专利名称：一种蛋白a免疫吸附材料及其制备方法
技术领域：
本发明属于医用生物材料，具体的是涉及用于血液净化用的蛋白A免疫吸附材料及其制备方法。
背景技术：
很多疾病的发生与发展都是由于致病因子在机体内积累的结果。能特异、有效地通过净化血液的方法从机体内清除这些致病因子，而又不造成对机体的损害，是临床医学近一二十年来一直不断探索的问题。免疫吸附治疗是血液净化的一种重要方法，其原理是将某一配体牢固地结合在一个固定的载体上构建成免疫吸附柱，通过体外循的方法特异性地清除患者血液中的致病因子，净化血液，从而达到治疗疾病的目的。目前临床上应用免疫吸附能够通过特异性地清除机体的自身抗体，治疗自身免疫性疾病、器官移植排斥反应，以及通过吸附低密度脂蛋白治疗高胆固醇血症及其并发症等。由于免疫吸附疗法直接从血液中去除致病因子，在治疗过程中不丢失血浆有效成分，不输入异体血浆，可避免交叉感染、过敏反应等优点，而且治疗效果显著，因而具有良好的临床应用前景。
葡萄球菌蛋白A(SPA)是某些金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白质，其分子量约为42,000，其氨基末端含有4-5个高度类似的免疫球蛋白Fc段结合区，可与人体血浆中的抗体(如免疫球蛋白IgG)及其免疫复合物的Fc段特异结合。如果将SPA固定在某一载体上制备成载体-SPA复合物免疫吸附柱，当人体血浆通过该吸附柱时，血浆中的抗体及其免疫复合物就会被特异性地吸附，一些因抗体和免疫复合物导致的疾病与症状，如自身免疫性疾病、器官移植、恶性肿瘤等即可得到预防、治疗与缓解。免疫吸附治疗的关键是免疫吸附柱的研制，具体的说就是免疫吸附柱中免疫吸附材料的合成，所以将SPA固定在载体上的合成技术至关重要。目前，临床上使用的蛋白A免疫吸附材料采用的载体基质主要是琼脂糖凝胶和硅胶，偶联试剂一般采用溴化氰、羰基咪唑、环氧氯丙烷等。由于溴化氰是剧毒物质，合成过程对人体和环境危害较大；并且用溴化氰方法偶联的蛋白基团容易脱落进入人体，对病人产生较大的副作用。所以这一合成工艺不甚理想。
贾凌云和夏列波等人发明了蛋白A-琼脂糖免疫吸附材料的新方法，它们分别采用羰基二咪唑(申请号01106107.3，公开号CN1367181A)和环氧氯丙烷(申请号01103114.X，公开号CN1365853A)作为偶联试剂活化琼脂糖载体。虽然这两种方法剔除了剧毒物质溴化氰，其制备的材料使用也更安全，但其制备过程反应步骤较多，需要经过五步化学反应才能合成吸附材料，方法复杂，因此得到的吸附材料产品批间差异大，性能不稳定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种无毒、无害、SPA吸附效率高以及稳定性能好的SPA免疫吸附材料。
本发明的另一目的是提供一种新的SPA免疫吸附材料的制备方法，该方法无毒、无害、反应路线较短、操作简便，能取代溴化氰法、羰基咪唑法和环氧氯丙烷法。
本发明的另一目的是提供上述吸附材料在血液净化中的应用。
本发明的技术方案是蛋白A免疫吸附材料，是琼脂糖凝胶与蛋白A偶联的高分子材料，其具有如下的化学结构
其中 代表琼脂糖凝胶，X代表C2～6的直链烷基，或者代表CH2-CH2-On，其中n＝1～9，SPA-NH2为蛋白A。
上述蛋白A免疫吸附材料，其特征是X代表-CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-或者-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-。
琼脂糖凝胶是一种天然多糖，含有丰富的羟基，它可参与多种化学反应转化为活性基团，然后与蛋白A反应固定在琼脂糖凝胶载体上。本发明的基本构想是选用偶联试剂双缩水甘油醚类试剂，作为活化琼脂糖凝胶的试剂。这些活化试剂都含有两个环氧基团，是一类具有很高反应活性的试剂，其中的一个环氧基团可与琼脂糖凝胶上的羟基反应，另一个环氧基团可在温和的条件下与SPA上的氨基反应，从而将SPA以共价键方式固定在琼脂糖凝胶上。
上述蛋白A免疫吸附材料的制备方法是以琼脂糖凝胶为载体，将琼脂糖凝胶与偶联试剂双缩水甘油醚类试剂反应形成活化琼脂糖凝胶，然后与蛋白A的氨基偶联，形成琼脂糖凝胶蛋白A免疫吸附材料，具体在于a、偶联试剂双缩水甘油醚类试剂与琼脂糖凝胶在0.4～1.0mol/L的碱性水溶液中，于20～40℃下反应；琼脂糖凝胶在反应液中所占的体积比为30％～50％；
b、步骤a反应结束后，将活性琼脂糖凝胶过滤，用蒸馏水冲洗至中性；C、步骤b所得的活性琼脂糖凝胶溶于PH缓冲液中，控制pH值在8.0～10.0范围内，加入蛋白A，0～40℃反应16～20小时；D、步骤c所得产物进行端基封闭反应。
反应方程式如下 其中，X代表-CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-，或者CH2-CH2-On其中n＝1～9 为琼脂糖凝胶，SPA-NH2为蛋白A。
具体的偶联试剂为乙二醇双缩水甘油醚、1，4-丁二醇双缩水甘油醚、1，6-己二醇双缩水甘油醚或聚乙二醇双缩水甘油醚中的任一种。
SPA是一个具有约42,000分子量的大分子，与其特异性结合的抗体及其免疫复合物分子更大，其分子量是几十万到上百万，SPA要保持其吸附能力，需要保证与琼脂糖键合后，其空间立体结构不变形，同时大分子抗体及其免疫复合物与SPA的接触也需要足够的空间，SPA免疫吸附材料的微环境对其吸附能力影响很大。SPA只有充分裸露在琼脂糖凝胶载体外面，被吸附的抗体及其免疫复合物才能尽可能地无空间障碍地与SPA接触，充分发挥SPA的吸附能力。如果在材料表面与SPA之间有一定长度的间隔臂，使SPA与材料表面保持一定的距离，将保证其空间结构不变，同时抗体及其免疫复合物能不受空间障碍地与SPA尽可能接触，提高材料上SPA的吸附效率。本发明选择的偶联试剂乙二醇双缩水甘油醚主链含有10个原子(X＝CH2CH2)、1，4-丁二醇双缩水甘油醚主链含有12个原子(X＝CH2CH2CH2CH2)、1，6己二醇双缩水甘油醚主链含有14个原子(X＝CH2CH2CH2CH2CH2CH2)具有较长的长度，将SPA固定在琼脂糖凝胶上后SPA能够充分暴露在材料表面，这样制得的材料SPA的吸附效率较高，降低了生产成本。同样，选择聚乙二醇醚双缩水甘油醚作为偶联试剂(X＝CH2-CH2-On)也得到较好的结果。
由于空间的障碍，大分子的SPA与带有乙二醇双缩水甘油醚等活化的载体反应后，将还有一些未反应完的环氧基团，这些基团是产生非特异性吸附的潜在因素，必须将其惰性化。本发明选用甘氨酸乙酯盐酸盐或乙醇胺其中的一种作为封端试剂，除去未反应的环氧活性基团。
本发明还包括所述的蛋白A免疫吸附材料在血液净化中的应用。
基于以上叙述，本发明的显著优势和效果是1、选用乙二醇(或丁二醇、己二醇及聚乙二醇醚)双缩水甘油醚作为活化琼脂糖凝胶的试剂，克服了溴化氰活化的毒性和不稳定性，从而增加了合成的安全性，延长了材料的使用寿命；2、乙二醇(或丁二醇、己二醇及聚乙二醇醚)双缩水甘油醚分子含有一定的长度，这样就在琼脂糖凝胶载体表面与蛋白A之间引入了间隔臂，为蛋白A与抗体及抗体抗原复合物的结合创造了足够的空间，改善了材料的微环境，从而提高了蛋白A对免疫球蛋白及免疫复合物的结合效率，减少了吸附剂的用量，降低了生产成本。
3、琼脂糖凝胶载体通过乙二醇(或丁二醇、己二醇及聚乙二醇醚)双缩水甘油醚活化后，由于带有间隔臂，与蛋白A反应的环氧基团具有更高的活性，从而能提高蛋白A的键合量。
4、活化与连接间隔臂于一步反应同时完成，从而使制备过程大为简化，减少了产品的批间差异。
5、吸附材料的吸附效率高，再生性能好。
以上的优势在临床治疗上表现为提高了临床治疗效果、安全性和可靠性。体外血浆吸附试验数据表明，本发明的蛋白A免疫吸附材料对人体免疫球蛋白特别是IgG具有特异性吸附。
具体实施例方式
以下详述本发明的实施例。应理解的是，本发明的实施例用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质而进行的改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例一含有环氧基的活性琼脂糖凝胶(Sepharose 6FF)的合成1.琼脂糖凝胶与乙二醇双缩水甘油醚的反应在5L的反应器中加入琼脂糖凝胶(Sepharose 6FF)1.5升，0.8mol/L的NaOH水溶液1000ml，混合均匀，加入乙二醇双缩水甘油醚1000ml后，置于恒温摇床中，在20℃下反应2小时。结束反应，将凝胶过滤，用大量蒸馏水冲洗至中性。将活化好的介质储存在4℃备用。用硫代硫酸钠法检测用这种方法活化的凝胶中的环氧基团数量，测得每毫升至少有45μmol的环氧活性基团。
2.琼脂糖凝胶与丁二醇双缩水甘油醚的反应在5L的反应器中加入琼脂糖凝胶(Sepharose 6FF)1升，1mol/L的NaOH水溶液1000ml，混合均匀，加入丁二醇双缩水甘油醚1000ml后，置于恒温摇床中，在35℃下反应2小时。结束反应，将凝胶过滤，用大量蒸馏水冲洗至中性。将活化好的介质储存在4℃备用。用硫代硫酸钠法检测用这种方法活化的凝胶中的环氧基团数量，测得每毫升至少有40μmol的环氧活性基团。
3、琼脂糖凝胶与己二醇双缩水甘油醚的反应在5L的反应器中加入琼脂糖凝胶(Sepharose 6FF)1升，0.5mol/L的KOH水溶液1000ml，混合均匀，加入己二醇双缩水甘油醚1000ml后，置于恒温摇床中，在20℃下反应2小时。结束反应，将凝胶过滤，用大量蒸馏水冲洗至中性。将活化好的介质储存在4℃备用。用硫代硫酸钠法检测用这种方法活化的凝胶中的环氧基团数量，测得每毫升至少有40μmol的环氧活性基团。
4、琼脂糖凝胶与聚乙二醇双缩水甘油醚的反应在5L的反应器中加入琼脂糖凝胶(Sepharose 6FF)1升，0.7mol/L的NaOH水溶液1000ml，混合均匀，加入聚乙二醇双缩水甘油醚(n＝9)1000ml后，置于恒温摇床中，在20℃下反应2小时。结束反应，将凝胶过滤，用大量蒸馏水冲洗至中性。将活化好的介质储存在4℃备用。用硫代硫酸钠法检测用这种方法活化的凝胶中的环氧基团数量，测得每毫升至少有35μmol的环氧活性基团。
实施例二蛋白A免疫吸附材料的合成1、活性琼脂糖凝胶(Sepharose 6FF)与蛋白A反应合成免疫吸附材料在5L的反应器中加入例一(1～3)中合成的环氧活性琼脂糖凝胶(Sepharose 6FF)1升，0.1mol/L的硼酸缓冲液1.5L，pH值控制在8.0～10.0范围内，加入6.0g蛋白A，在30℃恒温反应16小时，停止反应，回收未反应的蛋白A，用0.2mol/L的甘氨酸乙酯盐酸盐封端未反应的环氧活性基团，在室温反应5小时。用大量蒸馏水冲洗干净未反应组分，保存在0.1mol/L pH＝7.4的磷酸缓冲溶液中，加入防腐剂保存。用紫外法检测蛋白A的键合量为5～5.5mg/ml。
2、活性琼脂糖凝胶(Sepharose 6FF)与蛋白A反应合成免疫吸附材料在5L的反应器中加入例一(4)中合成的环氧活性琼脂糖凝胶(Sepharose 6FF)1升，0.1mol/L的硼酸缓冲液1.5L，pH值控制在8.0～10.0范围内，加入6.0g蛋白A，在20℃恒温反应20小时，停止反应，回收未反应的蛋白A，用0.2mol/L的乙醇胺封端未反应的环氧活性基团，在室温反应5小时。用大量蒸馏水冲洗干净未反应组分，保存在0.1mol/L pH＝7.4的磷酸缓冲溶液中，加入防腐剂保存。用紫外法检测蛋白A的键合量为4.3mg/ml。
实施例三蛋白A免疫吸附材料的动物试验将例二(1)中合成的蛋白A免疫吸附材料20ml，其中蛋白A的键合量为100mg，放入烧杯中用生理盐水浸泡1小时，再装于Φ20×50mm的柱中，用生理盐水充分冲洗柱子。以动物狗为试验对象，将狗麻醉后，从狗的股动脉中以30ml/min的速度泵出血液，经过血浆分离器将血细胞与血浆分开，以10ml/min的速度将血浆泵入蛋白A吸附柱，吸附后再与血细胞混合一同泵入狗的股静脉中。吸附5分钟后，用生理盐水冲出柱中血浆直到在280nm的吸收值为零。用0.2mol/L，pH＝2.3甘氨酸-HCl缓冲液洗脱柱中吸附的免疫球蛋白及其免疫复合物，收集洗脱液。吸附柱再用约150ml的平衡缓冲液平衡柱子，用约1500ml的生理盐水冲洗平衡缓冲液，再生过程完毕。SDS-PEAG电泳检测洗脱物，电泳结果表明，洗脱液中吸附物主要为IgG，检测洗脱下的抗体总量为480mg，在实验过程中及实验后24小时内，试验动物狗的一切生理指征正常。
实施例四蛋白A免疫吸附材料的再生性能将例二(1)中合成的蛋白A免疫吸附材料50ml放入烧杯中用生理盐水浸泡1小时再装于Φ40×50mm的柱中，用生理盐水充分冲洗柱子。将人体免疫球蛋白IgG溶于含有0.85％NaCl，pH＝7.4的0.01M磷酸缓冲溶液中，以30ml/min的速度过柱30分钟，使人体免疫球蛋白IgG充分吸附在吸附材料上。用0.2mol/L，pH＝2.3甘氨酸-HCl缓冲液作为洗脱剂将吸附在吸附材料上人体免疫球蛋白IgG洗脱下来，收集洗脱液，用紫外法检测吸附的人体免疫球蛋白IgG含量。洗脱完毕后，用生理盐水将柱中的洗脱剂置换出来再生，再将人体免疫球蛋白IgG的磷酸缓冲溶液过柱30分钟。重复以上“吸附-洗脱-中和-吸附”操作50次，每次都检测吸附的人体免疫球蛋白IgG的量，吸附效率未发现显著变化，表明制备的蛋白A免疫吸附材料具有良好的再生性能。
权利要求
1.一种蛋白A免疫吸附材料，是琼脂糖凝胶与蛋白A偶联的高分子材料，其具有如下的化学结构 其中 代表琼脂糖凝胶，X代表C2～6的直链烷基，或者代表CH2-CH2-On，其中n＝1～9，SPA-NH2为蛋白A。
2.权利要求1的蛋白A免疫吸附材料，其特征是X代表-CH2CH2-、-CH2CH2CH2CH2-或者-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-。
3.权利要求1或2的蛋白A免疫吸附材料的制备方法，其特征为以琼脂糖凝胶为载体，将琼脂糖凝胶与偶联试剂双缩水甘油醚类试剂反应形成活化琼脂糖凝胶，然后与蛋白A的氨基偶联，形成琼脂糖凝胶蛋白A免疫吸附材料，具体在于a、偶联试剂双缩水甘油醚类试剂与琼脂糖凝胶在0.4～1.0mol/L的碱性水溶液中，于20～40℃下反应，琼脂糖凝胶在反应液中所占的体积比为30％～50％；b、步骤a反应结束后，将活性琼脂糖凝胶过滤，用蒸馏水冲洗至中性；c、步骤b所得的活性琼脂糖凝胶溶于PH缓冲液中，控制pH值在8.0～10.0范围内，加入蛋白A，0～40℃反应16～20小时；d、步骤c所得产物进行端基封闭反应。
4.权利要求3所述的蛋白A免疫吸附材料的制备方法，其特征在于偶联试剂为乙二醇双缩水甘油醚、1，4-丁二醇双缩水甘油醚、1，6-己二醇双缩水甘油醚或聚乙二醇双缩水甘油醚。
5.权利要求3所述的蛋白A免疫吸附材料的制备方法，其特征还在于端基封闭反应是用甘氨酸乙酯盐酸盐或乙醇胺与步骤c所得产物中未反应完的环氧基团反应封端。
6.权利要求1或2所述的蛋白A免疫吸附材料在血液净化中的应用。
全文摘要
本发明涉及用于血液净化的蛋白A免疫吸附材料及其制备方法。公开了琼脂糖凝胶与蛋白A偶联的高分子材料，该材料以琼脂糖凝胶为载体基质，与双缩水甘油醚类偶联试剂反应后得到活性载体，再与蛋白A进行偶联反应而得到。该材料的合成方法简便、工艺路线短、制备安全；产品具有特异性强、对免疫球蛋白及其复合物的吸附效率高、再生性能好的特性，可用于临床上免疫吸附治疗。
文档编号A61L101/46GK101069751SQ200610035470
公开日2007年11月14日 申请日期2006年5月10日 优先权日2006年5月10日
发明者陈校园, 汪志刚, 李光吉, 许春生, 张旭锋 申请人:广州康盛生物科技有限公司, 华南理工大学