专利名称：新型抗乙肝病毒抑制剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明设计药物领域，具体地，本发明设计一种含咖啡提取物的抗乙肝病毒(HBV)抑制剂及其应用。所述抗乙肝病毒抑制剂抑制HBVDNA复制，抑制HBeAg和HbsAg的合成和分泌，可用作治疗和辅助治疗乙型肝炎的药物。
背景技术：
咖啡成分包括绿原酸(A)，咖啡酸(B)和奎宁(尼)酸(C)等，其化学结构式如下。虽然有统计学的研究报道长期饮用咖啡能降低肝细胞肝癌的发病率，减少慢性肝炎的发生(包括慢性病毒性肝炎)，以及咖啡成分具有抗HIV，HSV等的活性报道，但是关于咖啡及其成分具有直接的抗HBV活性作用，国内外未见有研究报道。本发明的研究结果证明了咖啡，咖啡粗提物以及咖啡中含有的一类天然小分子化合物具有明显的抗乙肝病毒活性作用，抑制HBV DNA复制，抑制HBeAg和HbsAg的合成和分泌。我们的研究结果证实了日常饮用咖啡可能具有防治乙肝病毒引起的乙肝病毒性肝炎。
发明内容
本发明的目的是提供一种包含咖啡提取物的抗乙肝病毒抑制剂。
本发明的再一目的是提供上述抗乙肝病毒抑制剂在制备用于治疗乙肝的药物中的应用。
本发明提供了一种抗乙肝病毒抑制剂，其包括咖啡提取物和辅剂，其中，基于100重量份的所述抗乙肝病毒抑制剂，含有10～90重量份的咖啡提取物，余量为辅剂。
在本发明的抗乙肝病毒抑制剂中，其中所述咖啡提取物为普通咖啡、低咖啡因咖啡或脱咖啡因咖啡的提取物；所述辅剂为维生素C、羟丙维生素、预胶化淀粉、微粉硅胶、蔗糖、乙醇、防腐剂、和/或硬脂酸镁。
根据本发明的技术方案，所述咖啡提取物通过以下方法制备，1)咖啡在80～100℃的热水过滤或热水煮5～10分钟，获得咖啡溶液，其中，咖啡与水的重量比为1∶15～1∶5，并冻干咖啡溶液，获得粉末状咖啡提取物，其中，优选咖啡与水的重量比为1∶10；或2)称取咖啡置于圆底烧瓶内，加入95％食用乙醇，乙醇体积与咖啡质量的比例为1∶5ml/g，混合物加热到90℃进行回流1.5小时，过滤，滤液于旋转蒸发仪上、在60℃下进行浓缩成浸膏，进行喷雾干燥得粉末状咖啡粗提物；或3)称取咖啡置于圆底烧瓶内，加入40-60％食用乙醇，乙醇体积与咖啡质量的比例为1∶5ml/g，混合物加热到90℃进行回流1.5小时，过滤，滤液于旋转蒸发仪上60℃进行浓缩成浸膏，进行喷雾干燥得粉末状咖啡粗提物。
本发明还提供了上述抗乙肝病毒抑制剂在制备用于治疗乙肝的药物中的应用。
对于本发明的抗乙肝病毒抑制剂，其服用形式包括片剂(包括泡腾片)、胶囊剂(包括软胶囊)、冲剂、口服液、丸剂(包括滴丸)等已有的任意一种口服剂型。
本发明研究证明了咖啡和咖啡提取物能有效抑制乙肝病毒DNA复制、乙肝病毒s抗原和e抗原的合成，咖啡为一种常用饮料食品，无明显的毒副作用，其提取物可用于制成治疗或辅助治疗乙型肝炎的药物。
具体实施例方式
实施例实施例1提取咖啡粗提物普通咖啡(麦斯威尔咖啡，100％纯咖啡，美国Maxwell咖啡公司)和低咖啡因咖啡(美乐家经典低因咖啡，中等程度烤陪，100％纯美乐家咖啡，包含不超过0.4％的咖啡因，德国Melitta集团)购自麦德龙超市。粗提物的提取方法为(1)称取40g咖啡，加入约400ml水，用咖啡壶(咖啡壶专用18k包金金属过滤网)煮成新鲜咖啡后，冻干，获得粉末状咖啡粗提物；或者，(2)称取100g咖啡置于1L的圆底烧瓶，加入95％食用乙醇约500ml，加热到90℃进行回流1.5小时，过滤，滤液于旋转蒸发仪上、在60℃下进行浓缩成浸膏，进行喷雾干燥得粉末状咖啡粗提物；或者，(3)称取100g咖啡置于1L的圆底烧瓶，加入40-60％食用乙醇约500ml，加热到90℃进行回流1.5小时，过滤，滤液于旋转蒸发仪上60℃进行浓缩成浸膏，进行喷雾干燥得粉末状咖啡粗提物。称重，与原咖啡质量相比，得回收率。绿原酸，咖啡酸和奎宁(尼)酸在咖啡粗提物中的含量，分别以各自的标准品为对照，做标准曲线，采用HPLC-ESI-MS/MS法进行含量测定。
实施例2～3提取咖啡粗提物除了咖啡与水的重量比为1∶15和1∶5之外，以与实施例1相同的方法提取咖啡粗提物。
实施例4选用下列用量的咖啡或脱咖啡因咖啡提取物，并使用药食两用植物金银花提取物配以辅料，以如下比例混合咖啡或脱咖啡因咖啡提取物 400克金银花提取物 400克羟丙维生素 20克微粉硅胶 60克预胶化淀粉 120克硬脂酸镁 适量制成 1000粒将脱咖啡因咖啡提取物、金银花提取物与附加剂混合均匀，用10％预胶化淀粉浆作为粘合剂，湿法制粒，烘干，加入适量硬脂酸镁混合，压制成片剂。
实施例5选用下列用量的咖啡或脱咖啡因咖啡提取物、维生素C与辅料，以如下比例混合咖啡或脱咖啡因咖啡提取物 400克维生素C 400克羟丙维生素20克微粉硅胶 48克乙醇 适量硬脂酸镁 适量制成 900粒将咖啡与羟丙纤维素及微粉硅胶混合，用适量70％醇做湿润剂，湿法制粒，过40目筛选成颗粒，烘干，加入硬脂酸镁，混合，装入硬胶囊。
实施例6选用下列用量的咖啡或脱咖啡因咖啡提取物、维生素C与附加剂，以如下比例混合咖啡或脱咖啡因咖啡提取物800克维生素C 400克蔗糖40克防腐剂 适量蒸馏水 适量制成20000ml
取蒸馏水适量，加入咖啡，边加边搅拌使溶解，过滤。另将蔗糖和防腐剂用蒸馏水加热溶解，在搅拌下缓缓加入上述溶液，加蒸馏水至全量，混合，冷藏，过滤，罐封，灭菌，得口服液。
实施例7除基于1000g的总混合物使用200g咖啡或脱咖啡因咖啡提取物和600g金银花提取物外，以与实施例4相同的方法制剂。
实施例8除基于1000g的总混合物使用600g咖啡或脱咖啡因咖啡提取物和200g金银花提取物外，以与实施例4相同的方法制剂。
实验实施例一、实验目的样品化合物抗乙型肝炎病毒(HBV)活性筛选。试验包括在病毒一细胞水平的试验中，检测样品化合物的细胞毒性、对乙型肝炎病毒表面和核心抗原的分泌，以及病毒核酸(DNA)的复制水平的影响作用。
二、实验原理乙型肝炎病毒(HBV)转基因人肝癌细胞HepG2.2.15细胞株，在培养时能分泌乙肝病毒颗粒(含抗原和DNA)于培养上清中。
在抗病毒药物的干预下，检测细胞分泌到培养上清中的HBsAg、HBeAg以及病毒DNA含量，参照未加药对照组的含量，可以观测样品药物的抗病毒活性作用，同时检测样品药物的细胞毒性作用。运用MTT法检测样品药物导致50％细胞毒性死亡的数值浓度为CC50；用ELISA方法检测样品药物达到抑制HBsAg、HBeAg分泌，以及运用荧光定量PCR法检测样品药物抑制病毒DNA复制量的50％时的浓度数值为IC50。
三、实验样品临用时配成实验所需样品药物浓度，每个样品药物做7个稀释浓度的试验，并设拉米夫定等抗病毒药物作为实验的阳性对照药。
四、实验方法1、培养上清的收集将HepG2.2.15细胞接种于96孔板中，次日加入样品药物，定期更换培养液及同浓度的样品药物，于第八天收集培养上清待测。向96孔板中的细胞加MTT，4小时后加MTT溶解液反应过夜，次日在酶标仪上测OD570。根据OD值计算出样品药物对HepG2.2.15细胞的毒性作用，影响细胞生长的状况，导致半数细胞死亡量所需的浓度(CC50)。
2、处理细胞的收集将HepG2.2.15细胞接种于培养瓶中，次日加入样品药物，经定期更换培养液及同浓度的样品药物，于第八天收集细胞待测。
3、培养上清中HBsAg和HBeAg含量的检测(ELISA法)运用HBsAg和HBeAg检测用试剂盒(华美生物工程公司，河南洛阳)进行检测。向包被好的条形板中加入样品，并加入等量的酶标结合物，37℃反应1小时后洗板，重复5次。加入显色液A和B，15分钟后终止反应，测定OD450/630，并根据OD值计算出样品对HBV抗原的半数抑制率(IC50)。
4、荧光定量PCR法检测样本中HBV-DNA含量(1)细胞外培养上清中HBV DNA检测取适量的培养上清加入到等体积的病毒提取液中，混匀后煮沸，然后于室温10000rpm离心5分钟，取适量的上清用于PCR扩增，同时设置HBV-DNA标准样品5个，做标准曲线。并根据检测所得的病毒DNA复制值，计算出每个样品药物各浓度时对HBV-DNA复制的抑制率，然后再进行样品药物半数抑制率计算获得其(IC50)，对不能进行IC50值计算的样品，给与ICx表示并给出相应的浓度数值。
试验用PCR引物为P15’ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT3’P25’ACAGTGGGGAAAGCCCTACGAA3’，试验用PCR探针为5’TGGCTAGTTTACTAGTGCCATTTTG3’(2)细胞内HBV核心颗粒中DNA检测溶液A1ml 10mM Tris(pH 7.5)/1mM EDTA/50mM NaCl/8％蔗糖/0.25％Nonidet(诺乃洗涤剂)P-40，裂解液溶液BDNase I(50g/ml)和RNase A(20g/ml)，提取液溶液C26％聚乙二醇/1.4M NaCl/25mM EDTA，沉淀液溶液D10mM Tris(pH 7.5)/6mM MgCl2，悬液采用的方法为用药处理8天的细胞，胰酶消化，从细胞中提取核心颗粒中的DNA消化下来的细胞用溶液A裂解，4℃离心3min，取上清，调成6mM MgCl2浓度，加入溶液B，37℃30min。加入330μl溶液C沉淀核心颗粒，4℃30min后，离心4min。沉淀重悬于100μl溶液D，加入DNase I 37℃消化15min，所获得的样品进行实时荧光定量PCR，以HepG2.2.15细胞总DNA中GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)为内标，检测HBV核心颗粒中DNA水平的改变。
试验引物为P35’-GGTATCGTGGAAGGACTCATGAC-3’P45’-ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAGC-3’五、实验结果表1、实施例1制备的咖啡提取物及咖啡成分绿原酸，咖啡酸和奎宁(尼)酸对HepG2.2.15细胞HBV的抑制作用
aCC50为样品药物对HepG2.2.15细胞的生长的影响，50％致死浓度。
bIC50为样品对DNA拷贝的抑制达50％时的浓度。SI为样品生物活性选择系数。
表2、绿原酸，咖啡酸和奎宁(尼)酸在咖啡中的含量
40g咖啡，经18k包金金属过滤网咖啡壶加热过滤后得到约400ml新鲜饮用咖啡，经冻干浓缩成咖啡粗提物。普通咖啡回收得10g咖啡粗提物；低咖啡因咖啡回收得8.6g咖啡粗提物。检测相应的活性化合物在粗提物中的含量，然后换算成在100ml新鲜饮用咖啡中的含量。
权利要求
1.一种抗乙肝病毒抑制剂，其特征在于，包括咖啡提取物和辅剂。
2.如权利要求1所述的抗乙肝病毒抑制剂，其特征在于，基于100重量份的所述抗乙肝病毒抑制剂，含有10～90重量份的咖啡提取物，余量为辅剂。
3.如权利要求1或2所述的抗乙肝病毒抑制剂，其特征在于，所述咖啡提取物为普通咖啡、低咖啡因咖啡或脱咖啡因咖啡的提取物。
4.如权利要求1所述的抗乙肝病毒抑制剂，其特征在于，所述辅剂包括维生素C、羟丙维生素、预胶化淀粉、微粉硅胶、蔗糖、乙醇、防腐剂、和/或硬脂酸镁。
5.如权利要求1所述的抗乙肝病毒抑制剂，其特征在于，所述咖啡提取物通过以下方法制备，1)咖啡在80～100℃的热水过滤或热水煮5～10分钟，获得咖啡溶液，其中，咖啡与水的重量比为1∶15～1∶5，并冻干咖啡溶液，获得粉末状咖啡提取物；或2)称取咖啡置于圆底烧瓶内，加入95％食用乙醇，乙醇体积与咖啡质量的比例为1∶5ml/g，混合物加热到90℃进行回流1.5小时，过滤，滤液于旋转蒸发仪上、在60℃下进行浓缩成浸膏，进行喷雾干燥得粉末状咖啡粗提物；或3)称取咖啡置于圆底烧瓶内，加入40-60％食用乙醇，乙醇体积与咖啡质量的比例为1∶5ml/g，混合物加热到90℃进行回流1.5小时，过滤，滤液于旋转蒸发仪上60℃进行浓缩成浸膏，进行喷雾干燥得粉末状咖啡粗提物。
6.如权利要求5所述的抗乙肝病毒抑制剂，其特征在于，在方法1)中，咖啡与水的重量比为1∶10。
7.权利要求1所述的抗乙肝病毒抑制剂在制备用于治疗乙肝的药物中的应用。
8.权利要求1的抗乙肝病毒抑制剂的剂型，其特征在于，所述剂型为片剂、胶囊剂、冲剂、口服液、或丸剂。
全文摘要
本发明设计一种含咖啡提取物的抗乙肝病毒(HBV)抑制剂及其应用。经药理试验表明该类抑制剂能有效抑制乙肝病毒DNA复制、乙肝病毒s抗原和e抗原的合成，并且具有高效低毒的优点，因此，可以用作治疗或辅助治疗乙型肝炎，且具有廉价、安全、方便的特点。
文档编号A61K9/10GK1879727SQ20061002639
公开日2006年12月20日 申请日期2006年5月9日 优先权日2006年5月9日
发明者左建平, 赵维民, 王桂凤, 刘群芳, 石丽萍, 张如隽, 任宇丹, 邹健, 何佩岚, 冯加权, 唐炜, 朱峰华 申请人:中国科学院上海药物研究所