专利名称：山羊精液液态保存方法
技术领域：
本发明涉及一种山羊精液液态保存的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
尽管利用山羊冻精进行人工授精已经成功，但是使用冷冻精液的成本很高。因此，采用鲜精进行人工授精可大大提高山羊繁殖率和加快遗传进展。精液一般是用含卵黄或脱脂乳稀释液稀释，山羊精子在脱脂乳稀释液中的受精能力仅能维持大约12-24小时[Leboeuf B，Restall B，Salamon S.Production and storage of goatsemen for artificial insemination.Anim Reprod Sci 2000；62113-141]，因此鲜精人工输精必须在采精的当天进行。这在实践中造成了精液的极大浪费和动物管理的不方便。因此，急切需要对山羊精液进行长期液态保存，这样就可以在农场(村)输精时有较大的机动余地。
长期以来一直困扰着山羊精液液态保存的一个问题是精液中的精浆对保存于含卵黄或脱脂乳稀释液中的精子存活非常有害。人们已经发现来自于山羊尿道球腺分泌物中的卵黄凝集酶[Roy A，Egg yolk-coagulating enzyme in the semen andCowper’s gland of the goat.Nature 1957；179318-319]，[Cabrera F，Gonzalez F，Batista M et al.The effect of removal of seminal plasma，egg yolk level and season on sperm freezability of canarybuck(Capra hircus).Reprod Domest Anim 2005；40191-195.]和BUSgp60蛋白[Pellicer-RubioMT，MagallonT，Combarnous Y,Deterioration of goat sperm viability in milk extenders is due to abulbourethral 60-kilodalton glycoprotein with triglyceride lipase activity.Biol Reprod 1997；571023-1031]对保存于含卵黄或脱脂乳稀释液中的精子产生了有害的影响。因此，在利用含卵黄或脱脂乳的稀释液保存山羊精液的时候，精液稀释之前需要先离心、洗涤除去大部分精浆。但是，离心、洗涤是一个复杂而耗时的过程，会对精子造成损害[Harrison RA，White IG，Glycolytic enzymes in the spermatozoa and cytoplasmicdroplets of bull，boar and ram，and their leakage afte shock.J Reprod Fertil 1972；30105-115]，也会丢失一些精子[Corteel JM.Collection，processing and artificial insemination of goat semen.InGall C.(eds)Goat Production.Academic Press，London，1981，pp.171-191]。这样，化学成分明确的稀释液在长期保存山羊精液上就具有了明显的优势。但是，关于这方面的研究很少[Leboeuf B，Guillouet P，Batellier Fetal.，Effect of native phosphocaseinate onthe in vitro preservation of fresh semen.Theriogenology 2003；60867-877]。另外，已经发现在不同物种的精液液态保存过程中，诸如稀释液组成、稀释方法[Johnson LA，KFWeitze，P Fiser et al.Storage of boar semen.Anim Reprod Sci 2000；62143-172]、降温方法[Fernandez-Santos M R，Esteso M C，Soler A J，et al.Effects of egg yolk and cooling rate on thesurvival of refrigerated red deer(Cervus elaphus hispanicus)epididymal spermatozoa.ReprodDomest Anim 2006；41114-118]、保存温度[LeboeufB，Guillouet P，Batellier F，etc.Effect ofnative phosphocaseinate on the in vitro preservation of fresh semen.Theriogenology 2003；60867-877]、[Zhou J B，Yue K Z，Luo M J，etc.Effect of extenders and temperatures on spermviability and fertilizing capacity of Harbin White boar semen during long-term liquid storage.Asian-Aust J Anim Sci 2004；171501-1508]以及稀释液的pH值[Maxwell W M，Salamon S.Liquid storage of ram semena review.Reprod Fertil Dev 1993；5613-638]等因素都会对精子的存活产生影响，所以山羊精液液态保存方案必须进一步完善。
发明内容本发明的目的就是研制用化学成分明确的稀释液对山羊精液进行长期液态保存，优化稀释液配方、pH值、精液处理方法及保存温度，最终研制出山羊精液液态保存的方法。
我们基于Zorlesco和Androhep稀释液，研制了一种新的稀释液(称为改进的Zorlesco/Androhep液，mZA)。mZA维持精子活力的效果好于Zorlesco或Androhep，而且用PVA(聚乙烯醇)代替mZA中的BSA(牛血清白蛋白)(称mZA为mZAP)并不影响保存效果。试验还发现，5℃的保存效果最好，并且随着保存温度的升高保存效果显著下降。山羊精液用不含卵黄或乳汁的稀释液稀释后，可以不用离心除去精浆而直接保存，并且稀释液的pH值显著影响保存效果。
本方法的关键是用pH6.04的mZAP稀释液10倍稀释山羊精液，保存于5℃，精子活力维持30％以上的时间达9天。用上述条件下保存7天的精液进行人工输精出生了羔羊。
图1山羊精液液态保存的程序示意图1是mZAP溶液配制2是山羊精液采集3是山羊精液质量检测4是山羊精液稀释5是稀释的山羊精液质量检测6是稀释的山羊精液保存7是保存的山羊精液质量检测8是人工授精具体实施方式
1、mZAP溶液配制葡萄糖1.15g、果糖1.45g、柠檬酸钠1.17g、乙二胺四乙酸0.23g、碳酸氢钠0.125g、羟乙基哌嗪乙磺酸0.9g、聚乙烯醇0.25g、青霉素5000IU、链霉素0.1g溶于100mL蒸馏水中，调整溶液pH为6.04。
2、山羊精液采集在繁殖季节，应用假阴道法，采集鲁北白山羊和波尔山羊的精液。精液保存于30℃水浴的集精杯中。
3、精液质量检测1)检测采集的精液体积和精子密度。
2)精子活力检测 在显微镜下检查精子的活力，只有活力超过85％的精子，才能应用。
4、精液稀释精液质量检测后，用30℃的mZAP溶液进行稀释。
5、稀释的山羊精液质量检测1)精子活力检测 在显微镜下检查精子的活力，只有活力超过30％的精子，才能应用。
2)精子脂膜完整性检测 将精液置于低渗溶液中，38℃孵育45min，加入2％戊二醛，在显微镜下检测精子的弯尾率。
6、稀释的山羊精液保存稀释后的精液置于1.5mL的离心管中(0.5mL/管)降温，降温速率为-0.11～-0.17℃/min，降至5℃，保存备用。
7、保存的山羊精液质量检测1)精子活力检测 从保存精液的离心管中取出l0μL，置于显微镜下检测精子的活力。只有活力超过30％的精子，才能应用。
2)精子脂膜完整性检测 将保存的精液置于低渗溶液中，38℃孵育45min，加入2％戊二醛，在显微镜下检测精子的弯尾率。
3)精子顶体完整性和获能检测 利用金霉素(CTC)/Hoechst33258染色，在显微镜下观察，确定保存的精子顶体完整性和获能情况。当精子头部未被Hoechst 33258着色时被视作质膜完整。质膜完整的精子在用CTC染色时分为三种类型F型，整个精子头部有均一荧光；B型，精子头部顶体后区无荧光；AR型，整个精子头部无荧光或赤道段有非常弱的荧光。其中F型和B型顶体完整，并且B型已获能。
8、人工授精应用保存的精子活力超过30％的精液，对发情正常的鲁北白山羊进行人工授精。25d后进行妊娠检查，将妊娠羊隔离饲养直至分娩。
权利要求
1.一种山羊精液液态保存方法，其特征在于精液稀释液各组分及其适宜浓度为葡萄糖1.15g、果糖1.45g、柠檬酸钠1.17g、乙二胺四乙酸0.23g、碳酸氢钠0.125g、羟乙基哌嗪乙磺酸0.9g、聚乙烯醇0.25g、青霉素5000IU、链霉素0.1g溶于100mL蒸馏水中，调整稀释液pH为6.04，山羊精液10倍稀释，5℃保存。
全文摘要
本发明涉及一种山羊精液液态保存方法，属于生物技术领域。筛选出了适宜山羊精液液态保存的稀释液配方。稀释液的主要成分为葡萄糖1.15g、果糖1.45g、柠檬酸钠1.17g、乙二胺四乙酸0.23g、碳酸氢钠0.125g、羟乙基哌嗪乙磺酸0.9g、聚乙烯醇0.25g、青霉素5000IU、链霉素0.1g，溶于100mL蒸馏水中。实验证明，该稀释液对山羊精液液态保存的效果明显好于以往的稀释液。应用pH6.04的稀释液10倍稀释山羊精液，保存于5℃，精子活力维持30％以上的时间达9d。并在上述条件下，用保存7d的精液进行人工输精出生了羔羊。
文档编号A61K35/48GK1951185SQ20061007004
公开日2007年4月25日 申请日期2006年11月7日 优先权日2006年11月7日
发明者谭景河, 许常龙, 周佳勃, 罗明久, 常仲乐, 樊新忠, 赵本田, 兰国成, 隋宏书 申请人:山东农业大学