专利名称：环孢菌素c和d的衍生物及其药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及环孢菌素C和D的衍生物，以该化合物为活性成分的药物组合物，以及它们在治疗肿瘤和改善增强抗癌药疗效中的应用。
背景技术：
自从1969年瑞士sandoz公司成功的分离环孢菌素以来，对环孢菌素及其衍生物的研究引起人们极大的兴趣。研究发现环孢菌素及其衍生物具有广泛的生物活性，主要表现在免疫抑制作用、肿瘤细胞多药耐药(MDR)逆转作用、抗HIV。
发明内容
本发明的目的在于提供一类新的具有药用价值的环孢菌素衍生物。
本发明的进一步目的是提供上述化合物在治疗肿瘤和改善增强抗癌药疗效的药物方面的用途。
发明人由环孢菌素C和D合成带有乙酰基和双氢还原的环孢菌素衍生物，该衍生物能明显的改善和增强抗癌药的疗效。
本发明新的环孢菌素衍生物用下述通式(I)表示(I)
其中R1表示氢基或C1～C5的酰基，R2表示C1～C5的酰氧基或甲基，X-Y表示CH-CH。
优选的本发明化合物是其中R1表示乙酰基，R2表示乙酰氧基，X-Y表示CH-CH的式(I)的化合物。该化合物是由环孢菌素C在常规的酯化条件和双氢还原条件下获得的产物。
发明人发现本发明化合物有明显的P-糖蛋白抑制作用，能增强脑组织内抗癌药物阿霉素的浓度，改善和增强抗癌药的疗效。
附图为本发明新的环孢菌素衍生物的通式。
具体实施例方式
实施例1环孢菌素C的单乙酰化产物的制备将1g环孢菌素C，用5ml醋酐溶解后，缓慢滴加7.5ml的乙酰氯，置于室温下搅拌24小时后停止反应，滴加冰水至反应不再放热。将上述反应液用乙酸乙酯进行萃取，将萃取所得的上层液体进行减压蒸馏。蒸馏所得固体用氯仿溶解之后用高压层析柱进行分离洗脱，所用硅胶为200～300目，洗脱液为丙酮、石油醚的1∶3混合溶液。收集Rf值最大的洗脱液进行浓缩。所得的白色粉末状固体用丙酮进行重结晶，所析出的白色结晶即为环孢菌素C的单乙酰化纯品。如上所得的环孢菌素C的单乙酰化物具有下述理化性质1.形状白色粉末状晶体2.熔点190～192℃3.分子量1260.6714.分子式C64H113N11O145.推定化学结构式 其中R1表示氢基，R2表示乙酰氧基，X-Y表示CH＝CH。
6.元素分析分析值碳61.0％ 氢9.0％ 氮12.2％ 氧17.8％理论值碳60.8％ 氢9.1％ 氮12.4％ 氧18.1％
7.比旋度[α]D20＝-230°(C＝0.5，氯仿中)8.红外吸收光谱(Acetat)1735和12409.1H-核磁共振谱1.85(s，3H，CH3COO)；3.8(m，1H，H-C(β)derC9-AS)；3.9(m，1H，H-C(β)Von Thr)10.质谱(m/e)1259(M+)，1241(M+-H2O)，1181(M+-CH3COOH)实施例2环孢菌素C的单乙酰化二氢还原产物的制备将实施例1所得晶体1g用50ml乙醇进行溶解后加入0.1g的钯炭，通入氢气，进行二氢还原反应24小时。反应结束后将反应液进行过滤浓缩，既得目标产物，为白色结晶固体。元素分析和各种光谱数据表明该产物是环孢菌素C的单乙酰化二氢还原产物。
1.形状白色粉末状晶体2.熔点167～169℃3.分子量1262.6874.分子式C64H115N11O145.推定化学结构式
其中R1表示氢基，R2表示乙酰氧基，X-Y表示CH-CH。
6.红外吸收光谱(Acetat)1742和12417.质谱(m/e)1261(M+)，1243(M+-H2O)，1183(M+-CH3COOH)实施例3环孢菌素C的双乙酰化产物的制备将1g环孢菌素C，用5ml醋酐溶解后，边搅拌边加入0.1g的对二甲氨基吡啶(DMAP)，然后缓慢滴加7.5ml的乙酰氯，置于室温下搅拌24小时后停止反应，滴加冰水至反应不再放热。将上述反应液用乙酸乙酯进行萃取，将萃取所得的上层液体进行减压蒸馏。蒸馏所得固体用氯仿溶解之后用高压层析柱进行分离洗脱，所用硅胶为200～300目，洗脱液为丙酮、石油醚的1∶3混合溶液。收集Rf值最大的洗脱液进行浓缩。所得的白色粉末状固体用丙酮进行重结晶，所析出的白色结晶即为环孢菌素C的单乙酰化纯品。如上所得的环孢菌素C的双乙酰化物具有下述理化性质
1.形状白色粉末状晶体2.熔点157～159℃3.分子量1302.7084.分子式C66H115N11O155.推定化学结构式 其中R1表示乙酰基，R2表示乙酰氧基，X-Y表示CH＝CH。
6.元素分析分析值碳60.9％ 氢8.9％ 氮11.8％ 氧18.4％理论值碳61.0％ 氢9.1％ 氮11.7％ 氧18.4％7.比旋度[α]D20＝-275°(C＝0.5，氯仿中)8.红外吸收光谱(Acetat)1735和12409.1H-核磁共振谱1.95(s，3H，CH3COO)；2.0(s，3H，CH3COO)；3.9(m，2H，H-C(β)derC9-AS.und3.9H-C(β)Von Thr)
10.质谱(m/e)1301(M+)，1241(M+-CH3COOH)，1181(M+-2CH3COOH)实施例4环孢菌素C的双乙酰化二氢还原产物的制备将实施例3所得晶体1g用50ml乙醇进行溶解后加入0.1g的钯炭，通入氢气，进行二氢还原反应24小时。反应结束后将反应液进行过滤浓缩，既得目标产物，为白色结晶固体。元素分析和各种光谱数据表明该产物是环孢菌素C的单双乙酰化二氢还原产物。如上所得的环孢菌素C的双乙酰化二氢还原产物具有下述理化性质1.形状白色粉末状晶体2.熔点158～160℃3.分子量1304.7244.分子式C66H117N11O155.推定化学结构式
其中R1表示乙酰基，R2表示乙酰氧基，X-Y表示CH-CH。
6.红外吸收光谱(Acetat)1743和12377.质谱(m/e)1303(M+)，1243(M+-CH3COOH)，1183(M+-2CH3COOH)实施例5环孢菌素D的单乙酰化二氢还原产物的制备将1g环孢菌素D，用7.5ml醋酐溶解后，边搅拌边加入5ml的酰氯，搅拌反应24小时后停止反应，滴加冰水至反应不再放热。将上述溶液用乙酸乙酯进行萃取后进行浓缩。浓缩所得固体用乙醇-进行溶解后加入0.1g的钯炭，通入氢气，进行二氢还原反应24小时。反应结束后将反应液进行过滤浓缩，既得目标产物，为白色结晶固体。元素分析和各种光谱数据表明该产物是环孢菌素D的单乙酰化二氢还原产物。
m.p.138～140℃。
元素分析C65H117N11O13实施例6实施例3、4化合物的肿瘤MDR逆转剂的筛选方法K562/ADM MDR细胞株用含15％小牛血清的RPMI1640培养基温孵，于5％CO2，37℃培养，培养基中加入阿霉素(2μM)以维持其耐药性，并于筛选实验前一周，用不含阿霉素的RPMI1640进行培养，以免影响筛选结果。
胞内罗丹明Rh123的积累采用流式细胞仪测定。在受试管中，分别加入培养液200μl(细胞浓度约为5×108个/L)；Rh123(5μM)约25μl；药液25μl(受试药物浓度为10、100μM)。在阳性对照管中，分别加入同样体积与浓度的培养液和Rh123，维拉帕米25μl(终浓度为10μM)。另外，在空白管中，分别加入同样体积和浓度的培养液和Rh123，DMSO缓冲液25μl。各管孵育90min，用冰冷的PBS洗两次重悬，在激发波长为488nm，发射波长为535nm条件下，用流式细胞仪检测胞内荧光强度，每个样品取10000个细胞，经数据统计分析，取平均值，胞内Rh123的累积浓度通过标准曲线求得。
实施例7实施例4化合物的整体实验给药组设三个剂量2、5、10mg/kg人脑瘤裸小鼠移植瘤模型收集体外对数生长期的人脑瘤细胞，接种细胞量根据不同细胞而定，接种体积为0.025ml。接种点为一等边三角形的顶点，三角形的底边为右眼和右耳的连线，高为5mm左右。裸小鼠腹腔麻醉(4.35％的三氯水合氯醛)后，酒精消毒接种点，用注射器将细胞悬液接种到颅内和皮下，接种深度为2mm左右。7-10天后，裸小鼠内和皮下开始长肿瘤。给荷瘤裸小鼠单用抗癌药(阿霉素)或与实施例4化合物合用后，采用LC-MS检测脑脊液和脑组织内抗癌药物浓度及分布，并观察裸小鼠生存期和生存率，考察实施例1化合物的P-糖蛋白抑制作用。
结果给裸小鼠脑内和皮下接种肿瘤细胞后，荷瘤裸鼠平均生存期为11天；给裸小鼠脑内和皮下接种肿瘤细胞后，每隔一天单用注射阿霉素治疗，荷瘤裸鼠平均生存期为16；给裸小鼠脑内和皮下接种肿瘤细胞后，每隔一天合用注射阿霉素和实施例4化合物(2、5、10mg/kg)治疗，荷瘤裸鼠平均生存期分别为23、31和46天；采用LC-MS检测裸小鼠脑组织内阿霉素浓度，阿霉素和实施例4化合物(2、5、10mg/kg)合用和单用相比，其脑内浓度分别增加28％、41％和73％。这表明，实施例4化合物有明显的P-糖蛋白抑制作用，能增加脑组织内抗癌药阿霉素的浓度，改善和增强抗癌药的疗效。
权利要求
1.环孢菌素C和D的衍生物，其特征在于该衍生物为具有下述通式(I)的化合物 其中R1表示C1～C5的酰基，R2表示C1～C5的酰氧基或甲基，X-Y表示CH-CH。
2.如权利要求1的衍生物，其中R1表示C1～C5的酰基，R2表示C1～C5的酰氧基，X-Y表示CH-CH。
3.如权利要求1的衍生物，其中R1表示C1～C5的酰基，R2表示甲基，X-Y表示CH-CH。
4.环孢菌素C和D的衍生物的药物组合物，其中含有治疗有效量的权利要求1或2或3的化合物和药学上可接受的载体。
5.权利要求1～3中任意一项的衍生物及权利要求4的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
全文摘要
环孢菌素C和D的衍生物及其药物组合物，涉及环孢菌素C和D的衍生物。由环孢菌素C和D合成带有乙酰基和双氢还原的环孢菌素衍生物，该衍生物能明显的改善和增强抗癌药的疗效。
文档编号A61P35/00GK101041689SQ20061007138
公开日2007年9月26日 申请日期2006年3月24日 优先权日2006年3月24日
发明者程元荣, 郑卫, 何玲, 肖丽华 申请人:福建省微生物研究所