专利名称：一种含有植物乳杆菌的组合物及其在增强肠道免疫屏障中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及的植物乳杆菌LP-Onlly，其16S RNA基因序列于GeneBank(NCBI)备案，其登录号为AY590777。
本发明涉及的植物乳杆菌LP-Onlly组合物和肠内营养成分的组合，可以独立组合包装或混合包装。涉及的植物乳杆菌LP-Onlly的载体可以为该菌株发酵的培养基，尤其是基于豆芽、谷芽等，适当的培养基还可以含有水溶性膳食纤维、低聚糖等。根据本发明的植物乳杆菌LP-Onlly载体如为口服液，主要含植物乳杆菌活菌和代谢产物，其活菌数量达1.0×106～2.0×108CFU/ml；如为颗粒、片剂或胶囊等固体剂型，则其活菌数量达1.0×108～2.0×1010CFU/g。涉及的肠内营养可为常规的肠内营养成分，特别地也可含有具有一定药理学作用的特殊营养素，如谷氨酰胺、精氨酸、ω-3脂肪酸、牛磺酸、抗氧化剂、蛋白寡肽等。
本发明涉及的植物乳杆菌LP-Onlly组合物和肠内营养成分的组合，可以以任何适当的方式给药，优选口服给药或直肠给药，如口服产品可以是口服液、颗粒、片剂或胶囊，也可以制成灌肠剂剂型，还可以通过导管经胃插入肠道或直接插入肠道给药。
下面结合实施例和图进一步说明本发明。
实施例1动物实验 1.大鼠重症急性胰腺炎(Severe Acute Pancreatitis，SAP)模型的建立 本发明采用雄性SD大鼠，体重250～300g(复旦大学医学院动物中心提供)，禁食不禁水12h，20g/L盐酸氯胺酮(100mg/kg体重)腹腔内注射麻醉后，将大鼠固定于仰卧位，颈部和腹部去毛，1g/L新洁而灭酊消毒，铺无菌巾。正中切口打开腹腔，于十二指肠内侧找到片状分布的胰腺及胆管，将4.5号针头经系膜对侧肠壁逆行插入胆管，结扎胆管末端和针头，无创血管夹夹闭肝门处胆管，均匀缓慢推注50g/L牛磺胆酸钠(1ml/kg)，推注时间约5min，10min后松开血管夹和结扎线，8字缝合肠壁处穿刺点。
在距盲肠约40cm小肠处荷包埋入另一硅胶管，外径为12mm，并将其沿腹壁皮下潜行至颈背部肩胛间引出，经该管给予肠内营养液及植物乳杆菌LP-Onlly。旁正中切口剪开颈部皮肤，钝性分离出颈外静脉，经颈外静脉置入外径为12mm的硅胶管，皮下隧道潜行至颈背部引出，经该管给予肠外营养液。颈外静脉插管及空肠造瘘管穿过螺旋式弹簧圈与360°旋转式输液装置相连接。肠外营养液及肠内营养液以微量输液泵24h均匀输入。
2.植物乳杆菌LP-Onlly发酵液、肠外营养(PN液)、肠内营养(EN液)组成 本发明中采用的植物乳杆菌LP-Onlly发酵液，是以植物乳杆菌LP-Onlly为出发菌株发酵豆芽生产的“昂立一号口服液”，产品中含有活性植物乳杆菌LP-Onlly，活菌数量达1.0×106～2.0×108CFU/ml，该产品由上海交大昂立股份有限公司售出。
PN液为常规肠外营养成份，由葡萄糖、氨基酸、脂肪乳剂、维生素、矿物质等组成。
EN液由荷兰纽迪希亚Nutricia(Zoetermeer)公司生产的百普素经温水稀释而成，百普素由麦芽糖糊精、葡萄糖糖浆、乳清蛋白水解物、植物油、中链甘油三酯、维生素、矿物质素等组成。
3.动物实验分组 将造模成功的实验动物随机分为三组，前24h均给予生理盐水2ml/h(1)肠外营养组(PN组)，第2～6天给予PN支持，微量输液泵保持输液速度约33ml/h，平均每只大鼠输液数量约80ml/天；(2)肠外营养+肠内营养组(PN+EN组)，第2～6天给予PN+EN支持，其中80％的热氮量由PN提供，平均每只大鼠输液量约64ml/天；20％由EN提供，百普素用温水按1g∶4ml稀释成16ml，再用生理盐水将后者以1∶2(体积比)稀释至24ml，1ml/h经空肠造瘘管滴入，每日EN供能200.6kj/kg(48kcal/kg)。(3)肠外营养+肠内营养+植物乳杆菌LP-Onlly发酵液组(PN+EN+LP-Onlly组)，第2～6天给予PN+EN支持，PN液+EN液支持量同PN+EN组，同时经空肠造瘘管分三次滴入植物乳杆菌LP-Onlly发酵液共10ml/d。上述三组大鼠于造模成功后观察大鼠一般情况、反应灵敏度、活动度及死亡情况；所有上述实验组大鼠均于第7天处死并取样检测或观察。
正常对照组同样予以颈外静脉插管，禁食不禁水24h处死，取样检测或观察。
4.观察指标 (1)菌群易位率 取腔静脉血1ml，肠系膜淋巴组织、肝脏中叶、肺脏右叶组织匀浆后分别倒入心脑浸出液管中35℃增菌培养，18-24h后置于伊红美兰平板35℃培养，18-24h后计数鉴定。菌群易位率＝培养阳性的样本数/检测的总样本数×100％。
(2)末端回肠粘膜免疫组化和Peyer’s结MAdCAM-1、CD4、CD8、IgA分析 所有组织标本用10％中性缓冲福尔马林固定；采用石蜡包埋，5μm厚连续切片，经脱腊、水化及0.01mol/L(PH6.0)柠檬酸盐缓冲液抗原修复后滴加抗体。使用HPIAS1000高清晰度彩色图文病理报告分析系统，光密度法测定每视野相应细胞CD4、CD8、MAdCAM-1、IgA密度，并计算阳性显色面积占测量窗内的百分比。
5.结果分析 (1)各实验组一般情况及死亡情况 实验组大鼠造模24h后均出现不同程度萎靡不振，对外界刺激反应度下降，其中以PN组最为明显。
PN+EN+LP-Onlly组死亡率明显低于PN组(P＜0.05)，PN+EN组与PN组相比差异无统计学意义(P＞0.05)，但总体优于PN组(5238％VS 7561％)；PN+EN组与PN+EN+LP-Onlly组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。
表1各组死亡率％ 与PN组相比△P＝0.0641 △△P＝0.0455 以上结果提示，植物乳杆菌LP-Onlly与肠内营养组合，有助于提高重症急性胰腺炎大鼠的存活率。
(2)菌群易位率 PN+EN组、PN+EN+LP-Onlly组低于PN组，其中PN+EN+LP-Onlly组最低，PN+EN组与PN+EN+LP-Onlly组相比差异无统计学意义(P＝0.6256)。
表2.各组脏器菌群易位率％ 与PN组相比，△P＝0.0003，△△P＝0.0001 以上结果提示，植物乳杆菌LP-Onlly与肠内营养组合，有助于降低重症急性胰腺炎大鼠脏器菌群易位率。
(3)末端回肠粘膜免疫组化 如
图1～4和表3所示，模型实验组末端回肠粘膜CD4、CD8、MAdCAM-1、IgA表达均低于正常对照组(P＜0.05)，表明重症急性胰腺炎大鼠肠道免疫屏障功能损害，造模成功。但PN组与PN+EN组、PN+EN+LP-Onlly组相比，前者明显低于后两组，且有显著性差异(P＜0.05)；而后两组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)，但总体上添加植物乳杆菌LP-Onlly组数值高于PN+EN组。表明重症急性胰腺炎大鼠给予肠外营养+肠内营养和肠外营养+肠内营养+植物乳杆菌LP-Onlly较单纯肠外营养组有助于改善肠道免疫屏障功能；该结果提示，植物乳杆菌LP-Onlly有助于提高回肠粘膜免疫功能。
表3.各组末端回肠粘膜免疫组化(％，
) △与其余组相比P＜0.05，*与其余组相比P＜0.05 (4)Peyer Patches免疫组化 如图5～8和表4所示，模型实验组Peyer Patches中CD4、CD8、MAdCAM-1、IgA表达均低于正常对照组(P＜0.05)，表明重症急性胰腺炎大鼠肠道免疫屏障功能损害，造模成功。但PN组与PN+EN组、PN+EN+LP-Onlly组相比，在CD4和IgA表达中，前者明显低于后两组，且有显著性差异(P＜0.05)；而后两组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)，但总体上添加植物乳杆菌LP-Onlly组数值高于PN+EN组；而在CD8、MAdCAM-1表达中，PN组低于PN+EN组，且有显著性差异(P＜0.05)，添加植物乳杆菌LP-Onlly组显著低于PN+EN组(P＜0.05)。表明重症急性胰腺炎大鼠给予肠内营养较单纯肠外营养有助于改善肠道免疫屏障功能，而植物乳杆菌LP-Onlly则有助于提高Peyer Patches中CD8和粘附分子MAdCAM-1的表达，该结果提示植物乳杆菌LP-Onlly可提高肠淋巴细胞归巢，增强肠道免疫屏障功能。
表4.各组Peyer Patches免疫组化(％，
) △与PN组相比P＜0.05，#与PN+EN组相比P＜0.05，*与其余组相比P＜0.05 6.结论 上述结果表明，本发明植物乳杆菌LP-Onlly有助于提高Peyer Patches中CD8和粘附分子MAdCAM-1的表达，提示植物乳杆菌LP-Onlly可提高肠淋巴细胞归巢，增强肠道免疫屏障功能。植物乳杆菌LP-Onlly与肠内营养成分组合将提高末端回肠粘膜和Peyer Patches中CD4、CD8、MAdCAM-1和IgA的表达，增强肠道免疫屏障功能。
实施例2植物乳杆菌LP-Onlly与肠内营养组合对重症胰腺炎患者自然病程的影响 1.重症急性胰腺炎患者筛选 选择30例符合急性重症胰腺炎诊断标准的患者。30例患者中男性17例，女性13例；年龄20-87岁(平均59.9±16.4岁)；发病至入院平均时间25.6±15.6小时；30例患者发病均有腹痛症状，发热(T＞38℃)，WBC升高(＞109/L)，血/尿淀粉酶升高(血淀粉酶＞110U/L；尿淀粉酶＞641U/L)；血淀粉酶最高6500U/L，平均1236±1373U/L；尿淀粉酶最高20000U/L，平均5636±6439U/L。入院时18例伴有黄疸(总胆红素＞18μmol/L)；13例伴有肝功能异常(ALT＞65U/L或AST＞37U/L)；6例伴有肾功能异常(BUN＞6.4mmol/L或Cr＞115μmol/L)。30例均采取保守治疗。凡需外科手术干预者，病情过重者(APACHE II评分＞25分)，有严重代谢性疾病者(糖尿病，高脂血症等)，不在本研究之列。
2.植物乳杆菌LP-Onlly发酵液、肠外营养(PN液)、肠内营养(EN液)组成 本发明中采用的植物乳杆菌LP-Onlly发酵液，是以植物乳杆菌LP-Onlly为出发菌株发酵豆芽生产的“昂立一号口服液”，产品中含有活性植物乳杆菌LP-Onlly，活菌数量达1.0×106～2.0×108CFU/ml，该产品由上海交大昂立股份有限公司生产。
PN液为常规肠外营养成份，由葡萄糖、氨基酸、脂肪乳剂、维生素、矿物质等组成。
EN液采用荷兰纽迪希亚Nutricia(Zoetermeer)公司的百普素(Nutricia，126g/袋，可冲成500ml营养液)为主要能源。
3.实验分组及治疗方法 30例重症急性胰腺炎随机分为三组，即常规治疗组(常规组)、肠外营养治疗组(PN组)和植物乳杆菌LP-Onlly联合肠外和肠内营养治疗组(LP-Onlly组)。
(1)常规治疗组 采用传统禁食，胃肠减压，常规液体治疗，全量补液，约3000ml/天，以10％GS、5％GS为主，部分5％GNS，平衡液等，补液中按葡萄糖∶胰岛素比约6g∶1g加入胰岛素。电解质需要量NaCl 4.5g/天，KCl 3g/天。静脉使用头孢呋辛钠(6g/天)、灭滴灵(200ml/天)等抗生素。对低蛋白血症者使用人体白蛋白纠正，静脉补充10-20g/天。入院初期生长抑素(施他宁或善宁，6mg/24h维持)抑制消化腺分泌。一般至患者腹部体征缓解，无腹胀，呕吐等，可停止胃肠减压。血常规，血/尿淀粉酶正常3天以上，可考虑逐步开放饮食。
(2)肠外营养组(PN组) PN经中心静脉输注，实施时间1周。以50％葡萄糖和20％脂肪乳剂(Intralipid，SSPC)提供能量，供热量25-30kcal/kg/天，糖脂供能比1-2∶1；以8.5％乐凡命(Novamin，SSPC)供氮，供氮量为0.12-0.15g/kg/天。同时加入维生素(水乐维他，SSPC)、微量元素(安达美，SSPC)和K+、Na+等电解质；按葡萄糖∶胰岛素的比例为4-5g∶1g加入胰岛素，所有营养液混入三升袋中，营养液输入时间不少于12-14h(PN配方见表4)。同样使用头孢呋辛钠、灭滴灵等抗生素，善宁、施他宁等生长抑素，使用方法同常规组，不使用血浆或人体白蛋白等制剂。
(3)植物乳杆菌LP-Onlly联合肠外和肠内营养组(LP-Onlly组) 实施时间1周。能量供应同PN组。EN开始后第1-2天予百普素126g/天，3天后予百普素252g/天，输注速度120ml/h。能量不足部分由PN补充，PN部分由10％GS和20％脂肪乳剂(Intralipid，SSPC)供能，8.5％乐凡命(Novamin，SSPC)供氮，经外周静脉途径输注，输注单瓶脂肪乳剂和乐凡命时，控制输液速度约120ml/h。实施EN同时合并使用植物乳杆菌LP-Onlly(使用量50ml/天，经空肠营养管注入)。灭滴灵等抗厌氧菌药物不予使用，头孢呋辛钠等仍正常使用同常规组，不使用血浆或人体白蛋白等制剂。
4.观察指标 (1)血/尿淀粉酶，血常规，肝肾功能 静脉采血，碘比色法测血/尿淀粉酶；全自动血细胞分析仪测定血常规和肝肾功能。
(2)血浆内毒素 内毒素试剂盒(美国Accociates of Cape Cod公司LAL试剂盒)测治疗前后血浆内毒素变化。
(3)并发症 患者出院后对病史资料进行整理统计，包括并发症、住院时间、住院费用。并发症包括胰腺局部并发症(胰腺坏死，胰腺脓肿，胰腺假性囊肿)、全身并发症(败血症，脏器功能衰竭)、PN并发症(导管感染，代谢并发症)、EN并发症(导管阻塞，呕吐，腹泻)。
5.结果分析 (1)血/尿淀粉酶、血常规、肝肾功能 三组间上述指标均无统计学差异(P＞0.05)(详见表5和表6)。随时间变化，各指标变化趋势一致。总体上血/尿淀粉酶，WBC等均呈下降趋势并逐渐恢复正常。
表5.血/尿淀粉酶 表6.WBC，肝肾功能 (2)血浆内毒素 治疗前三组血浆内毒素平均值无统计学差异。常规组第二周内毒素水平较第一周升高(p＜0.05)；PN组变化不明显(p＞0.05)；LP-Onlly组则有显著降低(p＜0.05)。比较治疗后的内毒素水平，LP-Onlly组显著低于常规治疗组(p＜0.01)，与PN组比较无统计学差异(表7)。该结果提示，植物乳杆菌LP-Onlly联合肠外和肠内营养有助于降低重症急性胰腺炎患者的内毒素水平，增强肠屏障功能。
表7.治疗前后血浆内毒素变化(Pg/ml) 注*与第1周比较p＜0.05，#与第1周比较p＜0.05 △与常规组比较p＜0.01 (3)并发症 常规治疗组1例患者入院1周后出现肾功能衰竭，并发呼吸功能衰竭。入院第13天家属放弃治疗后死亡。其余29例患者均治愈出院。统计病程中并发症情况见表8)。可见PN组和LP-Onlly组在严重并发症方面(胰腺局部并发症、败血症、器官功能衰竭)少于常规组。该结果提示，植物乳杆菌LP-Onlly联合肠外和肠内营养有助于缓解重症急性胰腺炎患者的病发症，减轻病情。
表8.并发症情况 (4)住院天数和住院费用 统计学分析表明，总费用常规治疗组显著高于PN组和LP-Onlly组(p＜0.01)，PN组和LP-Onlly组之间无统计学差异(P＞0.05)。住院天数LP-Onlly组20.9天低于常规组34.8天和PN组24.2天。该结果提示植物乳杆菌LP-Onlly联合肠内营养有助于重症急性胰腺炎患者减少并发症、降低治疗费用、以及缩短住院时间。
表8.住院天数(天)与费用(元) 注**与常规组比较(p＜0.01) 6.结论 本发明植物乳杆菌LP-Onlly联合肠内营养有助于减少肠道内毒素的吸收、增强肠道屏障功能，减少并发症发生率，降低住院费用，缩短住院天数。
权利要求
1.一种含有植物乳杆菌的组合物，其特征在于，所述组合物包括植物乳杆菌LP-Onlly和肠内营养液；
其中植物乳杆菌LP-Onlly，CGMCC NO.1258，其16S RNA基因序列于Gene Bank(NCBI)备案，其登录号为AY590777；
所述肠内营养液为常规的肠内营养成分或具有药理学作用的营养液。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物中还含有常规的肠外营养成分。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述具有药理学作用的营养液是谷氨酰胺、精氨酸、ω-3脂肪酸、牛磺酸、抗氧化剂、蛋白寡肽、麦芽糖糊精、葡萄糖糖浆、乳清蛋白水解物、植物油、中链甘油三酯、维生素、矿物质或者微量元素。
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述植物乳杆菌LP-Onlly的载体可以为该菌株发酵的培养基。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述培养基是基于豆芽、谷芽。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述培养基还含有水溶性膳食纤维、低聚糖。
7.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述植物乳杆菌LP-Onlly的载体为口服液，活菌数量达1.0×106～2.0×108CFU/ml。
8.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述植物乳杆菌LP-Onlly的载体为固体剂型，活菌数量达1.0×108～2.0×1010CFU/g。
9.根据权利要求1～8所述的任一组合物，其特征在于，所述组合物为独立组合包装或混合包装。
10.权利要求1所述的组合物应用于增强肠道免疫屏障、预防和/或治疗肠道炎症及感染性疾病。
全文摘要
本发明涉及一种含有乳杆菌属、植物乳杆菌种、植物乳杆菌株LP－Onlly的组合物及其在增强肠道免疫屏障中的应用。本发明的组合物通过干预肠淋巴细胞归巢、肠道分泌性IgA和肠道淋巴细胞数量、降低内毒素水平，改善肠道免疫屏障，增强肠道屏障功能，防止饥饿、营养不良、长期全肠外营养、感染、应激、损伤、免疫紊乱等疾病所引起的肠道免疫屏障破坏，预防和/或治疗肠道炎症、感染性疾病和免疫紊乱疾病的发生。
文档编号A61K38/00GK1985854SQ20061014773
公开日2007年6月27日 申请日期2006年12月22日 优先权日2006年12月22日
发明者兰先德, 范小兵, 杭晓敏, 张和春, 杨国, 潘玉辉 申请人:上海交大昂立股份有限公司