专利名称：一种可溶性大肠杆菌表达质粒及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达蛋白质/多肽的重组质粒载体及应用。本发明进一步涉及该重组质粒载体在制备蛋白质/多肽药物、诊断抗原、以及疫苗等方面的应用。
背景技术：
DNA重组技术又称基因工程，为大量获得蛋白质/多肽(以下所称“蛋白质”和“多肽”通用)提供了技术支持。已有不少蛋白质类药物、疫苗、诊断试剂采用基因工程方法生产。要获得大量的具有生物学活性的蛋白质，选择合适的表达系统是关键。在众多的表达系统之中，大肠杆菌表达系统是目前应用最为广泛的经典表达系统，具有结构简单、易操作、成本低廉的优点。但采用大肠杆菌高效表达外源蛋白质时，外源蛋白质经常以不溶性的包涵体形式存在。包涵体要用变性剂溶解，再通过复性过程才能得到在缓冲液中溶解的蛋白质。经过复性处理的目标蛋白质不一定能完全恢复原来的生物学活性，有时甚至完全得不到有活性的蛋白质。复性处理工艺也使目标蛋白质的制备成本上升。
将目标蛋白质与某一伴侣蛋白(或称载体蛋白)形成融合蛋白质，使其以可溶性形式表达，是避免形成包涵体的一种最常见的策略。目前使用最多的伴侣蛋白是大肠杆菌的硫氧还蛋白(thioredoxin，简称Trx)(La Vallie et al，1993，Biotechnology，11187-193)。使用硫氧还蛋白作为载体蛋白的蛋白质表达系统已经由美国Invitrogen公司开发成为商品，并得到广泛使用。然而在大肠杆菌的最适生长温度37℃条件下，Trx不能保证融合蛋白以可溶性的形式存在，特别是目标蛋白比较大时，更是如此。虽然可以用较低的温度(比如15℃)增加融合蛋白的可溶性，但低温时的表达效率太低，不适合大量表达目标蛋白质。
此外，还有另外几个伴侣蛋白用于融合表达，如分子量为40kDa的麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein，简称MBP)(Guan et al，1988，Gene，6721-30)和分子量大小为26kDa的谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase，简称GST)(Smith et al，1988，Gene，1988，6731-40)。但它们形成可溶性融合蛋白的能力比Trx还要差。其它还有一些含原核基因引导序列的分泌型表达载体，如含ompA、pelB、CBD、DsbA/C、β-半乳糖酶、碱性磷酸酶等基因的引导序列的表达载体，但多受到通用性、稳定性等因素的困扰，目前应用的并不多。
最近美国Invitrogen公司又开发了另一个可溶性大肠杆菌表达系统。他们以大肠杆菌的NusA作为伴侣蛋白，融合蛋白的可溶性和稳定性都获得了改善(Marco et al，2004，Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，322766-771)。但NusA蛋白由495个氨基酸残基组成。采用该系统生产蛋白质药物，一般要在获得融合蛋白之后，将目标蛋白质从融合蛋白上裂解下来。因为NusA蛋白本身太大，该系统的效率将会受到影响。
国内杨海杰等(2003，厦门大学学报(自然科学版)，42(4)410-415)以opmT基因的引导序列为伴侣基因构建了分泌型表达载体pTO-OT。该系统表达的重组蛋白主要存在于胞内，可溶性的蛋白仅占总目的蛋白的20-30％。
发明内容
(一)要解决的技术问题本发明的目的旨在提供一种可溶性大肠杆菌重组质粒载体以克服上述缺陷。
(二)技术方案本发明以大肠杆菌表达系统为基础构建重组质粒载体(命名为pMB)，图1是可溶性表达质粒pMB结构示意图。该重组质粒具有以下特征
(1)含有SEQ ID NO1的核苷酸序列或者SEQ ID NO1中一个或几个核苷酸残基的替换、缺失、添加或插入形成的核苷酸序列。SEQ IDNO1又称为msyB基因，由378个碱基对组成，是大肠杆菌基因组中的固有序列。
(2)其表达产物具有SEQ ID NO2的氨基酸序列或者SEQ ID NO2中一个或几个氨基酸残基的替换、缺失、添加或插入形成的氨基酸序列。
采用DNA重组技术构建本发明质粒载体的步骤如下(1)选用来源于大肠杆菌基因组的msyB基因作为伴侣基因，采用PCR方法，从大肠杆菌基因组中扩增msyB基因；(2)将msyB基因插入质粒中，使msyB基因置于蛋白质表达调控元件的控制之下，获得含有msyB基因的表达质粒；(3)将目标蛋白的编码基因插入表达质粒中，获得含有融合基因的重组质粒。
其中步骤(1)中是根据msyB基因序列设计1对引物msyBup/msyBdn，用于扩增msyB基因，在引物msyBup/msyBdn两端分别加上Kpn I/EcoRI酶切位点，引物序列如下msyBup5′-ATT GGT ACC GTG ATG ACCATG TAC GCA ACG-3′，msyBdn5′-ATT GAA TTC ATT GAA GGCAGAACG TTC ATC CCA CTC ATC-3′。为了便于将目标蛋白从融合蛋白上裂解下来，在msyB的3′端插入了一段序列ATT GAA GGC AGA，这是Xa的作用位点。
用大肠杆菌菌液为模板，或者以大肠杆菌总DNA为模板，用特异性引物msyBup/msyBdn扩增msyB基因片段。PCR反应体系的组成和温度循环条件根据常规方法确定。msyB基因的长度为378bp，因此，PCR产物在琼脂糖凝胶电泳检测时可观察到400bp左右的特异性条带。
其中步骤(2)中选用的质粒，称为基础质粒，比如pET-32a(美国Invitrogen公司产品，购自广州美津生物技术有限公司)，具有调控蛋白质表达的基本元件，能保证融合蛋白在大肠杆菌中正确表达。将PCR产物酶切消化，同时将基础质粒用相应的限制性内切酶和CIAP进行消化；在DNA连接酶的作用之下，将已经消化的基础质粒和msyB基因的PCR产物连接，连接产物直接用于转化大肠杆菌DH5α。在具有氨卞青霉素(或其它抗生素)存在的培养基中，筛选出阳性克隆，再经过PCR筛选、酶切鉴定和序列测定，获得具有msyB基因的表达质粒，命名为pMB。用特异性引物msyBup/msyBdn进行PCR，可以扩增出400bp左右DNA条带的克隆为阳性克隆。将阳性克隆用LB培养基(含1μg/ml氨卞青霉素，Amp)在37℃继续培养，然后抽取质粒，用限制性内切酶对质粒进行消化，应该获得预期大小的DNA片段。对重组质粒进行序列测定，应该含有msyB基因的完整序列(SEQ ID NO1)，且读码框正确。
其中步骤(3)中是采用特异性引物扩增目标蛋白的编码基因(目标基因)，然后采用(1)的步骤，将目标蛋白的编码基因插入表达质粒pMB中，使目标基因置于msyB基因的3′端，msyB基因和目标基因形成融合基因。将目标基因的PCR产物酶切消化，同时将表达质粒pMB用相应的酶进行消化；在DNA连接酶的作用之下，将已经消化的质粒pMB和目标基因的PCR产物连接，连接产物直接用于转化大肠杆菌DH5α。在具有氨卞青霉素(或其它抗生素)存在的培养基中，筛选出阳性克隆，再经过PCR筛选、酶切鉴定、和序列测定，获得具有融合基因的表达质粒，命名为pMB-X。用特异性引物进行PCR，可以扩增出预期大小DNA条带的为阳性克隆。将阳性克隆用LB培养基(含1μg/ml氨卞青霉素，Amp)在37℃继续培养，然后抽取质粒，用限制性内切酶对质粒进行消化，可获得预期大小的DNA片段。对重组质粒进行序列测定，其含有融合基因的序列(序列1)，且读码框正确。
用经酶切鉴定和序列测定的本发明的重组质粒转化合适的大肠杆菌菌株BL21(DE3)(美国stratagene公司产品，购自广州美津生物技术有限公司)，获得表达融合蛋白的基因工程菌。在IPTG(或其它合适的诱导条件)的诱导之下，获得的融合蛋白中，目标蛋白位于msyB蛋白的C端。为了便于获得纯的目标蛋白，可以在msyB与目标蛋白之间设计一蛋白酶特异性消化位点，这样在纯化融合蛋白之后，就可以通过特异性蛋白酶消化，将目标蛋白从融合蛋白上裂解下来。
本发明提供的重组质粒具有重要的应用价值。应用之一是采用所述的可溶性表达质粒，表达作为免疫原使用的蛋白质或多肽。采用该表达质粒表达的蛋白质或多肽可以直接作为免疫原免疫动物，也可以纯化之后免疫动物，或与佐剂配合之后免疫动物。有时为了减少免疫的副作用，如果目标蛋白足够大，也可以用特定蛋白酶处理融合蛋白，将目标蛋白与伴侣蛋白裂解，收集、纯化目标蛋白，然后用相应的目标蛋白作为抗原免疫动物或人。
本发明提供的重组质粒的第二个应用，是采用该系统表达蛋白质类药物。采用该表达方法表达的融合蛋白，经特定蛋白酶作用之后，将目标蛋白与伴侣蛋白裂解，收集、纯化目标蛋白，就可以获得相应的蛋白质。
本发明提供的重组质粒的另一个应用，是采用所述的表达方法，获得蛋白质抗原，用于检测人或者动物血清中的特异性抗体。
(三)有益效果本发明具有明显的优点和效果(1)和目前已经存在的大肠杆菌可溶性表达系统相比，采用本发明提供的表达系统表达目标蛋白，融合蛋白中可溶性蛋白比例超过90％。本系统采用msyB蛋白作为融合蛋白的伴侣蛋白，大大提高了融合蛋白的可溶性。msyB蛋白是大肠杆菌本身的蛋白，是一种高度可溶性多肽，在大肠杆菌中表达量高，其作为伴侣蛋白具有稳定性好、可溶性强和表达水平高的特性。当被诱导表达时，msyB多肽作为载体可与外源蛋白一道分泌到大肠杆菌的细胞质中，大大增加了外源蛋白的可溶性，且表达的外源蛋白能够正确折叠。
(2)本发明提供的表达系统是在目前广泛使用的大肠杆菌质粒的基础上改造的，因此该表达质粒具有大肠杆菌质粒本身所具有的其它优点，比如可以利用组氨酸标签(6 x His Tag)进行亲和层析纯化目标蛋白。
(3)因为msyB蛋白本身具有大小合适、可溶性强的特点，本发明提供的表达质粒还具有适用范围广，表达蛋白容量大的优点。
(4)由于采用本发明提供的表达质粒表达的融合蛋白中90％以上都是可溶性的，因此融合蛋白的纯化工艺大为简化，蛋白制备成本大大降低。
图1是可溶性表达质粒pMB结构示意图。目标蛋白位于msyB蛋白的C端，两者之间有可裂解位点。msyB蛋白的N端有一6x His标签，方便采用Ni柱亲和层析纯化融合蛋白。融合基因位于蛋白质表达调控元件的控制之下。
图2是msyB基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。M为DNA分子量标准DL2000，1-5为PCR产物。
图3是表达质粒pMB示意图。
图4是禽流感病毒(H9N2)非结构蛋白NS1基因PCR产物电泳图。M为DNA分子量标准DL2000，1-4为PCR产物。
图5是重组质粒pMB-NS1的酶切鉴定图谱。M1为DNA分子量标准DL15000，M2DNA分子量标准DL2000，1、2为经限制性内切酶EcoRI和Xho I消化的质粒。
图6为不同时间NS1诱导表达产物的SDS-PAGE分析。M为蛋白质分子量标准，1为空质粒对照，2为0h诱导，3-7分别为诱导表达1、2、3、4、5h的NS1产物。
图7是融合蛋白NS1的可溶性分析。M为蛋白质分子量标准，1为空质粒对照，2为细菌裂解上清，3为细菌裂解沉淀。
图8是融合蛋白NS1的Western blot分析。M为预染色的蛋白质分子量标准；1为NS1融合表达产物。
图9是融合蛋白NS1的纯化。1为空质粒对照，2为裂解液洗脱产物，3为洗涤液洗脱产物，4为洗脱液洗脱产物。
图10是FMDV 3B基因PCR产物电泳图。M为DNA分子量标准DL2000，1-4为PCR产物。
图11是重组质粒pMB-3B的酶切鉴定图谱。M1为DNA分子量标准DL15000，M2DNA分子量标准DL2000，1、2为经限制性内切酶EcoRI和Xho I消化的质粒。
图12是融合蛋白3B的可溶性分析。M为蛋白质分子量标准，1为细菌裂解沉淀，2为细菌裂解上清。
图13是融合蛋白3B的Western blot分析。M为预染色的蛋白质分子量标准；1为3B融合表达产物。
图14是融合蛋白3B的纯化。1为细菌裂解产物沉淀，2为裂解上清；3、4、5为纯化产物。
具体实施例方式
通过下面给出的本发明的具体实施例可以进一步清楚地理解本发明，但下述实施例不是对本发明的限定。
实施例1 msyB基因的PCR扩增根据msyB基因序列设计1对引物msyBup/msyBdn，用于扩增msyB基因，msyB基因的理论长度为378bp。在引物msyBup/msyBdn两端分别加上Kpn I/EcoR I酶切位点，引物序列如下msyBup5′-ATT GGTACC GTG ATG ACC ATG TAC GCAACG-3′，msyBdn5′-ATT GAA TTCATT GAA GGC AGA ACG TTC ATC CCA CTC ATC-3′。为了便于将目标蛋白从融合蛋白上裂解下来，在msyB的3′端插入了一段序列ATT GAAGGC AGA，这是Xa的作用位点。
用大肠杆菌菌液为模板，或者以大肠杆菌总DNA为模板，用特异性引物msyBup/msyBdn扩增msyB基因片段。PCR反应体系的组成如下10×PCR buffer 10μL，dNTPs 8μL，msyBup 1μL，msyBdn 1μL，ExTaq 1μL，加ddH2O补至100μL。PCR反应程序为94℃预变性3min；94℃ 40s，55℃ 40s，72℃ 1min，30个循环；72℃后延伸10min。
PCR产物在含有溴化乙啶的1％琼脂糖凝胶电泳检测时可观察到400bp左右的特异性条带(图2)。克隆的msyB基因的核苷酸序列如SEQID NO1所示，长度为378bp，msyB基因的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，长度为125个氨基酸。
实施例2表达质粒pMB的构建将msyB基因的PCR产物用限制性内切酶Kpn I和EcoR I进行酶切消化，同时将质粒pET-32a(美国Invitrogen公司产品，购自广州美津生物技术有限公司)用同样的酶进行酶切消化，在T4连接酶的作用下连接，将连接产物转化DH5α感受态细胞。转化方法为CaCl2法。经氨卞青霉素抗性(Ampr)筛选，获得插入了msyB基因的重组子。然后用特异性引物msyBup/msyBdn进行PCR筛选。对PCR筛选阳性的细菌，挑取单菌落接种于3mL LB培养基(含1μg/ml氨卞青霉素)中，37℃，200r/m振摇培养16～20小时。离心收集菌体，抽提质粒，再经限制性内切酶消化和序列测定，获得的重组质粒命名为pMB。pMB载体大小约为6291bp，有6x His融合标签，有Xa的裂解位点。
实施例3表达NS1融合蛋白的重组质粒pMB-NS1的构建根据Genbank中的禽流感病毒(AIV)非结构蛋白NS1基因序列，设计1对引物用于扩增NS1基因，在上游引物NS1up(5′-ATG AAT TCTATG GAT TCC AAC ACT G-3′)的5′端加入EcoR I酶切位点，下游引物NS1dn(5′-ATC TCG AGG TCA AAC TTC TGA CTC-3′)的5′端加入Xho I酶切位点。PCR扩增NS1基因，长度为654bp。克隆的NS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示，NS1基因的氨基酸序列如SEQID NO4所示，长度为232个氨基酸。
然后将NS1基因插入pMB质粒中，获得重组的pMB-NS1质粒，具体操作如下参照RizolLS Reagent(GibcoBRL公司产品)说明书提取病毒RNA，以NS1up/NS1dn为引物，在AMV反转录酶作用下合成AIV NS1基因的cDNA，反转录(RT)产物直接用作PCR扩增NS1基因的模板。按常规方法扩增NS1基因，反应条件为94℃预变性3min；94℃变性40s，50℃退火90s，72℃延伸90s，循环30次，最后72℃延伸10min。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭，EB)电泳检测，在紫外灯下可以观察到特异性条带(图4)。
纯化的PCR产物用限制性内切酶EcoR I和Xho I在37℃消化3小时，反应体系如下10×buffer M 15μL，Xho I 5μL，EcoR I 5μL，NS1 PCR产物30μL，加ddH2O补至l00μL。用上述两种限制性内切酶和CIAP在相同条件下消化pMB质粒。纯化回收消化的NS1 PCR产物和pMB质粒，在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，4℃过夜，连接反应体系如下10×连接buffer 1μL，消化的PCR产物2μL，消化的pMB质粒2μL，T4DNA连接酶1μL，加ddH2O补至总体积10μL。
用连接产物直接转化E.coli DH5α感受态细胞，转化方法为CaCl2法。经Ampr抗性筛选，获得插入了NS1基因的重组子。然后用特异性引物NS1up/NS1dn进行PCR筛选。对PCR筛选阳性的细菌，挑取单菌落接种于3mL LB培养基(含1μg/m1氨卞青霉素)中，37℃，200r/m振摇培养16-20小时。离心收集菌体，抽提质粒，再经限制性内切酶消化(图5)和序列测定，获得的重组质粒命名为pMB-NS1。
实施例4 NS1基因在大肠杆菌BL21中的表达及表达产物分析取质粒pMB-NS1转化大肠杆菌BL21(DE3)(美国stratagene公司产品，购自广州美津生物技术有限公司)感受态细胞，转化方法为CaCl2法。经Ampr抗性筛选，以及采用特异性引物NS1up/NS1dn进行PCR筛选，阳性菌落为含有质粒pMB-NS1的基因工程菌，命名为E-NS1。挑取阳性菌落接种3mL LB液体培养基(含有100μg/mL Amp)，37℃ 220r/min振摇过夜；次日，以1％的浓度接种10mL LB液体培养基(含有100μg/mL氨卞青霉素)，37℃ 200r/min振摇至OD600＝0.5时，加入终浓度为1mmol/L IPTG进行诱导表达，取诱导6h的菌液1mL，12000r/min离心2min，弃上清，细菌沉淀中加600μL裂解缓冲液，冰浴10min，然后超声裂解细菌工作时间4s，间隔时间10s，功率400w，循环10次。将细菌裂解液于4℃ 12 000r/min离心10min，分别收集上清液和沉淀。上清液中加入150μL的5×SDS上样缓冲液，100℃处理5min，用于SDS-PAGE电泳。沉淀中加入750μL 1×SDS上样缓冲液，100℃处理5分钟，进行SDS-PAGE电泳。根据沉淀和上清液中融合蛋白的相对量来判断蛋白的可溶性。用感染了禽流感病毒的阳性血清对表达的融合蛋白进行Western Blot分析。
SDS-PAGE方法如下参照汪家政等(2000)编《蛋白质手册》方法制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAG)。成层胶浓度为5％，分离胶浓度为12％。将待检样品煮沸5min，取10μL加入凝胶点样孔中，在电场作用下进行电泳。电泳缓冲液为Tris-甘氨酸。电压为80v/cm，待溴酚蓝到达成层胶底部时电压升高到160v/cm。待溴酚蓝接近凝胶底部时，停止电泳，取下凝胶，置于1％考马斯亮蓝溶液中染色过夜，用脱色液脱色。电泳结果(图6、图7)表明，NSl融合蛋白的分子量约为59kD，用VL凝胶成像系统BiolD++程序对电泳结果进行扫描分析，融合蛋白占细菌总蛋白的45％。经蛋白可溶性分析表明，细菌裂解上清液中目标蛋白占总蛋白量的41.2％，沉淀中目标蛋白占总蛋白量的3.8％，初步估算细菌中目标蛋白的可溶性部分占91％以上。
Western Blot分析方法如下SDS-PAGE电泳结束后，不对凝胶进行染色。剪一张与凝胶相同大小的硝酸纤维素膜及两张滤纸，与电泳之后的凝胶一起在室温浸泡在转移缓冲液中15min，按海绵-滤纸-凝胶-硝酸纤维素膜-滤纸-海绵的顺序安装转印夹。将夹中有膜的一侧接正极，并在15V的电压下转移1.5h。用镊子夹取硝酸纤维素膜，转移至5％脱脂奶粉/PBS溶液4℃封闭过夜。翌日，用TBS漂洗硝酸纤维素膜1遍，将硝酸纤维素膜装入塑料袋，加入5mL以1∶100稀释于1％脱脂奶粉/PBS中的感染了H9N2禽流感活病毒的小鼠血清，封口，塑料袋放在平缓摇动的摇床上，25℃温育1h。剪开塑料袋，废弃液体，漂洗硝酸纤维素膜3次，每次10min。将硝酸纤维素膜装入另一新塑料袋，加入5mL以1∶1000稀释于1％脱脂奶粉/PBS中的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(二抗)，排除气泡密封袋口，25℃摇床摇动温育1h。弃二抗，TBS洗涤硝酸纤维素膜3次，每次10min。把硝酸纤维素膜移至一平皿，加入底物液，观察反应过程，待蛋白带的颜色深度达到要求，立即用清水漂洗滤膜，然后将滤膜转移至内装适量PBS液的平皿中，在59kD位置可见一特异性条带(图8)。Western Blot结果表明表达产物都能与相应的抗体进行反应。
收集IPTG诱导表达的E-NS1菌体，于0℃冰浴上进行超声破碎、离心后，用50％ Ni-NTA纯化树脂在非变性条件下进行纯化。具体操作如下将100ml工程菌E-NS1在IPTG诱导下表达4h，取样，4℃10 000r/m离心10min，收集菌体并保存在-20℃；将保存的细菌菌体沉淀置冰浴上解冻15min，然后向细菌沉淀中加入200mL裂解缓冲液(LysisBuffer)，冰浴10min，然后超声裂解细菌工作时间4s，间隔时间10s，功率400w，循环30次。将细菌裂解液于4℃ 12 000r/min离心10min，收集上清液。
在层析柱中预先加入5～10mL PBS液，将纯化树脂50％Ni-NTA混匀，取出3mL缓慢逐滴加入，沉淀4～6h后，用5倍于纯化柱体积的LysisBuffer平衡纯化柱(流速≤1.5mL/min，纯化过程的流速都如此)。待LysisBuffer即将全部进入纯化树脂之时，沿着管壁缓慢加入表达的细菌裂解上清，待上清完全进入柱床之后，用2倍于纯化柱体积的Lysis Buffer过柱，收集样品。用5倍于纯化柱体积的Wash Buffer洗柱、备样。最后用1mL Elution Buffer过柱4次，依次收集过柱液，同时备样，将以上样品进行SDS-PAGE分析。在SDS-PAGE图(图9)上可见，纯化后的蛋白只有一条带。纯化的目的蛋白用凝胶成像系统BioID++程序对电泳结果进行扫描分析，纯度达98％以上。纯化蛋白的浓度为2.25mg/mL；诱导表达1L菌液，可获得纯化蛋白45mg。
结果表明，NS1基因插入pMB表达载体后，以融合蛋白的形式在大肠杆菌中获得表达，表达量为细菌总蛋白的45％。蛋白可溶性分析表明，NS1基因在pMB中表达后，融合蛋白主要以可溶性形式存在。融合蛋白可溶性组分占细菌裂解上清的41.2％，不溶组分占细菌裂解沉淀的3.8％。重组蛋白的可溶性组分超过目标蛋白90％。
实施例5表达口蹄疫病毒非结构蛋白3B的重组质粒pMB-3B的构建根据Genbank中的FMDV 3B基因序列，设计一对引物用于扩增3B基因阅读框架，在上游引物3Bup(5′-ATG AAT TCG GAC CCT ACG CCGGGC CAC TC-3′)的5′端引入EcoR I酶切位点，下游引物3Bdn(5′-ATCTCG AGC TCA GTG ACA ATC-3′)的5′端引入Xho I酶切位点。PCR扩增3B基因，长度为213bp；然后将3B基因插入pMB质粒中，获得重组的pMB-3B质粒，具体操作如下参照RizolLSReagent说明提取病毒RNA，以3Bup/3Bdn为引物，在AMV反转录酶作用下合成FMDV 3B基因的cDNA，RT产物直接用于PCR扩增3B基因的模板。按常规方法扩增3B基因，反应条件为94℃预变性3min；94℃变性40s，55℃退火90s，72℃延伸90s，循环30次，最后72℃延伸10min。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭，EB)电泳检测PCR产物，在100V的电压下进行电泳，20min后在紫外灯下观察结果。克隆的口蹄疫病毒非结构蛋白3B基因的核苷酸序列如SEQ ID NO5所示，长度为213bp。3B基因的氨基酸序列如SEQID NO6所示，长度为71个氨基酸。
用EcoR I和Xho I双酶切纯化的PCR产物，37℃作用3h，反应体系如下10×buffer M 15μL，Xho I 5μL，EcoR I 5μL，3B PCR产物30μL，ddH2O补至100μL。同时用上两种酶酶切pMB质粒。纯化回收酶切后的3B PCR产物和pMB质粒，在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，4℃连接过夜，反应体系如下10×连接buffer 1μL，PCR酶切回收产物2μL，pMB质粒回收产物2μL，T4 DNA连接酶1μL，ddH2O补至10μL。
将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，取菌液涂布LB固体培养基(含有100μg/mL Amp)上，37℃培养12～16h。从平板上挑取5个单菌落接种3mL含100μg/mL Amp的LB培养液中，37℃振摇培养12h后，取菌液用引物3Bup/3Bdn进行PCR检测，同时设立空白对照，反应体系如下10×PCR buffer 2uL，菌液0.5uL，dNTPs 2uL(2.5mM)，3Bup 0.5uL(20uM)3Bldn 0.5uL(20uM)，EX Taq 0.1uL(5U/uL)，ddH2O补至20uL。按常规方法扩增3B基因，反应条件为94℃预变性3min；94℃变性40s，50℃退火90s，72℃延伸90s，循环30次，最后72℃延伸10min。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙锭，EB)电泳检测PCR产物，在100V的电压下进行电泳，20min后在紫外灯下，可见特异性条带(图10)。
将PCR鉴定为阳性的菌落置37℃ 220r/m过夜振荡培养，收集菌体，提取质粒。用EcoR I和Xho I双酶切质粒，反应体系如下10×buffer M2.5ml，Xho I 0.75μL，EcoR I 0.75μL，重组质粒10μL，ddH2O补至25μL。离心混匀后，37℃反应2小时，用1.0％琼脂糖凝胶电泳进行检测，紫外灯下可见两条预期大小的DNA条带(图11)。取质粒酶切鉴定正确的转化子菌液送上海博亚公司进行DNA序列测定。将测序鉴定正确的表达质粒命名为pMB-3B。
实施例6 3B基因在大肠杆菌BL21中的可溶性表达用质粒pMB-3B转化大肠杆菌BL21感受态细胞，转化方法为CaCl2法。将菌液均匀涂布在LB固体培养基(含有100μg/mL Amp)上，37℃培养12～16小时。挑取菌落接种3mL LB液体培养基(含有100μg/mLAmp)，37℃ 220r/min振摇过夜；次日，以1％的浓度接种10mL LB液体培养基(含有100μg/mL Amp)，37℃ 220r/min振摇至OD600＝0.5时，加入终浓度为1mmol/L IPTG进行诱导表达，取诱导表达6h的菌液1mL，12000r/min离心2min，弃去上清液，细菌沉淀中加600μL裂解缓冲液，冰浴10min，然后超声裂解细菌工作时间4s，间隔时间10s，功率400w，循环10次。结束后，4℃ 12,000r/m离心10min，收集上清和沉淀。上清液中加入150μL的5×SDS上样缓冲液，100℃处理5min，用于SDS-PAGE电泳。沉淀加入750μL 1×SDS上样缓冲液，100℃处理5分钟，进行SDS-PAGE电泳，根据沉淀和上清液中各自的融合蛋白的量来判断蛋白的可溶性。电泳方法同实施例4。电泳结果(图12、13)表明，3B融合蛋白的分子量为42kD；用VL凝胶成像系统BioID++程序对电泳结果进行扫描分析，融合蛋白的表达量为50％。经蛋白可溶性分析可以看出，细菌裂解上清液中目标蛋白占总蛋白量的48.2％，沉淀中目标蛋白占总蛋白量的0％，初步估算细菌中目标蛋白的可溶性组分达100％。
将表达产物在5％浓缩胶浓度和12％分离胶中进行SDS-PAGE电泳。然后在“半干式”电转印仪上50mA稳流电转移90min。电泳将要结束后，用镊子夹取硝酸纤维素膜，转移至5％脱脂奶粉/TBS溶液4℃封闭过夜。翌日，用TBS漂洗硝酸纤维素膜1遍，将硝酸纤维素膜装入塑料袋，加入5mL以1∶100稀释于1％脱脂奶粉/PBS中的感染了FMDV活病毒的小鼠血清，封口，塑料袋放在平缓摇动的摇床上，25℃温育1h。剪开塑料袋，废弃液体，漂洗硝酸纤维素膜3次，每次10min。将硝酸纤维素膜装入另一新塑料袋，加入5mL以1∶1000稀释于1％脱脂奶粉/PBS中的羊抗小鼠IgG(二抗)(华美公司)，排除气泡密封袋口，25℃摇床摇动温育1h。弃二抗，TBS洗涤硝酸纤维素膜3次，每次10min。把硝酸纤维素膜移至一平皿，加入底物液，观察反应过程，待蛋白带的颜色深度达到要求，立即用清水漂洗硝酸纤维素膜，然后将硝酸纤维素膜转移至内装适量PBS液的平皿中。在42kD位置可见一特异性条带(图13)。Western Blot结果表明表达产物都能与相应的抗体进行反应。
在层析柱中预先加入5-10mL PBS液，将纯化树脂50％Ni-NTA混匀，取出3mL缓慢逐滴加入，沉淀4～6h后，用5倍于纯化柱体积的LysisBuffer平衡纯化柱(流速≤1.5mL/min，纯化过程的流速都如此)。待LysisBuffer即将全部进入纯化树脂之时，沿着管壁缓慢加入表达的细菌裂解上清，待上清完全进入柱床之后，用2倍于纯化柱体积的Lysis Buffer过柱，收集样品。用5倍于纯化柱体积的Wash Buffer洗柱，备样。最后用1mL Elution Buffer过柱4次，依次收集过柱液，同时备样，将以上样品进行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE电泳图上，纯化的蛋白只有一条带(图14)。目的蛋白用凝胶成像系统BioID++程序对电泳结果进行扫描分析，纯度达98％以上。纯化蛋白的浓度为2.67mg/mL；诱导表达1L菌液，可获得纯化蛋白为66.7mg。
结果表明，3B基因插入到pMB表达质粒中，以融合蛋白的形式在大肠杆菌中获得表达，表达量为细菌总蛋白的50％。3B基因在pMB中表达后，融合蛋白主要以可溶性形式存在。融合蛋白可溶性组分占细菌裂解上清的46.2％，不溶组分占细菌裂解沉淀的0％。重组蛋白的可溶性组分超过目标蛋白90％。
序列表SEQUENCE LISTING<110>华南农业大学<120>一种可溶性大肠杆菌表达质粒及其用途<130>
<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>378<212>DNA<213>Escherichia coli<220>
<221>CDS<222>(1)..(378)<400>1gtg atg acc atg tac gca acg ctt gaa gaa gcc att gac gct gca cgc 48Val Met Thr Met Tyr Ala Thr Leu Glu Glu Ala Ile Asp Ala Ala Arg1 5 10 15gaa gaa ttt ctt gca gac aac ccc ggc atc gac gcc gaa gat gcg aat 96Glu Glu Phe Leu Ala Asp Asn Pro Gly Ile Asp Ala Glu Asp Ala Asn20 25 30gtg caa cag ttc aat gcc caa aaa tac gtt ttg cag gac ggc gac atc 144Val Gln Gln Phe Asn Ala Gln Lys Tyr Val Leu Gln Asp Gly Asp Ile35 40 45atg tgg caa gtt gag ttt ttt gcc gac gaa ggg gaa gaa ggt gaa tgt 192Met Trp Gln Val Glu Phe Phe Ala Asp Glu Gly Glu Glu Gly Glu Cys50 55 60tta cct atg ctt agc ggt gaa gcc gcg caa agt gtt ttt gat ggc gac 240Leu Pro Met Leu Ser Gly Glu Ala Ala Gln Ser Val Phe Asp Gly Asp
65 70 75 80tat gat gag ata gag ata cgc cag gag tgg cag gaa gag aat aca tta 288Tyr Asp Glu Ile Glu Ile Arg Gln Glu Trp Gln Glu Glu Asn Thr Leu85 90 95cat gaa tgg gac gag ggg gaa ttt cag ctt gag cca ccg ctg gat acc 336His Glu Trp Asp Glu Gly Glu Phe Gln Leu Glu Pro Pro Leu Asp Thr100 105 110gag gaa gga cgc gca gca gct gat gag tgg gat gaa cgt taa 378Glu Glu Gly Arg Ala Ala Ala Asp Glu Trp Asp Glu Arg115 120 125<210>2<211>125<212>PRT<213>Escherichia coli<400>2Val Met Thr Met Tyr Ala Thr Leu Glu Glu Ala Ile Asp Ala Ala Arg1 5 10 15Glu Glu Phe Leu Ala Asp Asn Pro Gly Ile Asp Ala Glu Asp Ala Asn20 25 30Val Gln Gln Phe Asn Ala Gln Lys Tyr Val Leu Gln Asp Gly Asp Ile35 40 45Met Trp Gln Val Glu Phe Phe Ala Asp Glu Gly Glu Glu Gly Glu Cys50 55 60Leu Pro Met Leu Ser Gly Glu Ala Ala Gln Ser Val Phe Asp Gly Asp65 70 75 80Tyr Asp Glu Ile Glu Ile Arg Gln Glu Trp Gln Glu Glu Asn Thr Leu85 90 95
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权利要求
1.一种可溶性大肠杆菌重组质粒，其特征在于它含有下列核苷酸序列a)SEQ ID NO1；或b)SEQ ID NO1中一个或几个核苷酸残基的替换、缺失、添加或插入形成的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的可溶性大肠杆菌重组质粒，其特征在于它的表达产物的氨基酸序列为a)SEQ ID NO2；或b)SEQ ID NO2中一个或几个氨基酸残基的替换、缺失、添加或插入形成的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的可溶性大肠杆菌重组质粒在制备作为免疫原使用的蛋白质或多肽中的应用。
4.如权利要求1或2所述的可溶性大肠杆菌重组质粒在制备蛋白质类药物中的应用。
5.如权利要求1或2所述的可溶性大肠杆菌重组质粒在制备用于检测人或者动物血清中特异性抗体的蛋白质抗原中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种在大肠杆菌中以可溶性形式高效表达蛋白质/多肽的重组质粒及其应用。通过本发明提供的重组质粒在大肠杆菌中融合表达拟表达的蛋白质/多肽，融合蛋白/多肽的可溶性产物可以达到表达产物的90％以上。本发明还提供了该重组质粒在制备蛋白质/多肽药物、诊断抗原、以及疫苗等方面的应用。
文档编号A61K38/16GK1850977SQ20061007859
公开日2006年10月25日 申请日期2006年5月12日 优先权日2006年5月12日
发明者曹永长, 谢青梅, 李少璃, 陈丽, 覃健萍, 马静云, 毕英佐 申请人:华南农业大学