上用作生物反应器的微生物、动物或者植物的细胞。在本发明的一些具体实施方案中，宿主细胞是允许表达载体复制的昆虫细胞。例如，宿主细胞可以来自草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)，如Sf9或者或者Sf21细胞系、果蝇细胞系，或者蚊子细胞系，例如，白纹伊蚊(Aedes albopictus)来源的细胞系。昆虫细胞表达异源蛋白质的用途，以及将核酸，如载体，例如，昆虫细胞相容的载体(如杆状病毒载体)导入此类细胞中的方法和培养保持此类细胞的方法有详细记载。见例如，Methods inMolecular Biology，ed.Richard，Humana Press，NJ(1995)；O′Reilly等人，Baculoviras Expression Vectors，A Laboratory Manual，OxfordUniv.Press(1994)；Samulski等人，J.Vir.633822-8(1989)；Kajigaya等人，Proc.Natl Acad.Sci USA 884646-50(1991)；Ruffing等人，J.Vir.666922-30(1992)；Kimbauer等人，Vir.21937-44(1996)；Zhao等人，Vir.272382-93(2000)；和Samulski等人的美国专利号6,204,059。在本发明的一些具体实施方案中，昆虫细胞是Sf9细胞。
可以通过常规转化或者转染技术向原核或者真核细胞中引入载体。本文使用的术语“转化”和“转染”指多种本领域中公知的将外源核酸(例如DNA)导入宿主细胞的多种方法，包括磷酸钙或者氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染、电穿孔、显微注射、装载DNA的脂质体、脂转软胺(lipofectamine)-DNA复合体、细胞超声处理、使用高速微粒进行基因轰击，和病毒介导的转染。用于转化或者转染宿主细胞的合适的方法可以见Sambrook等人(MolecularCloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring HarborLaboratory press(1989))和其它实验室手册。在本发明的另一些实施方案中，宿主细胞可以用编码融合蛋白的异源核酸序列稳定转化。本文使用的“稳定转化”通常指异源核酸序列整合到宿主细胞的基因组中，这与“瞬时转化”相反，瞬时转化中，导入宿主细胞的异源核酸不整合到宿主细胞的基因组中。术语“稳定转化”还可以指游离体(episome)(例如，EB病毒(EBV))在细胞中的稳定保持。
当产生稳定转化的细胞时，通常仅一小部分细胞(尤其哺乳动物细胞)将外源细胞整合到它们的基因组中。为了鉴定和选择这些整合体，可以将编码选择标记(例如，抗生素抗性)的核酸与目的核酸一起导入宿主细胞。优选的选择标记包括赋予对药物(如G418、潮霉素和氨甲蝶呤)的抗性的那些选择标记。可以将编码选择标记的核酸与包含目的核酸的载体的相同载体上导入宿主细胞中，或者可以导入单独的载体上。可以通过药物选择来鉴定用导入的核酸稳定转染的细胞(例如，已经包括进选择标记基因的细胞将存活，而其它细胞死亡)。
还可以在转基因植物中产生融合蛋白，所述植物中，编码融合蛋白的分离的核酸已经插入到细胞核或者质体的基因组中。植物转化是本领域中已知的；一般而言，Methods in Enzymology Vol.153(“Recombinant DNA Part D”)1987，Wu和Grossman Eds.，AcademicPress和欧洲专利申请EP 693554。
可以通过几种方法将外源核酸导入植物细胞或者原生质体中。例如，可以通过使用微量移液器直接显微注射到植物细胞中，来机械地转移核酸。还可以通过使用聚乙二醇，也可以向植物细胞中转入外源核酸，聚乙二醇与遗传物质形成沉淀复合体，其被细胞吸收(Paszkowski等人(1984)EMBO J.32712-22)。可以通过电穿孔可以向植物细胞中导入外源核酸(Fromm等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci USA 825824)。在该技术中，在含有相关的遗传构建体的质粒或者核酸的存在的情况下，对植物原生质体进行电穿孔。高场强的电脉冲可逆地透化生物膜，这允许质粒的导入。经电穿孔的植物原生质体再形成细胞壁、分裂并形成植物愈伤组织。使用表型标记可以完成对包含外源核酸的经转化的植物细胞的选择。
花椰菜花叶病毒(CaMV)可以用作向植物细胞中导入外源核酸的载体(Hohn等人(1982)“Molecular Biology of Plant Tumors，”Academic Press，New York，pp.549-560；Howell，美国专利号4,407,956)。CaMV病毒DNA基因组插入到亲本细菌质粒中，产生可以在细菌中增殖的重组DNA分子。通过导入希望的DNA序列可以进一步修饰重组质粒。从亲本细菌质粒切下重组质粒的经修饰的病毒部分然后，并用于接种植物细胞或者植物。
通过小颗粒进行的高速射弹穿透可以用于向植物细胞中导入外源核酸。核酸被布置在小珠或者颗粒的基质内，或者在表面上(Klein等人(1987)Nature 32770-73)。尽管典型地仅需要单次导入新的核酸区段，但是该方法也提供多次导入。
通过用经核酸转化的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转染植物细胞、外植体、分生组织或者种子可以向植物细胞中导入核酸。在合适的条件下，可以培养经转化的植物细胞以形成枝条、根，并进一步发育成植物。例如，可以通过根癌农杆菌的Ti质粒可以向植物细胞中导入核酸。当根癌农杆菌感染时，Ti质粒转移进植物细胞，并稳定整合到植物基因组中(Horsch等人，(1987)Science 2271229-1231；Fraley等人(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 804803)。
可以从可操作地连接其它肽或者蛋白质，如可操作地连接纯化信号(如多聚His)的核酸或者作为与其它蛋白质(例如，细胞因子，如γ-干扰素和/或IL-2-免疫毒素，如IL-2-白喉毒素)的嵌合体表达融合蛋白。
5.施用本发明的融合蛋白、鞭毛蛋白佐剂和组合物的方法为了治疗和预防目的，可以根据已知的技术(见例如，Pizzo等人PCT申请WO 2004/101737)实施本发明。通常，预防性实施本发明，以减少肿瘤形成。然而，在其它一些实施方案中，实施本发明的方法，以治疗已经产生肿瘤的受试者。用于本发明方法中的免疫原性组合物在下文描述。可以在数周、数月或者数年的时间过程内进一步施用强化剂量。对于现有的肿瘤，最初的高剂量后接着施用强化剂量可以是有益的。
可以实施本发明以治疗具有现有肿瘤的受试者或者预防或者延迟肿瘤发生。此外，本发明方法可以用于治疗原发性肿瘤和预防转移。此外，本发明方法可以有利地用于减少或者预防转移性结节的生长(例如，手术除去原发肿瘤后)。本发明的方法还可以是预防性的，例如，用于治疗认为处于肿瘤危险中的受试者。
术语“治疗”(或者语法上等同的术语)指受试者病况的严重性降低或者至少部分改善或者减轻，和/或实现了至少一种临床症状的一定的减轻、缓和或者减退，和/或状况的进展被延迟，和/或对疾病或者病症发作的预防或者延迟。术语“治疗”等还包括对受试者的预防性治疗(例如，预防感染或者癌症的发作)。本文使用的术语“预防”(和其语法等同物)不意在暗含疾病的完全消除并且，其包括任何类型的预防性治疗，其减少状况的发病率，延迟状况的发作和/或进展，和/或减轻与该状况有关的症状。从而，术语“治疗”(或者语法上等同的术语)指预防和治疗方案。
如本文使用的，“治疗受试者中肿瘤”的方法包括治疗现有肿瘤的治疗性方法(包括减小转移的发生率和/或严重性)和预防或者减少肿瘤形成的预防性方法。
术语“接种”或者“免疫”是本领域中公知的，除非另有指明，其在本文中互换使用，除非另外指出。例如，术语接种或者免疫可被理解为增加生物对抗原的免疫应答并因此抵抗或者克服感染的方法。在本发明的情况中，针对肿瘤抗原的接种或者免疫增强生物的免疫应答和对肿瘤的抵抗力。
本文使用的“治疗有效量”是足够治疗(如本文定义)受试者的量。
“主动免疫应答”或者“主动免疫”的特征是“遇到免疫原后，宿主组织和细胞的参与。它涉及淋巴网状组织中免疫活性细胞的分化或者增殖，这导致抗体的合成或者细胞介导的反应性的发展，或者两者均被导致”。Herbert B.Herscowitz，ImmunophysiologyCell Functionand Cellular Interactions in Antibody Formation，in IMMUNOLOGYBASIC PROCESSES 117(Joseph A.Bellanti ed.，1985).或者可以说，通过感染或者接种暴露于免疫原后，宿主发动主动免疫应答。主动免疫与被动免疫相反，被动免疫中，通过“来自主动免疫的宿主的预先形成的物质(抗体、转移因子、胸腺移植物、白介素-2)转移到非免疫宿主”获得被动免疫。
如本文使用的“保护性”免疫应答或者“保护性”免疫性指该免疫应答对受试者赋予一定的益处，因为它防止或者减小疾病的发生率和/或严重性。备选地，保护性免疫应答或者保护性免疫可以用于对现有疾病的治疗性治疗。
可以为了医学或者兽医目的实施本发明。本发明方法可治疗的受试者包括鸟类和哺乳动物受试者、(哺乳动物受试者包括但不限于人)、非人灵长类(例如，猴子、猿、狒狒和黑猩猩)、狗、猫、兔、山羊、马、猪、牛、绵羊等等(包括雄性和雌性受试者和所有年龄的受试者，包括婴儿、青少年、青年和成年受试者)。可以为了任何目的治疗受试者，例如，为了引起保护性免疫应答；为了引起抗体在受试者(典型地，动物受试者)中的产生，可以收集抗体并用于其它目的，如诊断目的或者施用于其它受试者以在其中产生被动免疫，等等。在一些具体实施方案中，受试者是动物模型。在其它实施方案中，受试者具有肿瘤和/或是认为处于肿瘤危险中的受试者。
任选地，受试者可以是“需要本发明的融合蛋白、组合物、药物制剂和方法”的受试者。
在一些实施方案中，受试者是年老受试者，例如，50或者60岁或者更老的人类受试者，其中其它佐剂如明矾通常效果较低。
因此，在一些具体实施方案中，本发明提供了在受试者(如哺乳动物受试者，例如人或者灵长类动物)中诱导针对肿瘤抗原的免疫应答的方法，该方法包括对受试者以免疫原性有效量施用本发明的融合蛋白或者其药物组合物。在一些代表性实施方案中，实施方法作为治疗受试者(如哺乳动物受试者，例如人或者灵长类动物)中肿瘤的方法，该方法包括对受试者以治疗能有效量施用本发明的融合蛋白或者其药物组合物。任选地，通过向粘膜表面(例如，通过鼻内或者吸入施用)递送融合蛋白或者药物组合物实施这些方法。
本发明还提供了在受试者(如哺乳动物受试者，例如人或者灵长类动物)中诱导对肿瘤抗原的免疫应答的方法，该方法包括对受试者以免疫原性有效量施用鞭毛蛋白佐剂或者肿瘤抗原，或者其药物组合物。在一些代表性实施方案中，实施该方法作为治疗受试者(如哺乳动物受试者，例如人或者灵长类动物)中肿瘤的方法，该方法包括对受试者以能治疗有效量施用鞭毛蛋白佐剂或者肿瘤抗原，或者其药物组合物。任选地，通过向粘膜表面(例如，通过鼻内或者吸入施用)递送融合蛋白或者药物组合物实施该方法。可以在相同或者单独的组合物中施用鞭毛蛋白佐剂和肿瘤抗原。如果作为分别的组合物施用，任选地，它们可以同时施用。
施用可以通过本领域中已知的任何途径来进行。作为非限制性例子，施用途径可以是通过吸入(例如，经口和/或鼻吸入)、经口、口含(例如，舌下)、直肠、阴道、局部(包括施用于呼吸道)、眼内、经皮、通过肠胃外(例如，肌内[包括施用于骨骼肌、心肌和/或膈肌]、静脉内、皮下、皮内、胸膜内、脑内和动脉内、和鞘内)途径，以及直接肌肉或器官注射，或者通过施用于中枢神经系统(例如，趋实体性(stereotactic)施用于脑)。
在具体实施方案中，施用到粘膜表面，例如，通过鼻内、吸入、气管内、经口、直肠或者阴道施用，等等。通常，粘膜施用指递送到粘膜表面，如呼吸道、胃肠道、泌尿道、生殖道等等的表面。
施用于呼吸道表面的方法包括但不限于，经粘膜、鼻内、吸入或者气管内施用或者施用于肺。其它粘膜施用方法包括经口、口含(例如，舌下)、气管内、直肠、阴道和眼内施用。
在本发明的一些实施方案中，在肿瘤部位中或者附近施用。在其它实施方案中，直接施用到淋巴系统中(例如，淋巴结中或者附近)。可以通过递送编码本发明蛋白质的核酸中间体并在宿主中表达产生所述蛋白质，来递送本发明的蛋白质，如Feigner等人的美国专利号5,589,466中描述。
免疫调节化合物，如免疫调节性趋化因子和细胞因子(优选地，CTL诱导型细胞因子)可以共同施用于受试者。可以通过本领域中已知的任一种方法施用细胞因子。可以将外源的细胞因子施用于受试者，或者备选地，使用合适的载体可以将编码细胞因子的核苷酸序列递送到受试者，并在体内产生该细胞因子。在一些具体实施方案中，细胞因子作为与鞭毛蛋白佐剂和/或肿瘤抗原的融合蛋白提供。例如，可以施用包含鞭毛蛋白佐剂、肿瘤抗原和免疫调节性细胞因子(例如，γ-干扰素或者IL-2-免疫毒素)的融合蛋白。备选地，可以施用包含细胞因子和肿瘤抗原或者鞭毛蛋白佐剂的融合蛋白。
除了它们用于预防或者治疗目的的用途外，可以对受试者施用本发明的融合蛋白和组合物，用于产生针对肿瘤抗原的抗体，该抗体又可以用于人和动物受试者中的诊断或者治疗/预防目的。
6.药物组合物本发明还提供了处于可药用载体中的本发明融合蛋白的药物组合物(例如，免疫原性组合物)。在一些具体实施方案中，配制药物组合物用于粘膜递送。“可药用的”指并非有毒的或者不希望的物质。
在一些代表性实施方案中，融合蛋白在药物组合物中以“免疫原性有效”量存在。“免疫原性有效量”是足够在施用了药物组合物所施用的受试者中引起主动免疫应答(即，细胞和/或体液的)的量。任选地，剂量足够产生保护性免疫应答(感染发生后预防性或者治疗性的)。赋予的保护程度不必是完全的或者持久的，只要施用药物组合物的益处超过其任何缺点即可。免疫学有效量取决于蛋白质、施用方式、被治疗的疾病的阶段和严重性、和受试者的体重和一般健康状态，和处方医生的判断。
可以通过本领域已知的方法来确定药学活性化合物的剂量，见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing Co.，Easton，Pa)。在一些具体实施方案中，对于典型的(例如，70kg)受试者，本发明的融合蛋白的剂量为约0.1、0.5、1、10、25、250、100、150或250μg到约300、500、1000、2500、5000或10,000μg融合蛋白的范围。在一些具体实施方案中，对于典型的受试者，剂量为约50到2000μg、约100到1500μg，或者约250到1000μg的范围。最初剂量后，可以在数周、数月或者数年内进行约1μg到250、500或者1000μg的强化剂量，这取决于受试者对最初剂量的应答。
本发明还提供了下述药物组合物，其包含(a)鞭毛蛋白佐剂；和(b)肿瘤抗原。在一些具体实施方案中，配制药物组合物用于粘膜施用。任选地，肿瘤抗原与鞭毛蛋白佐剂偶联，即为与鞭毛蛋白抗原的融合蛋白的形式。根据该实施方案，所述组合物可以还包含一种或多种额外、不与鞭毛蛋白佐剂偶联(即，不是与鞭毛蛋白佐剂的融合蛋白的部分)的肿瘤抗原。
任选地，肿瘤抗原以如本文定义的免疫原性有效量存在。此外，在一些实施方案中，鞭毛蛋白佐剂以“佐剂有效量”存在。“佐剂有效量”是下述量的鞭毛蛋白佐剂的量，该量足以增强或者刺激宿主发起的针肿瘤抗原的主动免疫应答(细胞和/或体液的)，任选主动的粘膜免疫应答。在具体实施方案中，宿主的主动免疫应答(例如，粘膜免疫应答)被增强至少约2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、60、75、100、150、500、1000倍或者以上。在其它一些实施方案中，“佐剂有效量”是下述量的鞭毛蛋白佐剂的量，该量能减少实现特定水平的免疫(细胞和/或体液的)、任选粘膜免疫所需的抗原的量，例如，抗原的量减少至少约15％、25％、35％、50％、65％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或者以上。作为另一选择，“佐剂有效量”可以指下述量的鞭毛蛋白佐剂的量，该量能加速宿主中免疫应答的诱导和/或减小对强化免疫以实现保护的需要。作为再一个选择，“佐剂有效量”可以是能延长免疫应答、任选地保护性免疫应答持续的时间期限(例如，至少约2倍、3倍、5倍、10倍、20倍更长的时间期限或者更长)的量。
本领域技术人员可以确定鞭毛蛋白佐剂和肿瘤抗原(如果不是融合蛋白的形式)的剂量。在一些具体实施方案中，对于典型的(例如70kg)受试者，鞭毛蛋白佐剂的剂量为约0.1、0.5、1、10、25、50、100或150μg到约200、250、300、500、1000或2500μg的范围。在具体实施方案中，对于典型的受试者，剂量为约10到1000μg，或者约50到500μg，或者约150到300μg.对于典型的(例如70kg)受试者，肿瘤抗原的合适的剂量可以为约0.1、0.5、1、10、25、50、100或150μg到约200、300、500、1000、1500、2000、2500或5000或者10000μg。在一些具体实施方案中，对于典型的受试者，肿瘤抗原的剂量为约50到2000μg，约150到约1500μg，或者约300到约1000μg。最初剂量后可以在数周、数月或者数年内进行约1μg到约1000μg的强化剂量，这取决于受试者对最初剂量的应答。
本发明的药物组合物可以任选包含其它药用剂、制药剂、稳定剂、缓冲剂、载体、稀释剂、盐、张力调节剂、增湿剂等等，例如，乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯，等等。
对于注射，载体将典型地为液体。对于其它施用方法，载体可以为固体或者液体。对于吸入施用，载体将是可以呼吸的，并且通常为固体或者液体微粒形式。
尽管通常不需要鞭毛蛋白之外的佐剂，但是组合物可以任选包含额外的佐剂，如完全或者不完全弗氏佐剂、磷酸铝、氢氧化铝、明矾、细胞因子、TLR配体等等。
药物组合物中蛋白质的浓度可以变化很大，例如，从按重量计小于约0.01％或者0.1％到至少约2％到多大20％到50％或者以上，并且将主要通过流体体积、粘度等等根据所选的具体施用方式对其进行选择。
可以根据已知的技术用药物载体配制蛋白质，以用于施用。见例如，Remington，The Science And Practice of Pharmacy(第九版，1995)。在对根据本发明的药物组合物的生产中，通常将蛋白质(包括其生理上可接受的盐)与可接受的载体混合。载体可以为固体或者液体或者两者，并且任选用化合物配制为单位剂量剂型，例如片剂。可以使用多种可药用的水性载体，如水、经缓冲的水、0.9％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸、无致热原的水、无致热原的磷酸缓冲盐溶液、抑菌水或者Cremophor EL[R](BASF，Parsippany，N.J.)，等等。可以通过常规技术对这些组合物灭菌。可以将一种或多种蛋白质掺入本发明的制剂中，可以通过药剂学的任一种公知技术配制本发明的制剂。
药物组合物可以经包装后原样使用，或者被冻干，冻干的制剂通常与在施用前与无菌水溶液组合。组合物还可以包装在单位/剂量或者多剂量容器，如封闭的安瓿和小瓶中。
可以根据药剂学的常规技术配制药物组合物，以用于通过本领域中任一种已知的方法施用。例如，可以配制组合物进行鼻内施用、通过吸入(例如，经口吸入)、经口、口含(例如，舌下)、直肠、阴道、局部、鞘内、眼内、经皮施用、通过肠胃外施用(例如，肌内(包括施用于骨骼肌、心肌和/或膈肌]、静脉内、皮下、皮内、胸膜内、脑内和动脉内、和鞘内)途径，局部(例如，施用于皮肤和粘膜表面，包括呼吸道表面)以及直接肌肉或器官注射，或者通过施用于中枢神经系统(例如，趋实体性(stereotactic)施用于脑)施用。
在本发明的一些实施方案中，配制药物组合物用于在肿瘤部位中或者附近施用。在其它实施方案中，配制药物组合物用于直接施用于淋巴系统中(例如，淋巴结中或者附近)。
在具体实施方案中，将药物组合物施用于粘膜表面，例如，通过鼻内、吸入、气管内、经口、直肠或者阴道施用，等等。
对于鼻内或者吸入施用，可以将药物组合物配制为气溶胶(该术语包括液体和干粉气溶胶)。例如，药物组合物可以以细分的形式与表面活性剂和推进剂一起提供药物组合物。组合物的典型的百分数是按重量计0.01-20％，优选1-10％。表面活性剂通常是无毒的，并且可溶于推进剂中的。此类物质的代表是含有6到22个碳原子的脂肪酸(如己酸、辛酸、十二烷酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、olestericacid和油酸)与脂肪族多元醇或者其环酐的酯或者部分酯。可以使用混合的酯，如混合的或者天然甘油酯。表面活性剂可以构成组合物重量的0.1-20％，优选0.25-5％。组合物的差额通常是推进剂。如需要，还可以包括载体，如用于鼻内递送的卵磷脂。可以通过任何合适的方式，如用压力驱动的气溶胶喷雾器或者超声喷雾器，来产生液体颗粒的气溶胶，如本领域技术人员已知。见例如，美国专利号4,501,729。通过药学领域中已知的技术，类似地，可以用任何固态微粒药物气溶胶发生器可以同样产生固体颗粒的气溶胶。也可以通过小滴施用于鼻表面也可以进行鼻内施用。
可注射的制剂可以以常规形式制备，如作为液体溶液剂或者混悬剂、适于在注射前溶解或者悬于液体中的固体形式，或者作为乳剂。备选地，可以以局部而不是全身方式，如以贮库制剂(depot)或者持续释放制剂施用药物组合物。
可以从以前描述的种类的无菌粉剂、粒剂和片剂，来制备临时注射溶液和混悬液。例如，可以在密闭的容器中以单位剂型提供本发明的可注射的、稳定的无菌组合物。可以以冻干物的形式提供组合物，可以用合适的可药用载体重构冻干物以形成适于注射到受试者的液体组合物。单位剂型可以为约1μg到约10g本发明的组合物。当组合物基本上是水不溶的时候，可以以足够的量包括足够量的可药用乳化剂以在水性载体中乳化组合物。一种此类有用的乳化剂是磷脂酰胆碱。
适于经口施用的药物组合物可以为离散单位，如胶囊剂、扁囊剂、糖锭剂或者片剂，作为粉剂或者粒剂；作为水性或非水性液体中的溶液剂或者混悬剂；或者作为水包油或者油包水乳剂。通过将本发明的化合物与能够抵抗动物肠中消化酶的降解的载体复合，来进行经口递送。此类载体的例子包括塑料胶囊或者片剂，如本领域中已知。可以通过药剂学的任何合适的方法制备此类制剂，所述方法包括使化合物和合适的载体(其可以含有如上述的一种或多种辅助成分)联合。通常，通过将化合物与液体或者细分的固态载体或者两者均匀和紧密地预先混合，然后如果必要，再将所得混合物成形，可以制备药物组合物。例如，可以通过对压紧或者模制含有化合物的粉末或者粒剂，任选地与一种或多种辅助成分进行压紧或模制，来制备片剂。可以通过在合适的机器中对自由流动形式的组合物(如任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂和/或表面活性剂/分散剂混合的粉剂或者粒剂)进行压片。可以通过在合适的机器中模制用惰性液体粘合剂湿润的粉末化化合物进行模制，来制备经模制的片剂。
适于口含(舌下)施用的药物组合物包括糖锭剂其包含增香的基质，(通常为蔗糖和阿拉伯树胶或者西黄着胶中化合物(tragacanth))；和锭剂，其包含惰性基质(如明胶和甘油或者蔗糖和阿拉伯树胶中的化合物的锭剂)。
本发明的适于肠胃外施用的药物组合物可以包含本发明化合物的无菌水性和非水性注射溶液，该制剂优选与预期的受试者的血液等渗。这些制剂可以含有抗氧化剂、缓冲剂、制菌剂和溶质，其使得组合物与预期的受试者的血液等渗。水性和非水性无菌混悬剂、溶液剂和乳剂可以包括悬浮剂和增稠剂。非水性溶质的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油，如橄榄油，和可注射的有机酯，如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳液或者混悬液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格(Ringer’s)葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格液或者不挥发油(fixed oil)。静脉内载体包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格葡萄糖的那些)，等等。还可以存在防腐剂和其它添加剂，如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、和惰性气体等等。
适于直肠施用的药物组合物优选作为单位剂量栓剂存在。这些可以通过将化合物与一种或多种常规固态载体(如可可脂)混合，然后成型所得混合物加以成型来制备。
适于局部应用于皮肤的本发明的药物组合物优选采用软膏剂(ointment)、霜剂、洗剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气溶胶或者油的形式。可以使用的载体包括，但不限于矿脂、羊毛脂、聚乙二醇、醇、经皮增强剂，和它们两种或多种的组合。在一些实施方案中，例如，可以通过将本发明的药物组合物与能够穿过皮肤的亲脂试剂(例如，DMSO)，来混合可以进行局部递送。
适于经皮施用的药物组合物可以为离散贴剂的形式，其适于与受试者的表皮长时间保持紧密接触。适于经皮施用的组合物还可以通过离子电渗疗法(见例如，Pharmaceutical Research 3318(1986))施用，并且典型地，采取化合物的任选缓冲的水溶液的形式。合适的制剂可以包含柠檬酸或者bis/tris缓冲液(pH6)或者乙醇/水，并且其可以含有0.1到0.2M活性成分。
此外，可以将化合物配制为脂质体制剂。用于形成脂质体混悬液的技术是本领域中公知的。当化合物或者其盐是水溶性盐时，可以使用常规的脂质体制剂，可以将所述盐掺入到脂囊泡中。在这种情况下，由于化合物或者盐的水溶性，化合物或者盐将基本被导引于亲水中心或者脂质体的核心中。使用的脂质层可以为任何常规的组合物，并且可以含有胆固醇或者可以是无胆固醇的。当目的化合物或者盐是水溶性的，再次使用常规脂质体形成技术，盐可以基本上被导引于疏水脂质双层中，该双层形成脂质体的结构。在任一情况下，产生的脂质体可以减小尺寸，如通过使用标准超声处理和匀浆技术。
可以冻干脂质体制剂以产生冻干物，可以用可药用的载体，如水对其进行重构，以再生脂质体混悬液。
已经描述了本发明，将在下面的实施例中更详细地解释本发明，本文中包括进这些实施例仅用于阐明目的，并且不意在限制本发明。本发明中使用缩写如下GM-CSF，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；IL，白介素；i.n.，鼻内；i.t.，气管内；NK，自然杀伤细胞；NO；一氧化氮；s.c.，皮下的；TLR，toll样受体；TGF-β，转化生长因子β。
实施例1癌抗原和其疫苗鞭毛蛋白对小鼠肺中先天免疫的影响。1μg鞭毛蛋白的非手术气管内(i.t.)滴注足够在约4小时后诱导TNFα的最大产生(图1)。12-24小时后，支气管肺洗出液中的细胞因子水平返回到基线水平。注意不结合TLR5并从而缺乏信号传递活性的突变的鞭毛蛋白不诱导细胞因子产生。除了TNFα外，几种其它细胞因子(包括IL-6、G-CSF)和趋化因子MIP-2和KC被诱导到相对高的水平。细胞因子表达的增加，之后接着是嗜中性粒细胞的暂时浸润(在12-24小时时最大)。强调鞭毛蛋白引起的先天免疫应答不导致严重的组织损伤炎症是重要的。诱导的炎性应答在性质上是相对适度和急性的。这些发现以及其他研究人员的发现一起确立了鞭毛蛋白作为先天免疫的激活剂的体内潜能。
小鼠肺中鞭毛蛋白的佐剂效果。除了分析鞭毛蛋白诱导的先天应答外，还检查了鞭毛蛋白对抗体应答的效果。用10μgF1抗原与1μg鞭毛蛋白或者失活的鞭毛蛋白突变蛋白通过非手术的气管内(i.t.)或者鼻内(i.n.)滴注免疫BALB/c小鼠。4周后，用相同的方案对小鼠进行强化，然后2周后测定抗F1 IgG的血清水平。鞭毛蛋白，而非无活性的突变体显示出如通过血清抗-F1 IgG水平测量得到的格外强烈的佐剂活性。在i.t.免疫的动物中，抗体效价为20,000到大于100,000，对于i.n.免疫的动物的情况，其为90,000到大于300,000。i.n.免疫的结果在表1中给出。使用敲除小鼠对该应答的细胞因子需要的分析表明鞭毛蛋白的佐剂效果不需要IL-6、IL-12，也不需要TNF-α(图5)。此外，用比在小鼠的呼吸道中先天性免疫应答的最大诱导所需的剂量小5-10x的鞭毛蛋白剂量(1μg)实现了鞭毛蛋白的最大佐剂效果。从而，用产生有限的炎症的鞭毛蛋白剂量实现了最大的佐剂活性。
表1.用鼠疫耶尔森氏菌F1抗原和野生型鞭毛蛋白鼻内免疫导致强的抗F1 IgG应答。用10μgF1抗原和1μg野生型或者突变的鞭毛蛋白对小鼠给予两次免疫。通过ELISA测量血清抗F1 IgG效价。
实施例2鞭毛蛋白作为佐剂以产生抗原特异性乳腺癌应答乳腺瘤体内治疗。用Fra-1(在许多乳腺瘤中过表达的抗原)、鞭毛蛋白或者鞭毛蛋白的失活形式免疫BALB/c小鼠。在皮下注射一种乳腺癌肿瘤D2F2细胞前，对将小鼠一次强化。监视小鼠的肿瘤生长并测定肿瘤体积。数据在图2中显示。空心圆圈代表给予Fra-1抗原和失活形式的鞭毛蛋白的小鼠。实心圆圈代表给予Fra-1抗原和活性形式的鞭毛蛋白的小鼠。从图中显而易见，鞭毛蛋白+Fra-1抗原对肿瘤的生长具有显著影响。
评估鞭毛蛋白是否可以促进针对小鼠模型中D2F2乳腺癌细胞的保护性免疫应答。使用Fra-1作为抗原，评价鞭毛蛋白促进针对D2F2乳腺癌细胞的免疫的保护状态的能力，Fra-1是这些癌细胞过表达的一种蛋白质。这些实验包括免疫，然后用D2F2细胞攻击，以及攻击后免疫，此外，确定诱导的效应抗体对比溶细胞性T细胞和/或NK细胞的性质。
A.对纯化的重组Fra-1抗原的制备。编码编码鼠Fra-1的cDNA的pET22表达载体(由Dr.Rong Xiang(The Scripps ResearchInstitute)友情提供)，用于在Rosetta-gami-pLysS细菌中表达Fra-1蛋白质。使用Talon亲和树脂(通过Fra-1上His标签的识别)纯化蛋白质，并通过纯化的蛋白质穿过Detoxi-凝胶柱(McDermott等人(2000)Infect.Immun.685525-5529)来除去污染性内毒素。使用该方法，此前已得到了mg量的几种蛋白质(例如，鞭毛蛋白、F1抗原和IRAK-4[一种真核蛋白])。
B.评估鞭毛蛋白是否促进用Fra-1抗原和鞭毛蛋白免疫的BALB/c小鼠中对D2F2乳腺癌细胞的保护性免疫。用10μg Fra-1蛋白与或不与1μg鞭毛蛋白或者突变的鞭毛蛋白229腹膜内(i.p.)或者肌内(i.m.)免疫7只小鼠组。2周后，对小鼠进行强化，然后用1×106D2F2攻击(皮下(s.c.)给予)。跟踪肿瘤质量和小鼠存活大约3个月。不存在免疫时，约50％的小鼠在攻击后4周内死亡。测量皮下肿瘤的宽度和长度，从而可以计算肿瘤体积。如果观察到鞭毛蛋白的显著效果，那么确定产生最大应答的鞭毛蛋白的剂量。一旦建立其鞭毛蛋白的最佳剂量，就确定鞭毛蛋白是否可以促进现有肿瘤的清除。用D2F2细胞通过皮下注射攻击7只小鼠组，然后用Fra-1(与或者不与鞭毛蛋白一起)在攻击时或者1、3、7和21天后免疫。在每种情况下，2周后攻击小鼠。确定肿瘤体积和小鼠的存活。
C.鉴定针对表达Fra-1的D2F2细胞的鞭毛蛋白促进的应答中潜在的效应子。为了鉴定鞭毛蛋白促进的应答中诱导的效应子，确定循环的抗Fra-1抗体的水平，以及CD8+溶细胞性T细胞(CTL)和NK细胞的相对数目。用Fra-1和鞭毛蛋白或者突变的鞭毛蛋白，根据上述方案免疫BALB/c小鼠。
1.抗-Fra-1抗体。用D2F2细胞攻击后两周，对小鼠进行安乐死，并取血清样品用于通过ELISA分析循环的抗Fra-1抗体。使用合适的抗同种型抗体，评估循环的总IgG和IgM以及IgG1和IgG2a的水平。
2.抗-Fra-1特异性CD8+CTL。通过分离脾细胞，并用标准的51Cr释放测定法评估它们的细胞溶解活性，来确定抗Fra-1特异性CD8+CTL。CD8+CTL介导的裂解将被抗-MHC I类抗体阻断。因此，在该抗体存在和不存在下的情况下分析细胞样品。通过改变效应子与靶标的比例，得到用Fra-1和鞭毛蛋白或者突变的鞭毛蛋白免疫的小鼠中CD8+CTL的增加的相对估计。还可以针对γ干扰素(INF-γ)产生的ELISPOT测定法，来测定激活的CD8+CTL的数目。使用抗CD8MACS MicroBeads(Miltenyl Biotech)，从免疫的小鼠分离CD8+脾细胞，并将细胞与经辐射的D2F2细胞一起温育24小时。针对INF-γ的产生，通过ELISPOT测定法测定法来分析细胞。如果存在足够数目的细胞，那么将细胞内细胞因子染色(ICS)用作第二种方法。
3.NK细胞。使用YAC-I细胞作为靶标，在51Cr释放测定中评估激活的NK细胞的相对数目。从经免疫和D2F2攻击的小鼠得到脾细胞，并评估针对YAC-I细胞的细胞溶解活性。因为DX5的表达与NK细胞有关，使用可通过商业途径得到的PE标记的抗体，通过流式细胞术测量该标记的表达。鞭毛蛋白对NK细胞的扩大的刺激效果应该与DX5表达的增加有关。
含有Fra-1表位的重组鞭毛蛋白在针对D2F2乳腺癌细胞的保护性应答中的功效。进一步确定鞭毛蛋白是否可以作为疫苗载体和佐剂。如果是这样的，那么产生编码来自不同肿瘤抗原的多种表位的重组的鞭毛蛋白。
可得到的证据表明人乳腺癌在它们表达的肿瘤特异性抗原中显示出很大的异质性(heterogeneity)。例如，MAGE-3在约14％的乳腺癌中表达，而Her2/neu在约40％、NY-BR-62在60％、NY-BR-85在约90％的乳腺癌中表达(Scanlan和Jager(2001)Breast CaneerRes.395-98)。确定含有全长Fra-1抗原的重组鞭毛蛋白蛋白质是否可以与这两种蛋白质以相同的方式发挥功能。如果是这样的，那么对参与诱导保护性应答的Fra-1内的表位作图。用其它主要的乳腺癌抗原靶标进行相同的事件将是直接的工作。可以产生表达来自一系列靶抗原的表位的鞭毛蛋白蛋白质。备选地，可以使用鞭毛蛋白蛋白质的混合物-每种鞭毛蛋白表达一小组靶表位。此外，通过将外源表位导入蛋白质的高变区-不参与鞭毛蛋白与TLR5的相互作用的区域(Donnelly和Steiner(2002)J.Biol Chem.27740456-40461；Smith等人(2003)Nat.Immunol.41247-1253；Murthy等人(2004)J.BiolChem.2795667-5675)，不可能以任何显著的方式实现鞭毛蛋白的生物活性。
鞭毛蛋白Fra-1嵌合体的产生。将Fra-1完整序列插入到鞭毛蛋白的高变区并将所得构建体克隆进pET22a表达载体，并在Rosetta-gami-pLysS细菌中表达蛋白质。使用Detoxi凝胶柱除去内毒素。使用RAW264.7细胞的TNFα生产，来评估嵌合蛋白的生物活性。滴定嵌合体，并将其功效与野生型鞭毛蛋白的进行比较。
对Fra-1表位的作图需要针对D2F2细胞的保护。评价了嵌合体保护BALB/c小鼠免于D2F2细胞的攻击的能力。如果嵌合体诱导保护性免疫，那么产生Fra-1序列的重叠截短，并在鞭毛蛋白的背景中测试功效。为了减少构建体数目，制备覆盖Fra-1的完整序列的三种重叠片段。如果这些截短之一是活性的，那么产生额外的截短以界定出保护所需的最小序列。如果三种截短没有一种自身是有功能的，那么对这些进行成对测试，以确定所需的序列是否在蛋白质的不同部分。使用该方法，可以确定所需的最小序列。
实施例3鞭毛蛋白是针对鼠疫耶尔森氏菌的致死性呼吸攻击的免疫的有效粘膜佐剂方法质粒和细胞培养物。将鼠疫耶尔森氏菌的F1抗原的编码序列caf1(含有整个caf操纵子的质粒，由Dr.J.B.Bliska(State University ofNew York，Stony Brook)友情提供)亚克隆进来自Novagen(EMDBiosciences，Inc.，Madison，WI)的pET29a表达载体的NdeI和XhoI位点中。对重组的F1/V融合构建体(Heat等人(1998)Vaccine 161131-1137)(由Drs.G.Andrews和P.Worsham，USAMRIID提供)进行测序，并亚克隆进pET16b中。测序揭示不存在对应于F1的信号序列的21个氨基酸。
试剂和抗体。如以前描述的(Honko和Mizel(2004)Infect.Immun.726676-6679；McDermott等人(2000)Infect.Immun.685525-5529)制备来自肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)的经纯化的、重组的、经His标记的鞭毛蛋白。以相同的方式纯化229突变的鞭毛蛋白以及F1和F1/V抗原。如通过来自Cambrex Corporation(EastRutherford，NJ)的QCL-1000Chromogenic LAL Test Kit所检测的，内毒素水平≤1pg/μg。使用OptEIA ELISA试剂盒(mono/mono)按照生产商的使用说明(BD Biosciences)检测TNF-α。从ResearchDiagnostics，Inc.(Flanders，NJ)得到的抗-F1小鼠单克隆IgG1、克隆YPF 19用作为抗-F1 ELISA中的对照。从SouthernBiotech(Birmingham，AL)购买山羊抗小鼠IgG-HRP.从ResearchDiagnostics，Inc.(Flanders，NJ)购买山羊抗猴IgG-HRP。
小鼠。从Frederick Cancer Research and Development Center(Frederick，MD)购买雌性BALB/cAnNCr小鼠。从JacksonLaboratory(Bar Harbor，ME)购买雌性IL-6-/-小鼠(B6；129S2-I16/J)、TNFR1小鼠(tm1Kopf-/-B6；129S-Tnfrsf1a Tnfrsf1b/J)、IFNγ(tm1Imx tm1Imx-/-B6.129S7-Ifngtm1Ts/J)和对照小鼠(C57BL/6J，B6；129SF2/J和129/SvJ)。IFNα/βR-/-小鼠由Dr.C.Schindler，Columbia University，New York(Müller等人(1994)Science2641918-1921)提供。将小鼠保持于特定的无病原体的设施中，并且所有研究都遵从Wake Forest University Animal Care and UseCommittee规定的联邦和机构准则。
小鼠的非手术气管内和鼻内免疫。对于器官内免疫，将小鼠用阿佛丁(2，2，2-三溴代乙醇，Sigma；叔戊醇，Fisher)通过腹膜内注射麻醉小鼠，并将其用一定长度的线通过它们的前门牙(front incisor)对其进行悬吊。使用轻轻插入进气管、装载凝胶的无菌吸头，施用总共50μL无致热原的PBS中的10μgF1抗原和指示量的鞭毛蛋白或者鞭毛蛋白突变体229。对于鼻内施用，对经麻醉小鼠的鼻孔使用PBS中的小体积(总共9-12μL)抗原和佐剂。在4周时对小鼠进行强化，并在强化后2-3周收集血浆用于对抗体效价的分析。
对猴子的免疫。按照Wake Forest University Animal Care and UseCommittee规定的联邦和机构准则保持15只健康的成年雌性猕猴(Macaca fascicularis)。将动物用7-10m/kg氯胺酮肌内对动物进行麻醉，以用于免疫并收集血液。对于鼻内免疫，将150μgF1/V融合蛋白和50μg鞭毛蛋白逐滴递送(100μL/鼻孔)给动物，以卧位递送来进行。以1ml体积向四头肌施用肌内免疫。对照动物鼻内和肌内接受PBS。
通过酶联免疫吸附测定(ELISA)分析血浆抗体效价。用肝素化管(StatSpin；Fisher Scientific)或者BD Vacutainer PST管进行血浆收集。然后将血浆等分试样，并在-70℃冷冻直到分析．100μL抗原以无菌PBS中的10μg/mL对ELISA板进行在4℃下的过夜包被，并用PBS中的10％FCS封闭。加入一式两份或者一式三份的血浆稀释液，并在4℃过夜温育平板，接着将其与二级抗-Ig抗体在室温温育2小时。用3,3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)Liquid Substrate System(Sigma-Aldrich)检测过氧化物酶活性，并用2M H2SO4终止反应．将终点稀释效价定义为导致吸收值(OD450)比未曾进行实验的血浆的＞0.1的最高稀释度的倒数。
用鼠疫耶尔森氏菌CO92进行呼吸攻击。Centers for DiseaseControl(CDC)Division of Vector-Borne Infectious Diseases(FortCollins，CO)提供了鼠疫耶尔森氏菌CO92 biovar orientalis的原种培养物，其是从人原发性肺鼠疫的致死病例分离的一种菌株(Doll等人(1994)Am.J.Trop.Med.Hyg.51109-114)。用来自亚培养板的单个菌落接种心浸液肉汤，并在28℃培养到约1×109个菌落形成单位(cfu)/mL的密度。将小鼠用以PBS稀释到～1/8×107cfu/mL(等于1.2×104cfu的150×50％致死剂量(LD50)的剂量)的10μL培养物，对小鼠进行鼻内攻击(数据未显示)。通过在胰蛋白 (sryptose)血液琼脂板上平板接种连续稀释液，来确定实际的cfu/mL值。所有实验都根据CDC批准的关于Virginia Tech的Infectious Disease Unit的BSL3和ABSL3设施的标准操作步骤(CDC批准#C20031120-0016)进行。
统计学分析。数据以单个值表示，标有具有平均值和标准误。对方差齐(equality of variance)的F检验和斯氏单侧t检验用于给出p＜0.05或者p＜0.01时的统计学显著性。用SigmaStat3.1(SystatSoftware，Inc.，Richmond，CA)通过非线性回归确定LD50值。
结果用鞭毛蛋白免疫促进了对鼠疫耶尔森氏菌的F1抗原的有效的主动应答。为了确定鞭毛蛋白促进对于鼠疫耶尔森氏菌的F1抗原的体液免疫应答的能力，将BALB/c小鼠用10μgF1抗原和1μg重组鞭毛蛋白(FliC)气管内(i.t.)或者鼻内(i.n.)免疫．对照动物用PBS中的F1抗原或者F1和鞭毛蛋白的突变形式(称作229)免疫。4周后，以相同的方式强化小鼠并收集血浆用于分析在强化后不同时间的循环抗体效价。在对照组中没有检测到F1特异性IgG。然而，含有F1和鞭毛蛋白的疫苗刺激总IgG效价的显著增加(图1，a)，具有高水平的F1特异性IgG1和IgG2a。当i.t.施用鞭毛蛋白和F1时，IgG1与IgG2a的平均比例(条形内指出)为30-170，当i.n.给药时，为约3。尽管i.n.和i.t.免疫导致混合型Th应答，但是气管内免疫后，对表观Th2应答的偏向更明显。注意到鞭毛蛋白不促进显著的F1-特异性IgE产生是重要的。用F1和鞭毛蛋白免疫的小鼠在两次免疫后显示出抗-F1IgG的持续效价(图3，b)。在16周时的第三次免疫提高了具有较低最初效价的两只小鼠中的抗体应答。
在以前的研究中展示出在5-15μg的鞭毛蛋白剂量下，肺中对鞭毛蛋白的先天性应答是最大的(Honko和Mizel(2004)Infect.Immun.726676-6679)。为了确定在细胞因子应答和鞭毛蛋白促进的抗体应答的幅度之间是否存在线性关系，用F1抗原和1μg、5μg和15μg鞭毛蛋白免疫BALB/c小鼠(图3，c)。在这些剂量下抗-F1 IgG效价没有显著不同，表明在1μg鞭毛蛋白下佐剂效果是最大的。然而，我们注意到使用增加剂量的鞭毛蛋白时，倾向于更大的IgG1/IgG2a比。从而，似乎最大的适应性应答不需要最大的先天性应答。
当考虑到鞭毛蛋白用作佐剂时，对鞭毛蛋白的预先存在的免疫是明显受到关注的。因此，我们评价了在高效价的抗鞭毛蛋白抗体存在下，用鞭毛蛋白和F1免疫的有效性。用5μg鞭毛蛋白免疫和强化雌性BALB/c小鼠，并测定抗鞭毛蛋白抗体效价。免疫前，鞭毛蛋白特异性IgG效价低于检测水平，其显著增加，平均抗-FliC IgG效价为8.5×105。然后用10μg F1和1μgFliC鼻内免疫和强化这些小鼠。强化后2周，在未曾用于实验的和FliC免疫小鼠之间，抗-FliC IgG效价是相似的(图3，d)，表明循环的抗鞭毛蛋白抗体没有积极或者消极地改变对鞭毛蛋白的应答。我们的结果支持了如下结论在对鞭毛蛋白的先前免疫性存在下，鞭毛蛋白是有效的佐剂。
鞭毛蛋白的佐剂效果刺激抗原特异性应答并且依赖于T淋巴细胞。免疫记忆的发生是有效疫苗的基本特征，这让免疫系统准备在感染期间再次暴露于抗原后快速反应。为了评价二次免疫中对鞭毛蛋白刺激的需要，用F1抗原和鞭毛蛋白免疫四组BALB/c小鼠，并随后用PBS、仅鞭毛蛋白、仅F1抗原或者鞭毛蛋白和F1强化(图4，a)。用仅PBS或者鞭毛蛋白强化的小鼠中，F1特异性IgG效价保持在500-1100，其是首次应答后典型的值。然而，在二次免疫中仅接受F1抗原的小鼠具有显著增加的抗F1 IgG效价。尽管在强化中不需要鞭毛蛋白，但是当存在鞭毛蛋白时，抗F1抗体效价显著增加。这些发现类似于Pasare和Medzhitov(2004)Immunity 21733-741使用LPS作为佐剂所报导的结果。作者提示一旦用LPS作为佐剂建立了CD4+记忆，那么这些淋巴细胞的活化不再需要TLR刺激。尽管我们系统中的记忆应答仍然有待完全分析，但是，在用鞭毛蛋白和F1免疫的无胸腺裸鼠(BALB/cAnNCr-nu/nu)中F1特异性IgG的缺乏，表明在对该疫苗的体液应答中需要T细胞。
TNF-α、IL-6和干扰素不是鞭毛蛋白的佐剂效应所需的。此前确定了鞭毛蛋白在肺中诱导高水平的TNF-α和IL-6(实施例1；Honko和Mizel(2004)Infect.Immun.72，6676-6679)。因此，评估了这些细胞因子在鞭毛蛋白的佐剂活性中的作用。TNF-α是一种多效细胞因子，其促进树突细胞成熟(Banchereau等人(2000)Annu.Rev.Immunol.18，767-811)。如图5，a中所示，在这些小鼠中，抗F1抗体应答保持非常高，表明TNF-α不是鞭毛蛋白的佐剂效果所需的。然而，鞭毛蛋白刺激的TNF-α产生看起来能增强对F1抗原的抗体应答，因为TNFR-/-小鼠中的效价相对于野生型的B6；129小鼠减小约两倍。使用IL-6-/-小鼠评估了IL-6——一种促进B细胞增殖和分化的细胞因子(Kaminura等人(2003)Rev.Physiol Biochem.Pharmacol.1491-38)——在鞭毛蛋白的佐剂活性中的作用。用F1和FliC免疫后，这些小鼠中抗-F1 IgG的产生没有缺陷(图5，b)，表明该细胞因子也不是鞭毛蛋白的佐剂效果必需的。
在体外，通过经由功能性TLR5/4异源复合体的信号传递，鞭毛蛋白刺激一氧化氮和β干扰素(IFN-β)的产生(Mizel et al.(2003)J.Immunol.1706217-6223)。C3H/HeJ小鼠具有非功能的突变TLR4(Poltorak等人(1998)Science 2822085-2088)，这提供了分离体内TLR5/4异数(heterometric)和TLR5/5同数(hemometric)信号传递效果的模型。在肺中，对TNF-α、IL-6、G-CSF(粒细胞集落刺激因子)、角质形成细胞衍生趋化因子(KC)、巨噬细胞炎症蛋白2(MIP-2)和MIP-1α的经鞭毛蛋白刺激的产生在C3H/HeJ小鼠中未受破坏(实施例1；Honko和Mizel(2004)Infect.Immun.726676-6679)；然而，没有对干扰素产生加以评估。已提出I型IFN通过刺激MHC和抗原呈递细胞上的共刺激分子的上调，从而将先天性和适应性免疫应答联系起来(Le Bon和Tough(2002)Curr.Opin.Immunol14432-436)。为了确定TLR5/4信号传递对鞭毛蛋白的佐剂效果的影响，用F1抗原和鞭毛蛋白免疫后，将C3H/HeJ小鼠中的抗-F1抗体效价与它们的野生型副本C3H/HeN小鼠比较(图5，c)。由于抗体产生中没有缺陷，通过TLR5/4复合体的信号传递不是鞭毛蛋白的佐剂效果所需的。通过确定缺少I型干扰素信号传递(IFNα/βR-/-)或者产生γ干扰素(IFNγ/-)的能力的小鼠中的抗体应答，直接评估干扰素在鞭毛蛋白的佐剂活性中的作用(图5，d和e)。由于两种品系的小鼠都以与用F1抗原和鞭毛蛋白免疫的野生型小鼠相似的方式应答，所以干扰素不是鞭毛蛋白的佐剂效果所需的。
鞭毛蛋白促进对鼠疫耶尔森氏菌CO92的鼻内攻击的保护性应答。对疫苗的基本测试是提供对病原体攻击的保护能力。作为针对呼吸感染的模型，用毒性鼠疫耶尔森氏菌CO92对经免疫的和对照小鼠进行鼻内攻击。为了确保诱导足够保护的接种，基于NIAID和FDA(2004年10月13-14日)发起的最近的Plague Vaccine Workshop的推荐，选用是鼠疫耶尔森氏菌的鼻内感染的50％致死剂量(LD50)的约150倍的攻击剂量。用等于100×LD50的剂量攻击后，用鞭毛蛋白和F1鼻内免疫和强化的BALB/c小鼠具有93％的存活率，相比之下，对照组中仅为7％(图6，a)。用B细胞缺陷的IgH-/-小鼠来评价保护性应答的B细胞/抗体依赖性(图6，b)。在约150×LD50的剂量下，所有对照和经免疫小鼠都死于鼠疫耶尔森氏菌感染，表明在该攻击剂量下的保护是B细胞介导的，并且从而可能是抗体介导的。以前，Elvin等人使用具有缺陷的IL-12和IFN-γ介导的细胞免疫应答的Stat4-/-动物，检查了1型效应子功能在保护免疫鼠疫耶尔森氏菌感染中的作用(Elvin和Williamson(2004)Microb.Patho.37177-184)。而免疫的Stat4-/-小鼠与它们的野生型副本产生类似水平的抗-F1和抗VIgG，这些动物对于高剂量攻击受到的保护较弱。为了处理我们的系统中鼻内攻击后IFN-γ介导的保护的作用，用F1抗原和鞭毛蛋白对IFN-γ-/-和野生型C57BL/6小鼠组进行免疫和强化后，用150×LD50鼠疫耶尔森氏菌攻击。野生型C57BL/6小鼠受到鞭毛蛋白和F1的鼻内免疫的完全保护，相比之下，仅10％对照受到保护(图6，c)。经免疫的IFN-γ-/-小鼠在攻击后具有80％存活(图6，d)，表明IFN-γ介导的应答不是保护所需的。由于这些动物具有高效价的抗-F1 IgG，所以这些结果证实了F1特异性抗体在保护免于鼠疫耶尔森氏菌感染中的重要性，并且支持了利用循环IgG效价作为保护功效的相关物的用途。两只IFN-γ-/-小鼠死于感染这一观察提示IFN-γ可能增加对鼠疫耶尔森氏菌的抗体介导的保护，这可能是通过促进吞噬细胞中的呼吸爆发来实现的。
鞭毛蛋白是非人灵长类中的有效佐剂。考虑到鞭毛蛋白促进鼠模型中适应性免疫应答的能力，我们接下来评估了鞭毛蛋白作为非人灵长类中佐剂的有效性。用由鼠疫耶尔森氏菌的F1和V抗原组成的重组融合蛋白免疫雌性猕猴。用150μgF1/V融合蛋白和50μg鞭毛蛋白对6只猕猴组进行鼻内或者肌内(i.m.)免疫。额外的对照动物(n＝3)通过两种途径接受PBS。免疫前，猴子显示出约9.8×104的抗鞭毛蛋白抗体效价。在免疫后的前24小时内，用鞭毛蛋白免疫的猴子不显示出体温或者血浆TNF-α水平的改变，并且在注射部位没有不发生可观察到的炎症。在4周以相同的方式强化动物，并在2周后确定血浆抗-F1/V IgG效价(图7)。经免疫的猴子显示出F1/V特异性抗体效价的显著增加。没有检测到抗原特异性IgE。这些结果清楚地表明鞭毛蛋白是在非人灵长类动物中发生抗体应答的有效佐剂，即使存在循环的抗鞭毛蛋白抗体的情况下也是如此。
实施例4鼠疫耶尔森氏菌抗原和疫苗以与实施例2相似的方式，用鼠疫耶尔森氏菌V抗原、鼠疫耶尔森氏菌F1抗原或者其融合肽，产生了用于诱导对鼠疫耶尔森氏菌的免疫应答的融合蛋白。此类融合蛋白可以用于诱导免疫应答，任选地保护性免疫应答，如本文所述。任选地，应答是粘膜免疫应答。合适的融合蛋白的特定非限制性例子为
例子AfliC/F1/V氨基酸序列(SEQ ID NO1)1 MAQVINTNSL SLLTQNNLNK SQSSLSSAIE RLSSGLRINS AKDDAAGQAI51 ANRFTSNIKG LTQASRNAND GISIAQTTEG ALNEINNNLQ RVRELSVQAT101 NGTNSDSDLK SIQDEIQQRL EEIDRVSNQT QFNGVKVLSQ DNQMKIQVGA151 NDGETITIDL QKIDVKSLGL DGFNVNGPKE ATVGDLKSSF KNVTGRSMAD201 LTASTTATAT LVEPARITLT YKEGAPITIM DNGNIDTELL VGTLTLGGYK251 TGTTSTSVNF TDAAGDPMYL TFTSQDGNNH QFTTKVIGKD SRDFDISPKV301 NGENLVGDDV VLATGSQDFF VRSIGSKGGK LAAGKYTDAV TVTVSNQGSI351 EGRNRAYEQN PQHFIEDLEK VRVEQLTGHG SSVLEELVQL VKDKNIDISI401 KYDPRKDSEV FANRVITDDI ELLKKILAYF LPEDAILKGG HYDNQLQNGI451 KRVKEFLESS PNTQWELRAF MAVMHFSLTA DRIDDDILKV IVDSMNHHGD501 ARSKLREELA ELTAELKIYS VIQAEINKHL SSSGTINIHD KSINLMDKNL551 YGYTDEEIFK ASAEYKILEK MPQTTIQVDG SEKKIVSIKD FLGSENKRTG601 ALGNLKNSYS YNKDNNELSH FATTCSDKSR PLNDLVSQKT TQLSDITSRF651 NSAIEALNRF IQKYDSVMQR LLDDTSGKRSATGDKITLAG KTMFIDKTAS701 GVSTLINEDA AAAKKSTANP LASIDSALSK VDAVRSSLGA IQNRFDSAIT751 NLGNTVTNLN SARSRIEDAD YATEVSNMSK AQILQQAGTS VLAQANQVPQ801 NVLSLLRLEH HHHHH*例子BFliC/F1氨基酸序列(SEQ ID NO2)1 MAQVINTNSL SLLTQNNLNK SQSSLSSAIE RLSSGLRINS AKDDAAGQAI51 ANRFTSNIKG LTQASRNAND GISIAQTTEG ALNEINNNLQ RVRELSVQAT101 NGTNSDSDLK SIQDEIQQRL EEIDRVSNQT QFNGVKVLSQ DNQMKIQVGA151 NDGETITIDL QKIDVKSLGL DGFNVNGPKE ATVGDLKSSF KNVTGRSMAD201 LTASTTATAT LVEPARITLT YKEGAPITIM DNGNIDTELL VGTLTLGGYK251 TGTTSTSVNF TDAAGDPMYL TFTSQDGNNH QFTTKVIGKD SRDFDISPKV301 NGENLVGDDV VLATGSQDFF VRSIGSKGGK LAAGKYTDAV TVTVSNQRSA351TGDKITLAGK TMFIDKTASG VSTLINEDAA AAKKSTANPL ASIDSALSKV401 DAVRSSLGAI QNRFDSAITN LGNTVTNLNS ARSRIEDADY ATEVSNMSKA451 QILQQAGTSV LAQANQVPQN VLSLLRLEHH HHHH*
例子CFliC/V氨基酸序列(SEQ ID NO3)1 MAQVINTNSL SLLTQNNLNK SQSSLSSAIE RLSSGLRINS AKDDAAGQAI51 ANRFTSNIKG LTQASRNAND GISIAQTTEG ALNEINNNLQ RVRELSVQAT101 NGTNSDSDLK SIQDEIQQRL EEIDRVSNQT QFNGVKVLSQ DNQMKIQVGA151 NDGETITIDL QKIDVKSLGL DGFNVNGPKE ATVGDLKSSF KNVTGRSMIR201 AYEQNPQHFI EDLEKVRVEQ LTGHGSSVLE ELVQLVKDKN IDISIKYDPR251 KDSEVFANRV ITDDIELLKK ILAYFLPEDA ILKGGHYDNQ LQNGIKRVKE301 FLESSPNTQW ELRAFMAVMH FSLTADRIDD DILKVIVDSM NHHGDARSKL351 REELAELTAE LKIYSVIQAE INKHLSSSGT INIHDKSINL MDKNLYGYTD401 EEIFKASAEY KILEKMPQTT IQVDGSEKKI VSIKDFLGSE NKRTGALGNL451 KNSYSYNKDN NELSHFATTC SDKSRPLNDL VSQKTTQLSD ITSRFNSAIE501 ALNRFIQKYD SVMQRLLDDT SGKRSATGDKITLAGKTMFI DKTASGVSTL551 INEDAAAAKK STANPLASID SALSKVDAVR SSLGAIQNRF DSAITNLGNT601 VTNLNSARSR IEDADYATEV SNMSKAQILQ QAGTSVLAQA NQVPQNVLSL651 LRLEHHHHHH*注释FliC从肠炎沙门氏菌得到。在这些融合蛋白的每一种中，FliC的N-末端恒定区在氨基酸残基198处结束，C末端恒定区(以粗体和下划线表示的前7个氨基酸)在例子A(SEQ ID NO1)的氨基酸残基679处开始，例子B(SEQ ID NO2)的氨基酸残基348处开始，在例子C(SEQ ID NO3)的氨基酸残基524处开始。
实施例5含有鞭毛蛋白和鼠疫耶尔森氏菌的F1和V抗原的融合肽的生物活性为了制备编码作为单种蛋白质的鞭毛蛋白和鼠疫耶尔森氏菌F1和V抗原的表达质粒，除去编码肠炎沙门氏菌鞭毛蛋白的高变区的核苷酸序列的大部分，并用串联的F1和V序列替代，所述F1和V序列由编码6个氨基酸的8核苷酸桥分开(见上面的例子A，SEQ ID NO1)。在BL21细胞中产生重组蛋白质，并通过在金属亲和树脂上亲和层析纯化。使用Acrodisc层析滤器除去内毒素和污染性核酸。为了确定所得蛋白质是否保留鞭毛蛋白活性，将TLR5-阴性和TLR5-阳性RAW264.7细胞与三融合蛋白温育，并确定肿瘤坏死因子α产生的程度。TLR5-阴性RAW细胞用于控制可能在该测定中具有影响的任何污染性因子。如图8中所示，含有鞭毛蛋白和鼠疫耶尔森氏菌F1和V蛋白的融合蛋白在TLR5-阳性细胞中保留了鞭毛蛋白生物活性。该蛋白质在TLR5-阴性RAW264.7细胞中不传递信号。
将Toll-样受体5(TLR5)阴性RAW264.7细胞或者TLR5-阳性RAW264.7细胞(通过用编码TLR5-增强的黄色荧光蛋白的构建体稳定转染RAW264.7细胞产生的细胞系)与增加浓度的编码鞭毛蛋白和鼠疫耶尔森氏菌F1和V蛋白的融合蛋白温育4小时，然后通过ELISA测定培养基的TNF-α含量。
为了确定鞭毛蛋白+F1+V或者含有所有三种组分的单种蛋白质是否能针对鼠疫耶尔森氏菌CO92的致死攻击提供保护，仅用磷酸缓冲盐水(PBS)或者含有三种蛋白质-1mg鞭毛蛋白+5mg每种F1和V的疫苗或者含有包含鞭毛蛋白、F1和V的一种蛋白质(鞭毛蛋白/F1/V；10mg)的疫苗免疫和强化C3H/HeJ小鼠。在4周后用相同的方案强化小鼠，然后用约150 LD50的鼠疫耶尔森氏菌CO92进行攻击。在攻击前对小鼠取血并通过ELISA确定抗-F1 IgG效价。如表2中所示，鞭毛蛋白+鼠疫耶尔森氏菌的F1和V抗原或者含有鞭毛蛋白和鼠疫耶尔森氏菌的F1和V抗原的融合蛋白提供了对鼠疫耶尔森氏菌的致死性呼吸攻击的完全保护。
表2.用鞭毛蛋白+鼠疫耶尔森氏菌的F1和V抗原或者含有鞭毛蛋白和鼠疫耶尔森氏菌的F1和V抗原的融合蛋白免疫的小鼠对鼠疫耶尔森氏菌的致死性呼吸攻击的保护研究结果上文阐明了本发明，并且不作为本发明的限制。本发明通过下面的权利要求来限定，其中包括权利要求的等同方案。
权利要求
1.融合蛋白，其包含(a)鞭毛蛋白佐剂，该鞭毛蛋白佐剂包含(i)鞭毛蛋白N-末端恒定区；和(ii)鞭毛蛋白C-末端恒定区；和(b)在N-末端恒定区和C-末端恒定区之间的肿瘤抗原。
2.权利要求1的融合蛋白，其中所述鞭毛蛋白佐剂包含缺失的鞭毛蛋白高变区，或者所述鞭毛蛋白佐剂中不存在鞭毛蛋白高变区。
3.权利要求1的融合蛋白，其中所述肿瘤抗原插入在(i)高变区内，(ii)鞭毛蛋白N-末端恒定区和高变区之间，或者(iii)鞭毛蛋白C-末端恒定区和高变区之间。
4.权利要求1的融合蛋白，其中肿瘤抗原是乳腺肿瘤抗原。
5.权利要求1的融合蛋白，其中肿瘤抗原是癌/睾丸抗原。
6.编码权利要求1的融合蛋白的核酸。
7.包含权利要求6的核酸的载体。
8.包含权利要求6的核酸或者权利要求7的载体的宿主细胞。
9.制备权利要求1的融合蛋白的方法，该方法包括在足够产生所述融合蛋白的条件下，在培养基中培养权利要求8的宿主细胞。
10.权利要求9的方法，其中从宿主细胞或者培养基收集融合蛋白。
11.免疫原性组合物，其包含处于可药用载体中的、权利要求1的融合蛋白。
12.在哺乳动物受试者中产生针对肿瘤抗原的免疫应答的方法，该方法包括以在该哺乳动物受试者中有效产生针对所述肿瘤抗原的免疫应答的量对所述哺乳动物受试者施用权利要求1的融合蛋白或者权利要求11的免疫原性组合物。
13.治疗哺乳动物受试者中肿瘤的方法，该方法包括以治疗有效量对该哺乳动物受试者施用权利要求1的融合蛋白或者权利要求11的免疫原性组合物。
14.权利要求13的方法，其中所述肿瘤是乳腺肿瘤。
15.免疫原性组合物，其包含可药用载体中的(a)鞭毛蛋白佐剂；和(b)肿瘤抗原。
16.权利要求15的免疫原性组合物，其中所述肿瘤抗原是乳腺肿瘤抗原。
17.权利要求15的免疫原性组合物，其中所述肿瘤抗原是癌/睾丸抗原。
18.权利要求17的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含两种或多种癌/睾丸抗原。
19.权利要求15的免疫原性组合物，其中所述肿瘤抗原与鞭毛蛋白佐剂偶联。
20.在哺乳动物受试者中产生针对肿瘤抗原的免疫应答的方法，该方法包括以在该哺乳动物受试者中产生针对肿瘤抗原的免疫应答有效的量对所述哺乳动物受试者施用权利要求15的免疫原性组合物。
21.治疗哺乳动物受试者中肿瘤的方法，该方法包括以治疗有效量对该哺乳动物受试者施用权利要求15的免疫原性组合物。
22.权利要求21的方法，其中所述肿瘤是乳腺肿瘤。
全文摘要
本发明提供了包含鞭毛蛋白佐剂和肿瘤抗原的融合蛋白。本发明还提供了包含鞭毛蛋白佐剂和肿瘤抗原的组合物。本发明还提供了用于诱导针对肿瘤抗原的免疫应答的药物制剂和方法和治疗受试者中肿瘤的方法。
文档编号A61K39/02GK101094686SQ200580045667
公开日2007年12月26日 申请日期2005年12月16日 优先权日2004年12月16日
发明者S·B·米策尔 申请人:韦克福里斯特大学健康科学院