专利名称：抗猪大肠杆菌病三联高免免疫球蛋白的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及抗猪大肠杆菌病三联高免免疫球蛋白，国际专利分类号为A61K39/395。
背景技术：
在当前养猪生产中，对养猪业发展威胁最大的猪大肠菌病仍然是引起仔猪腹泻的黄、白痢和水肿病，是威胁仔猪成活的最严重的仔猪疾病，是引起仔猪死亡的重要原因。据不完全统计，因大肠菌感染引起的仔猪腹泻和猪水肿病导致仔猪死亡占仔猪总数的50％以上，给养猪业带来了巨大的损失。猪大肠杆菌病总共包括3个疾病，即仔猪黄痢、仔猪白痢和猪水肿病。这3种疾病的致病因素都是由于致病性大肠杆菌在生长和繁殖过程中产生的毒素所引发的。其中热稳定肠毒素(ST)和热不稳定毒素(LT)主要引起仔猪黄痢和仔猪白痢，类志贺氏毒素(Shiga-like toxins，Stx2e)主要引起猪水肿病。在引起腹泻的大肠菌的分类中，将产生ST和LT毒素的大肠杆菌归类为产肠毒素大肠菌(Enterotoxigenic Escherichia ColiETEC)；将产生志贺氏毒素大肠菌(Shiga toxin-producing E.coli，STEC)归类为肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhagic E.coli，EHEC)。
目前在养猪业中普遍使用的预防仔猪黄白痢的疫苗是K88、K99基因工程活菌苗，用户普遍反应其效果不甚理想。K88和K99是大肠菌菌体上的菌毛，菌毛在致病机理中的作用是先与肠道中肠绒毛的上皮细胞结合，菌毛与肠细胞的结合就意味着菌体与肠细胞的结合，结合后菌体可将毒素输入肠上皮细胞内，从而引起腹泻。基于此原理才设计出菌毛疫苗。而动物能否会发生腹泻，是由于致病性大肠菌所分泌的毒素所引起的，菌毛只不过是一个中间的介质，虽然抗K88、K99抗体能够阻断菌体与肠粘膜上皮细胞的结合，但细菌所分泌的毒索还可以通过其他途径结合到肠粘膜细胞上，从而引起腹泻，这也就是K88、K99基因工程菌毛疫苗免疫失败的原因。
在治疗上，常规使用抗生素类药物对这三种疾病进行治疗。问题是抗生素类药物可以杀死细菌，但不能灭活毒素，在菌体被杀死之后，其产生的毒素仍然存在，也就是说，由于毒素是一种菌体分泌的蛋白质，抗生素类药物对其没有作用，而引起腹泻的罪魁祸首就是毒素，这样在菌体被杀死之后，毒素仍然具有活性，仍然可以引起腹泻。这就是用抗生素类药物进行治疗，其治疗效果不是很好的原因。
目前在我国畜产品生产过程中，为了预防控制疾病以及促进动物生长，动物从一出生就给动物饲喂抗生素类药物，这种生产方式导致的结果是在生产的畜产品中，药物残留量超标和抗药性的菌株的产生。抗药性菌株不断增加使抗药性菌株的抗药谱越来越广，从而给疾病的预防和治疗带来了极大的困难，即使用抗菌素类药物治疗或预防这一类疾病无效。从而给畜牧养殖业带来了巨大的经济损失，尤其是引起仔猪的大批死亡严重的阻碍了养猪业的发展。药物残留量超标引起的副作用是出口检疫不合格，使我们生产的猪肉产品不能顺利出口，给养殖企业带来经济损失，同时由于药物残留超标，在国内消费会对人类的健康长生不利的影响。
此外，某些毒素，如引起猪水肿病的类志贺氏毒素的作用是非常急速的，在兽医临床上，当看到动物发病进行紧急治疗时，药物注射完不久，动物就会发生死亡，也就是人们常说的这种病太急，不给治疗留下时间。这就是猪大肠杆菌病治疗效果不好的又一个原因。
发明内容
本发明的目的是提供一种安全性好、不产生药物残留、预防、紧急预防和治疗猪大肠杆菌病的抗猪大肠杆菌病三联高免免疫球蛋白。
本发明的免疫动物使用经过严格检疫的猪、马(骡、驴)作为免疫动物。
本发明的免疫原采用可引起仔猪黄痢和白痢的猪致病性大肠杆菌196，C83902(产生LT和ST毒素菌株)192，C83549和产生志贺氏毒素(Stx2e)O138菌株，按照体积比(1～2)∶(1～2)∶(1～2)的比例混合制备抗原免疫动物，制备高免免疫球蛋白；免疫佐剂采用弗氏完全佐剂；免疫增强剂采用吉林鲸象动物药业有限公司生产的苷肽注射液(发明名称为一种提高动物免疫功能的苷肽注射液，专利申请号为2005 1 0016626.2)，5毫升/支，以提高抗体效价；免疫原与弗氏完全佐剂按照体积比1∶1混合；免疫程序免疫途径采用皮内、皮下或穴位、肌肉多点注射。基础免疫剂量为每头猪3ml，马(骡、驴)5ml。免疫方式猪为皮下或肌肉多点注射，马(骡、驴)用皮内、皮下或穴位多点注射。间隔18～21天进行第一次加强免疫，免疫剂量为猪8ml，马(骡、驴)10～12ml。以后每间隔18～21天进行加强免疫一次，经2～4次加强免疫后，检测抗体效价，抗体效价≥2048时视为合格，如抗体效价达不到此标准，继续加强免疫一次，然后对马(骡、驴)颈静脉采血或对免疫猪颈动脉或心脏直接放血。
抗体效价检测使用ELISA方法检测血清抗体效价。检测抗原用经超声波破碎的细菌培养物，第二抗体采用相对应的兔抗猪(鼠抗猪)或兔抗马(鼠抗马)，同时设立阴、阳性血清对照。血清抗体效价合格者方能进行采血或作为合格产品出厂。
采血和血清提取首先用1％～5％无菌氯化钠溶液将采血的容器内壁完全打湿。每个容器应标明动物号码、最后一次加强免疫日期和采血日期。无菌采血后将采集的血液在20℃在～25℃放置，待其全部凝固并有血清析出时，加入灭菌的压砣，48～72小时后，以无菌方式提取血清。同时按血清总量的0.5％加入氯仿、0.0035％加入硫柳汞，加塞密封，充分摇匀，放置于2℃～15℃冷暗处，沉淀澄清。同时每瓶血清应贴有动物号、血清量和分离日期。
血浆提取将血液收集于盛有5％灭菌枸橼酸钠溶液的灭菌玻璃瓶中，血液和枸橼酸钠溶液的比例为9∶1；经48～72小时沉淀，抽取上清，并按总量的0.5％加入氯仿、0.0035％加入硫柳汞，加塞密封，充分摇匀。每瓶血浆应作详细记录。
血清(血浆)精制将要精制的血清(血浆)混合至同一灭菌容器中，按血清(血浆)总量的2倍量加入蒸馏水，充分搅拌均匀；用2mol/L盐酸调节pH至3.0，加入盐酸调节pH时，要缓慢加入，边加边搅拌边测量，防止局部pH过酸对免疫球蛋白的活性产生影响。放置60分钟，再用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至3.2～3.4。然后按照每1ml 6～9单位的量加入胃蛋白酶，并按总量的0.2％加入甲苯，在29℃～31℃条件下消化2～24小时，消化期间要经常搅拌。
将消化完的溶液按照总量的15％加入硫酸铵，充分溶解后，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至4.5～4.7，60℃水浴60分钟。待溶液冷却至43℃以下时，用帆布过滤，收集滤液，去掉沉淀。对收集到的滤液进行计量，并放于同一个灭菌的容器中，用2mol/L的氢氧化钠点溶液调节pH至7.1～7.3，按照总量的20％加入硫酸铵，充分搅拌均匀后，用灭菌的帆布过滤，收集沉淀物。然后对沉淀进行称量，放入到一个无菌容器中，并向沉淀物中加入5～6倍的蒸馏水，溶解沉淀物，待沉淀物充分溶解后，按照总量加入10％的明矾溶液，使明矾总含量达到1％。再用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.7～7.8，静置2～4小时使其沉淀，然后用无菌帆布过滤，收集滤液。
将收集到的滤液放置于同一个无菌容器中，按总量的38％加入硫酸铵，充分搅拌后用无菌帆布过滤，弃上清收集沉淀，将沉淀压干后用透析袋分袋包装，每袋约200～250g，加入少许氯仿，扎紧透析袋后放置于流水槽内透析48～72小时。然后收集袋内的血清，按总量的0.5％加入氯仿、0.85％加入氯化钠，0.0035％加入硫柳汞。充分溶解后在无菌条件下用0.22um膜过滤，放置于5℃～15℃静置沉淀。然后取少量血清进行抗体效价检测，并对其保护效力进行测定。
按照中华人民共和国农业部2000年出版的《中华人民共和国兽用生物制品规程》对生产的血清进行无菌检验。
高免免疫球蛋白免疫效力测定试验将10kg左右易感仔猪20头共分为4组，每组5头。第一组肌肉注射经ELISA检测抗体效价≥1024的高免免疫球蛋白4ml，在注射免疫球蛋白后4小时肌肉注射引起仔猪黄、白痢的标准强毒菌株培养液0.5ml(菌体含量为≥100亿/ml)。连续观察7天。在7天内不发病者为保护，有轻微腹泻症状，但在两日内不用药自然康复者为显效，7日内不康复者为无效。
第二组同样注射经ELISA检测抗体效价≥1024的高免免疫球蛋白4ml，在注射免疫球蛋白后4小时肌肉注射可引起猪水肿病的标准强毒菌株0.5ml。连续观察7天，在7日内不发病者为保护，发病者为无效。
第三、四组为对照组，肌肉注射生理盐水5ml，注射后4小时分别用引起仔猪黄、白痢和猪水肿病的标准强毒菌株进行攻毒，应全部发病。
实验结果结果表明，第一组仅有一头猪在攻毒后第二天出现轻微腹泻症状，未经治疗在第三天自然康复，有效率为100％。第二组未见有发生猪水肿病的情况，有效率也为100％。第三组对照组中有4头猪出现腹泻症状，一头猪未发病。第四组全部出现水肿病，有4头猪在发病后12小时之内死亡。
产品分装将半成品经适当稀释后，作为成品分装时，抗体效价应比规定标准高出20％，即使用时的抗体效价为≥1024时，分装成品的抗体效价应不低于≥1230。使用剂量为0.4ml/kg体重。
本发明的积极效果如下①安全性好 在免疫球蛋白的加工工艺中使用胃蛋白酶对免疫球蛋白进行消化，将抗体的FC片断切掉，使免疫球蛋白的分子量缩小将近一倍，同时用硫酸胺沉淀法将血轻重的白蛋白除去，这样就不会引起过敏反应。
②特异性强 高免免疫球蛋白是用适宜的抗原免疫动物之后，经过一定时间在动物体内的作用，动物产生了抗猪大肠杆菌病特异性的免疫球蛋白，检测特异性抗体的效价，检测合格后，对免疫动物进行采血或放血，用适宜的加工工艺从血液中提取或精制的特异性的、抗猪大肠杆菌病的抗体。由于这种抗体不仅仅只是针对菌毛，而且也针对毒素。对发病猪进行治疗或紧急预防就会取得迅速、特异的疗效。
③临床应用效果好 实际应用证明，用这种高免免疫球蛋白治疗或预防猪的大肠杆菌病病其疗效是确实和迅速的，用药后(肌肉注射)20分钟即可见到明显的效果，2小时即可达到临床治愈，患病猪食欲、精神等项临床体症都恢复正常。一般较为轻型病例，一次用药就可治愈，对于个别重症病例，在2～3天后再重复注射一次，即可达到临床治愈的效果。
④组方科学 猪大肠杆菌病总共包括3个疾病，即仔猪黄痢、仔猪白痢和猪水肿病。这三种疾病都是引起仔猪的疾病，本发明将这三种疾病的免疫球蛋白在一种产品中都生产出来，用一种制剂就可以同时防治三种疾病。
⑤对人类健康的意义 由于引起仔猪黄痢的LT毒素与引起人的霍乱肠毒素(CT)同源性较高，引起猪水肿病的Stx2e毒素与引起人类痢疾的志贺氏痢疾杆菌所产生的志贺氏毒素同源性较高，用这种制剂对猪群进行预防和治疗不但可以控制这些疾病在猪群中的发生和流行，还可以间接的防止人群中霍乱和痢疾的发生和流行。
⑥不会产生药物残留 由于免疫球蛋白的半衰期短，代谢较快，在体内没有蓄积作用，没有药物残留。可以生产出高质量、绿色的猪肉产品，对人体健康不会产生不利影响。
⑦保存和使用方便 本品为淡黄色透明液体，4℃保存一年内检测抗体效价仍在≥1024以上，非常稳定。
具体实施例方式
实施例1本发明的免疫原采用可引起仔猪黄痢和白痢的猪致病性大肠杆菌196，C83902(产生LT和ST毒素菌株)192，C83549和产生志贺氏毒素(Stx2e)O138菌株，按照体积比1.5∶2∶1的比例混合制备抗原免疫动物，制备高免免疫球蛋白；免疫佐剂采用弗氏完全佐剂，与免疫原hunhe的体积比为1∶1；免疫增强剂采用吉林鲸象动物药业有限公司生产的苷肽注射液，5毫升/支，以提高抗体效价；免疫程序本发明的免疫动物使用经过严格检疫的猪、马(骡、驴)作为免疫动物。
免疫途径采用皮内、皮下或穴位、肌肉多点注射。基础免疫为每头猪3ml，马(骡、驴)5ml。免疫方式猪为皮下或肌肉多点注射，马(骡、驴)用皮内、皮下或穴位多点注射。加强免疫间隔18～21天进行第一次加强免疫，免疫剂量为猪8ml，马(骡、驴)10～12ml。以后每间隔18～21天进行加强免疫一次。抗体效价检测使用ELISA方法检测血清抗体效价。抗体效价≥2048时视为合格，如抗体效价达不到此标准，继续加强免疫一次，然后对马(骡、驴)颈静脉采血或对免疫猪颈动脉或心脏直接放血。
采血和血清提取无菌采血后将采集的血液在20℃在～25℃放置。血清提取待其全部凝固并有血清析出时，加入灭菌的压砣，48～72小时后，以无菌方式提取血清。同时按血清总量的0.5％加入氯仿、0.0035％加入硫柳汞，加塞密封，充分摇匀，放置于2℃～15℃冷暗处，沉淀澄清。
血浆提取将血液收集于盛有5％灭菌枸橼酸钠溶液的灭菌玻璃瓶中，血液和枸橼酸钠溶液的比例为9∶1；经48～72小时沉淀，抽取上清。
血清(血浆)精制将要精制的血清(血浆)混合至同一灭菌容器中，按总量的2倍量加入蒸馏水，用2mol/L盐酸调节pH至3.0，放置60分钟，再用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至3.2～3.4。然后按照每1ml 6～9单位的量加入胃蛋白酶，在29℃～31℃条件下消化2～24小时。
将消化完的溶液按照总量的15％加入硫酸铵，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至4.5～4.7，60℃水浴60分钟。待溶液冷却至43℃以下时，过滤，收集滤液，去掉沉淀。计量并放于同一容器中，用2mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.1～7.3，按照总量的20％加入硫酸铵，用灭菌的帆布过滤，收集沉淀物。称量后放入到容器中，加入5～6倍的蒸馏水，溶解沉淀物后，按照总量加入10％的明矾溶液，再用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.7～7.8，静置2～4小时使其沉淀，过滤并收集滤液。
将收集到的滤液放置于同一容器中，按总量的38％加入硫酸铵，搅拌后用无菌帆布过滤，弃上清收集沉淀，将沉淀压干后用透析袋分袋包装，每袋约200～250g，扎紧透析袋后放置于流水槽内透析48～72小时。收集袋内的血清，充分溶解后在无菌条件下用0.22um膜过滤，放置于5℃～15℃静置沉淀。
按照中华人民共和国农业部2000年出版的《中华人民共和国兽用生物制品规程》对生产的血清进行无菌检验。
产品分装将半成品经适当稀释后，作为成品分装时，抗体效价应比规定标准高出20％，即使用时的抗体效价为≥1024时，分装成品的抗体效价应不低于≥1230。使用剂量为0.4ml/kg体重。
实施例2本发明的免疫原采用可引起仔猪黄痢和白痢的猪致病性大肠杆菌196，C83902(产生LT和ST毒素菌株)、192，C83549和产生志贺氏毒素(Stx2e)O138菌株，按照1∶2∶1.5的比例混合制备抗原免疫动物，制备高免免疫球蛋白；免疫佐剂采用弗氏完全佐剂，与免疫原的体积比为1∶1；免疫增强剂采用吉林鲸象动物药业有限公司生产的苷肽注射液，5毫升/支，以提高抗体效价；制备方法与实施例1相同。
权利要求
1.抗猪大肠杆菌病三联高免免疫球蛋白，其特征是免疫原采用可引起仔猪黄痢和白痢的猪致病性大肠杆菌196，C83902、192，C83549和产生志贺氏毒素O138菌株；免疫佐剂采用弗氏完全佐剂；免疫增强剂采用吉林鲸象动物药业有限公司生产的苷肽注射液。
2.根据权利要求1所述的抗猪大肠杆菌病三联高免免疫球蛋白，其特征是所述的仔猪黄痢和白痢的猪致病性大肠杆菌196，C83902、192，C83549和产生志贺氏毒素O138菌株按照体积比(1～2)∶(1～2)∶(1～2)的比例混合制备抗原免疫动物，制备高免免疫球蛋白；免疫原与免疫佐剂弗氏完全佐剂的体积比为1∶1；免疫增强剂苷肽注射液为5毫升。
3.根据权利要求1所述的抗猪大肠杆菌病三联高免免疫球蛋白，其特征是分装成品的抗体效价应不低于≥1230。
全文摘要
抗猪大肠杆菌病三联高免免疫球蛋白，免疫原采用引起仔猪黄痢和白痢的猪致病性大肠杆菌196，C83902(产生LT和ST毒素菌株)、192，C83549和产生志贺氏毒素(Stx2e)O138菌株，按照体积比(1～2)∶(1～2)∶(1～2)的比例混合，免疫原与弗氏免疫佐剂的体积比按照1∶1混合制备抗原免疫动物，制备高免免疫球蛋白，同时采用吉林鲸象动物药业有限公司研制成的苷肽注射液作为免疫增强剂，以提高抗体效价，其制备方法按照中华人民共和国兽用生物制品规程(2000年版)规定的方法对制备的高免免疫球蛋白进行加工；本发明产品具有组方科学、特异性强、安全性好、不会产生药物残留、保存和使用方便、临床应用效果好等积极效果。
文档编号A61K39/395GK1958609SQ200610131630
公开日2007年5月9日 申请日期2006年11月15日 优先权日2006年11月15日
发明者张中洋 申请人:张中洋