专利名称：富含有机硒的γ－亚麻酸干菌粉及其生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种γ-亚麻酸干菌粉及其生产工艺，具体地说，涉及一种利用刺孢小克银汉霉的诱变菌株发酵生产富含有机硒的γ-亚麻酸干菌粉产品及其工艺。
背景技术：
γ-亚麻酸(Gamma-Linolenic Acid)，简称GLA，分子式C18H30O2，是一种十八碳三烯酸，属于多烯类活性物质。GLA为人体必需的不饱和脂肪酸，是一大类调节人体细胞自身活力的物质。它具有治疗高血压、高血脂、高血糖、糖尿病、纠正脂质代谢紊乱、治疗肝硬化和肾病综合症、抑制癌细胞繁殖、增强人体免疫功能的功效。
现有技术中一直是从月见草等植物中提取γ-亚麻酸，但由于原料的缺乏，导致γ-亚麻酸的产量受到限制，远远满足不了国内外市场的需求。近年来开发出一种生物合成γ-亚麻酸的方法，采用被孢霉、小克银汉霉等微生物菌种发酵生产γ-亚麻酸菌粉。生物合成的γ-亚麻酸主要成分，除含有多烯亚油酸(脉通的主要成分)和亚麻酸外，还含有抗突变、抗辐射、抗疲劳、抗衰老的超氧化物歧化酶(SOD)，增强肌体免疫力的高分子多糖，以及蛋白质、多种氨基酸、维生素和微量元素。其多种有效成分的综合利用，经大量临床病理试验证明，疗效显著，无任何毒副作用，而且不含任何激素。
硒元素，是人和动物生命活动不可缺少的微量元素。科学研究表明，四十多种疾病与硒元素有关，缺硒可引起贫血，心脑血管疾病，肝病，糖尿病，癌症，儿童发育不良，人体过早老化等。硒元素是多种抗氧化酶的活性中心，其抗氧化能力是Ve的400倍。它可有效抑制癌细胞的分裂和增殖，增强人体免疫力。硒的补充可净化血液、增强心肌动力。目前有人将亚麻酸纯品与硒元素采用化学方法合成硒化亚麻酸，得到了抗肿瘤效果明显的产品。但这种采用化学合成获得的产品中有化学溶酶残留，对人体有害，这个问题目前尚未解决。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种利用微生物发酵法(工业化)生产富含有机硒的γ-亚麻酸干菌粉的新工艺；目的之二是提供了一种没有任何化学溶酶残留的富含有机硒的γ-亚麻酸干菌粉产品；目的之三是提供了一株经诱变得到的高产GLA的耐硒菌株。
本发明采用下述技术方案来解决上述发明目的1.菌株诱变本发明使用的刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)CGMCC NO.1652，是以中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心提供的AS3.2473刺孢小克银汉霉为原始菌种，经诱变获得。具体诱变过程为将幼龄菌丝进行处理获得原生质体，经过微波、亚硝基胍复合处理，将处理后的菌种悬液涂在含亚硒酸钠10mg/L-200mg/L的PDA平板上培养，挑出形态明显差异的菌株，然后经过摇瓶复选而获得。该菌株与原始菌株相比具有生长速度快，孢子数量多，菌丝粗壮、传代后遗传性状稳定等特点。
该菌株在PDA培养基上，温度28℃培养。2天菌落直径为2-5cm，菌丝为灰白色，有部分分生孢子形成；3-4天菌落直径为4-10cm，分生孢子大量形成，菌落为深灰色。
菌丝初期无分隔，以后形成横隔。菌丝粗壮多分枝，直径约11-19微米。孢囊梗直立、分枝呈伞状。孢子囊单生，呈球形。分生孢子为球形或椭圆形，上有长刺，并且可以脱落。孢子直径9.5-13.2微米。分生孢子聚伞状，梅花状或不规则状。
2.种液培养将制成的孢子悬液接种于种子罐中进行培养。培养基的组成包括蔗糖(或葡萄糖)3-5％，蛋白胨0.05-0.1％，磷酸二氢钾0.01-0.03％，硫酸镁0.01-0.03％，碳酸钙0.03-0.05％，亚硒酸钠0.0005-0.001％，PH5.5-6，温度22-30℃，培养时间24-36小时。
3.发酵罐培养将生长良好的种子液接入发酵罐中。发酵培养基的组成包括蔗糖(或淀粉)8-15％，花生饼粉1-5％，蛋白胨1-5％，磷酸二氢钾0.01-0.03％，硫酸镁0.01-0.03％，碳酸钙0.03-0.05％，亚硒酸钠0.0005-0.001％，促生长因子微量，PH5.5-6，温度22-30℃，风量1∶0.05-0.5v/v，搅拌速度150-200rpm，罐压0.02-0.08mpa，培养时间96-100小时。
4.菌体收集将得到的γ-亚麻酸鲜菌体采用微波真空冷冻升华干燥法进行干燥。反应参数如下真空室直径1.6m，长13m，真空度30mbar输入微波频率2450MHz±50MHz输入微波功率48KW±2KW使用玻璃增强聚四氟乙烯传输带进行传送。
将在-5℃下预冻结的γ-亚麻酸鲜菌体放在传送带上，80-100T的低压下输入微波能量，加热40分钟，并保持温度15-20％的热风对流，由里向外蒸发水份。干燥时间共4-6小时。
本发明的产品技术指标如下每100g干菌粉中，油脂含量35-39％γ-亚麻酸含量15-18％硒含量139-330μg/g复合氨基酸3.5-6.8g蛋白多糖4-7g超氧化物歧化酶(SOD)543.7μg/g采用上述的技术方案实施本发明，其主要的有益效果如下1.使用诱变的菌株发酵生产γ-亚麻酸，在筛选高产GLA菌株的同时，用含有高浓度硒的培养基对菌株进行培养，筛选出含硒的耐硒菌株(普通的刺孢小克银汉霉不能耐硒生长)，并在发酵培养中采取了相应的条件，获得了即含GLA又富含有机硒的γ-亚麻酸干菌粉产品，其中γ-亚麻酸的含量在12-15％，最高可达18％。同时，含有丰富的硒，硒含量高达139-330μg/g。实验证明，多种具有生理功能物质的协同作用可明显提高产品的功效。
2.制备过程中，主要原料(碳源、氮源)全部采用天然有机物，不使用无机原料，提高了产品的安全程度，绿色环保。
3.针对产品油脂含量高、易氧化等特点，采用微波真空冷冻升华干燥法对产品进行干燥。该法是将真空微波干燥和真空冷冻升华干燥有机结合到一起，微波在此处主要起到加热的作用。过去在真空冷冻升华技术中，加热采用电加热或热泵机组等装置，采用微波后，可以取消上述装置。冷冻干燥的基本原理，是基于水的三态变化，三种相态既可以相互转换又可以共存。当水在三相点(温度0.01℃，水蒸气压610.5Pa)时，水、冰、水蒸气三者可共存且相互平衡。在高真空状态下，利用升华原理，使预先冻结的γ-亚麻酸菌体中的水分不经过冰的溶化，直接以冰态升华为水蒸气被除去，从而达到冷冻干燥的目的。冻干的γ-亚麻酸菌体成海绵状、无干缩、复水性极好、含水分极少，相应包装后可在常温下长时间保存和运输。相对于其他干燥方法，微波真空冷冻升华干燥法的优点如下许多热敏性物质不会发生变性或失活；在低温下干燥时，γ-亚麻酸菌体中的一些挥发性成分损失很小；低温下，微生物的生长和酶的作用无法进行，因此产品能保持原来的状态；由于在冻结状态下进行干燥，因此产品体积几乎不变，保持了γ-亚麻酸菌体原来的结构，不会发生浓缩现象；由于γ-亚麻酸菌体中的水分在预冻以后以冰晶的形态存在，原来溶于水中的无机盐类物质被均匀的分配在γ-亚麻酸的菌体中。升华时，溶于水中的溶解物质就析出，避免了一般干燥方法中γ-亚麻酸菌体内部水分向表面迁移所携带的无机盐在表面析出而造成表面硬化的现象；干燥后的γ-亚麻酸菌体疏松多孔，呈海绵状，加水后溶解迅速而完全，几乎立即恢复原来的状态；由于干燥在真空下进行，氧气极少，因此一些易氧化物质得到了保护；干燥能排除95-99％以上的水分，使干燥后的γ-亚麻酸菌体能长期保存而不致变质。
由于上述优点的存在，采用该方法进行干燥可提高γ-亚麻酸干菌粉的各项技术指标1-3个百分点，有效提高γ-亚麻酸干菌粉的附加值。
4.采用生物发酵法获得的富含有机硒的γ-亚麻酸干菌粉与化学合成的硒化亚麻酸相比，没有任何化学溶酶残留，对人体无任何毒副作用，并且多种具有生理功能物质的协同作用可明显提高产品的功效。
5.生产发酵全过程，设立无菌区并采用全封闭作业，计算机全程监控，能保证γ-亚麻酸干菌粉的质量，降低工业化生产成本。
本发明使用的刺孢小克银汉霉(Cunninghamellaechinulata)已经于2006年3月16日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.1652。
具体实施例方式
下列实施例将进一步说明本发明。
实施例11吨发酵罐生产菌体1.将斜面菌种CGMCC NO.1652接种于克氏瓶中扩大培养，温度22-30℃，培养3-5天。
2.将菌种制成菌悬液接种于种子罐中，种子罐容积为100升，培养基蔗糖4kg，蛋白胨0.4kg，磷酸二氢钾20g，硫酸镁20g，碳酸钙35g，亚硒酸钠2.1g，PH5.5-6，温度25-30℃，风量1∶0.5v/v，搅拌速度150-200rpm，培养时间32小时。
3.将种子液转接到发酵罐中，发酵罐容积1000升。培养基蔗糖72kg，花生饼粉4kg，磷酸二氢钾200g，硫酸镁200g，碳酸钙350g，亚硒酸钠21g，促生长因子2.3g，PH5.5-6，温度22-30℃，风量1∶0.25-0.55v/v，搅拌速度150-200rpm，罐压0.02-0.08mpa，培养96小时。
4.菌体收集，采用微波真空冷冻升华技术，输入微波频率2400MHz，输入微波功率46KW，加热40分钟，并保持温度15-20％的热风对流，干燥4-6小时。得菌体31.5kg，其中每100g干菌粉中油脂含量35.5％，GLA含量12.5％，硒含量139.2μg/g。
实施例25吨发酵罐生产菌体1.将斜面菌种CGMCC NO.1652接种于克氏瓶中扩大培养，温度22-30℃，培养3天。
2.将菌种制成菌悬液接种于种子罐中，种子罐容积为500升。培养基蔗糖15kg，蛋白胨3.5kg，磷酸二氢钾90g，硫酸镁90g，碳酸钙150g，亚硒酸钠12g，PH5.5-6，温度22-30℃，风量1∶0.3v/v，搅拌速度150-200rpm，罐压0.02-0.08mpa，培养时间28小时。
3.将种子液转接到发酵罐中，发酵罐容积5000升。培养基蔗糖400kg，花生饼粉35kg，磷酸二氢钾900g，硫酸镁900g，碳酸钙1500g，亚硒酸钠120g，促生长因子10.5g，PH5.5-6，温度22-30℃，发酵至糖含量4％时，补力100kg灭菌后的糖蜜，风量1∶0.1-0.3v/v，搅拌速度150-200rpm，罐压0.02-0.08mpa，培养100小时。
4.菌体收集，同实施例1。得菌体128kg，其中每100g干菌粉中，油脂含量32.3％，GLA含量18.1％，硒含量142.4μg/g。
实施例35吨发酵罐生产菌体1.将斜面菌种CGMCC NO.1652接种于克氏瓶中扩大培养，温度22-30℃，培养3-4天。
2.将菌种制成菌悬液接种于种子罐中，种子罐容积为500升。培养基蔗糖15kg，蛋白胨3.5kg，磷酸二氢钾90g，硫酸镁90g，碳酸钙150g，亚硒酸钠12g，PH5.5-6，温度25-30℃，风量1∶0.3v/v，搅拌速度150-200rpm，罐压0.02-0.08mpa，培养时间30小时。
3.将种子液转接到发酵罐中，发酵罐容积5000升。培养基蔗糖400kg，花生饼粉35kg，磷酸二氢钾900g，硫酸镁900g，碳酸钙1500g，亚硒酸钠120g，促生长因子10.5g，PH5.5-6，温度25-30℃，发酵至糖含量10％时，补加80kg灭菌后的糖蜜，风量1∶0.1-0.3v/v，搅拌速度150-200rpm，罐压0.02-0.08mpa，培养100小时。
4.菌体收集，同实施例1。得菌体120kg，其中每100g干菌粉中油脂含量37.3％，GLA含量16.2％，硒含量168.5μg/g。
实施例45吨发酵罐生产菌体1.将斜面菌种CGMCC NO.1652接种于克氏瓶中扩大培养，温度22-30℃，培养3-4天。
2.将菌种制成菌悬液接种于种子罐中，其中温度22℃，罐压0.05mpa，其余同实施例3。
3.将种子液转接到发酵罐中，其中温度30℃，罐压0.08mpa，搅拌速度180rpm，其余同实施例3。
4.菌体收集，同实施例1。得菌体118kg，其中每100g干菌粉中油脂含量35.2％，GLA含量17.0％，硒含量156.3μg/g。
对比实施例11吨发酵罐生产菌体1.同实施例1。
2.同实施例1。
3.同实施例1。
4.菌体收集，采用硫化床干燥法。干燥时间6-8小时，温度50-70℃。
结果比较
对比实施例25吨发酵罐生产菌体1.同实施例3。
2.同实施例3。
3.同实施例3。
4.菌体收集，采用硫化床干燥法。干燥时间6-8小时，温度50-70℃。
结果比较
值得说明的是，本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明。
权利要求
1.一种富含有机硒的γ-亚麻酸的生产方法，其特征在于采用刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)CGMCC NO.1652为菌株进行富硒发酵，包括以下步骤(1)菌种培养将斜面菌种接入克氏瓶中进行扩大培养；(2)种液培养将孢子悬液接种于种子罐中培养，培养基以葡萄糖和/或蔗糖为碳源，以花生饼粉和/或蛋白胨为氮源，并添加亚硒酸钠，PH5.5-6，温度22-30℃，培养时间24-36小时；(3)发酵培养将生长良好的种子液接入发酵罐中培养，培养基以蔗糖、糖蜜、淀粉中任意一种或几种为碳源，以花生饼粉和/或蛋白胨为氮源，并添加亚硒酸钠，PH5.5-6，温度22-30℃，罐压0.02-0.08mpa，风量10.05-0.5v/v，搅拌速度150-200rpm，培养时间96-100小时；(4)菌体收集采用微波真空冷冻升华干燥法干燥，得富含有机硒的γ-亚麻酸干菌粉。
2.根据权利要求1所述的生产方法，其中所述的菌种培养的条件为PDA培养基，温度22-30℃，培养3-5天。
3.根据权利要求1所述的生产方法，其中种子培养基包括蔗糖3-5％，蛋白胨0.05-0.1％，磷酸二氢钾0.01-0.03％，硫酸镁0.01-0.03％，碳酸钙0.03-0.05％，亚硒酸钠0.0005-0.001％。
4.根据权利要求1所述的生产方法，其中发酵培养基包括蔗糖8-15％，花生饼粉1-5％，蛋白胨1-5％，磷酸二氢钾0.01-0.03％，硫酸镁0.01-0.03％，碳酸钙0.03-0.05％，亚硒酸钠0.0005-0.001％，促生长因子微量，培养时间96小时。
5.根据权利要求1所述的生产方法，其中微波真空冷冻升华干燥的条件为输入微波频率2450MHz±50MHz，输入微波功率48KW±2KW，微波加热40分钟，并保持温度15-20％的热风对流，干燥时间为4-6小时。
6.根据权利要求1-5任意一项所述的方法生产的γ-亚麻酸干菌粉。
7.刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)CGMCC NO.1652。
全文摘要
本发明涉及一种富含有机硒的γ－亚麻酸干菌粉及其生产工艺，以及生物合成该菌粉使用的诱变菌株。采用经诱变的刺孢小克银汉霉CGMCC N0.1652，在含有机碳源、有机氮源、无机盐、亚硒酸钠的培养基上进行富硒发酵，获得富含有机硒的γ－亚麻酸菌体，后采用微波真空冷冻升华干燥技术，获得油脂含量35－39％，γ－亚麻酸含量15－18％，硒含量139－330μg/g的γ－亚麻酸干菌粉。本发明经多次生产试验，技术成熟，工艺简单，绿色环保，适合于大规模工业化生产，具有原料来源广泛、成本低廉、质量好等特点。其产品，富含有机硒的γ－亚麻酸干菌粉，可广泛应用于医药、食品、饲料添加剂等领域。
文档编号A61P3/10GK1858216SQ200610065889
公开日2006年11月8日 申请日期2006年3月29日 优先权日2006年3月29日
发明者王景恒, 葛英华 申请人:王景恒, 葛英华