专利名称：表明局部应用活性成分效力的方法
技术领域：
本发明涉及表明局部应用活性成分的效力的方法。该方法可用于支持基于时间的效力权利要求。
背景技术：
消费品市场充斥着用于提供皮肤护理益处的乳膏、洗剂、喷雾剂等。针对的益处包括增加水份、减少皱纹、平滑皮肤、治疗痤疮、降低炎症和淡化色素。许多这些益处是通过局部应用含活性成分的组合物实现的。
开发了试验方法来表明局部应用活性成分的效力。这些试验方法典型地分析活性成分的存在，然后仅仅由活性成分的存在推测效力。例如，美国专利申请序列号2002/0019055描述了测定皮肤表面物质的非侵入性试验。将吸收垫放置在皮肤上一段时间，除去，然后测定感兴趣的物质。测定方法也可包括在吸收垫中作为一部分，以同时进行感兴趣化学物质的提取和原位测定。虽然该方法可定量分析物，但不能表明分析物的效力。因此，需要表明局部用活性成分效力的试验方法。
发明内容
本发明提供一种用于表明局部应用活性成分的效力的方法，所述方法包括将含治疗有效量活性成分的组合物局部应用于皮肤区域；将吸收材料应用于皮肤区域一段时间，以从皮肤有效提取至少一部分活性成分，从而将这部分活性成分以可释放方式掺入吸收材料中；从皮肤区域除去含掺入的活性成分的吸收材料；从吸收材料提取吸收的活性成分，将提取的活性成分与含培养细胞的细胞生长培养液混合；将培养细胞在细胞生长培养液中孵育一段时间，以在生长培养液中有效产生生物标记；和测定生物标记以表示活性成分的效力。
本发明方法的第一步是将含有活性成分的组合物局部应用于皮肤区域。如本文所用，局部应用表示用手、喷雾器、雾化器、施加器或本领域已知的任何方式将组合物应用于皮肤表面。合适的组合物包括粉末剂、溶液、乳膏、洗剂、软膏等。组合物包含治疗有效量的至少一种活性成分。如本文所用，治疗有效量指提供将组合物应用于皮肤区域所追寻的治疗效果所需的量。合适的活性成分包括用于提供选自以下的皮肤益处的活性成分增加水份、抗衰老、平滑皮肤、痤疮治疗、降低炎症、瘙痒、淡化色素以及它们的组合。合适的活性成分包括但不限于视黄醇、二甲基氨基乙醇、四羟基丙基乙二胺、大豆、野甘菊、氢化可的松、水杨酸、过氧苯甲酰等。将组合物保留在皮肤上持续足以提供所需皮肤益处的时间，或持续证明效力所需的预定时间。例如，进行下一步骤之前，组合物可保留在皮肤上约1-12小时，或长达24小时。数据可用于调节或销售目的。
本发明方法的第二步是将吸收材料应用于已施用活性成分的皮肤区域一段时间，以从皮肤有效提取至少一部分活性成分用于进一步的效力分析。如本文所用，吸收材料包括可吸收活性成分的材料，或粘附或粘结活性成分的材料。所用的吸收材料不是严格的，只要活性成分能够可释放地粘结或可释放地结合吸收材料中。通过化学或机械结合，吸收材料吸收或粘附活性成分。合适的吸收材料的例子包括但不限于粘合剂、粉末、膜、海绵和擦布。
吸收材料可含有溶剂以溶解和从皮肤提取活性成分。溶剂可以是有机溶剂、水性溶剂或它们的混合物。优选地，采用粘合剂以从皮肤除去活性成分。合适的粘合剂包括水基粘合剂、溶剂基粘合剂和热熔粘合剂。合适的粘合剂的例子包括但不限于那些基于苯乙烯(styrenic)嵌段共聚物和增粘树脂的粘合剂，例如得自HB-Fuller Co.(St.Paul MN)的HL-1491、得自ATO-Findley(Wawatausa，WI)的H-2543和得自National Starch & Chemical Company(Bridgewater，NJ)的Resyn34-5534。乙烯共聚物也可用作粘合剂，包括乙烯醋酸乙烯共聚物。
合适的粘合剂还包括丙烯酸基、糊精基和氨甲酯基粘合剂，以及天然和合成弹性体粘合剂。粘合剂还包括无定形聚烯烃，包括无定形聚丙烯，例如得自HB Fuller的HL-1308或得自Huntsman(Odesssa，TX)的Rextac RT 2373。粘合剂可基于Kraton牌合成弹性体或天然橡胶。这些粘合剂还可包含增粘剂、抗氧化剂、加工油等，如本领域所知。
在一个实施方式中，可将粘合剂涂覆到诸如纸或聚合物膜的基材上，例如，条带，然后应用于皮肤。将条带保留在皮肤上足够的时间，以从皮肤提取活性成分。条带保留在皮肤上的时间取决于粘合剂和活性成分，但通常为1秒到1小时。
本发明的第三步是将含有可释放地结合于其中的部分活性成分的吸收材料从皮肤上除去。通常以本领域已知的方式从皮肤揭下吸收材料。
本发明的第四步是从吸收材料提取全部或部分可释放地结合吸收材料的部分活性成分，并与细胞生长培养液混合，用于分析。可采用适用于提取特定活性成分的溶剂提取活性成分。一旦阅读了本说明书，本领域技术人员能够容易地确定特定活性成分的合适溶剂。选定的溶剂还应是对本发明方法所采用的细胞没有细胞毒性的。在某些实施方式中，可将吸收材料置于细胞生长培养液中，在存在生长培养液时存提取活性成分。可使用能够支持活细胞的任何生长培养液。这种生长培养液中的一种是RPMI培养液1640。
本发明的第五步是在细胞生长培养液中孵育培养细胞一段时间，以有效产生用于测定从皮肤除去时活性成分的效力的生物标记。活细胞可以是各种细胞型。本发明方法中可使用的活细胞的合适例子包括但不限于鼠细胞、人源性细胞如Hacat角质形成细胞和Jurkat T-细胞。孵育的时间可变化，取决于测定的生物标记，但通常为1分钟到24小时，例如8小时或16小时。
本发明方法的最后一步是测定培养细胞中指示效力的特定生物标记。合适的生物标记包括但不限于细胞因子，例如白介素1、白介素2(“IL-2”)或白介素6；和活性氧簇(reactive oxygen species)，例如醇和过氧化物。可通过本领域已知方法，例如高效液相色谱法、气相色谱法、酶联免疫分析法等定量测定细胞产生的生物标记。
下面描述了几个实施例以进一步阐明本发明的性质及其实施方式。但是，不应认为本发明受到这些具体描述的限制。
具体实施例方式
i.局部应用约4mg/cm2的Clean & Clear Persa-Gel101小时后，将10％过氧苯甲酰局部用乳膏Sebutape应用于皮肤区域。用从条带提取的物质处理Hacat(角质形成细胞)细胞，然后测定活性氧簇(“ROS”)，检测过氧化氢作为终点。还用1∶1000稀释的Persa-Gel软膏和1∶1000稀释的30％过氧化氢处理细胞。与未处理的细胞(125M.F.U.H2O2)相比，来自提取的条带的过氧化物种类(400M.F.U.H2O2)与用软膏1∶1000处理(350M.F.U.H2O2)相当。因此，本方法检测从皮肤条带提取后，局部应用在皮肤上的抗痤疮药物的存在情况和体外活性。
ii.选择3位受试者进行试验，以表明氢化可的松乳膏在一段时间内的的效力。在每位受试者的手内侧前臂上标记四个矩形，第一个方形的外缘大概离开手肘关节半英寸。然后，在矩形区域的内角上用不可擦墨水标记皮肤。将含有1％氢化可的松的产品从上到下施加在矩形上大约中心的均一细线上(32微升/矩形)。然后，将各个产品小心地仅涂布在矩形区域内，画圆圈，持续10秒。
在施加产品后的指定时间之后，将Sebutape条带应用于合适的皮肤部位。戴上手套，用镊子从片板揭下条带，应用于皮肤矩形中央，紧紧按压，1分钟后用镊子除去。然后，将条带皮肤面向下置于合适的标记玻璃管中。最后，每个玻璃管中加入500μl细胞生长培养液RPMI1640，将玻璃管至于-80℃冻干机中直到IL-2试验。
将玻璃管在冰上融化，然后在冰上声处理15分钟。将100μl Jurkat细胞以100,000细胞/孔接种于96-孔圆形底培养板中。然后，加入50μl肉豆蔻酸佛波酯(“PMA”，200ng/ml)和植物凝集素(“PHA”，16μg/ml)的混合物，刺激细胞产生IL-2。然后，涡旋10秒后用50μl来自样品管的培养液处理指定样品孔。每个样品处理2孔。对于指定仅刺激的孔来说，加入50μl RPMI细胞生长培养液+10％胎牛血清(“FBS”)生长培养液。将培养板在37℃、5％CO2下孵育过夜，持续约16小时。
孵育后，吸取上清液并转移至低结合的96-孔板中。将上清液1∶5稀释在RMPI生长培养液中，根据生产商的说明，用Upstate试剂盒分析IL-2浓度，在Luminex100多分析物检测器(Luminex Corp，Austin，TX)上测定。使用培养板包括的已知IL-2浓度的标准曲线，将Luminex的值与实际IL-2浓度值相关。将刺激孔的平均浓度确定为正常IL-2释放。
使用处理孔的计算浓度计算该正常值的抑制百分比。每块板包含一组刺激孔，对每块板分别计算。将试验结果与各个时间点处各样品的结果进行比较。进行非成对斯氏T-检验，评价组间显著性差异，所有试验组的显著性水平为值＜0.05。
结果表明，在1小时、7小时和12小时，氢化可的松处理皮肤可抑制IL-2产生。IL-2抑制平均百分比为，1小时66％，7小时61％、12小时67％。这些数据支持受试氢化可的松软膏在上述时间范围内的效力。
权利要求
1.一种表明局部应用活性成分的效力的方法，所述方法包括将含活性成分的组合物局部应用于皮肤区域；将吸收材料应用于皮肤区域以从该皮肤区域除去至少一部分活性成分，从而将该部分活性成分以可释放方式掺入吸收材料中；从皮肤除去其中掺有部分活性成分的吸收材料；从吸收材料提取活性成分；将提取的活性成分与含培养细胞的细胞生长培养液混合；将培养细胞在细胞生长培养液中孵育一段时间，以有效产生生物标记；和测定生物标记以表示活性成分的效力。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活性成分选自视黄醇、二甲基氨基乙醇、四羟基丙基乙二胺、大豆、野甘菊、氢化可的松、水杨酸和过氧苯甲酰。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述吸收材料选自粘合剂、海绵、粉末、膜和擦布。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞生长培养液是RPMI培养液1640。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞选自鼠细胞、Hacat角质形成细胞和Jurkat T-细胞。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物标记选自白介素1、白介素2、白介素6和活性氧簇。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述含活性成分的组合物应用于皮肤区域之后，将所述吸收材料应用于皮肤区域1-24小时。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在存在细胞生长培养液时从吸收材料提取所述部分活性成分。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述细胞在细胞生长培养液中孵育约1分钟到24小时。
全文摘要
描述了一种表明局部应用活性成分的效力的方法，该方法包括将含活性成分的组合物局部应用于皮肤区域；将吸收材料应用于皮肤区域以从皮肤有效提取至少一部分活性成分，从而将这部分活性成分以可释放的方式结合入吸收材料中；从皮肤除去吸收材料；从吸收材料提取活性成分；将提取的活性成分与细胞生长培养液混合；将培养细胞在细胞生长培养液中孵育一段时间以有效产生生物标记；和测定生物标记以表示活性成分的效力。
文档编号A61K31/13GK1928115SQ20061015360
公开日2007年3月14日 申请日期2006年9月8日 优先权日2005年9月9日
发明者M·伽雷, M·索思奥 申请人:强生消费者公司