专利名称：纳米止血贴的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及医药领域，尤其涉及一种新型纳米止血贴。
背景技术：
目前，局部止血剂多为模仿或放大凝血过程的一个或多个步骤，临床常用的有明胶海绵、氧化纤维素和氧化再生纤维素、纤维蛋白胶和壳聚糖等。明胶海绵通过吸附创面血液，破坏血小板形成凝血的网架，封闭血管裂口或创面；由于需要机体的凝血因子参与才能获得最后的止血结果，故对凝血机制障碍者效果欠佳。氧化纤维素和氧化再生纤维素则通过与血红蛋白发生化学反应，凝结成血凝块样的物质，覆盖于出血创面而达止血目的；但是这两种纤维的酸性能破坏凝血酶的止血作用。纤维蛋白胶因其优良的组织相容性及止血效果，在临床上得到广泛的应用。但是纤维蛋白胶成本高、储存及使用较复杂，并且止血速度慢，对大血管出血止血成功率低，还可能带来人体或动物血源性疾病感染。
针对当前局部止血剂的缺点，申请人曾经尝试研制出了纤维蛋白帖，虽然克服了纤维蛋白胶等止血剂的上述缺点，以适应手术及急救止血的需要。但是动物实验及临床实践中发现，当前的纤维蛋白帖有以下不足1.临床应用中力学性能较差、易降解，因而影响止血效果和使用的安全性；2.纤维蛋白贴中蛋白稳定性较弱，常温下不能储存；3.不能用作药物载体，如在肿瘤切除术中不能用作局部化疗的载体等。
因上述原因而限制了其在临床上的推广使用。
壳聚糖为天然生物材料，可以在体内降解为安全无毒的氨基葡萄糖，无抗原性，具有优良的生物相容性；壳聚糖是自然界中唯一带正电荷的氨基葡萄糖，因其独特的理化结构，使得壳聚糖能通过与红细胞膜之间的电荷作用凝集红细胞而止血，而且止血机理不依赖于凝血因子及血小板，能介导肝素化病人血液的凝固，对血小板功能不佳患者亦有效。在凝血酶的酶固定化方面，壳聚糖因有N末端的α-氨基，可用交联剂将之与凝血酶形成希夫碱，从而显示出特殊的固定化效应。
随着纳米技术的发展研究，纳米级壳聚糖等有N末端的α-氨基的材料现已被认为是一类极具应用前景的药物控释载体，特别适用于具有生物活性大分子药物的包埋和释放；同时，壳聚糖纳米微粒具有附着在生物体粘膜表面的特性；壳聚糖制成纳米微粒后，可固定化凝血酶，还可作为化疗药物、抗菌药物、生长因子等药物的载体，起到降低生物制品的保存条件、减小抗原性及药物缓释作用。
如何将纳米技术及现代生物技术相结合，运用酶固定化技术，制备新型的纳米级多功能止血贴便成为当前该领域亟待研究和探索的重要课题。
实用新型内容本实用新型的主要目的在于提供一种操作方便、无需繁琐的准备工作、使用安全可靠、能起到快速止血、加速创面愈合、并且可作为药物载体的多功能止血材料的制备方法。
为实现上述目的，本实用新型采用如下技术方案本实用新型纳米止血贴，包括支撑层和止血层，止血层附着在支撑层的一面，其中，所述止血层包括凝血酶和联结物的止血混合物，所述联结物呈纳米级大小。
所述支撑层的另一面还设置有载药层，该载药层包括有所述呈纳米级大小的联结物与治疗药物的治疗混合物。
所述联结物为壳聚糖、甲壳素、明胶颗粒或微胶原蛋白中任意一种。
所述支撑层为胶原海绵、壳聚糖海绵或氧化纤维素。
所述支撑层的厚度为0.4～1cm。
所述止血层与支撑层的密度大致均为载药层密度的1/2。
所述止血层每平方厘米至少存在10～15mg的止血混合物。
与现有技术相比，本实用新型具有如下优点1.按本实用新型与机体生物相容性好、无毒副作用，在体内可彻底降解；撕开包装即可应用，使用方便、快捷；凝血酶为纳米级联结物尤其是壳聚糖所固定化，物理及化学稳定性大为提高，可于常温下储存运输，价格低廉；2.内层(止血层)及中层(支撑层)疏松(如密度为0.004-0.008g/cm2)，外层相对致密(如密度为0.008-0.0015g/cm2)，形成特殊的内密外疏的结构，可增强止血贴的虹吸作用，快速吸收组织渗液；并有较好的黏附性，可用于相对湿润及蠕动器官的手术创面；
以下结合附图，对本实用新型的具体实施方式
作进一步的说明。
图1为应用本实用新型方法所生产的产品的结构示意图，其中黑点表示该层的密度，黑点越多表明其密度越大，反之则越小。
具体实施方式请参阅图1，本实用新型纳米止血贴，包括支撑层和止血层1，止血层附着在支撑层2的正面，止血层1包括凝血酶和联结物的止血混合物，所述联结物呈纳米级大小。支撑层2的反面则设置有载药层3，该载药层3包括有所述呈纳米级大小的联结物与治疗药物的治疗混合物。
所述联结物为壳聚糖、甲壳素、明胶颗粒或微胶原蛋白中任意一种。
所述支撑层2为胶原海绵、壳聚糖海绵或氧化纤维素。
所述支撑层2的厚度为0.4～1cm。止血层1与支撑层2的密度大致均为载药层3密度的1/2。
下面说明本实用新型的制作方法1.用聚电解质的离子凝胶反应制作纳米级壳聚糖固定化凝血酶壳聚糖作为联结物，其具有N末端的α-氨基。将凝血酶与壳聚糖共混、溶解，加入三聚磷酸钠作为交联剂并进行搅拌，严格控制温度于10℃以下，pH值在4-7.3之间，或者更精确地控制在4.2-4.8之间，制备纳米级壳聚糖固定化凝血酶；2.将从动物肌腱中提取的胶原蛋白溶液(胶原的量为溶液重量的4％)倒入平底托盘中，液体高0.4-1cm，真空冷冻干燥，得厚度呈0.4-1cm左右的胶原海绵作为支撑层2，所述支撑层2亦可用明胶海绵、壳聚糖海绵、氧化纤维素等生物相容性及止血效果好的材料代替；3.按步骤1制作壳聚糖载药纳米粒，分别包封抗菌药物、抗癌药物、生长因子等，加入葡萄糖酸钙或氯化钙等交联剂，制备药物-纳米粒载药悬浮液；4.将药物-纳米粒载药溶液倒入平底盘中，使支撑层2即胶原海绵的一面如反面与悬浮液接触，对其迅速于低温下真空干燥，消毒便形成附着或渗浸入胶原海绵的载药层3；5.将纤维蛋白原、壳聚糖固定化凝血酶干粉溶解于无水乙醇搅拌成均匀的悬浮液，每1毫升无水乙醇中加入10～15mg混合干粉，震荡使悬浮颗粒均匀分布；6.将均匀分布的悬浮液倒入平底盘中，使胶原海绵的一面与悬浮液接触，悬浮液中的颗粒黏附在胶原海绵上，每平方厘米的胶原海绵上黏附有10～15mg混合干粉颗粒，对粘附有混合干粉颗粒的胶原海绵抽真空干燥即可在支撑层2即胶原海绵的正面形成止血层1，从而形成具体的产品。
实际应用中，也可只将止血层1生成于支撑层2上，不必增设载药层3，如此所生成的产品便只具有止血功效，而不具备治疗功效。
上述制作壳聚糖纳米粒是壳聚糖季铵盐纳米体系，该体系制作工艺成熟，产物生物相容性好，有一定的黏附性，且可作为多种药物的载体。同时，随着旧材料的改型及新材料的研发，壳聚糖纳米粒亦可为甲壳素、明胶颗粒、微胶原蛋白等材料所替代。
上述凝血酶、纤维蛋白原、胶原蛋白来自猪，制备方法如下(1)以猪血为原料，经过高速离心，过滤、冷冻得到固体目的蛋白，再经过纯化水溶解，添加辅助物质，去病毒、无菌过滤获得纤维蛋白原溶液。
(2)以猪血为原料，经过高速离心，硫酸钡沉淀、盐溶液洗脱、脱盐、氯化钙激活浓缩，加保护剂，去病毒、无菌过滤、得到凝血酶溶液。
(3)以猪肌腱为原料，清洗去油脂 破碎，获得胶原，酸性水溶液溶解离心获得胶原蛋白溶液。
由于胶原海绵的外面与内面分别与药物-纳米粒载药交联悬浮液及纤维蛋白原、壳聚糖固定化凝血酶无水乙醇悬浮液冷冻干燥，形成了特殊的分层结构内层较疏松，由纤维蛋白原、壳聚糖固定化凝血酶及胶原蛋白构成，起止血作用；外层是药物-纳米粒载药交联层，可作为药物载体携带药物。
下面以壳聚糖为例介绍几种利用本实用新型的方法制造形成相应产品的过程过程一(1)将壳聚糖季铵盐0.1g，加入0.1g的氧氟沙星及生理盐水10ml制成溶液，然后将4ml的浓度为0.5mg/ml三聚磷酸钠水溶液加入到溶液中，严格控制反应条件，搅拌生成纳米粒子(粒径50～200nm)悬浮液。纯化后加入1％氯化钙溶液1ml，装入平底盘中；(2)使胶原海绵的一面与悬浮液接触，对其迅速于低温下真空干燥，消毒；(3)将壳聚糖季铵盐0.5g，加入50ml生理盐水中，再将凝血酶500UI溶于壳聚糖季按盐溶液中，然后将20ml的浓度为0.5mg/ml三聚磷酸钠水溶液加入到壳聚糖季铵盐溶液中，温度控制在10℃以下，pH值控制在4.2-4.8之间，搅拌条件下生成纳米粒子，颗粒直径50～200nm，纯化并真空干燥成干粉；(4)纤维蛋白原1000mg和壳聚糖固定化凝血酶250UI，加入研钵中充分研细；加入无水乙醇100毫升搅拌成均匀的悬浮液，震荡使悬浮颗粒均匀分布；(6)将均匀分布的悬浮液倒入10×20平方厘米的平底托盘中，使胶原海绵的另一面与悬浮液接触，悬浮液中的颗粒黏附在胶原海绵上；对粘附有混合干粉颗粒的胶原海绵抽真空干燥。
过程二(1)将壳聚糖季铵盐0.1g，加入0.1g的甲氨蝶吟及生理盐水10ml制成溶液，然后将4ml的浓度为0.5mg/ml三聚磷酸钠水溶液加入到溶液中，严格控制反应条件，搅拌生成纳米粒子(粒径50～200nm)悬浮液。纯化后加入1％氯化钙溶液1ml，装入平底盘中；(2)使胶原海绵的一面与悬浮液接触，对其迅速于低温下真空干燥，消毒；(3)将壳聚糖季铵盐0.5g，加入50ml生理盐水中，再将凝血酶500UI溶于壳聚糖季按盐溶液中，然后将20ml的浓度为0.5mg/ml三聚磷酸钠水溶液加入到壳聚糖季铵盐溶液中，温度控制在10℃以下，pH值控制在4.2-4.8之间，搅拌条件下生成纳米粒子，颗粒直径50～200nm，纯化并真空干燥成干粉；(4)纤维蛋白原1000mg和壳聚糖固定化凝血酶250UI，加入研钵中充分研细；加入无水乙醇100毫升搅拌成均匀的悬浮液，震荡使悬浮颗粒均匀分布；(5)将均匀分布的悬浮液倒入10×20平方厘米的平底托盘中，使胶原海绵的另一面与悬浮液接触，悬浮液中的颗粒黏附在胶原海绵上；对粘附有混合干粉颗粒的胶原海绵抽真空干燥。
过程三(1)将壳聚糖季铵盐0.1g，加入10ml的500000U/ml碱性成纤维细胞生长因子制成溶液，然后将4ml的浓度为0.5mg/ml三聚磷酸钠水溶液加入到溶液中，严格控制反应条件，搅拌生成纳米粒子(粒径50～200nm)悬浮液。纯化后加入1％氯化钙溶液1ml，装入平底盘中；(2)使胶原海绵的一面与悬浮液接触，对其迅速于低温下真空干燥，消毒；(3)将壳聚糖季铵盐0.5g，加入50ml生理盐水中，再将凝血酶500UI溶于壳聚糖季按盐溶液中，然后将20ml的浓度为0.5mg/ml三聚磷酸钠水溶液加入到壳聚糖季铵盐溶液中，温度控制在10℃以下，pH值控制在4.2-4.8之间，搅拌条件下生成纳米粒子，颗粒直径50～200nm，纯化并真空干燥成干粉；(4)纤维蛋白原1000mg和壳聚糖固定化凝血酶250UI，加入研钵中充分研细；加入无水乙醇100毫升搅拌成均匀的悬浮液，震荡使悬浮颗粒均匀分布；(5)将均匀分布的悬浮液倒入10×20平方厘米的平底托盘中，使胶原海绵的另一面与悬浮液接触，悬浮液中的颗粒黏附在胶原海绵上；对粘附有混合干粉颗粒的胶原海绵抽真空干燥。
综上所述，本实用新型相对现有技术具有较大的改进，应该本实用新型的方法所生产的产品可广泛应用于普通外科、神经外科、心胸外科、泌尿外科、妇产科、口腔科、微创外科(如腹腔镜、胸腔镜、盆腔镜)等需要止血、堵漏(瘘)的手术中，缩短手术时间，降低手术风险，加速创伤愈合，缩短住院时间。亦可用于战伤、事故中的急救止血。
权利要求1.一种纳米止血贴，包括支撑层和止血层，止血层附着在支撑层的一面，其特征在于所述止血层包括凝血酶和联结物的止血混合物，该联结物呈纳米级大小。
2.根据权利要求1所述的纳米止血贴，其特征在于所述支撑层的另一面还设置有载药层，该载药层包括有所述呈纳米级大小的联结物与治疗药物的治疗混合物。
3.根据权利要求2所述的纳米止血贴，其特征在于所述联结物为壳聚糖、甲壳素、明胶颗粒或微胶原蛋白中任意一种。
4.根据权利要求1至3中任意一项所述的纳米止血贴，其特征在于所述支撑层为胶原海绵、壳聚糖海绵或氧化纤维素。
5.根据权利要求4所述的纳米止血贴，其特征在于所述支撑层的厚度为0.4～1cm。
6.根据权利要求5所述的纳米止血贴，其特征在于所述止血层与支撑层的密度大致均为载药层密度的1/2。
7.根据权利要求6所述的纳米止血贴，其特征在于所述止血层每平方厘米至少存在10～15mg的止血混合物。
专利摘要本实用新型纳米止血贴，包括支撑层和止血层，止血层附着在支撑层的正面，其中，止血层包括凝血酶和联结物的止血混合物，所述联结物呈纳米级大小。支撑层的反面则设置有载药层，该载药层包括有所述呈纳米级大小的联结物与治疗药物的治疗混合物。本实用新型产品止血材料与机体生物相容性好、无毒副作用，在体内可彻底降解；且使用方便快捷；物理及化学稳定性大为提高，可于常温下储存运输，价格低廉，可广泛应用于多种需要止血的场合。
文档编号A61F13/00GK2920163SQ20062005798
公开日2007年7月11日 申请日期2006年4月20日 优先权日2006年4月20日
发明者陈汝福 申请人:中山大学附属第二医院