专利名称：一类具有蛋白转导结构域tat－ptd的融合蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属基因工程技术领域，具体涉及一种蛋白转导结构域与一类抗氧化作用的蛋白分别形成的融合蛋白，以及该类融合蛋白在制备抗氧化药物中的应用。
背景技术：
基因治疗(gene therapy)是二十世纪八十年代以来发展起来的一项新技术，它主要是向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RNA片段，以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的。
传统的基因治疗是将目的基因导入到细胞当中，并使其表达，但是这一技术存在着诸多缺点限制了它的应用。首先是转染效率较低，或转染后目的基因表达水平不足，其次是常用的病毒载体存在着安全性的问题。
蛋白质转导是近年发展起来的一种将外源蛋白导入细胞的方法。将某些特殊的多肽与靶物质共价相连后，这些多肽会连同靶物质一起，进入临近细胞。这种由多肽携带靶物质跨过细胞膜的阻挡，进入细胞质的过程称为蛋白转导(protein transduction)。这些能携带外源物质进入细胞的多肽成称蛋白转导结构域(protein transduction domain，PTD)。
在正常情况下，蛋白质由于分子量较大，是不能透过细胞膜阻挡，进入细胞质甚至细胞核中的，但是将富含赖氨酸、精氨酸的蛋白转导结构域多肽与共价的所需要的目的基因产物相连后，这些目的基因产物就会被带到细胞中，发挥应有的生物学功能。目前利用该方法已经高效地将EGFP、β-半乳糖苷酶、Caspase-3、insulin等等多种多肽带到细胞中。目前最常用的蛋白转导结构域共价偶连方法是将目的基因与蛋白转导结构域基因相融合，最后产生赋予了新的转导能力的目的蛋白。
蛋白转导技术高效、快速，并且不受目的基因产物大小限制，因而有望成为一种新的基因治疗手段，目前正成为研究热点。
超氧化物歧化酶(SOD-1)、人血红素加氧酶(HO-1)、过氧化氢酶(CAT)以及谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)等都是人体内重要的抗氧化酶，在清除自由基，保持细胞内环境稳定中发挥着重要作用。然而当人体受到氧化损伤时外源补给的这些抗氧化酶并不能穿透细胞膜进入到细胞中，清除自由基，保护细胞，这大大降低了这些酶的应用价值。
发明内容
本发明的目的是利用人免疫缺陷病毒HIV的TAT基因编码的蛋白转导结构域(TAT-PTD)的转导能力来弥补超氧化物歧化酶(SOD-1)、人血红素加氧酶(HO-1)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)不能进入跨过细胞膜进入细胞发挥抗氧化作用的不足，将人免疫缺陷病毒TAT基因38-46氨基酸编码序列分别与人SOD-1、HO-1、CAT和PHGPx基因融合，使得这些基因的最终表达产物具有新的功能—能够进入细胞中，产生抗氧化作用。
本发明的融合蛋白具有R1-R2或R1-L-R2通式，其中R1为人免疫缺陷病毒HIV的TAT基因编码的蛋白转导结构域(TAT-PTD)，具有SEQ.ID.NO1的氨基酸残基序列其中R2为人Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD-1)、血红素加氧酶-1(HO-1)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)中的一种，其中超氧化物歧化酶(SOD-1)具有SEQ.ID.NO2的氨基酸残基序列，人血红素加氧酶(HO-1)具有SEQ.ID.NO3的氨基酸残基序列，过氧化氢酶(CAT)具有SEQ.ID.NO4的氨基酸残基序列，谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)具有SEQ.ID.NO5的氨基酸残基序列；L为连接子，其序列选自下列氨基酸中的一个或多个甘氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸和丙氨酸的氨基酸，或者选自下列各组合中的一种(a)ala，ala，ala；(b)ala，ala，ala，ala；(c)ala，ala，ala，ala，ala；(d)gly，gly；(e)gly，gly；(f)gly，gly，gly；(h)gly-pro-gly；或者(a)～(h)组中的任意几个的组合。
本发明的融合蛋白通过下述方式获得1、分别扩增人超氧化物歧化酶(SOD-1)、血红素加氧酶(HO-1)、过氧化氢酶(CAT)或谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)基因根据已知的SOD-1、CAT、HO-1及PHGPx基因的mRNA序列，设汁引物，用RT-PCR扩增出这四种基因的cDNA序列。扩增产物酶切后连接到表达载体中(比如Novagen公司的pET系列载体)，分别构建成为pET-SOD-1、pET-HO-1、pET-CAT和pET-PHGPx，上述载体经酶切及测序检测，序列正确。
2、构建融合蛋白基因TAT-PTD的核苷酸序列采用寡核苷酸合成。分别合成两条链引物，5’-TAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAC-3’(SEQ ID NO6)，以及5’-TCGAGTCTTCGTCGCTG TCTCCGCTTCTTCC-3’(SEQ ID NO7)。引物退火后分别连接到酶切后的pET-SOD-1、pET-HO-1、pET-CAT和pET-PHGPx载体中，构建成为pTAT-SOD-1、pTAT-HO-1、pTAT-CAT以及pTAT-PHGPx，上述载体经酶切及测序检测，序列正确。
3、融合基因在大肠杆菌中的表达用构建的载体pTAT-SOD-1、pTAT-HO-1、pTAT-CAT以及pTAT-PHGPx分别转化带有DE3的大肠杆菌。菌液生长至OD600＝0.5时，加入IPTG诱导2小时。SDS-PAGE电泳分析证实，上述融合基因在大肠杆菌(DE3)中获得高效表达。
4、融合蛋白纯化上述诱导表达的菌液经过超声破碎后，4℃下12000rpm离心30分钟，表达产物存在于上清液中，经镍柱亲和层析纯化，获得纯化后的融合蛋白，其纯度大于90％。
本发明的另一个目的是提供以本发明的一类融合蛋白中一种或多种混合为活性成分的抗氧化药物。在需要的时候，在上述药物中还可以含有一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。本发明的融合蛋白可以制成片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液及注射液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明巧妙地利用低分子量的TAT-PTD多肽与人源的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等等形成融合蛋白，克服了过去这些大分子的酶不能进入细胞内的缺点，赋予了它们新的功能，使得他们可以进入跨过细胞膜的阻挡，到细胞中发挥抗氧化作用细胞，提高细胞自身抗氧化能力。本发明的融合蛋白具有很高的应用价值，可以作为一种高效的抗氧化药物。
图1为构建pTAT-SOD-1载体示意图。
图2为纯化后的TAT-SOD-1融合蛋白SDS-PAGE电泳结果。
图3为纯化后的TAT-SOD-1融合蛋白用SOD-1抗体进行免疫印记的结果。
图4为不同浓度的TAT-SOD-1融合蛋白对Hela细胞的抗氧化作用曲线。
图5为不同浓度的TAT-SOD-1融合蛋白对角朊细胞的抗氧化作用曲线。
图6为不同浓度的TAT-CAT融合蛋白对Hela细胞的抗氧化作用曲线。
图7为不同浓度的TAT-CAT与TAT-SOD-1对角朊细胞的联合抗氧化作用曲线。
具体实施例方式
下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1 HIV-TAT-SOD-1融合蛋白在大肠杆菌中表达1、构建重组TAT-SOD-1融合蛋白基因
1)用RT-pCR扩增SOD-1基因采用TRIzol抽提肝脏的总RNA，用引物P1和P2进行PCR扩增(上海生工生物工程技术服务有限公司合成)，P15’-CTCGAGGCGACGAAGGCCGTGTGCGTG-3’(SEQ ID NO8)，以及P25’-GGATCCTTATTGGGCGATCCCAATTAC-3’(如SEQ ID NO9)。PCR扩增反应在50微升体系中进行，条件为94℃变性5min，94℃30s，54℃lmin，72℃Imim，30个循环，72℃5mim。反应完成后，全部PCR反应液加入1％琼脂糖中电泳，割胶回收500bp条带(回收反应采用赛百盛公司回收试剂盒)。回收产物连接到TA克隆载体中，用Xho I与BamHI酶切后，连入pET-15b载体中，构建成为pET-15b-SOD-1，插入序列经测序鉴定，序列正确(测序采取双脱氧法，ABI 3730DNA测序仪，测序引物T7promoter primer，上海博亚公司协助完成)。TAT-PTD的核苷酸序列采用寡核苷酸合成。分别合成两条链引物，5’-TAGGAAGAAGCGGAGA CAGCGACGAAGAC-3’(SEQ ID NO6)，以及5’-TCGAGTC-TTCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCC-3’(SEQID NO8)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物分别溶于100μl纯水，各取20μl，加入40μl 1mol/LNaCl和20μl石蜡油，置于沸水中煮5min后让其缓慢冷却，自动退火。将退火产物连接到用Nde和XHO-1消化的pET-15b-SOD-1中，构建成为pTAT-SOD-1，该载体经酶切及测序检测，序列正确(见图1所示)。
2、融合基因在大肠杆菌中的表达用构建的载体pTAT-SOD-1与pET-15b-SOD-1(前者作为试验，后者作为对照)分别转化E.coliBL21(DE3)。菌液生长至OD600＝0.6时，加入IPTG(终浓度为1mmol/L)37℃诱导2小时。
3、融合蛋白纯化上述诱导表达的菌液中加入溶菌酶处理一小时，经过超声破碎后，4℃以12000rpm离心30分钟，表达产物存在于上清液中。取离心后上清至10ml Eppendorf管中，加入Ni-NTA(Novagen公司)，4℃，50rpm震荡2h。将上述混合物转移至层析柱中，待液体快流尽时加入4ml Wash Buffer(含有PBS及0.1M的咪唑)，洗涤层析柱。待液体快流尽时加入300μL洗脱液，(含有PBS及0.4M的咪唑)收集流出的液体。纯化后液体经SDS-PAGE检验，分子量大小约为25KD，与计算值相符，获得融合蛋白纯度大于90％。用SOD-1抗体进行免疫印记，同样可以证实上述结果(图2、图3所示)。
4、融合蛋白进胞作用检测体外培养Hela细胞，在培养基中加入0.5-2μl纯化的TAT-SOD-1融合蛋白，轻柔混匀，一小时后用胰酶-EDTA消化细胞，收集1×106细胞，用SOD-1抗体进行免疫印记。结果显示随着加入的融合蛋白浓度增加，细胞内SOD-1浓度随之增加；而在用SOD-1处理过的细胞中没有杂交条带。
实施例2TAT-SOD-1融合蛋白在Hela细胞中抗氧化作用检测在体外培养的Hela细胞培养基中，试验组加入0.1-2μl纯化后的TAT-SOD-1蛋白，对照组加入0.1-2μl纯化后的SOD-1蛋白，两小时后更换培养基。加入终浓度为5mM甲基紫精(Paraquat)，以产生超氧化物阴离子。12小时后用比色法测量细胞存活率。比色法采用MTT(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-dip-henyltetrazolium bromide，Sigma)进行测定.结果表明加入TAT-SOD-1蛋白的试验组细胞存活率明显增高，证实TAT-SOD-1融合蛋白进入细胞并具有明显抗氧化能力(图4所示)。
实施例3TAT-SOD-1融合蛋白在角朊细胞中抗氧化作用检测在原代培养的小鼠皮肤角朊细胞培养基中，试验组加入0.5-2μl纯化后的TAT-SOD-1蛋白，对照组加入0.5-2μl纯化后的SOD-1蛋白，两小时后用胰酶和EDTA混合液消化细胞，离心去上清液，加入磷酸缓冲液动融，置于漩涡混匀器上剧烈混匀，再次离心，上清为SOD-1提取液。在二甲亚砜中加入NaOH，在有氧条件下可产生氧自由基，此时加入化学发光剂鲁米诺，会发出冷化学光。再取0.1mlSOD-1提取液加入发光溶液中，计算发光抑制率。抑制率越高，说明SOD-1浓度越高。结果显示试验组的SOD-1浓度显著高于对照组，说明含有转导结构域的SOD-1融合蛋白进入了角朊细胞中(见图5所示)。
实施例4TAT-CAT融合蛋白在Hela细胞中抗氧化作用检测采用实施例1的构建载体表达融合蛋白的方法，分别表达、纯化TAT-CAT与CAT。在体外培养的Hela细胞培养基中，试验组加入0.1-2μl纯化后的TAT-CAT蛋白，对照组加入0.1-2μl纯化后的CAT蛋白，2小时后加入0.5mM的H2O2，以产生氧自由基。12小时后，用前述的MTT比色法测量细胞存活率。结果表明加入TAT-SOD-1蛋白的试验组细胞存活率明显增高，证实TAT-SOD-1融合蛋白进入细胞并具有明显增高的抗氧化能力(见图6所示)。
实施例5TAT-CAT与TAT-SOD-1联合抗氧化作用检测在体外培养的Hela细胞培养基中，试验组加入0.1-4μl纯化后的TAT-SOD-1与TAT-CAT融合蛋白混合物(1∶1)，对照组加入0.1-4μl纯化后的CAT与SOD-1蛋白混合物(1∶1)蛋白。2小时后加入0.5mM的H2O2，或5mM甲基紫精(Paraquat)以产生氧自由基。12小时后，用前述的MTT比色法测量细胞存活率。结果表明加入TAT-CAT与TAT-SOD-1蛋白混合物的试验组细胞存活率明显高于对照组增高，证实TAT-SOD-1与TAT-CAT融合蛋白混合物有更强抗氧化能力(见图7所示)。
序列表(1)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度9个氨基酸残基(B)类型氨基酸(D)拓扑类型线性(ii)分子类型蛋白质(iii)序列描述SEQ ID NO1GRKKRRQRR(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度153个氨基酸残基(B)类型氨基酸(D)拓扑类型线性(ii)分子类型蛋白质(iii)序列描述SEQ ID NO2ATKAVCVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGCTSAGPHFNPLSRKHGGPKDEERHVGDLGNVTADKDGVADVSIEDSVISLSGDHCIIGRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQ(3)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度288个氨基酸残基(B)类型氨基酸(D)拓扑类型线性(ii)分子类型蛋白质(iii)序列描述SEQ ID NO3MERPQPDSMPQDLSEALKEATKEVHTQAENAEFMRNFQKGQVTRDGFKLVMASLYIIIYVALEEEIERNKESPVFAPVYFPEELHRKAALEQDLAFWYGPRWQEVIPYTPAMQHYVKRLHEVGRTEPELLVAHAYTRYLGDLSGGQVLKKIAQKALDLPSSGEGLAFFTFPNIASATKFKQLYRSRMNSLEMTPAVRQRVIEEAKTAFLLNIQLFEELQELLTHDTKDQSPSRAPGLRQRASNKVQDSAPVETPRGKPPLNTRSQAPLLRWVLTLSFLVATVAVGLYAM(4)SEQ ID NO4的信息
(i)序列特征(A)长度228个氨基酸残基(B)类型氨基酸(D)拓扑类型线性(ii)分子类型蛋白质(iii)序列描述SEQ ID NO4TKVWPHKDYPLIPVGKLVLNRNPVNYFAEVEQIAFDPSNMPPGIEASPDKMLQGRLFAYPDTHRHRLGPNYLHIPVNCPYRARVANYQRDGPMCMQDNQGGAPNYYPNSFGAPEQQPSALEHSIQYSGEVRRFNTANDDNVTQVRAFYVNVLNEEQRKRLCENIAGHLKDAQIFIQKKAVKNFTEVHPDYGSHIQALLDKYNAEKPKNAIHTFVQSGSHLAAREKANL(5)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度197个氨基酸残基(B)类型氨基酸(D)拓扑类型线性(ii)分子类型蛋白质(iii)序列描述SEQ ID NO5MSLGRLCRLLKPALLCGALAAPGLAGTMCASRDDWRCARSMHEFSAKDIDGHMVNLDKYRGFVCIVTNVASQXGKTEVNYTQLVDLHARYAECGLRILAFPCNQFGKQEPGSNEEIKEFAAGYNVKFDMFSKICVNGDDAHPLWKWMKIQPKGKGILGNAIKWNFTKFLIDKNGCVVKRYGPMEEPLVIEKDLPHYF(6)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度31个核苷酸(B)类型核酸(D)拓扑类型线性(ii)分子类型核酸(iii)序列描述SEQ ID NO6TAGGAAGAAGCGGAGACAGCGACGAAGAC(7)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度31个核苷酸
(B)类型核酸(D)拓扑类型线性(ii)分子类型核酸(iii)序列描述SEQ ID NO7TCGAGTCTTCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCC(8)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度31个核苷酸(B)类型核酸(D)拓扑类型线性(ii)分子类型核酸(iii)序列描述SEQ ID NO8CTCGAGGCGACGAAGGCCGTGTGCGTG(9)SEQ ID NO9的信息(i)序列特征(A)长度31个核苷酸(B)类型核酸(D)拓扑类型线性(ii)分子类型核酸(iii)序列描述SEQ ID NO9GGATCCTTATTGGGCGATCCCAATTAC
权利要求
1.一种融合蛋白，其特征在于具有R1-R2或R1-L-R2通式，其中R1为人免疫缺陷病毒HIV的TAT基因编码的蛋白转导结构域；R2为人Cu/Zn超氧化物歧化酶、血红素加氧酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶中的一种；L为连接子。
2.根据权利要求书1的融合蛋白，其特征在于R1的氨基酸序列如SEQ.ID.NO1所示。
3.根据权利要求书1的融合蛋白，其特征在于所述超氧化物歧化酶氨基酸序列如SEQ.ID.NO2所示，人血红素加氧酶氨基酸序列如SEQ.ID.NO3所示，过氧化氢酶氨基酸序列如SEQ.ID.NO4所示，谷胱甘肽过氧化物酶氨基酸序列如SEQ.ID.NO5所示。
4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述连接子序列采用下列氨基酸中一个或多个甘氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸和丙氨酸的氨基酸。
5.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述连接子选自下述之一种(a)ala，ala，ala；(b)ala，ala，ala，ala；(c)ala，ala，ala，ala，ala；(d)gly，gly；(e)gly，gly；(f)gly，gly，gly；(h)gly-pro-gly；或者(a)～(h)中的任意几个组合。
6.一种抗氧化药物，其特征在于以权利要求1-5之一所述融合蛋白中一种或多种混合物作为活性成分。
7.根据权利要求1所述的抗氧化药物，其特征在于含有一种或多种医学上可以接受的载体。
全文摘要
本发明属于基因工程技术领域，具体为一种蛋白转导结构域多肽(TAT－PTD)分别与四种抗氧化酶人Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD－1)、血红素加氧酶－1(HO－1)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPx)融合形成的融合蛋白。该类融合蛋白能跨过细胞膜进入细胞中，并发挥很好的抗氧化作用。以本发明该类融合蛋白中一种或多种为活性成分的抗氧化药物都对人体细胞有明显的抗氧化保护作用。
文档编号A61K38/16GK1908016SQ20061003035
公开日2007年2月7日 申请日期2006年8月24日 优先权日2006年8月24日
发明者卢大儒, 张舒羽 申请人:复旦大学