病毒体的冷冻干燥的制作方法

专利名称：病毒体的冷冻干燥的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于病毒体的高效冷冻干燥和重建的组合物和方法。
背景技术：
冷冻干燥或"冻干"是用于去除水分的技术方法。其中，含水溶 液在其共晶点以下被冷却，直至其完全被冷冻。之后，将大气压力降 至真空，使得水升华并从溶液中脱出。被溶解的因子保持为多孔固体， 之后其可再次溶于水。冻干产生具有巨大表面积的固体，导致高的水 溶性。
冷冻干燥在制药学应用中得到广泛使用，因为绝大多数医药品在 溶液中具有有限的储存期。通过冻干剂的生产可显著提高其储存期， 所述冻干剂在使用前在适当的溶剂中快速溶解。尽管已证明冷冻干燥 是当前普遍使用的优良的保藏技术，但是其也具有本质的缺点。这些 缺点主要与冷冻和重建过程相关联，其经常对生物活性因子或组合物 有害。为保持功能性和活性，发展了不同的技术，特别是包括例如糖 如蔗糖和海藻糖的防冻剂的使用。
脂质体和病毒体作为药物递送载体具有突出的特点。但是脂质体
是球形脂质嚢，病毒体是不含有原始病毒感染遗传物质的病毒包膜。 脂质体和病毒体的区别在于病毒体在其表面含有使其成为融合活性 颗粒的额外蛋白，而脂质体是非活性载体。
因此，病毒体是现代疫苗接种中高度有效的佐剂/载体系统，具有 作为抗原递送载体的优良特性和强大的免疫原性潜能，同时伴随着最 小化的副作用危险。
当前，病毒体已被有效应用于许多疫苗。例如，可商业化获得的 抗甲肝病毒和流感病毒疫苗使用病毒体作为佐剂和安全的抗原递送 载体。由接种重建在病毒体内的抗原所引发的抗体显示出对其赖 发的抗原的高亲合性。
脂质体的冻干可以防止储存期间磷脂的水解和嚢泡的物理降解。 另外，其可帮助稳定整合在脂质体中的物质。脂质体制剂的冻干形成 干块，其可在数分钟内重建以获得最初的分散体，即，如果使用合适 的赋形剂，以及如果应用合适的冻千条件。另一方面，冻干方法本身 可以引起脂质体的物理变化，例如被灌嚢因子的丟失及嚢泡大小的改 变。这种损伤的出现并不惊奇，因为亲水的磷脂头部基团和水分子之 间的相互作用在脂质体双层形成中扮演关键的角色。因此，通过冻干 从脂质体中去除水是令人激动的挑战。另外，冻干是耗时和耗能的方 法，其确实需要一些专门技术以防止具体的缺陷。有幸的是，赋形剂， 例如双糖，在冷冻(冷冻干燥)过程中保护脂质体已得到确定，并且
冻干技术在文献中已得到广泛描述(Pikal等人.，1990， Int. J. Pharm. Sci. (国际制药科学杂志)60,203;Pikal， 1990,Biopharm(生物制药)10, 18; Essig等人.，1993， "Lyophilization (冷冻干燥)"，Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft, Stuttgart ; Jenning, 1999， "Lyophilization: Introduction and basic principles (〗令冻、干燥入门及基本原、J里)", Interpharm Press (国际制药学出版社)，Englewood， CO )。
冷冻干燥保护剂通过以下保护脂质体(1)阻止脂质体的融合， (2)阻止冰晶对双分子层的破坏，以及(3)在无水时保持双分子层 的完整性。为此，冷冻干燥保护剂必须在脂质体内和周围形成无定形 的玻璃状基质。冷冻千燥保护剂和磷脂头部基团之间的相互作用被认 为对阻止脂质体在重水合过程中的漏出特别重要，所述脂质体具有在 室温下呈水合状态的液-晶双分子层。
可以鉴别出有关冷冻的不同类型的脂质体制剂(1)空脂质体， 用要被灌嚢的化合物的溶液重建该脂质体，(2)承载与双分子层有力 相联的化合物的脂质体，以及(3)含有不与双层相互作用的水溶性 化合物的脂质体。第三种代表了最大的挑战，因为需要既阻止被灌嚢 溶质的漏出又保持脂质体大小。当确定脂质体对冻干压力的抗力时， 双分子层的组分是极为重要的因素，但是目前难于从文献中总结出一 般原则，因为涉及了许多的其它参数，包括冷冻干燥方法的条件，冷
冻干燥保护剂的选择，和嚢泡的大小。
如上文所描述，已证实脂质体的冷冻干燥至多是条件苛刻，但是 病毒体的冷冻干燥面对更大的问题。与脂质体相比，是由于包膜内承 担病毒体融合活性的额外的蛋白。因为蛋白对冻干带来的引起活性显 著丟失的压力极为易感。
因此，存在着对克服与融合活性分子即病毒体的高效冷冻千燥及 重建相关的问题的组合物和方法的需求。

发明内容
本发明提供了用于制备高度冷冻干燥压力抗性的、可水合的病毒 体冷冻干燥制剂的生物活性组合物和方法，及其重建的方法。根据本 发明，生物活性组合物是指含有病毒体和用于高效冷冻干燥和重建病 毒体的阳离子脂质的免疫原性组合物或药物组合物，并且特别是指免 疫原性组合物或药物组合物，其中用于高效冷冻干燥和重建病毒体的 阳离子脂质存在于病毒体的膜中。
使用本发明的教导，可以获得具有突出冷冻干燥和重建特性并且
特别有助于递送抗原、药物和包括DNA、 RNA、 siRNA在内的其它 药物活性物质进入细胞的病毒体。冷冻干燥后，其仍可以通过靶向系 统递送所述物质到特定的细胞，其识别特定细胞类型的表面标记，并 且因此特别优越于其它已知的递送系统。
在一优选实施方案中，使用的阳离子脂质体为阳离子胆固醇书亍生物。
在本发明的另 一实施方案中，所述胆固醇衍生物由以下通式表
示
(I)其中R选自R'; R'- (OO)-; R'-O- (OO)-; R'画NH- (OO) -; R'画O-(C=0) -R"- (C=0) -; R'- NH-(C=0)-R"-(C=0)-，其中R'为被至少一个阳性荷电基团取代的d-CV烷基，优选地是 通式1^112113:^+-的含1^基团，并且各自的反离子是x-;其中Ri， R2和R3相互独立地选自氢和d-CV烷基；其中x-选自卣素、硫酸氢根、磺酸根、磷酸二氩根、醋酸根、三 卤醋酸根和碳酸氢根；以及其中R"是d-CV亚烃基。根据本发明，为d-CV亚烃基的R"代表饱和的CrQ-亚烃基部分， 其可为-CH2-， -(CH2)2-等，也可以代表支链例如-CH(CH3)-(CH2)2-等。在一个进一步的实施方案中，所述胆固醇衍生物由通式n表示(I工)其中，RhR2和R3可相互独立地选自氬和d-CV烷基，并且其中X—是鹵素阴离子。在另一个实施方案中，所述阳离子脂质由通式II表示，其中R4和R2是甲基，R3是氢，并且X-是卣素阴离子，优选地是氯离子，即 3 (3 [N-(N',N'-二甲氨基乙基)-氨甲酰基]胆固醇氯化物(DC-Chol )。在 另一个最优选的实施方案中，所述阳离子脂质由式II表示，R4、 R2 和R3是甲基，并且X-是卣素阴离子，优选地是氯离子，即3(3[N-(N', N', N'-三甲氨基乙基)-氨甲酰基]胆固醇氯化物(TC-Chol)。本发明的病毒体是向细胞递送生物活性物质的融合活性载体，所 述生物活性物质选自药物因子和细胞的抗原分子。特别是，本发明的 病毒体是抗原递送载体，可以引发对靶抗原的免疫应答，或者是药物 递送载体，将药物递送至细胞，并且，由于其膜组分适于冷冻干燥。 在一个高度优选的实施方案中，病毒体是免疫增强的重建的流感病毒 体(IRIVs )。本发明的病毒体膜组合物优选地包括相对病毒体膜的总脂含量 的1.9和37mol。/。之间的DC-Chol或TC-Chol。在一个高度优选的实 施方案中，膜中的DC-Chol或TC-Chol含量在病毒体膜的总脂含量的 1.9和16mol。/。之间。膜的其余脂含量优选地由磷脂组成，最优选地， 以比例4: 1的磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺。另外，病毒体膜可以含 有足以保证病毒体的融合活性的一定量的血细胞凝集素。在本发明的一个实施方案中，组合物可以另外包括所需要的生物 活性物质，所述生物活性物质选自冷冻干燥前的溶液中的药物因子和 抗原分子。在另一个实施方案中，所选择的药物因子或抗原可在重建 步骤前加至冻千剂中，或者在冷冻干燥后在重建步骤中与流体溶剂一 起加入，即溶解于其中。在一个进一步的实施方案中，本发明的组合物可以进一步包括冷 冻干燥保护剂，例如蔗糖，或佐剂，或佐剂系统。本发明也包括上述提及的病毒体组合物的冷冻干燥和重建方法 和由其获得的冻干剂。另外，本发明组合物在制造用于接种和免疫受试对象的药物中的 应用也将成为本发明的一部分。最优选的受试对象是人。另外，本发明还包括试剂盒。所述试剂盒包括使用本发明的冷冻 千燥方法获得的冻干剂。进一步而言，所述试剂盒可进一步包括重建 溶剂和选自药物因子和抗原分子的所述生物活性物质，只要所述生物 活性物质并没有成为冻干剂组合物的一部分。在一个实施方案中，在 重建病毒体冻干剂之前，药物因子或抗原分子将在重建溶剂中溶解。所述试剂盒提供易于制备例如用于疫苗接种的，带所选靶抗原的 免疫原性组合物的装置，并且同时提供了延长的储存期和优良的储存 和操作性能。另外，如上所述阳离子脂质在促进病毒体的免疫原性上的应用也 是本发明的一部分。


图l显示了 FRET分析测量的具有不同的膜组合物的IRIVs在冷 冻干燥之前和之后的融合活性(见实施例9)。被比较的是不含脂质的 IRIVs (A )，含DC画Chol的IRIVs (B )，含DOTAP的IRIVs ( C )和 含DHAB的IRIVs (D )。图2显示了用在病毒体表面含AMA49-CPE肽的IRIV DC-Choi免 疫的小鼠血清ELISA (见实施例21)。被比较的是冷冻干燥前的 AMA49- IRIV- DC-Choi,冷冻干燥后用水重建的AMA49- IRIV-DC-Chol,冷冻干燥后用AMA49-CPE肽重建的IRIV-DC-Chol和 AMA49-IRIV对照血清。图3显示了用在病毒体内含HLA结合肽的IRIV- DC-Chol免疫的 小鼠的CTL实验(见实施例20)。被比较的是用水，200|ig/ml和650 吗/ml的HLA结合肽重建的DC-Choi- IRIV。
具体实施方式
本发明公开了用于冷冻干燥和重建病毒体的生物活性组合物和 方法。为达到对本发明病毒体融合活性的保持，本文公开了具体的膜
组合物。这些组合物是本发明的一部分，并且同时包括磷脂和病毒蛋 白红细胞凝集素阳离子脂质，以给本发明病毒体提供优良的冻干压抗 性。阳离子脂质本发明涉及一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括病毒 体和用于所述病毒体高效冷冻干燥和重建的阳离子脂质，并且，具体 地，涉及一种免疫原性组合物，其中用于病毒体高效冷冻干燥和重建 的阳离子脂质存在于所述病毒体的膜中。在本发明的一个优选实施例中，用作完整膜成分的阳离子脂质为DOTMA， DOTAP， DPPES, DOGS, DOSPA, DOSPER, THDOB， DOPA， DOTP， DOSC， DOTB, DOPC， DOPE以及优选地为月旦固醇衍生物。优选的胆固醇衍生物由下式表示H(工)其中，R选自R'; R'- (C=0)-; R'-O画(OO)-; R'-NH國(OO) -; R'-O-(OO) -R"- (C=0) -; R'- NH-(C=0)-R"-(O0)-，其中R'为被至少一个阳性荷电基团取代的d-CV烷基，优选地是 通式1^112113>^-的含>^基团，并且各自的反离子是X;其中R4， R2和R3相互独立地选自氬和C广C6-烷基；其中x-选自面素、硫酸氢根、磺酸根、磷酸二氢根、醋g吏根、三 卣醋酸根和碳酸氬根；以及其中R"是CVC6-亚烃基。根据本发明，作为CrQ亚烃基的R"代表饱和的d-C6亚烃基部
分，该部分可以是-CH2-, -(012)2-等，也可以以支链例如-CH(CH3) -(CH2) 2-等出现。在一个更优选的实施方案中，所述胆固醇衍生物由通式II表示H3C//,,(II)其中，R" R2和Rs相互独立地选自氢和Q-C6-烷基，并且其中 X—是卤素阴离子。在一个最优选的实施方案中，阳离子脂质由通式II表示，&和 R2为曱基，R3为氢，并且X-为卤素阴离子，优选地为氯离子，以产 生3(3[N-(N',N'-二曱氨基乙基)-氨甲酰基]胆固醇氯化物(DC-Chol)。在另 一个最优选的实施方案中，所述阳离子脂质由通式II表示，R2和R3为甲基，且X-为卣素阴离子，优选地为氯离子，以产生 3p[N-(N'，N', N'-三甲氨基乙基)-氨曱酰基]胆固醇氯化物(TC-Chol)。 发现DC-Chol和TC-Chol在保持冷冻干燥和重建后的病毒体融合活性 方面显示了优良的性能。 病毒体病毒体是病毒的包膜，不包括原始病毒感染性的遗传物质。如脂 质体一样，病毒体可以用于递送治疗性物质给多种种类的细胞和组 织，但是与脂质体不同的是，病毒体提供了在高效进入细胞上的优势， 进入细胞后紧接着是由病毒的融合蛋白激发的病毒体内容物的细胞 内释放。更进一步，由于有活性的病毒融合蛋白整合入其膜中，病毒 体在被细胞摄入后立即释;^文其内容物进入细胞质，因此阻止了治疗性
物质在内涵体酸性环境中的降解。病毒体可以进一步^^同时加上几种不同的B细胞和T细胞抗原决定簇(Poltl-Frank等人.，1999, Clin. Exp. Immunol (临床实验免疫学).117:496; Moreno等人.，1993, J. Immunol (免疫学杂志).151:489),包括通常的T辅助细胞抗原决定簇(Kumar 等人.，1992, J. Immunol (免疫学杂志).148: 1499-1505 )以及本领域 技术人员已知的其它抗原决定簇。因此，病毒体是现代疫苗的高效佐 剂，具有作为抗原递送载体的优良性质和强烈的免疫潜能，同时还可 最小化副作用风险。在本发明中，^Hf了生物活性组合物，所述生物活性组合物包4舌 选自药物因子和抗原分子的生物活性物质，所述生物活性物质被整合 入称为免疫增强的重建流感病毒体(IRIVs)的合成球状病毒体中。 IRIVs是具有150nm的平均直径的球状单层载体，并包括双脂质膜， 其主要由磷脂，优选为磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)组 成。与脂质体相比，IRIVs含有插入磷脂双分子膜中的功能性的病毒 包膜糖蛋白红细胞凝集素(HA)和神经氨酸酶(NA)。生物活性HA 不仅仅带来结构稳定性和病毒体制剂的均一性，还通过保持病毒的融 合活性而显著有助于免疫特性。根据本发明，所述生物活性组合物能够递送生物活性物质至有机 体的细胞空间内。所述生物活性物质选自药物因子和抗原分子，其优 选地选自DNA, RNA, siRNA,蛋白质，肽，氨基酸，药物，药物前体 和药物活性物质或其衍生物。生物活性物质优选地是药物，抗原或其 混合物。药物因子的例子选自下列物质麻醉剂，血管生成抑制剂，抗痤 疮制剂，抗过敏剂，局部使用的抗生素和化学治疗物，抗组胺剂，抗 炎症药物/抗感染药物，抗肺瘤药物，抗原，抗原生动物药物，抗风湿 药物，抗病毒疫苗，抗病毒药物，抗凋亡药物，细菌疫苗，〗匕学治疗 药物，细胞生长抑制剂，免疫抑制剂，松弛剂和精神抑制药物。药物 或免疫活性物质的优选例子是阿霉素，长春碱，顺铂，甲氨蝶呤，环 孢素，布洛芬。术语"抗原分子"是指所需免疫应答所依赖的分子。该分子可以 选自但不限于肽，蛋白质，脂质，单、寡聚和多聚糖，糖肽，糖类， 脂肽，细菌或病毒病原和毒素，其它小免疫分子和编码这些分子的DNA/RNA。"免疫原性"是指分子在接种该分子的有机体内引发免疫 应答的能力。抗原分子的例子是基于肽的T细胞抗原和B细胞抗原。 抗原分子的优选例子是基于HCV的T细胞抗原，肺瘤相关抗原，百 日咳毒素，霍乱毒素和痴疾，RSV,阿兹海默(Alzheimer)(特别是 P淀粉样)肽抗原。对于本发明的肿瘤治疗应用而言，任何化学治疗药物将适宜于通 过病毒体包嚢化。本发明的方法和组合物进一步适宜借助于将物质耙 向递送至特定细胞和组织的任何治疗相关的应用。这样的应用可以包 括抗肺瘤药物到肺瘤细胞，抗病毒药物到感染细胞和组织，抗微生物 药物和抗炎症药物到受侵袭组织的靶向递送，以及治疗剂向受特定疾 病侵袭的那些器官和组织的递送，因此增加了治疗药物的治疗指数， 并避免系统毒性。例如，在肺瘤治疗中，阿霉素， 一种蒽环类的抗肿 瘤抗生素可以通过本发明方法和组合物进4亍递送。蒽环类抗生素具有 广谱的抗肿瘤活性，及对细胞施加多向性的影响。尽管它们是经典的 DNA插入剂，其细胞毒性的机制被认为是涉及到与拓朴异构酶II的 相互作用，双链DNA突变的产生，及可能涉及到高细胞毒性的细胞 内自由基的产生，因此，结合的病毒体可以载有阿霉素以选择性和有 效性地抑制所构建的过度表达的rNeu乳腺癌的肿瘤进程。目前病毒体已被有效用于各种疫苗。例如，可商业化获取的抗曱 肝病毒和流感病毒的疫苗。病毒体,皮证明是优异和安全的佐剂/载体系 统。由在病毒体中重建的抗原接种引发的抗体显示出对其赖以引发的 抗原的高度亲合性。被单独注射的大多数肽抗原显示较低的免疫原性。但是采以与抗 原和病毒体结合的形式，可产生能够测量得到的高度特异性的抗体对抗原的滴度。抗原肽可以经病毒体递送，既可以位于病毒体表面上也 可以被包嚢入病毒体中。区别在于免疫应答的类型。当病毒体在内吞 作用后与内涵体融合时，它们的内容物，包括被包嚢的抗原被释放入 细胞质。在细胞质中，所述内容物被加工并与MHC I型分子复合一皮递呈在细胞表面，引发细胞的CD8+细胞介导的细胞毒性免疫应答。 与该机制相对照，表面抗原被B细胞识别和内吞，所述B细胞将其与 MHC II型分子复合递呈，并且因此引发了体液免疫应答和特异性抗 体的产生。为增加生物活性物质混合入病毒体的效率，其处理及为获得更长 的储存期，本发明公开了用于本发明的病毒体高效冷冻干燥的方法和 组合物。当欲开发高效的病毒体冻干剂时，双分子膜的组成是关4建因 素，应该予以仔细考虑。在上下文中，"冻干剂"是指在用所选溶剂 重建之前被冷冻干燥的组合物。"重建"是指用适当溶剂溶解冻干剂 的过程。因此，本发明用实验指明了不同的膜组合物的效率，所述膜 组合物包括在冷冻干燥和重建后保持病毒体大小和功能性的阳性、中 性荷电或不荷电的脂质。因此，本发明提供了使病毒体冷冻干燥和重 建不损失功能的病毒体膜组合物。基于这些实验结果，本发明提供了高冻干压抗性的、可水合的 病毒体冻千剂，其包括阳离子胆固醇衍生物，特别是作为整体膜成分 的DC-Chol或TC-Chol。可选择地，这种病毒体冻干剂另外包括选自药物因子和/或抗原分 子的生物活性物质。这些生物活性物质在冷冻千燥前连接至病毒体表 面或被装入其中。在另外一个实施方案中，药物因子和/或抗原分子与重建溶剂一起 被加至病毒体冻干剂中。这些药物因子和/或抗原分子被连接到新形成 的病毒体的表面。优选地，药物因子和/或抗原分子与脂质结合以为了通过脂质与病毒体膜连接。在另一个实施方案中，本发明公开了将药 物因子和/或抗原分子高效装入新形成的病毒体的内腔中的方法和组 合物。在一个优选的实施方案中，本发明的一种组合物包括病毒体膜总 脂含量的1.9至39moP/。的DC-Chol或TC-Chol。
在一个最优选的实施方案中，DC-Chol或TC-Chol的浓度在病毒 体膜的总脂含量的1.9至16moP/。之间。病毒体膜的剩余脂质由磷脂，优选由磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺组成。在一个高度优选的实施方案中，包含在病毒体膜中的磷脂酰胆 碱和磷脂酰乙醇胺的比例为4: 1。所有上述的组合物包括起作用量的病毒红细胞凝集素。在上下文 中"起作用量，，是指足以保护融合活性的病毒体微粒的量。所选的 一种抗原分子可以既是以足以引发免疫应答的量被直接 加至上述的一种组合物中，也可以是溶解在重建緩冲液中，在重建过 程中加至上述一种组合物的冻干剂中。因此本发明也包括适宜于冷冻 干燥的、另外包括经选择的耙抗原的组合物。所选的药物化合物可以足以显示生物活性的量被直接加至上述 的一种组合物中，也可以是溶解在重建緩沖液中，在重建过程中加至 上述一种组合物的冻干剂中。因此本发明也包括适宜于冷冻千燥的、 另外包括经选择的耙抗原的组合物。本发明的组合物可以进一步包括辅助成分，其有助于冷冻干燥 操作。这些辅助组分包括但不限于冷冻干燥保护剂例如蔗糖、海藻 糖、右旋糖、乳糖、甘露糖、木糖和甘露醇。这种糖类化合物在冷冻 干燥前在溶液中采以0.1到0.5%的比例特别有益。术语"冷冻干燥j呆 护剂"是指在冷冻干燥过程中用作辅助成分的一类化合物，其能够减 少病毒体的冻干压力。同样，本发明的一部分是冷冻干燥本发明组合物的方法，所述 方法基本上基于如下步骤冷冻、初级干燥和二级干燥以及随后的用 溶剂或緩冲液的重建步骤，所述溶剂或緩沖液可选择地含所需要的靶 抗原。所公开的组合物在制造用于免疫或接种受试对象的药物中的应 用也是本发明的一部分，所述受试对象优选为人。同样，本发明的 一部分是含已经被冻干的本发明病毒体的试剂 盒。除了病毒体冻干剂外，所述试剂盒可以进一步包括重建溶剂。如 果抗原分子还不是被冷冻干燥的病毒体的一部分，所述试剂盒还可另 外包括耙抗原。在本发明的一个实施方案中，试剂盒包括一种抗原分 子，在使用重建溶剂溶解被冻干的病毒体之前，所述抗原分子要被溶 解在所述重建溶剂中。另外，本发明公开了上述阳离子脂质在进一步促进病毒体的免疫 原性中的应用。在此方面，本发明人发现可以通过使用阳离子脂质， 优选地使用上述胆固醇衍生物的一种作为病毒体膜组分，IRIV本身的 免疫原性特点被进一步加强。在上下文中，术语"免疫原性，，是指引 发免疫应答的能力。 佐剂通过将任意的上述化合物与另外的免疫应答增强化合物结合可 以对本发明的组合物进行进一步地补充。免疫应答增强化合物被归类 于佐剂或细胞因子。额外的佐剂可以通过提供抗原库(细胞外或巨噬 细胞内)，激活巨噬细胞并刺激特异的淋巴细胞系而进一步促进免疫应答。在本领域有许多众所周知的佐剂；具体的例子包括弗氏佐剂(完 全和不完全)，分支杆菌例如卡介苗(BCG)，母牛分枝杆菌疫苗(M. Vaccae),或脂质A,或短棒菌苗，天然皂角苷(quil-saponin)混合物 例如QS-21 (SmithKlineBeecham公司)，MF59 ( Chiron公司)，以及 各种水包油乳液(例如IDEC-AF)。可以^吏用的其它佐剂包括^f旦不限 于矿物盐或矿物胶，例如氢氧化铝，磷酸铝，和磷酸钓；LPS衍生物， 皂角苷，表面活性物质例如溶血卵磷脂，多羟基的聚丙二醇与环氧乙 烷的加聚物(pluronicpolyols)，聚阴离子，肽或蛋白质片段，钥孔威 血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin),和二》肖基酚；免疫刺，敫分子， 例如皂角苷，胞壁酰二肽和三肽衍生物，CpG二核苷酸，CpG寡聚核 苷酸，单磷酰脂质A,和聚磷腈；颗粒或《鼓粒佐剂，例如乳液，脂质 体，病毒体，脂质双层巻(Cochleates);或免疫刺激复合物粘膜佐剂。 细胞因子因为其的淋巴细胞刺激特性可以在疫苗方案中应用。用于该 用途的许多细胞因子对于本领域一个普通技术人员来说是已知的，包 括白细胞介素-2 (IL-2), IL-12, GM-CSF以及许多其它的细胞因子。
给药当给药时，本发明的治疗性组合物以制药学可接受的制剂给药。 这种制剂可常规地包括在制药学可接受的浓度的盐、緩冲剂、防腐剂、 适合的载体、补充的免疫增强剂例如佐剂和细胞因子以及可选地其它 的治疗因子。本发明的这种制剂可以以有效量给药。通常认为免疫剂 量从1纳克/千克到100毫克/千克是有效的，这取决于用药模式。优选的范围被认为是在每千克体重500纳克到500微克之间。绝对量将 依赖各种因素，包括所选择用药的组合物，不论用药是单独或多重剂 量，及包括个体病人的参数包括年龄、身体状况、身材、体重、以及 病程。这些因素对于本领域普通技术人员是充分公知的，并且仅通过 常规实验就能够说明。 实施例通过以下实施例对本发明进行说明，这些实施例不能祸:认为是对本发明的范围加以任何形式的限定。相反，应当清楚地理解为可以诉 诸不同的其它实施方案，修改的实例方案和与其等价的实例方案，这 些本领域技术人员在阅读过本文说明书后，都可以得出这些方案的启 示，但是它们仍然落入本发明的范围。 材料与方法化学药品八乙烯乙二醇-单-(n-十二烷基)醚(Octaethylene glycol-mono- (n画dodecyl) ether (OEG, C12E8)),三氟乙酸(TFA),双十 六烷基二甲基溴化铵(DHAB),来自牛脑的L-A-磷脂酰-L-丝氨酸(PS), 1，2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺(DPPE), 1,2-二月桂 酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DLPC),来自羊毛脂的胆固醇，1-肉豆蔻酰 -sn-丙三基-3-磷酸胆碱(Lyso-PC),棕榈酰-DL-肉碱氯化物(palmitoyl画DL-carnitine chloride)和N画(三甲氨基乙基)氨甲酸胆固 醇酯氯化物(TC-Chol),来自于Fluka或Sigma公司(布希，瑞士)。蛋 黄磷脂酰胆碱(PC)由类脂获得(Cham公司，瑞士)。 1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷-rac-(l-甘油)钠盐(DPPG)), 3卩[N-(N'，N'-二曱氨基乙基)-氨曱酰基]胆固醇氢氯化物(DC-Chol), 1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-磷酸 单钠盐(DPPA)和1,2-二棕榈酰乙烯基乙二醇(DPEG)购自Avanti Polar Lipids 7>司(Alabaster,阿一立巴马州，美国)。l-棕榈酰-3-油酰-sn-丙 三基-2-磷脂酰-乙醇胺(PE)从R. Berchtold (生化实验室，伯尔尼大 学，瑞士)获得。Bio-baeds SM2和Bio-Gel A-15m来自Bio-Rad Laboratories 7>司(Glattbrugg，瑞士 )。 LissamineTM若丹明Bl,2-双十 六烷酰-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺，三乙胺盐(Rh-DHPE), N-(4,4-二氟 一5,7-二苯基-4-硼杂-3a, 4a-二氮+引达省-3-丙酰)-l,2-双十六酰-sn-丙 三基画磷酸乙醇胺(N- (4,4- difluoro-5,7画diphenyl國4-bora画3a, 4a-diaza-s國indacene-3-propionyl)國l,2-dihexadecanoyl國sn-glycero-3-phosp hoethanolamine)( Bodipy 530/550-DHPE )来自Molecular Probes Europe 公司(莱顿,荷兰)。N-[l-(2, 3-二油酰氧)丙基]-N,N,N-三甲基铵氯化 物(DOTAP)购自Roche Applied Science 7〉司(Rotkreuz，瑞士)。盐酸 阿霉素从Fluka公司获得(布希，瑞士)。病毒流感病毒X-31抹和A/Sing (A/Singapore/6/86)抹，从Bema BiotechAG公司(伯尔尼，瑞士)获得，在鸡胚尿嚢腔中培养(Gerhard， J. Exp. Med (实验医学杂志).144:985-995, 1976 )。肽HLA-A2.1结合的丙肝病毒(HCV ) HLA结合肽 ((DLMGYIPLV， aa 132-140 )(Cerny等人.，J. Clin. Invest(临床调查). 95 (2) : 521-30， 1995)，以及HLA-A2.1结合的对照肽和痴疾模拟肽 AMAM-CPE( (1, 3-二棕榈酰-丙三基-2_磷酸乙醇胺)-蔗糖-GGCYKDEIKKE正RESKRIKLNDNDDEGNKKIIAPRIFISDDKDSLK CG (二硫键))(Moreno等人.，Chembiochem(化学生化)2:838-43, 2001) 从BachemAG公司(Bubendorf,瑞士)获得。小鼠在独立实验室对转HLA-A2.1 (A0201)单链组织相容性I类 分子基因的HDD小鼠和H-2Db和鼠(32-微球蛋白都缺失的HDD小鼠 进行两次免疫实验(Pascolo等人.，J. Exp. Med (实验医学杂志).185 (12) :2043-51, 1997)。小鼠被安置在适宜的动物饲养设备内并按国际 规则进行操作。实施例1
免疫增强的重建的流感病毒体(IRIV)的制备病毒体才艮据先前描述的方法进行制备(Bron等人.，Methods Enzymol (酶学方法). 220:313- 331, 1993; Zurbriggen等人.，Prog Lipid Res (脂质研究进展) 39(1) :3-18, 2000)。简而言之，将32 mg (41.7 fimol)蛋黄磷脂酰胆碱 (egg PC )和8 mg (11.1 ,1) PE溶解在2 ml的PBS, 100 mM OEG (PBS/OEG)中。流感病毒的4 mg HA以画，000xg在4°C离心1小时, 并且沉淀物溶解于2ml的PBS/OEG。将被去污剂溶解了的磷脂和病 毒混合并被超声处理1分钟。所述混合物在20。C以100,000xg离心1 小时，并且上清液被过滤除菌(0.22 pm )。之后使用180 mg的湿SM2 Bio-Beads在室温下震荡1小时，以及每次用90 mg的SM2 Bio- Beads 进行30分钟，共3次，通过去污剂移除使病毒体形成。脂质的终浓 度为8 mg/ml (10.4 |iimol/ml) PC和2 mg/ml (2.7 pmol/ml) PE。通过B6ttcher (B6ttcher等人.，Anal. Chim. Acta (分析化学学报) 24:202-203, 1961)的磷脂定量和Ball (Ball, Anal. Biochem(分析生物化 学).155:23-27, 1986)的SDS-PAGE与考马斯抽提方法之后的HA定 量来确定红细胞凝集素/磷脂的比例。 实施例2含DC-Choi的免疫增强的重建的流感病毒体(DIRIV)的制备: 通过先前描述的方法制备病毒体(Bron等人.，Methods Enzymol (酶 学方法).220:313-331， 1993; Zurbriggen等人.，Prog. Lipid Res (脂质 研究进展).39(1) :3-18, 2000))。简而言之，将32 mg (41.7 ,l)蛋黄 PC, 8 mg (11.1 pmol) PE和0.3画5 mg (0.6-10 pmol) DC國Chol溶解在 2 ml的PBS, 100 mM OEG (OEG-PBS)中。流感病毒4 mg的HA以 100，000xg在4。C离心1小时，并且沉淀物溶解于1 ml的PBS/OEG。 将被去污剂溶解了的磷脂和病毒及1ml的20% (w/v)蔗糖混合至终 体积4ml,并被超声处理1分钟。所述混合物在20。C以100，000xg离心 1小时，并且上清液被过滤除菌(0.22 (im)。之后使用180 mg的湿 SM2 Bio-Beads在室温下震荡1小时，以及每次用90 mg的SM2 Bio-Beads 进行 30 分钟， 共3次，通过去污剂移除使病毒体形成。脂质的
终浓度为8 mg/ml (10.4 pmol/ml) PC, 2 mg/ml (2.7 |imol/ml) PE和 0.075-1.25 mg/ml (0.12-2.5 pmol/ml) DC-Chol。通过B6ttcher (B6ttcher等人.，Anal. Chim. Acta (分析化学学报) 24:202-203, 1961)的磷脂定量和Ball (Ball, Anal. Biochem (分析生物化 学).155:23-27, 1986)的SDS-PAGE与考马斯抽提方法之后的HA定 量来确定红细胞凝集素/磷脂的比例。实施例3AMA49-DIRIV的制备构建带脂质结合抗原的DIRIV的方法 病毒体的制备，其中，抗原结合至病毒体的表面。为制备PE-模拟IRIV, 将磷酸盐緩沖液(PBS)中的纯化曱型流感病毒/新加坡红细胞凝集素 (4mg )的溶液以lOOOOOg离心30分钟，并且沉淀物溶解于含100 mM 八乙烯乙二醇单十二烷基醚(PBS-OEG)的PBS(1.33ml)中。AMA49-PE 共轭物(4mg)，磷脂酰胆碱(32mg, Lipoid公司，路德维希港，德国) 和磷脂酰乙醇胺(6mg)溶解在总体积为2.66ml的PBS-OEG中。磷 脂和红细胞凝集素溶液纟皮混合并,皮超声处理1分钟。之后所述溶液以 100,000g离心1小时，并且上清液在无菌条件下被过滤(0.22 (im)。 之后使用BioRad SM BioBeads (BioRad公司，Glattbrugg,瑞士 )通过 去污剂移除使病毒体形成。DIRIV在冷冻千燥前被等份储存在-7(TC。 实施例4构建带靶配体和间隔体(spacer)的DIRIV的方法本实施例描述 Fab'片段和柔韧的间隔臂的定点结合，用于使抗原结合位点能够结合 靶细胞。为了将Fab'分子放置在可以保持其二价结合能力的位置，通 过定点结合将Fab'片段和柔韧的间隔臂结合。将100 mg含长的聚乙 二醇间隔臂(PEG)的NHS-PEG-MAL溶解在3ml含10 |il三乙苯的 无水甲醇中。之后，将45 mg溶解在4ml氯仿和甲醇(l:3;v/v)中的 二油酰磷脂酰乙醇胺加至溶液中。在有氮的情况下室温(RT) 3小时 完成反应。降压以去除曱醇/氯仿，并且产物被重新溶解在氯仿中。用 1%的NaCl抽提溶液以去除未反应的物质和水溶性的副产物。通过如 Martin等人(1982)描述的硅酸色语法纯化PE-PEG-MAL,对所述方法进行一些改动硅胶柱具有1.5cm的直径，并填装14硅胶(Kieselgel 60， Fluka 60752)。用下列梯度进行洗脱氯仿甲醇29:1, 28:2, 27:3, 26:4(ml)等。收集6ml的流分。在流分13-31中获得PEG-PEG-MAL。 流分和PE-PEG-MAL的纯度以氯仿-甲醇-水65:25:4通过在珪胶上的 薄层层析(TLC )进行分析。将PE-PEG-MAL溶解在含10mg/150 pi八 乙烯乙二醇-单-十二烷基醚(C12E8>々Tris-HCl緩冲液(100mM，pH7.6) 中。以Fab'/PE-PEG-MAL的比为1:10的比例将Fab'片段加入所述溶 液。在氮气中室温下将该溶液搅拌2小时。再将d2Es加入以获得1% -d2Es溶液，并且在4。C搅拌该反应混合物过夜。通过加入400jil洗 过的湿润的硫代丙基琼脂糖(Thiopropyl Sepharose) 6B去除未反应的 PE-PEG-MAL。孵育3小时后，通过离心去除凝月交。通过流过0.2pm 的滤器对PE-PEG-Fab'溶液(3.6 ml)除菌并以0.01 M (:12￡8去污剂溶液 储存。实施例5制备FAB' DIRIV的方法本实施例说明了革巴向特异细胞的结合 病毒体的制备。根据Wadti和Glueck在Int. J. Cancer(国际癌症杂志) 77: 728-733, 1998中描述的方法从流感病毒A/Singapore/6/86抹中分离 红细胞凝集素(HA)。将含溶解在0.01M d2Es去污剂溶液中的HA三 聚物(2.5 mg/ml)的上清用于生产病毒体。将氯仿中的磷脂酰胆碱 (38mg)加入到圓底烧瓶中，并通过旋转蒸发器蒸发氯仿以在玻璃壁 上获得薄的PC (磷脂酰胆碱)膜。将上清液(4 ml,含10 mg HA) 和实施例3的3.6 ml PE-PEG-Fab'(含4 mg Fab'片段)加入至所述烧 瓶中。在轻柔的摇动下，覆盖烧瓶玻璃壁的PC膜被含C12E8去污剂 的混合物溶解。通过以无菌Biobeads SM-2进行抽提去除所产生溶液 的去污剂。用REAX2震荡器(Heidolph公司，科尔海姆，德国)震荡容 器1小时。为完全去除去污剂，用0.58 mg的Biobeads重复三次，之 后获得Fab'-病毒体轻微透明的溶液。定量分析显示1 ml的Fab'-病毒 体含1.3 mg的HA, 5 mg的PC和0.53 mg的Fab'片段。才艮据 Antibodies, A Laboratory Manual (抗体，实验室手册)中的描述，通
过在高荷载Superdex 200柱(High Load Superdex 200 colmnn)上凝胶 过滤收集的流分的免疫分析确定Fab'的浓度。生产不含Fab'的病毒体 的步骤与此相同，例外之处在于不加入PE-PEG-Fab'。含DC-Choi ( DIRIV)和带PE-PEG-Fab'的免疫增强重建流感病毒 体的制备病毒体通过先前描述的方法制备(Bron等人.，Methods Enzymol(酶学方法).220:313-331, 1993; Zurbriggen等人.，Prog. Lipid Res (脂质研究进展).39(1) :3-18, 2000))。简而言之，将32mg(4L7 pmol)蛋黄PC， 8 mg (11.1 pmol) PE和0.3 - 5 mg (0.6-10 pmol) DC画Chol 和先前形成的PE-PEG-Fab'溶解在2 ml的PBS, 100 mM OEG (OEG-PBS)中。流感病毒4mg的HA以100，000xg在4。C离心1小时， 并且沉淀物溶解于1 ml的PBS/OEG中。将被去污剂溶解了的磷脂和 病毒及1ml的20% (w/v)蔗糖混合至终体积4ml,并被超声处理1 分钟。所述混合物在20。C以100，000xg离心1小时，并且上清液^皮过 滤除菌(0.22 pm)。之后使用180 mg的湿SM2 Bio-Beads在室温下 震荡1小时，并每次用90 mg的SM2 Bio- Beads进行30分钟，共3 次，通过移除去污剂形成病毒体。脂质的终浓度为8 mg/ml (10.4 pmol/ml)PC ， 2 mg/ml (2.7 pmol/ml)PE和0.075-1.25 mg/ml (0.12-2.5 (imol/mi;) DC-Chol。通过B6ttcher (B6ttcher等人.，Anal. Chim. Acta (分析化学学报) 24:202-203, 1961)的磷脂定量和Ball (Ball, Anal. Biochem(分析生物化 学).155:23-27, 1986)的SDS-PAGE与考马斯抽提方法之后的HA定 量来确定红细胞凝集素/磷脂的比例。实施例6使DIRIV负载有关药物组合物如Gabizon等人.，在J. Natl.Cancer Inst (国家癌症学会).81: 1484-1488, 1989所描述的方法,通 过病毒体捕获的硫酸铵产生的质子梯度将阿霉素装入病毒体。为了用硫酸铵装填病毒体，将硫酸铵溶液(4.17 g/ml)加入到DIRIV溶液(7.5 ml)，超声处理1分钟，并用含5%葡萄糖的1升PBS在4。C透析1 小时(Spectra/Por 2.1, Biotech DispoDialyzers, MWCO: 15 '000,
Spectrum Medical Industries公司，休斯顿，德克萨斯州，美国)。24 小时后更换透析緩沖液，病毒体溶液被进一步透析24小时。为制备 阿霉素装填溶液，将10 mg阿霉素溶解于3 ml水中，并通过0.2pm 滤器除菌，之后加入750 ^的5x浓度的无菌PBS和5%蔗糖。将病毒体溶液和阿霉素装填溶液加热至33。C,之后，将2体积的 病毒体溶液与1体积的阿霉素装填溶液相混合。将混合物在33。C孵育 10小时并在28。C被进一步孵育过夜。通过在用无菌PBS， 5%蔗糖平 衡的High Load Superdex 200柱(Pharmacia，乌普萨拉，瑞典)上进行 凝胶过滤，从病毒体中分离未被灌嚢的阿霉素。含灌嚢的阿霉素的 Fab'-病毒体的空隙体积流分(void volume fractions)以含5%蔗糖的 PBS进行洗脱并收集。实施例7DIRIV的冷冻干燥DIRIV在冷冻干燥前于-70。C被等份储存。 在萨文特公司AES1010快速真空冷冻干燥系统(Savant AES1010 speedvac)中根据供应商的说明书进行冷冻干燥。干燥后的样品^皮立 即应用或储存于-70。C。为重建被冷冻干燥的DIRIV,向干燥后的 DIRIV中加入与冷冻干燥前等量体积的水。重建的空DIRIV在4。C储 存。实施例8HLA结合肽-DIRIV的制备DIRIV在冷冻干燥前在-70。C被等份 储存。在萨文特公司AES1010快速真空冷冻干燥系统中根据供应商 的说明书进行冷冻干燥。干燥后的样品被立即应用或储存于-70。C。为 重建被冷冻干燥的DIRIV,向干燥后的DIRIV中加入与冷冻千燥前等 体积的溶解于水中的HLA结合肽。重建的HLA结合肽-DIRIV在4°C 储存。通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)对被灌嚢肽的浓度进行定 量。实施例9DIRIV在冷冻千燥前在-70 °C被等份储存。在萨文特公司AES1010 快速真空冷冻干燥系统中根据供应商的说明书进行冷冻干燥。干燥后
的样本被立即应用或储存于-7(TC。为重建#1冷冻干燥的DIRIV,向 干燥后的DIRIV中加入与冷冻干燥前等体积的溶解于水中的 AMA49-CPE。重建的AMA49-DIRIVs在4。C储存。通过反相高效液 相色语对被整合的肽的浓度进行定量。 实施例10阿霉素-DIRIV (DOXRUBICINE -DIRIV)的制备DIRIV在冷 冻干燥前在-70。C被等份储存。在萨文特公司AES1010快速真空冷冻 干燥系统中根据供应商的说明书进行冷冻干燥。干燥后的样本被立即 应用或储存于-7(TC。为制备阿霉素装载溶液，将10 mg的阿霉素溶 解在3ml的水中并通过0.2卞m滤器过滤除菌。为重建被冷冻千燥的 DIRIV,向干燥后的DIRIV中加入与冷冻干燥前等体积的阿霉素。重 建的阿霉素-DIRIV在4"C储存。实施例11被整合的阿霉素的定量被灌嚢药物的量，在这里是阿霉素，由 在480nm的吸收定量。DIRIV制剂含平均150吗/ml的阿霉素。由相 关光量子光语学(PCS)与库尔特N4Plus亚微米离子大小分析仪 (Coulter N4Plus Sub-Micron-Particle Size Analyzer)(迈阿密，佛罗里 州，美国)确定病毒体的平均直径。根据Hoekstra等人先前在 Biochemistry (生物化学)23: 5675-5681， 1984中描述的，通过基于十 八烷基若丹明(R18)荧光脱猝灭作用(dequenching)来检测病毒体 的病毒融合基因活性的适当表达。 实施例12含有其它脂质的免疫增强的重建的流感病毒体的制备根据实施 例3的描述制备病毒体，仅有区别在于DC-Choi由下列物质代替 DHAB、 DOTAP、 PS、胆固醇、DPPE、 DLPC 、溶血磷脂酰胆石威 (Lyso-PC)、棕榈酰-DL-肉碱、DPEG或TC-Chol。脂质的终浓度各 自为8 mg/ml (10.4 nmol/ml) PC, 2 mg/ml (2.7 jimol/ml) PE和0.125 mg/ml (0.22 ,ol/ml) DHAB,或0.125 mg/ml (0.18拜ol/ml) DOTAP， 或2-8 mg/ml (2.8-11.3 jimol/ml) PS,或0.125 mg/ml(0.32 (imol/ml)胆
固醇，或0.125 mg/ml (0.18 nmol/ml) DPPE，或0.125 mg/ml (0.19 jimol/ml) DLPC,或0.125 mg/ml (0.27 jimol/ml) Lyso画PC,或0.125 mg/ml (0.29 (imol/ml)棕榈酰-DL-肉碱，或0.135 mg/ml (0.25 pmol/ml) DPEG,或0.125 mg/ml (0.23 ,1/ml) TC-Chol。修饰的IRIV在冷冻干燥前在-7(TC被等份储存。在萨文特公司 AES1010快速真空冷冻干燥系统中根据供应商的说明书进行冷冻干 燥。干燥后的样品被立即应用或储存于-7(TC。为重建被冷冻干燥的病 毒体，向干燥后的病毒体中加入与冷冻千燥前等量体积的水或在水中 的HLA结合肽PBS。重建的病毒体在4。C储存。实施例13HLA结合肽的定量在Agilent 1100 Series (Agilent Technologies 公司，瑞士)上使用CC 125/4.6 Nucleosil 100-5 C8反相柱 (Macherey-Nagel公司，瑞士 )通过HPLC ( RP-HPLC )进行肽定量。 使用以下的洗脱剂緩冲液A, 10mMTEAP水溶液；緩沖液B, 100 %乙腈。HPLC程序流量1.3 ml/min;緩冲液和柱温度25。C;緩冲 液启动浓度25%B; 0-7分钟将緩冲液B增至38。/。； 7-12.4务钟 将緩冲液B增至100。/。； 12.4-16.4分钟緩冲液B100。/。。为定量被灌 嚢的肽，将病毒体流分(5-30 pi )装到新鲜制备的、PBS平衡的1ml的 Sephadex G50粗凝胶-过滤旋转柱(Coarse gel- filtration spin columns ) 上。在以300xg,离心旋转柱2分钟后才收获到装有肽的嚢泡，未装 入的肽纟皮阻留在柱里。 实施例14AMA49-CPE肽的定量在Agilent 1100 Series (Agilent Technologies公司，瑞士)上使用ZORBAX Eclipse XDB-C8反相柱 (Agilent Technologies公司，瑞士 )通过HPLC (RP-HPLC )进行肽 定量。^使用以下的洗脱剂緩冲液A, 0.P/。TFA水溶液；緩冲液B， 0.1Q/oTFA甲醇溶液。HPLC程序流量1.0 ml/min;緩冲液和柱温度 60°C;緩冲液启动浓度60。/。B; 0-15分钟将緩冲液B增至100。/o; 15-20分钟緩冲液B 100%。为定量被灌嚢的肽，将病毒体的流分(5-30pl)装到新鲜制备的、PBS平衡的lml的SephadexG50粗凝胶-过滤 旋转柱中。在以300xg,离心旋转柱2分钟后才收获到装有肽的嚢泡， 未装入的肽被阻留在柱里。 实施例15FRET分析为通过荧光共振能量转移(FRET)进行体外的融合 测定(Struck等人.,Biochemistry (生物化学)20 (14) :4093-99, 1981; Loyter等人.，Methods Biochem. Anal (生物化学分析方法).33:129-64, 1988 ),进行下列的分析将0.75mo1。/。的Bodipy 530/550-DHPE和 0.25 mol%的N-Rh-DHPE掺入由PC/DPPG(70:30)组成的脂质体中。 在4。C和42。C之间的离散温度下，在5mM磷酸钠緩冲液pH 7.5， 100 mM NaCl中，以2.5 ml PMMA微比色管(micro-cuvettes) (VWR公司， 瑞士)中的0.8ml终体积在持续搅拌下进行荧光测定。通常，lpl标记 的脂质体(0.3 nmol磷脂)与5-20 ^的病毒体(0.1-0.4 nmol的磷脂) 混合，并且通过加入3.75-7 pi的1 MHC1引发融合，最终pH为4.5。 在538 nm和558 nm的激发和发射波长下，激发狭缝为2.5 nm及发 射狭缝为15.0 nm，每5秒分别记录一次焚光增量。用配有恒温比色 架禾口》兹力4觉才半装置的LS 55发光分光计(Luminescence spectrometer) (Perkin Elmer Instruments公司，美国)进行测量。在无限探针稀释 (infinite probe dilution)下，加入Triton X國100 (0.5% v/v终浓度)后达 到最大荧光度。为校正荧光度的等级，脂质体的初始残留的荧光度被 设置为零，并且在无限探针稀释下的荧光度设为100%。 实施例16使用Zetasizer 1000HS仪器(Malvem Instruments公司，英国)在2 ml的PMMA比色皿(Sarstedt AG公司，瑞士)中通过光散射测定微粒大 小。5-20 的病毒体或脂质体分别被稀释于过滤后(0.22 )的PBS 中，根据厂商的说明书在25。C和633nm测量3次每次300秒。实施例17含DC-Choi的脂质体(DC-脂质体)的制备将32 mg (41.7 pmol) PC， 8 mg (11.1 ,ol) PE和0.8-5 mg (1.6-10 ,ol) DC-Chol溶解于4 ml
的PBS, 100 mM OEG, 5%(w/v)蔗糖(OEG-PBS)中，之后混合并超 声处理1分钟。该混合物被过滤除菌(0.22 nm )，并且之后4吏用180 mg 的湿SM2 Bio-Beads在室温下震荡1小时，并每次用90 mg的SM2 Bio-Beads 进行30分钟，共3次，通过去污剂移除使脂质体形成。脂质 的终浓度为8mg/ml PC (10.4 |imol/ml)， 2 mg/ml PE (2.7 (imol/ml)和0.2 -1.25 mg/ml DC-Chol(0.4-2.5 |imol/ml)。脂质体在冷冻干燥前被等份储 存在-70。C。在萨文特公司AES1010快速真空冷冻干燥系统中根据供 应商的说明书进行冷冻干燥。干燥后的样品被立即应用或储存于-70 °C。为重建冷冻干燥的DC-脂质体，向干燥后的DC-Choi中加入水或 HLA结合肽水溶液。重建的HLA结合肽-DC-脂质体在4。C储存。 实施例18脂质体的制备将78 mg (101.6 pmol)的PC(溶解于甲醇)和32.68 mg (43.56 ,l)的DPPG (溶解于甲醇/氯仿(1:1))(摩尔比70:30) 混合，通过使用旋转蒸发器(Rotavapor R-205, Buchi Labortechnik公 司，瑞士)在4(TC和30-10kPa的渐进真空下去除溶剂。干燥后的脂质 膜用1.5ml5"/o(w/v)蔗糖水溶液被重新水合。脂质体在冷冻干燥前被 等份储存在-70。C。在萨文特公司AES1010快速真空冷冻干燥系统中 根据供应商的说明书进行冷冻干燥。干燥后的样品被立即应用或储存 于-70。C。为重建被冷冻干燥的脂质体，向干燥后的脂质体中加入PBS 或HLA结合肽PBS溶液。重建的HLA结合肽-脂质体在4。C储存。实施例19含DC-Chol的脂质体(DC-脂质体)的制备将66.8-75.2 mg (87.1-98pmol) PC(溶解在甲醇中)和32.68 mg (43.56 pmol) DPPG(溶解 在甲醇/氯仿(l:l))以及1.82-7.26 mg (3.6-14.5 pmol)DC-Chol (溶解在 曱醇中)(摩尔比60-67.5:30:2.5-10) 一起混合，并且通过使用旋转蒸 发器(Rotavapor R-205, Buchi Labortechnik公司，瑞士 )在40。C和 30-10kPa的渐进真空下去除溶剂。干燥后的脂质膜用1.5 ml 5% (w/v) 蔗糖水溶液被重新水合。脂质体在冷冻干燥前被等份储存在-7(TC。在 萨文特公司AES1010快速真空冷冻干燥系统中根据供应商的说明书
进行冷冻干燥。干燥后的样品被立即应用或储存于-70。C。为重建被冷 冻干燥的DC-脂质体，向干燥后的DC-脂质体中加入PBS或HCV HLA 结合肽PBS溶液。重建的HLA结合肽DC-脂质体在4。C储存。 实施例20免疫和细胞毒性实验在HLA-2.1转基因小鼠尾基部用100 (J 的相应病毒体制剂皮下(sc.)免疫小鼠。小鼠以3周的间隔接受2次 注射，并且在最后一次注射2周后对应答进行分析。取自免疫小鼠的 脾细胞(4xl0V孔)和2xl()6被照射的(1500rad)的脾细胞在37。C和 2%C02下，在24-孔组织培养板，完全RPMI培养基(Sigma Aldrich公 司，圣路易斯，密苏里州)中被重激活5天，所述被照射的脾细胞已与 10pg/ml肽进行脉冲，所述完全RPMI培养基含2mML-谷酰胺，100U 青霉素，100 jxg/ml链霉素(Sigma Aldrich公司)，5 mM鞋乙基哌溱 乙磺酸(Hepes), 10%胎牛血清(FCS ) (Gibco BRL公司，巴塞尔， 瑞士)和5xl(T5 M巯基乙醇。在第2天，加入5U/ml的白细胞介素-2 (IL-2) (EuroCetusB.V.公司，阿姆斯特丹，荷兰)。在以EL-4S3:Rob HHD为耙细胞的标准的51Cr释放分析中检测特异性细胞溶解活性， 所述靶细胞已与10吗/ml所选择的肽或培养基对照一起脉冲。4小时 孵育后，通过使用Y计数器测量"Cr的释放。分别对只含培养基的孔 或用1MHC1裂解后的孔进行自发和最大释;^文的测量。裂解由下列公 式计算(在检测中的释放-自发释放)/ (最大释放-自发释放)x100。 才艮据肽存在或肽不存在时获得的裂解百分比来测定肽特异性的裂解。 自发裂解经常低于最大裂解的15%。 实施例21抗AMA49-CPE的酶联免疫吸附实验ELISA: ELISA微孔板 (PolySorb, Nunc, VWR International AG公司，瑞士 )与100 jiL /孔的 10 |ig/ml AMA49-CPE的PBS溶液一起在4。C孵育过夜。在被5%奶粉 的PBS溶液在37°C阻断2小时之前，每孔用含0.05%吐温-20的PBS 以300 pl/孔洗三次。用含0.05%吐温-20的PBS以300 pl/孔将孔清洗 三次。之后将板与两倍连续稀释的含0.05%吐温-20和5%奶粉(100 pl
/孔)的小鼠血清PBS溶液在37。C一起孵育2小时。清洗后，板与结 合了碱性磷酸酶的羊抗鼠IgG (Y-链特异性)抗体(Sigma公司，圣 路易斯，密苏里州，美国)在37。C一起孵育1小时，之后清洗三次。 加入磷酸酶底物(存在于0.14% (w/v) Na2C03, 0.3% (w/v) NaHC03, 0.02% (w/v) MgCl2, pH 9.6中的1 mg/ml磷酸对硝基苯酯(Sigma公 司))并在室温避光孵育。经适当时间后，通过加入100[iL/孔1M硫 酸终止反应。用微孔板读板器(Spectra MAX plus, Molecular Devices, Bucher Biotech AG公司，瑞士 )在405nm记录反应产物的光密度 (OD)。实施例22含DC-Chol的流感疫苗制剂的制备根据先前描述的方法(Bron 等人.，Methods Enzymol(酶学方法).220:313-331， 1993; Zurbriggen等 人.，Prog. Lipid Res (脂质研究进展) 39(1) :3-18, 2000 )制备三批流 感病毒体。简而言之，将32 mg (41.7 jamol)蛋黄PC和0.3 - 5 mg (0.6-10 (imol) DC-Choi溶解在2 ml的PBS， 100 mM OEG (OEG-PBS)中。流感 病毒4 mg的HA (第1批A/New Caledonia/20/99 (H1N1);第2批 A/Fujian/411/2002(H3N2)，第3批B/Shanghai/361/2002)以100,000xg 在4。C离心1小时，并且沉淀物溶解于lml的PBS/OEG中。将被去 污剂溶解了的磷脂和病毒及1ml的20%( w/v )蔗糖混合至终体积4ml, 并被超声处理1分钟。所述混合物在20。C以100，000xg离心1小时， 并且上清液被过滤除菌(0.22 pm)。之后使用180 mg的湿SM2 Bio-Beads在室温下震荡1小时，并每次用90 mg的SM2 Bio- Beads 进行30分钟，共3次，通过去污剂移除形成3批不同的病毒体。脂 质的纟冬浓度为8 mg/ml (10.4 pmol/ml) PC, 2 mg/ml (2.7 (xmol/ml) PE 和0.075-1.25 mg/ml (0.12-2.5 jimol/ml) DC画Chol。在HA定量后，三个批次被混合并被冷冻干燥。在萨文特公司 AES1010快速真空冷冻干燥系统中根据供应商的说明书进行冷冻干 燥。干燥后的样品被立即应用或储存于-70。C。为重建被冷冻干燥的流 感疫苗制剂，向干燥后的DIRIV中加入与冷冻干燥前等量体积的水。 重建的空DIRIV在4。C储存。
权利要求
1.一种生物活性组合物，所述组合物包括至少一种免疫增强的重建的流感病毒体(IRIV)和用于所述病毒体高效冷冻干燥和重建的阳离子胆固醇衍生物。
2. 根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述用于病毒体的 高效冷冻干燥和重建的阳离子胆固醇衍生物存在于病毒体的膜中。
3. 根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述胆固醇衍 生物在胆固醇的3-位置上具有阳性荷电的取代基，并且由下式表示<formula>formula see original document page 2</formula>(工)其中R选自R'; R'- (C=0)-; R'-O- (OO)-; R'画NH- (OO)画；R'-O- (OO) 國R"- (CO) -; R'- NH-(00)-R"-(C=0)-，其中R'为被至少一个阳性荷电基团取代的d-CV烷基，优选地是通 式R1R2R3N+-的含N基团，并且各自的反离子是X-;其中112和R3相互独立地选自氢和d-CV烷基；其中X选自卣素、硫酸氢根、磺酸根、磷酸二氢根、醋酸根、三卣 醋酸根和碳酸氢根；以及其中R"是d-CV亚烃基。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述胆固醇衍生物 由下式表示<formula>formula see original document page 3</formula>(II)其中，RhR2和R3相互独立地选自氢和d-C6-烷基，并且其中X—是卤素阴离子。
5. 根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，R4和R2是甲基，以及R3是氢。
6. 根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，&、 R2和R3是甲基。
7. 根据权利要求2-6中任一权利要求所述的组合物，其特征在于， 所述阳离子脂质的含量在膜总脂含量的1.9和37moP/。之间。
8. 根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述阳离子脂质的 含量在膜总脂含量的1.9和16mol。/。之间。
9. 根据权利要求7或8所述的组合物，其特征在于，所述病毒体膜 的其余脂含量由磷脂组成。
10. 根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述磷脂是磷脂 酰胆碱和磷脂酰乙醇胺。
11. 根据权利要求IO所述的组合物，其特征在于，磷脂酰胆碱和磷 脂酰乙醇胺以3: l至5: 1,优选以4: 1的比例存在。
12. —种冷冻干燥组合物，所述组合物包括权利要求1到11中任一 所述的生物活性组合物，和另外的冷冻干燥保护剂。
13. 根据权利要求12所述的组合物，其特征在于，所述冷冻干燥保 护剂选自蔗糖、海藻糖、右旋糖、乳糖、甘露糖、木糖和甘露醇。
14. 根据权利要求13所述的组合物，其特征在于，在冷冻干燥前， 所述冷冻干燥保护剂在溶液中以0.1到5% (W/V)的比例存在。
15. 根据权利要求12-14中任一权利要求所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括佐剂，或佐剂系统。
16. 根据权利要求1-11或12-15中任一权利要求所述的组合物，其 特征在于，所述组合物还包括选自药物因子或抗原分子的生物活性物质。
17. 根据权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述生物活性物 质或连接在病毒体的表面，和/或被包入病毒体之中。
18. —种应用权利要求12-15中任一权利要求所述的组合物用于病毒 体冷冻干燥的方法，所述方法包括下列步骤(a) 冷冻所述组合物，(b) 以第一降低的压力初级干燥所述冷冻组合物，并且(c) 以第二降低的压力二级干燥所述冷冻组合物，其中在高于所述第二降低的压力的压力下，进行所述初级干燥。
19. 一种应用权利要求16或17所述的组合物用于病毒体冷冻干燥 的方法，所述方法包括下列步骤(a) 冷冻所述组合物，所述组合物包括选自药物因子和抗原分子的 所述生物活性物质，(b) 以第一降低的压力初级干燥所述冷冻组合物，并且(c) 以第二降低的压力二级干燥所述冷冻组合物，其中在高于所述第二降低的压力的压力下，进行所述初级干燥。
20. —种通过权利要求18所述方法获得的病毒体冻干剂。
21. —种通过权利要求19所述方法获得的病毒体冻干剂。
22. —种用于重建权利要求20所述的病毒体冻干剂的方法，所述方 法包括将病毒体冻干剂溶解于重建溶剂中的步骤。
23. 根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述重建溶剂包括 选自药物因子和抗原分子的所述生物活性物质。
24. —种用于重建权利要求21所述的病毒体冻干剂的方法，所述方 法包括将病毒体冻干剂溶解于重建溶剂中的步骤。
25. 权利要求1到17中任一权利要求所述的组合物在生产用于将其 接种受试对象的药物中的应用。
26. 根据权利要求25所述的应用，其特征在于所述受试对象是人。
27. —种试剂盒，所述试剂盒包括含有权利要求20所述冻干剂的容器。
28. 根据权利要求27所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括含重建 溶剂和选自药物因子和抗原分子的所述生物活性物质的第二容器。
29. —种试剂盒，所述试剂盒包括含权利要求21所述冻干剂的容器。
30. 根据权利要求29所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括含重建 溶剂的第二容器。
31. 阳离子胆固醇衍生物在促进冷冻干燥后的病毒体可重建性中的 应用，所述病毒体包括，在其^C重建状态，选自药物因子或抗原分子的 生物活性物质。
32. 根据权利要求31所述的应用，其特征在于，所述胆固醇衍生物 在胆固醇的3-位置上具有阳性荷电的取代基，并且由下式表示<formula>formula see original document page 5</formula>(I)其中R选自R'; R'- (C=0)-; R'-O- (C=0)-; R'-NH画(C=0)-; R'國O- (OO) 隱R"画(C=0) -; R'- NH-(C=0)-R"-(C=0)-，其中R'为被至少一个阳性荷电基团取代的d-C6-烷基，优选地是通 式1^112113#-的含]^基团，并且各自的反离子是X-; 其中R1; R2和R3相互独立地选自氢和C广CV烷基； 其中x-选自由卣素、硫酸氢根、磺酸根、磷酸二氢根、醋酸根、三 囟醋酸根和碳酸氢根；以及 其中R"是d-CV亚烃基。
33.根据权利要求32所述的应用，其特征在于，所述胆固醇衍生物 由下式表示<formula>formula see original document page 6</formula> (I工)其中，R!，R2和R3相互独立地选自氢和C广C6-烷基，并且其中x—是卤素阴离子。
34. 根据权利要求33所述的应用，其特征在于，R4和R2是甲基，以及R3是氢。
35. 根据权利要求33所述的应用，其特征在于，Rp R2和R3是甲基。
36. 根据权利要求31-35所述的应用，其特征在于，病毒体膜中的所 述阳离子脂质的含量在膜总脂含量的1.9和37moP/。之间。
37. 根据权利要求36所述的应用，其特征在于，病毒体膜中的所述 阳离子脂质的含量在膜总脂含量的1.9和16moP/。之间。
38. 根据权利要求36或37所述的应用，其特征在于，所述病毒体 膜的其余脂含量由磷脂组成。
39. 根据权利要求38所述的应用，其特征在于，所述磷脂是磷脂酰 胆碱和磷脂酰乙醇胺。
40. 根据权利要求39所述的组合物，其特征在于，所述磷脂酰胆碱 和磷脂酰乙醇胺以3: l到5: 1,优选以七1的比例存在。
41.根据权利要求32-40中任一权利要求所述的应用，其特征在于, 所述应用还包括佐剂，或佐剂系统。 '
全文摘要
本发明涉及用于病毒体的高效冷冻干燥和重建的组合物和方法。
文档编号A61K9/127GK101119707SQ200580048279
公开日2008年2月6日 申请日期2005年12月21日 优先权日2004年12月30日
发明者西尔维娅·拉西, 里纳尔多·楚尔布里根, 马里奥·阿马克 申请人:佩维恩生物技术有限公司