专利名称：一种促进鳗鱼肝脏生长发育的微生物制剂及制作方法
技术领域：
本发明涉及一种促进鳗鱼肝脏生长发育的微生物制剂及制作方法，可添加在常用鳗鱼饲料中，利用特殊微生物及代谢产物促进鳗鱼肝脏发育及生长，进而提高鳗鱼中特殊的蛋白和产生维生素A能力，属于农业生物制品技术领域。
背景技术：
鳗鱼是一种名贵食用鱼类，具备补虚养血、祛湿抗痨等功效，是久病、虚弱、贫血、肺结核等病人的良好营养品。鳗鱼体内含有一种很稀有的西河洛克蛋白，具有良好的强精壮肾的功效，鳗鱼是富含钙质的水产品，经常食用，可增加血钙，强健身体。鳗鱼肝脏中含有丰富的维生素A，是夜盲症病人的优良食品。由于鳗鱼具有以上特殊功效，所以其养殖前景广阔，但是，由于近年来大量蛋白饲料的使用和抗生素的添加，鳗鱼抗生素残留增加，生长水体品质严重下降，表现为氨氮和亚硝酸盐含量严重超标，渔体主要合成特殊蛋白和维生素A的器官——肝脏生长缓慢，从而使食用品质严重下降。
鳗鱼饲料的相关专利，其申请号为CN88106818.7，题为“鳗鱼配合饲料秘方”，该专利仅从营养学角度，提供了一种适于鳗鱼生长的饲料配方，无任何微生物作用及机理。
发明内容
本发明的目的是发明一种促进鳗鱼肝脏生长发育的微生物制剂及制作方法。
为实现以上目的，本发明的技术方案是提供一种促进鳗鱼肝脏生长发育的微生物制剂及制作方法，其特征在于，所述菌种扩大培养基中菌种重量百分比为地衣芽孢杆菌 28-32％、植物乳杆菌 20-28％、干酪乳杆菌 25-28％、啤酒酵母菌 13-27％。
本发明所述的一种促进鳗鱼肝脏生长发育的微生物制剂的制作方法，其特征在于，采用的菌种通过自然界中生长的有益菌株进行筛选，利用特定培养基进行优化选育，生产工艺采用多菌种的复合、分级发酵工艺，每级发酵均有主要的代谢产物，在后处理工艺过程中添加适于菌体生长保存的特殊载体。它包括以下步骤第一步生产菌株选育a.菌株筛选在肉牛的瘤胃中取食糜为菌源，采用MRS乳酸菌培养基进行乳酸菌分离，筛选出植物乳杆菌和干酪乳杆菌和地衣芽孢杆菌；在啤酒发酵液中用酵母选择培养基分离啤酒酵母菌；将分离的菌种分别在营养琼脂培养基中4℃下保存菌种；b.分离的菌种分别接种于肉汤培养基中，在35-40℃温度下培养22-28小时后，将啤酒酵母菌接种于麦氏(Meclary)琼脂培养基，将植物乳杆菌和干酪乳杆菌和地衣芽孢杆菌接种于乳酸菌培养基中，进行划线培养，选出生长快、菌体特征明显的纳豆杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、啤酒酵母菌分别在实验室中保存；c.生产制种最后将选出生长快的地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、啤酒酵母菌分别转接入装有营养琼脂作培养基的茄子瓶中，在35-40℃温度下培养45-50小时，待茄子瓶表面菌苔布满，并白中带黄时即可取出。然后放入2-6℃的冰箱中进行保存；第二步有益菌株的单独及复合培养a.按重量配比称取步骤1生产制种的植物乳杆菌、干酪乳杆菌、啤酒酵母菌和地衣芽孢杆菌；b.将称取的植物乳杆菌、干酪乳杆菌和啤酒酵母菌混合在一起进行复合培养将茄子瓶中混合菌苔按1∶25-30的比例接种于121-130℃、30-45min高温灭菌的培养基中，在发酵罐中搅拌30min，其转速为200-240r/min，搅拌均匀后放入200L的消毒后塑料桶中静置10-15天，静置过程中每天测定Ph值并释放产出的气体，防止饲料桶爆裂，待Ph到达3.0-4.0时发酵结束；c.将称取的地衣芽孢杆菌单独培养将茄子瓶种的地衣芽孢杆菌按1∶25-35的比例接种于121-130℃、30-45min高温灭菌的培养基中，搅拌转速为200r/min-240r/min，培养温度为35-40℃，通气量1∶1，发酵时间为22-26小时，显微镜下观察90-95％生孢时结束；
第三步菌群的驯化和扩大培养将步骤2单独和复合培养的菌液混合按1∶25-30的比例接入121-130℃、30-45min高温灭菌的固体扩大培养基中，搅拌30-45min至均匀，倒入消毒双层饲料袋中密封发酵，温度30-35℃时间12-15天，发酵过程中取样三次，测定水分和Ph值，发酵结束后取样，测定水分为35-40％、Ph值为3.5-4.0；第四步粉碎添加特殊载体；a.干燥将步骤3发酵完全的产品按时间先后放入培养箱干燥，每盘重量2.0公斤±0.5，温度控制在40-45℃，时间14-16小时，干燥完成的物料水份控制在≤11.8％；b.添加载体；将干燥后的产品按1∶0.02-0.03(即的2％-3％)比例添加载体，倒入搅拌机中搅拌均匀；转入粉碎间进行粉碎，物料温度控制在45℃以下，粉碎后的物料过50目筛网，筛后粗料重新粉碎；c.过筛后装入带有内袋的桶或袋中，扎紧袋口，系好标识牌，转入成品库有序堆放；取样检测，主要参主要参数水份≤11.8％、活菌数40-60亿/g；物理性状淡黄色粉末状固体。
所述的乳酸菌酵母菌复合培养是清糠或无菌水再加豆粕粉、尿素、硫酸铵、酵母粉、玉米粉、糖蜜、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸镁、硫酸镁中的至少两种混合物，其重量百分配比为糖蜜12-18％、尿素2-4％、酵母粉1-3％、磷酸二氢钾0-1％、磷酸氢二钠0-1％、无菌水73-85％。
所述的驯化和扩大培养培养基是清糠或无菌水再加豆粕粉、尿素、硫酸铵、酵母粉、玉米粉、糖蜜、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸镁、硫酸镁中的至少两种混合物，其重量百分配比为豆粕3-7％、清糠50-58％、尿素1-2％、酵母粉1-2％、玉米粉6-10％、糖蜜10-15％、硫酸镁0.5-1％、无菌水5-28.5％。
所述的特殊添加载体由斜土废石粉和饲料用碳酸钙组成，其重量百分配比为沸石粉60-80％、碳酸钙20-40％。
本发明采用由多种筛选出的菌种与有机营养物质混合，通过分级微生物发酵技术制成，培养基和营养载体作为营养物质，在部分被菌体利用后，通过菌体代谢产生的酶对培养基中的有机物质进行分解，并在特定的条件下组合，可形成目的产物，在培养物中含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素，还含有菌类多糖、Fe、Ga、Zn、Mn等营养物质和如黄酮及其甙类和有机酸、多肽、植物甾醇、三帖皂甙等一些代谢产物。
芽孢杆菌在其生长繁殖过程中能够产生乙酸、丙酸、丁酸等挥发性脂肪酸，这些酸类能够降低鳗鱼肠道的pH值，可有效抑制病原菌的生长，为乳酸菌的生长创造了条件，其中丙酸还能够参与三羧酸循环，为动物新陈代谢提供能量，促进肝脏发育和胆汁合成。芽孢杆菌在生长繁殖过程中还能够产生很高的维生素B1、B2、B6等B族维生素和维生素C，为鳗鱼提供维生素营养，从而促进动物生产性能的提高。芽孢杆菌在生长繁殖过程中还能够产生植酸酶，促进动物对植酸磷的利用和对脂肪的消化吸收率；产生的氨基氧化酶及分解硫化氢的酶类，可将吲哚类氧化成无毒、无害的物质，从而降低水体内氨氮和亚硝酸含量，改良水体。乳酸杆菌能合成鳗鱼所需要的多种维生素，如维生素B1、B2、B6、B12、烟酸、泛酸、叶酸等。啤酒酵母由啤酒工业麦汁培养物中的酵母菌体及该培养基的残渣组成，经干燥而得，其粗蛋白一般在40-50％，内含大量B族维生素和未知生长因子，啤酒酵母还可促进鳗鱼食欲，引诱效果较好。其内含的各种营养素保存完善，具有较浓的芳香味。
此发明的产品已在上海饲料办公室申请批准文号，批准文号饲添字(2002)127370，在上海及江浙一代养殖户中销售并使用，增产增质效果十分明显。本发明的优点是1.采用单独培养和复合培养及驯化相结合的发酵技术，既保证了有益菌种的高速生长，又保证了其代谢产物完全保留，最大限度保证了产品对养殖体的特殊功效；2.一种促进鳗鱼肝脏生长发育的微生物中的抗生素、微量元素及其它代谢产物与活菌本身共同生长作用，对养殖体的作用达到最佳促进作用；3.乳酸菌改善鳗鱼肠道、酵母菌提高合成特殊的洛克西河蛋白需要的单细胞蛋白、芽孢杆菌提供抵抗疾病的杆菌肽等抗生素并降低水体中氨氮和亚硝酸含量，菌体代谢产生大量的微量元素和多种维生素，促进肝脏类维生素A的合成，针对性强、使用效果明显；4.采用粮食作物和常用饲料载体作为主要培养基原料，降低了生产成本，同时使用常用的发酵及生产设备，易于在水产养殖中推广；5.本发明的产品添加到鳗鱼饲料中，在保证鳗鱼营养需要的情况下改善鳗鱼自身免疫系统和生长发育，在动物体内无任何抗生素和重金属残留，符合生态农业的要求，保证了食用者的身体健康。
具体实施例方式
以下结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1第一步生产菌株选育a.菌株筛选在鳗鱼肠道中取均菌源，采用MRS乳酸菌培养基进行乳酸菌分离，筛选出Lactobacillus plantarum(ATCC8014)植物乳杆菌、Lactobacillus casei(ATCC7469)干酪乳杆菌和licheniformis(13123)地衣芽孢杆菌；在啤酒发酵液中用酵母选择培养基分离Saccharomycescerevisiae(IFO0203)啤酒酵母菌；b.菌株接种于肉汤培养基中，在35℃温度下培养24小时，分别接种于麦氏(Meclary)琼脂、营养琼脂(LB培养基)和Lactic-bacteria Medium I(乳酸菌培养基)中，进行划线培养，选出生长快、菌体特征明显的啤酒酵母和植物乳杆菌、干酪乳杆菌和地衣芽孢杆菌，在实验室中保存；c.生产制种将菌种转接入装有营养琼脂作培养基的茄子瓶中，在37℃温度下培养45小时，待茄子瓶表面菌苔布满，并白中带黄时即可取出。然后放入2-6℃的冰箱中进行保存。各筛选培养基组分乳酸菌培养基酵母膏7.5g、蛋白胨7.5g、葡萄糖10g、KH2PO42g、西红柿汁100ml、Tween(吐温)800.5ml、Disti蒸馏水900ml pH7.0；酵母选择培养基葡萄糖1g、KCl1.8g、酵母浸膏2.5g、醋酸钠8.2g、琼脂15-20g、蒸馏水1000ml。
营养琼脂培养基牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g、琼脂15-20g、水1000ml、pH7.0-7.2。
麦氏琼脂为葡萄糖1g、KCI 1.8g、酵母浸膏2.5g、醋酸钠8.2g、琼脂15-20g、蒸馏水1000ml。这些培养基在实验室操作书中都有。
第二步有益菌株的单独及复合培养a.按如下比例称取各菌种地衣芽孢杆菌28％、植物乳杆菌21％、干酪乳杆菌25％、啤酒酵母菌26％；b.乳酸菌、酵母菌的复合培养由于乳酸菌和酵母菌都适合在酸性液体条件下生长，且为兼性厌氧发酵，所以本发明中进行同一培养基的驯化培养，将乳酸菌、酵母菌混合接种于121℃、30min高温灭菌由糖蜜12％、尿素2％、酵母粉1％、磷酸二氢钾0.5％、磷酸氢二钠0.5％、无菌水84％组成的的培养基中，在发酵罐中搅拌30min，其转速为220r/min，搅拌均匀后放入200L的消毒后塑料桶中静置12天，静置过程中每天测定Ph值并释放产出的气体，防止饲料桶爆裂，待Ph到达3.5时发酵结束；c.地衣芽孢杆菌单独培养由于地衣芽孢杆菌为好氧菌，且在环境营养消耗殆尽、Ph值剧烈变化时开始形成特殊休眠体——芽孢，而芽孢具有耐高温高热(地衣芽孢可在80℃存活)特点，所以本发明将地衣芽孢杆菌在液体发酵罐中培养，具体做法是将地衣芽孢杆菌接种于121℃、30min高温灭菌由豆粕粉5％、玉米粉8％、磷酸二氢钾0.4％、磷酸二氢钠1.6％、硫酸镁0.6％、尿素1.5％.无菌水83％组成的培养基中，搅拌转速为220r/min，培养温度为37℃，通气量1∶1，发酵时间为24小时，显微镜下观察95％生孢时结束；第三步菌群的驯化和扩大培养菌液由于在不同的发酵环境中生长，所以虽然浓度高、生长快，但在同一培养基中生长速度下降，需要进行同一培养基的驯化，同时，在发酵过程中各种菌体发酵产生特殊的代谢产物，是促进鳗鱼肠道消化吸收、肝脏中胆汁合成及改良水体的关键物质，所以本发明在菌株培养后进行菌群的驯化和扩大培养，其具体做法是a.将单独和复合培养的菌液按1∶25比例接入121℃、45min高温灭菌由豆粕3％、清糠50％、尿素1％、酵母粉1％、玉米粉6％、糖蜜10％、硫酸镁0.5％、无菌水28.5％组成的固体扩大培养基中，搅拌30min至均匀，倒入消毒双层饲料袋中密封发酵，温度30℃，时间12天；b.发酵过程中取样三次，测定水分和Ph值。发酵结束后取样，测定水分为35％、Ph值为3.5。
第四步粉碎添加特殊载体a.干燥发酵完全的产品按时间先后放入培养箱干燥，每盘重量2.5公斤，温度控制在45℃，时间15小时。干燥完成的物料水份控制在≤11.8％；b.加载体；干燥后的物料按2％比例添加由废石粉60％，碳酸钙40％组成的载体中搅拌均匀。
c.碎过筛物料干燥后，转入粉碎间进行粉碎，物料温度控制在45℃以下，粉碎后的物料过50目筛网，筛后粗料重新粉碎。
d.过筛后装入包装袋中扎好盖，系好标识牌，转入成品库有序堆放，通知品管部门取样检测，主要参数水份≤11.8％、活菌数50亿/g；物理性状淡黄色粉末状固体。
实施例2第一步生产菌株选育同实施例1第二步有益菌株的单独及复合培养a.乳酸菌、酵母菌的复合培养将乳酸菌、酵母菌混合接种于121℃、30min高温灭菌由糖蜜18％、尿素4％、酵母粉3％、磷酸二氢钾1％、磷酸氢二钠1％、无菌水73％组成的培养基中，在发酵罐中搅拌30min，其转速为220r/min，搅拌均匀后放入消毒后塑料桶中静置15天，静置过程中每天测定Ph值并释放产出的气体，防止饲料桶爆裂，待Ph到达3.5时发酵结束；b.地衣芽孢杆菌单独培养将茄子瓶菌苔接种于121℃、30min高温灭菌的培养基中，搅拌转速为220r/min，培养温度为37℃，通气量1∶1，
发酵时间为24小时，显微镜下观察95％生孢时结束；第三步菌群的驯化和扩大培养将单独和复合培养的菌液接入121℃、45min高温灭菌由豆粕7％、清糠56％、尿素2％、酵母粉2％、玉米粉10％、糖蜜15％、硫酸镁1％、无菌水7％组成的固体扩大培养基中，搅拌30min至均匀，倒入50kg消毒双层饲料袋中密封发酵。温度30℃，时间12天，发酵过程中取样三次，测定水分和Ph值。发酵结束后取样，测定水分为35％、Ph值为3.5。
第四步粉碎添加特殊载体。
a.干燥发酵完全的产品按时间先后放入培养箱干燥。每盘重量2.5公斤，温度控制在45℃，时间15小时。干燥完成的物料水份控制在≤11.8％；b.添加载体；干燥后的物料按3％添加由废石粉80％，碳酸钙20％组成的载体中，倒入搅拌机中搅拌均匀；c.粉碎过筛物料干燥后，转入粉碎间进行粉碎，物料温度控制在45℃以下，粉碎后的物料过50目筛网，筛后粗料重新粉碎；d.过筛后装入包装袋中扎好盖，系好标识牌，转入成品库有序堆放，通知品管部门取样检测，主要参数水份≤11.8％、活菌数50亿/g；物理性状淡黄色粉末状固体。
使用时按1.5-2.0‰比例添加到鳗鱼饲料中并搅拌均匀，本产品需在干燥通风处密闭封存，开封后应尽快使用。本产品使用后鳗鱼每日摄食量将明显增加，在上海奉贤水产站的推广实验中，实验组的日增重比对照组增加7-12％、生长周期缩短11天，试验塘的氨氮含量平均比对照组降低了56％，亚硝酸盐降低了42％，溶解氧提高了8％。
权利要求
1.一种促进鳗鱼肝脏生长发育的微生物制剂及制作方法，其特征在于，所述菌种扩大培养基中菌种重量百分比为地衣芽孢杆菌28-32％、植物乳杆菌20-28％、干酪乳杆菌25-28％、啤酒酵母菌13-27％。
2.根据权利要求1所述的一种促进鳗鱼肝脏生长发育的微生物制剂的制作方法，其特征在于，采用的菌种通过自然界中生长的有益菌株进行筛选，利用特定培养基进行优化选育，生产工艺采用多菌种的复合、分级发酵工艺，每级发酵均有主要的代谢产物，在后处理工艺过程中添加适于菌体生长保存的特殊载体。它包括以下步骤第一步生产菌株选育a.菌株筛选在肉牛的瘤胃中取食糜为菌源，采用MRS乳酸菌培养基进行乳酸菌分离，筛选出植物乳杆菌和干酪乳杆菌和地衣芽孢杆菌；在啤酒发酵液中用酵母选择培养基分离啤酒酵母菌；将分离的菌种分别在营养琼脂培养基中4℃下保存菌种；b.分离的菌种分别接种于肉汤培养基中，在35-40℃温度下培养22-28小时后，将啤酒酵母菌接种于麦氏(Meclary)琼脂培养基，将植物乳杆菌和干酪乳杆菌和地衣芽孢杆菌接种于乳酸菌培养基中，进行划线培养，选出生长快、菌体特征明显的纳豆杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、啤酒酵母菌分别在实验室中保存；c.生产制种最后将选出生长快的地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、啤酒酵母菌分别转接入装有营养琼脂作培养基的茄子瓶中，在35-40℃温度下培养45-50小时，待茄子瓶表面菌苔布满，并白中带黄时即可取出。然后放入2-6℃的冰箱中进行保存；第二步有益菌株的单独及复合培养a.按重量配比称取步骤1生产制种的植物乳杆菌、干酪乳杆菌、啤酒酵母菌和地衣芽孢杆菌；b.将称取的植物乳杆菌、干酪乳杆菌和啤酒酵母菌混合在一起进行复合培养将茄子瓶中混合菌苔按1∶25-30的比例接种于121-130℃、30-45min高温灭菌的培养基中，在发酵罐中搅拌30min，其转速为200-240r/min，搅拌均匀后放入200L的消毒后塑料桶中静置10-15天，静置过程中每天测定Ph值并释放产出的气体，防止饲料桶爆裂，待Ph到达3.0-4.0时发酵结束；c.将称取的地衣芽孢杆菌单独培养将茄子瓶种的地衣芽孢杆菌按1∶25-35的比例接种于121-130℃、30-45min高温灭菌的培养基中，搅拌转速为200r/min-240r/min，培养温度为35-40℃，通气量1∶1，发酵时间为22-26小时，显微镜下观察90-95％生孢时结束；第三步菌群的驯化和扩大培养将步骤2单独和复合培养的菌液混合按1∶25-30的比例接入121-130℃、30-45min高温灭菌的固体扩大培养基中，搅拌30-45min至均匀，倒入消毒双层饲料袋中密封发酵，温度30-35℃时间12-15天，发酵过程中取样三次，测定水分和Ph值，发酵结束后取样，测定水分为35-40％、Ph值为3.5-4.0；第四步粉碎添加特殊载体；a.干燥将步骤3发酵完全的产品按时间先后放入培养箱干燥，每盘重量2.0公斤±0.5，温度控制在40-45℃，时间14-16小时，干燥完成的物料水份控制在≤11.8％；b.添加载体；将干燥后的产品按1∶0.02-0.03比例添加载体，倒入搅拌机中搅拌均匀；转入粉碎间进行粉碎，物料温度控制在45℃以下，粉碎后的物料过50目筛网，筛后粗料重新粉碎；c.过筛后装入带有内袋的桶或袋中，扎紧袋口，系好标识牌，转入成品库有序堆放；取样检测，主要参数水份≤11.8％、活菌数40-60亿/g；物理性状淡黄色粉末状固体。
3.根据权利要求2所述的一种促进鳗鱼肝脏生长发育的微生物制剂及制作方法，其特征在于，所述的乳酸菌酵母菌复合培养基是清糠或无菌水再加豆粕粉、尿素、硫酸铵、酵母粉、玉米粉、糖蜜、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸镁、硫酸镁中的至少两种混合物，其重量百分配比为糖蜜12-18％、尿素2-4％、酵母粉1-3％、磷酸二氢钾0-1％、磷酸氢二钠0-1％、无菌水73-85％。
4.根据权利要求2所述的一种促进鳗鱼肝脏生长发育的微生物制剂及制作方法，其特征在于，所述的驯化和扩大培养基是清糠或无菌水再加豆粕粉、尿素、硫酸铵、酵母粉、玉米粉、糖蜜、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸镁、硫酸镁中的至少两种混合物，其重量百分配比为豆粕3-7％、清糠50-58％、尿素1-2％、酵母粉1-2％、玉米粉6-10％、糖蜜10-15％、硫酸镁0.5-1％、无菌水5-28.5％。
5.根据权利要求2所述的一种促进鳗鱼肝脏生长发育的微生物制剂及制作方法，其特征在于，所述的特殊添加载体由斜土废石粉和饲料用碳酸钙组成，其重量百分配比为沸石粉60-80％、碳酸钙20-40％。
全文摘要
本发明涉及一种促进鳗鱼(鳗鲡)生长发育特别是肝脏合成功能改善的微生物饲料添加剂，该产品将来源于自然界中选育的地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、啤酒酵母菌进行单独和复合培养，得到复合菌种进行驯化和扩大培养，然后再与培养基、无菌水等原料进行固体发酵，最后经干燥机进行低温快速干燥，添加特殊载体后粉碎过筛后即得到成品；本发明中的活菌和活性代谢产物含量最大化，使产品中含有高浓度的微生物和丰富的活性生理代谢物质。这些菌种及代谢物能改善鳗鱼肠道功能，促进胆汁合成及肝脏分成特殊蛋白质的功能，同时改良生长水体，是一种针对性和实用性很强的生态农业产品。
文档编号A61P1/16GK101073585SQ20061002665
公开日2007年11月21日 申请日期2006年5月18日 优先权日2006年5月18日
发明者江瀚 申请人:上海创博生态工程有限公司