专利名称：：谷红注射液治疗肺癌的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及中药领域，具体地说涉及谷红注射液在制备治疗肺癌药物中的应用。
背景技术：
：专利文献CN20040086213公开了将红花和乙酰谷酰胺按照特定比例进行组配，进一步对红花提取制备红花提取液后与乙酰谷酰胺制得可用药物进行临床应用的报导；CN20040086213文献中重点提到了该发明具有活血化瘀、改善脑代谢及脑功能作用，可作为制备治疗闭塞性脑血管疾病，肝昏迷、偏瘫、神经外科手术等引起的昏迷、瘫痪及智力减退、记忆力障碍等疾病药物方面的应用；也可用于制备治疗冠心病、脉管炎等疾病药物方面的应用。依据CN20040086213专利技术生产的谷红注射液，是阿尔贝拉医药(中国)有限公司产品。谷红注射液为乙酰谷酰胺和红花提取物制成的灭菌水溶液。谷红注射液用法用量为静脉滴注，一次5-20m1.用5%或者10%葡萄糖注射液或0.90/o氯化钠注射液250500ml稀释后应用，一日一次.10-15天为一疗程。谷红注射液的功能主治为用于治疗脑血管疾病和脑供血不足，脑血栓，脑栓塞及脑出血恢复期肝病，神经外科手术等引起的意识功能低下，智力减退，记忆力障碍等.还可以用于治疗冠心病，脉管炎等。谷红注射液已经成为了心脑血管系统疾病的常用药物。但谷红注射液用于治疗肺癌药物的应用尚未见报道。
发明内容本发明的目的在于提供依据专利文献CN20040086213制备的谷红注射液的新用途。上迷的谷红注射液在制备治疗肺癌药物中的应用。上述的谷红注射液常规的用药方法和剂量是静脉滴注，一次5ml-20ml，用5%或10%葡萄糖注射液250ml-500ml稀释后緩慢滴注，一日一次，10-15天为一疗程。谷红注射液临床上用于发挥活血化瘀、改善脑代谢及脑功能作用，可作为制备治疗闭塞性脑血管疾病，肝昏迷、偏瘫、神经外科手术等引起的昏迷、瘫痪及智力减退、记忆力障碍等疾病药物方面的应用；也可用于制备治疗冠心病、脉管炎等疾病药物方面的应用。发明人通过大量基础实验和临床试验的验证，发现谷红注射液可以用于制备治疗肺癌细胞的药物，尤其是对高转移人肺癌(PGCL3)，具有全方面的杀灭作用，在临床上也验证了谷红注射液对肺癌的治疗作用。具体实施方式下面用实验例进一步描述本发明，有利于对本发明及其优点、效果更好的了解,但所迷实验例仅用于说明本发明而不是限制本发明。实验例1本研究探讨谷红注射液对高转移人肺癌(PGCL3)细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。1材料与方法1.1细胞抹和主要试剂克隆化高转移巨细胞癌细胞(PGCL3);RPMI-1640培养基是GIBCO公司产品；层粘连蛋白(LN)、纤粘连蛋白(FN)和基底膜胶(matrigel);澳乙啶、吖咬橙和Na-GBZ-l-Ly-sine-p-nitrophenylester为SIGMA公司产品，谷红注射液是阿尔贝拉医药(中国)有限公司产品，为便于研究，将谷红注射液冷冻干燥得到无定型粉末(以下简称"药物")用于实验研究，TUNEL-POD试剂盒为武汉博士德生物工程公司产品。1.2细胞培养和药物处理PGCL3细/i^种于含10%小牛血清pH7.4的RPMI-1640培养基中，置37匸、5%0)2培养箱中培养，至指数生长期进行实验。药物经细胞毒性试验和增殖抑制试验确定药物浓度为2.5mg/L和5.0mg/L,设两个浓度的药物处理组和一个对照组，每组3瓶，每瓶接种1x105个细胞，接种24h后加药。1.3细胞增殖抑制率测定和软琼脂集落形成试验2.5~5.0mg/L,药物处理96h，收集细胞经台盼蓝染色，进行细胞计数，计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率=(对照组细胞数-药物组细胞数)/组细胞数x100%。软琼脂集落形成试验按常规方法进行。1.4侵袭试验参照Albini等"所用方法，将作为化李趋化物的NIH3T3细胞培养上清液0.2ml加入Boyden小室的下室，在上下室之间用孔径8mm的聚碳酸酯微孔滤膜分开，该膜预先铺上Madrigel溶液50pH含Matrigel120yg)，并在37C聚合30min以重建基底膜。将各組已处理96h的细胞收集后分别加入上室，每室加0.5ml(含5x104-细胞)，在37t:、5%0)2培养箱孵育6h后取出滤膜，擦去未穿过的细胞，固定后经Giemsa染色，计数穿膜的细胞数。1.5运动试验参照Kantor等12所用方法，除用7.5mg/mlFN代替Matrigel溶液铺膜以促进细胞粘着于膜上外，其余操作步骤和计数方法与侵袭试验相同。1.6粘附试验在参照Kumagai等人[3所用的方法上进行改良，将各组处理96h的细胞制无血清RPMI-1640的细胞悬液，接种于已包被LN的96孔板的孔内，每孔含LN10Hg，每孔加0.2ml细胞悬液(含1000个细胞)置37匸、5%C02培养箱孵育60min后，倒置显微镜下计数细胞总数，弃去未粘附的细胞，PBS轻洗2次，镜下计数粘附细胞，计算粘附百分率。1.7组织蛋白酶B(CB)活性测定用酶动力学方法测定。取各组药物处理24h后换无血清培养液培养24h，取上清液100u1加激活液(舍0.03M二硫苏糖醇和0.03MEDTA-NA2溶液)200iJl,摇匀，25t:放置15min使酶激活；加入3ml反应緩冲液(含0.003MEDTA-NA2的0.025MpH5.1醋酸緩冲液)，混匀，加底物N+千氧羰基-L-赖氨酰对硝基苯酯溶液1000u1(5mg/L的DMSO溶液)，立刻混匀后每隔lmin测AA326nm值，至反应变慢为止，然后进行酶活性计算。酶活性单位是25t:、pH5.1的条件下，每分钟水解lpmol/L底物为一个酶活性单位(U)。U=(AA326nm测-厶A326nm空白)/7.58x10懇3。1.8细胞凋亡测定检测细胞凋亡的吖啶橙(AO)-澳乙啶(EB)荧光双染法按Zhi-Jun等W的方法进行，TUNELDNA片段末端标记法按武汉博士德生物工程公司TUNEL-POD试剂盒说明书方法进行。1.9统计学处理用SPSS软件进行组间t检验。2结果2.1药物对PGCL3细胞增殖的影响2.5、3.5、4.5、5.5和6.5mg药物处理96h，PGCL3细胞增殖抑制率分别为29.6%、43.2%，54.5°/。，84.1%和97.3%，经计算，药物的ICso为4.07mg/L，以下分别选取5.0mg/L的药物作为实验浓度。2.2药物对PGCL3细胞软琼脂集落形成能力的影响2.5mg/L、5.0mg/L，药物处理4dPGCL3细胞软琼脂集落形成数均低于对照组(P<0.05)，见表l。2.3药物对PGCL3细胞侵袭能力的影响2.5mg/L、5.0mg/L药物处理4d后对PGCL3细胞的穿膜侵袭能力均有显著抑制作用(P<0.05和P<0.001)且具有浓度依赖性。上述浓度药物处理2h，细胞的侵袭能力无明显改变(P>0.05),见表2、3。2.4药物对PGCL3细胞运动能力和粘附能力的影响药物处理96h,观察PGCL3细胞的穿膜运动能力和粘附能力，可见药物处理组的穿膜运动能力和粘附能力均显著下降，(PO.001)且具有浓度依赖性，见表4、2.5药物对PGCL3细胞分泌组织蛋白酶B(CB)的影响PGCL3细胞经药物处理72h后换无血清培液培养24h,培养液上清中组织蛋白酶B活性测定结果，药物处理组细胞分泌的CB活性显著降低(PO.001)，见表6。2.6药物诱导人肺癌细胞凋亡的作用药物处理PGCL3细胞48h，AO/EB焚光双染法和TUNEL法测定细胞竭亡率，结果可见药物处理使PGCL3细胞凋亡率明显增加(PO.05和P<0.001)，见表7。表l谷红注射液对肺癌细胞集落形成能力的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2谷红注射液对肺癌细胞侵袭能力的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表3谷红注射液处理2h对肺癌细胞侵袭能力的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表4谷红注射液对肺癌细胞运动能力的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表5谷红注射液对肺癌细胞粘附能力的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表6谷红注射液对肺癌细胞分泌CB活性的影响组别CB活性(u/ml)与对照组比较对照组5.0±1.32.5mg/L3.6±1.0P<0.055.0mg/L3.4±1.2P<0.05表7谷红注射液对PGCL3细胞凋亡的影响组别细胞凋亡率(％)AO/EB法TUNEL法对照组4.48±0.968.20±1.902.5mg/L7.38±0.83A14.76±3.52*5.0mg/L11.47±1.08*22.91±5.31*T测试，AP<0.05，*PO.013讨论4^研究发现谷红注射液既有抑制PGCL3细胞增殖作用，又有抗侵袭和诱导凋亡作用。本研究结果显示谷红注射液能明显抑制PGCL3人肺癌细胞增殖，其机理之一可能是诱导癌细胞恶性表型逆转，^研究还证明谷红注射液使PGCL3细胞软琼脂集落形成率显著下降，通常认为癌细胞在半固体琼脂上形成集落的多少与其恶性程度呈正相关。另一方面由于谷红注射液有诱导PGCL3细胞凋亡而使其细胞数量减少.细胞凋亡是遵循一定程序的生理性细胞死亡，其形态特征是以细胞核的变化为先导，早期出现核固缩，最后细胞碎裂成凋亡小体；细胞凋亡的生化特征是Ca2、MgW依赖的核酸内切酶激活使DNA断裂，^研究用反映细胞凋亡形态特征的AO/EB荧光双染法和高灵敏度特异反映细胞凋亡生化特征一一DNA聚合酶介导的原位缺口平移法、TdT介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL法)探测DNA的断裂，证明该药物有诱导PGCL3细胞凋亡的作用，这可能是细胞增殖抑制机理的另一方面。癌症的侵袭和转移是一个多步骤、多因素、多基因的发展过程。从分子水平可将这种过程人为分成三步粘附，肿瘤细胞与胞外基质中层粘连蛋白(LN和纤维连接蛋白(FN)相粘附；趋化运动，肿瘤细胞沿着趋化剂的浓度梯度迁移；降解，即肿瘤细胞释放各种水解酶类(组织蛋白酶B等)，破坏其粘附部位的组织，使肿瘤细胞得以向纵深移动远距离转移。在此过程中，细胞粘附，细胞外基质降解以及细胞运动是转移能否发生的决定环节。组织蛋白酶B与多种肿瘤细胞的侵袭能力有关，恶性肿瘤细胞与正常细胞相比，其组织蛋白酶B活性显著增加，且转移性肿瘤细胞的增加更明显。药物体外抗侵袭作用尚未见报道，本研究采用Albini等人用天然基底膜胶重建基底膜的模型(肿瘤细胞体外侵袭模型)进行肿瘤细胞侵袭定量实验，发现药物具有明显抑制PGCL3细胞侵袭的作用。为了探讨其抗侵袭的机理，本研究对癌细胞侵袭的三个基本环节一一粘附、运动和降解进行分析研究发现，上述浓度药物处理后，PGCL3细胞对层粘连蛋白的粘附能力、趋化运动能力和组织蛋白酶B的分泌均显著下降，并呈量效关系。可见谷红注射液抗PGCL3细胞侵袭的作用是多方面的，即侵袭作用的机理包括粘附、运动和降解能力的抑制，而不是对某一环节的阻断作用。Lotan5总结维曱类(含维甲酸)抗肿瘤侵袭和转移的机制，认为是由于促进恶性细胞分化，从而抑制参与侵袭的蛋白酶的产生，抑制肿瘤细胞的迁移和新血管的生成等。以上研究均表明，细胞分化诱导剂对侵袭作用的各个环节都呈抑制作用，而不是对个别环节的阻断作用。谷红注射液抗PGCL3细胞侵袭的作用也具有上述细胞分化谦导剂抗侵袭作用的特点，说明其抗侵袭作用机理也是由于细胞分化所致。本研究用谷红注射液处理PGCL3细胞2h后PGCL3细胞侵袭能力没有影响，也说明该药物不直接阻断肺癌细胞的侵袭过程，只有较长时间的处理才表现抗侵袭作用，因为细胞分化需要经历复杂的基因表达调控的历程。从本研究发现的该药抗侵袭作用特点和软琼脂集落形成率变化情况，说明谷红注射液的抗侵袭作用可能是通过诱导细胞恶性表型逆转即诱导细胞分化而实现的。因此，通过诱导细胞分化来抑制肺癌细胞的侵袭，似乎是比较合理的对策。参考文献[l]AlbiniA，IwamotoY，KleinmamHK，etal.Arapidinvitroassayforquantitatingtheinvasionpotentialoftumorcells[J〗，CancerRes;1987，47(12):3239-1973.[2]KantorJO，MccormickB，steegPS,etal，Inhibitionofcellmotilityafternm23transfectionofhumanandmurinetumorcells[J].CancerRes:1993，53(9):1971-1973.[3]KumagaiH，TajimaM，UenoY，EffectofcyclicRGDpeptideoncelladhesionand加mormetastasis[J]，BiochemBiophysResComm，1991，177(l):74-82.[4]Zhi-JunY，SriranganathanN，VaughtT，etal,Adye-basedlympho-cyteproliferationassaythatpermitsmultipleimmunologicalanalyses:mRNA，cytogentic，apoptosis，andimmuno-phenotypingStudies[J]，JImmunolMethods，1997,210(1):25-39.[5]LotanR，Retinoidsasmodulatorsoftumorcellsinvasionandmetasta-sis[J.SetninCancerBiol,l991,2(3):197-208.实验例2治疗一例小细胞肺癌病例刘某，男，53岁，无即往肿瘤发病，B超检查肝胆狭脾双肾未见明显异常。CT诊断报告:胸壁皮下软组织层次结构清晰，未见肿胀、积气或肿块。左肺上叶支气管周围见边界边界不清软组织块影围绕，左肺上叶支气管受压变窄，远端肺组织容积缩小、实变。纵隔内未见明确肿大淋巴结影。心脏大小及形态无特殊，心包腔内无积液，所见脉管粗细均匀，未见异常改变。支气管镜检查喉会厌会厌披裂皱襞披裂隆凸、披裂间隙声带(-)气管(-)气管隆凸锐利、动态好肺支气管右肺(-)左肺左上叶舌支新生物/坏死物阻塞，并有活动性出血，左下叶基底支开口外側壁外压性狭窄。肺活检挤压组织中见部分异型细胞，诊断为小细胞肺癌。治疗方法化疗，顺铂+紫杉醇，做2周期(2x21天)，化疗中结合谷红注射液静脉滴注，一次5ml-20ml，用5%或10%葡萄糖注射液250ml-500ml稀释后緩慢滴注，一日一次，15天为一疗程，间歇10天后再进行一个疗程。病人止痛药减量，体质恢复较好，病人存活期已经超过18个月。权利要求1.谷红注射液在制备治疗肺癌的药物中的应用。全文摘要本发明属于药物用途，具体公开了谷红注射液的新用途。通过大量的基础实验和临床试验的验证，确认谷红注射液在制备治疗肺癌药物方面的应用有良好前景。文档编号A61P35/00GK101120959SQ200610109289公开日2008年2月13日申请日期2006年8月8日优先权日2006年8月8日发明者张玉梅申请人:阿尔贝拉医药(中国)有限公司