使用羊膜的片状组合物及其制作方法

专利名称：使用羊膜的片状组合物及其制作方法
技术领域：
本发明涉及使用羊膜的片状组合物及其制作方法。本发明的片状组 合物可被用作例如眼表面或皮肤再建用的移植材料。
背景技术：
近来，利用角膜上皮干细胞的、对角膜上皮疾病的再生医疗技术不 断被付诸实用。除了角膜上皮疾病以外，在眼科领域中对于内皮疾病、 视网膜疾病，在皮肤科领域中对于表皮疾病等， 一直以来为了治疗各种 疾病而积极进行细胞培养的新尝试。认为今后对这样的再生医疗的需要 将不断增大。作为用于再生医疗的培养细胞的支持体使用的物质之一是 羊膜.羊膜是哺乳动物子宫内存在的胎盘的最内侧存在的组织，是包泉 胎儿的一层膜。已知羊膜作为各种细胞的培养基质非常优异，以往制成 有将羊膜作为载体的培养角膜上皮细胞片、培养口腔粘膜上皮片、培养
表皮细胞片之类的培养细胞片(例如，参照专利文献1~3)。
专利文献l:国际公开第03/043542 Al号文本 专利文献2:国际^>开第03/092762 Al号文本 专利文献3:国际7>开第2004/078225 Al号文本

发明内容
为了使培养细胞片或羊膜片等发挥高的治疗效果，必须将其迅速地 粘附于移植部并维持粘附状态。即，对这样的移植用片要求高粘附性及 存活性。然而，现状是由于得不到充分的粘附力，所以在将培养细胞 片或羊膜片移植到活体时有必要在几乎所有的情况下将片缝合。 一般而 言，进行缝合时，会产生如下的不良情况1.组织被机械破坏，引起 细胞的坏死；2.诱发细菌导致的感染；3.毛细血管被破坏，产生出血。 产生坏死细胞或细菌时，活体欲将它们去除，朗格汉斯细胞、树状细胞、 巨噬细胞、白血球等免疫系的细胞被活化，而引起炎症。此外，从巨噬 细胞释放成长因子而引起血管新生。炎症发生，则成为充血、泪眼、眼
屎、发热、发红、痒等的原因。在视网膜部位产生血管新生时，有可能 导致视力降低。产生这样的生理作用不仅使原来的治疗效果减少，还必 须根据情况进行追加处置等，在临床上非常不便，这在将细胞培养片或 羊膜片向活体移植时是个大课题。另一方面，缝合作业的操作烦杂，具 有经验和熟练的施术者是必不可缺的。因此，现状是可以实施片移植的 施术者、机关有限，考虑到再生医疗的进一步普及，在这方面存在潜在 的限制。此外，额外要缝合的操作，使移植所需要的时间也增加，随之 患者的负担也增加，病情也有恶化的可能性。为了解决这样问题，将细 胞培养片或羊膜片移植到活体时希望不需要缝合。
另一方面，作为通过无缝合将物质粘附到活体时所使用的物质，以
往主要使用组织粘附剂纤维蛋白胶(Tiseel: Baxter、 Bolheal:化血研、 Beriplast: Aventis Pharma )。纤维蛋白胶是模仿活体内血液凝固的最终 阶段而进行组织的粘附、封闭的药物制剂。考虑到使用纤维蛋白胶将细 胞培养片或羊膜片粘附于活体时，施术者将纤维蛋白胶另外购入作为药 物制剂，在手术中进行制备。然而，纤维蛋白胶的制备需要时间和工夫， 由于具有较易固化的性质而难以处理，将片粘附于组织时使用粘附剂是 不容易的。
通过无缝合使物质粘附于活体的产品除了纤维蛋白胶以外还有 Taco Comb ( Nycomed Pharma )。本产品能够用作损伤填补剂，其是把 胶原片作为栽体、将胶固着在单面的医药品。由于产品已经涂布完胶而 无需制备的时间和工夫，仅通过使Taco Comb接触患部，就完成向组 织的粘附。但由于作为Taco Comb的载体使用的是再构成胶原而制作 的化学物质，所以不是直接粘附羊膜片或培养细胞片之类活体来源的活 组织。此外，该片状构建物的厚度为数mm，缺乏透明性。因此，当然 不能应用于移植后要求充分透明性的用途(例如眼表面的再建)。此外， 以眼表面的再建为代表，在上皮组织的再建术等中，被移植部缺乏物理 空间，因此对移植材料要求薄度。在这方面，上述的产品也不适合。
如上所述，以往不能提供将具有功能的活体来源的组织通过无缝合 直接粘附于活体的技术。
本发明的目的在于提供一种片状组合物，其在以上的背景下，可以 应用于眼表面的再建、皮肤或者表皮的再建、烫伤时的礼菱等广泛的用 途，而且通过简便的移植术就能够移植。本发明的目的在于提供一种能
够优选应用于特别是对于眼表面的再建等、其自身要求高透明性的用途 的片状组合物。
为了达成上述目的，本发明人等使用羊膜作为在构建片状组合物方 面使用的支持体。因而，为了提高移植后的粘附性及存活性将纤维蛋白 及凝血酶附着于羊膜的表面。其结果得到的片状组合物非常薄，能够确 保高透明性。此外，具有足够的强度。另一方面，为了确认片状组合物 的粘附性及存活性，将片状组合物应用于眼表面，可观察到迅速的粘附， 而且长期维持良好的粘附状态。如上所述，在羊膜表面附着纤维蛋白及 凝血酶而构成的片状组合物的透明性、强度、粘附性及存活性优异。即， 可知该片状组合物满足应用于广泛用途所必要的条件。此外，由于具有 高粘附性及存活性，据此认为可以实现不并用缝合等的、简便的移植术。 如果不需要缝合，则可消除缝合后出现的问题，即炎症的产生和产生血 管新生的问题。此外，可以节省向活体移植时所必需的工夫和时间，可 以进行片移植作业的施术者的范围很广，期待大大有助于再生医疗的发 展。另一方面，由于所得片状组合物具有高透明性，可知能够优选用于 特别是眼表面的再建等、其自身要求高透明性的用途。
获得以上的知识后，进一步对上述片状组合物的粘附性进行研究， 从而发现，作为粘附成分的纤维蛋白原及凝血酶的添加量(附着量)与 粘附性之间的关联性。根据该见解，由于能够维持所必要的粘附性、并 能够减少纤维蛋白原等的添加量，所以能够将纤维蛋白原等的作用导致 的移植后的炎症及血管新生抑制在最小范围。因此，可以提供在必须要 抑制移植后的炎症及血管新生的用途中、即例如对眼表面的再建等中极 优选的移植材料。
本发明基于以上的成果，包括以下的构成。
一种片状组合物，具有表面附着纤维蛋白原和凝血酶的羊膜。在本 发明的一种实施方式中，羊膜中纤维蛋白原及凝血酶的附着面为干燥状 态。在本发明其他实施方式中，羊膜基本上整体为干燥状态。
此外，本发明的一种实施方式以羊膜表面进一步附着抑肽酶为特 征。通过并用抑肽酶，可抑制纤维蛋白块的分解、维持甚至增强粘附力。
作为羊膜，可以使用去除了上皮的羊膜。由于不含上皮成分，形成 免疫原性进一 步降低的片状组合物。
在本发明的进一步的一种实施方式中，在羊膜上形成含有活体来源 的细胞的细胞层，与该细胞层的形成面呈相反侧的羊膜表面为纤维蛋白 原等的附着面。这种实施方式的培养细胞片由于含有的细胞的作用而形 成治疗效果高的移植用片。形成细胞层的细胞，例如有角膜上皮、结膜 上皮、皮肤表皮、毛嚢上皮、口腔粘膜上皮、虹膜色素上皮、视网膜色 素上皮、呼吸道粘膜上皮或肠管粘膜上皮来源的细胞。
纤维蛋白原对羊膜的附着量优选为每1cii^羊膜0.5 mg ~ 20 mg。同 样地，凝血酶对羊膜的附着量优选为每1 112羊膜1吗~1 mg。这是因 为能够维持高的粘附性，并能够减少移植后的炎症及血管新生的发生。
本发明的片状组合物通过使用羊膜，可以将厚度制备为10nm~ 200fim。
本发明的片状组合物通过预先附着凝血酶等，对人组织具有粘附 性，移植时即使不缝合也可以获得良好的粘附力。
另一方面，本发明还提供上述片状组合物的制作方法。具体而言， 提供以下的构成。
即，片状组合物的制作方法，其包括如下步骤(a)制备羊膜的步 骤，(b)在上述羊膜的表面附着纤维蛋白原及凝血酶的步骤。
在本发明的一种实施方式中，在步骤b之后，实施干燥处理的步骤 (步骤c)。根据使用用途，对组合物整体或仅对纤维蛋白原等的附着面 等实施干燥处理。
在本发明的一种实施方式中，实施在羊膜的表面附着抑肽酶的步骤 (步骤b-l)。应说明的是，优选与纤维蛋白原及凝血酶的附着步骤同时 实施该步骤。
作为步骤a的一部分，优选实施从羊膜上去除上皮的步骤(步骤 a-l)。在该实施方式中，使用去除了上皮的羊膜来制作片状组合物。
此外，作为步骤a的一部分，可以实施干燥羊膜的步骤(步骤a-2)。 即，在该实施方式中，在片状组合物的制作过程中羊膜被暂时干燥，供 给其后的工序。
在本发明的进一步的一种实施方式中，在步骤a和步骤b之间实施 在羊膜上形成含有活体来源的细胞的细胞层的步骤(步骤A)。通过该
步骤在羊膜上形成细胞层，最终制成培养细胞片。 以下，更详细地说明本发明的构成。


图l是模式化地显示在羊膜上培养口腔粘膜上皮细胞及角膜上皮细
胞时器具等的状态的剖面图。在培养皿1内静置培养嵌勤culture insert) 2，在培养皿1的底面形成3T3细胞层5。此外，显示如下的状态在 培养嵌套2的底面上静置羊膜3，在其上培养口腔粘膜上皮细胞及角膜 上皮细胞4。符号6是培养基。
图2是概括粘附成分的附着量与粘附性的关系的实验结果的表。能 否粘附用+(片既不会偏移也不会剥离)及-(片偏移)表示。
符号说明
i培#^(第1容器) 2培养嵌套(第2容器) 3羊膜
4 角膜上皮细胞
5 3T3细胞层 6培养基
具体实施例方式
本发明的第l方面涉及片状组合物。在本发明的片状组合物中使用 羊膜作为其主要构成成分之一。由于羊膜所具有的高透明性及强韧性， 所以可以构成透明性及强度优异的片状组合物。此外，由于羊膜的高活 体亲和性及低免疫原性，所以可以构成活体亲和性更加优异且免疫原性 低的片状组合物。通过使用羊膜，可以进一步期待抗炎症作用、抑制痕 迹形成、阻碍血管新生的作用。在本发明的片状组合物含有细胞层的情 况下，在良好地形成该细胞层方面，也优选使用羊膜。即，如后所述， 具备细胞层的片状组合物是通过以羊膜为基质(支持体)并在其上播种、 培养规定的细胞而形成，结果由于羊膜具有使细胞在其上良好地粘附及 增殖的特性，所以使用羊膜则细胞可以良好地粘附及增殖而可以形成细 胞层。
羊膜更优选为通过刮除处理等将上皮去除而得的羊膜。这是因为由 于不含上皮成分而形成免疫原性进一步降低的片状组合物。此外，去除 了上皮的羊膜，由于在其上细胞更加良好地粘附及增殖，所以能够得到 在更短的时间内构建高品质的角膜上皮样片的制作上的优点。
去除了上皮的羊膜可以通过调查片状组合物中不含羊膜上皮层的 细胞来确认。应说明的是，作为羊膜，特别优选使用人羊膜。
在本发明的片状组合物中，纤维蛋白原及凝血酶(以下，也将它们 统称为"粘附成分")附着在羊膜表面。因此，移植本发明的片状组合 物时，首先，通过凝血酶特异性地水解纤维蛋白原，而生成纤维蛋白， 接着纤维蛋白聚合而形成稳定的纤维蛋白块，从而发挥粘附作用。
纤维蛋白原及凝血酶根据本发明的片状组合物的用途，附着在羊膜 的单面或两面。单面附着时，无论羊膜中有无上皮，羊膜的绒毛膜侧表 面(即，与上皮侧呈相反侧的表面)成为附着面。因此，使用如此构成 的片状组合物时，使存在羊膜上皮的侧朝上，移植到应用部位。以活体 粘附剂为目的移植到活体内时，优选在羊膜的两面附着粘附成分。
应说明的是，如后所述，本发明的片状组合物根据使用目的等制备 成适当的状态(例如干燥状态或湿润状态)，并经过在羊膜表面附着纤 维蛋白原及凝血酶的工序来制备。因此，根据其制作过程中及/或其最 终状态如何，可预想直到被^"吏用为止的期间由一部分纤维蛋白原生成纤 维蛋白。因此，本发明的片状组合物还包括附着有因这样的原因生成的 纤维蛋白或纤维蛋白块的物质。
纤维蛋白原及凝血酶的来源没有特别限定。例如，可以把人、猴子、 黑猩猩、牛、马、羊、猪等的血液作为材料来制备纤维蛋白原及凝血酶。
此外，作为纤维蛋白原及凝血酶，可以使用利用培养细胞(例如CHO 细胞或COS细胞)而得到的重组体(recombinant).优选使用人来源 (特别是人来源的重组体)的纤维蛋白原及凝血酶。这是因为在包括免 疫原性的安全性方面有利。此外，如果考虑可以使用稳定品质的物质及 感染的问题，则特别优选使用重组体。
特别优选使用来源于接受本发明片状组合物移植的患者(recipient)
的血液的纤维蛋白原及凝血酶。这是因为不用担心会发生起因于这些粘 附成分的免疫排斥反应。
另外，纤维蛋白原及凝血酶的来源可以不必相同。如果列举一例， 可以将人血液来源的纤维蛋白原和牛血液来源的凝血酶组合使用。
纤维蛋白原及凝血酶的附着量没有特别限定。例如，纤维蛋白原的
附着量可以设定在每1 112羊膜0.1mg~50mg。同样地，凝血酶的附着 量可以设定在每lcm2羊膜0.5fimg ~ 10mg。
设定纤维蛋白原及凝血酶的附着量时首要考虑粘附力。即，为了获 得所希望的粘附力，必须设定这些成分的附着量。另一方面，纤维蛋白 原或凝血酶的附着量过多时，虽然根据所使用的纤维蛋白原的来源来决 定，但是容易发生免疫反应或血管新生这一点成为问题。
在此，例如在片状组合物被应用于眼表面的再建等的情况下，在移 植后这些成分导致的血管新生成为问题时，为了尽可能抑制血管新生的 发生，优选减少这些成分的附着量。通过将这些成分的附着量设定在可 能的范围内的低值，可抑制移植后的血管新生，可期待高的治疗效果。 如后述的实施例所示，本发明人等的研究结果表明纤维蛋白原的附着 量为每1 112羊膜约0.5mg以上时，可获得对眼表面的良好粘附力。即 使凝血酶的附着量为每1 112羊膜约l吗时，也可获得对眼表面的良好 粘附力。基于这些见解，纤维蛋白原附着量优选的范围为每1 112羊膜 0.5~20mg，进一步优选的范围为每lcm2羊膜0.5mg 10mg,更进一步 优选的范围为每lcm2羊膜0.5mg 6mg (具体地说，例如约0.5mg、约 lmg、约2mg)。同样地，凝血酶附着量优选的范围为每1 112羊膜1吗~ lmg，进一步优选的范围为每lcin2羊膜5吗~200吗，更进一步优选的 范围为每lcm2羊膜10jig~ IOO吗(具体地说，例如约10jig、约20fig、 约30jig )。
在本发明的一种实施方式中，除了纤维蛋白原及凝血酶以外，还有 抑肽酶附着在羊膜表面。抑肽酶阻碍通过凝血酶的作用而形成的纤维蛋 白块被纤维蛋白溶酶溶解。因此，通过并用抑肽酶可抑制纤维蛋白块的
分解，可维持甚至增强粘附力。
抑肽酶的来源没有特别限定。例如，可以使用牛、马、羊、猪、猴 子、黑猩猩等的胰脏来源的抑肽酶。此外，还可以使用利用培养细胞(例
如CHO细胞或COS细胞)而得到的重组体(recombinant)的抑肽酶。 如果考虑可以使用稳定品质的物质及感染问题，则优选使用重组体。
使用抑肽酶时，其附着量没有特别限定。例如，可以将抑肽酶的附 着量设定在每1 112羊膜0.1 KIU~200 KIU。根据上述的纤维蛋白原附 着量的研究，使抑肽酶的附着量变化来研究对于粘附力的影响，即使将 抑肽酶量设定在1 KIU~2 KIU,也可以得到对眼表面的充分粘附力。 基于该见解，抑肽酶附着量优选的范围为每lcm2羊膜1 KIU ~ 100 KIU， 进一步优选的范围为每lcm2羊膜1 KIU ~ 20 KIU,更进一步优选的范 围为每lcm2羊膜1 KIU ~ 10 KIU(具体地说，例如约1 KIU、约2 KIU、 约3 KIU)。抑肽酶的量过多时，自然会引起制造成本的上升，起因于 抑肽酶自身的免疫原性等的副作用的可能性增大。另一方面，抑肽酶的 量过少时，可能不能充分发挥抑制纤维蛋白块的分解的抑肽酶的作用。
另外，在各种用途中纤维蛋白块被用作粘附剂，在那样的用途中 一般并用抑肽酶。本发明人等的研究结果表明，在本发明的片状组合物 中，即使不使用抑肽酶也可得到对于活体的充分粘附力。可以不使用抑 肽酶，意味着不仅简化构成而在制作上及成本面上有利，而且没有必要 考虑起因于抑肽酶自身的免疫原性等的副作用。
本发明的片状组合物的一种实施方式为在羊膜上具有细胞层。在该 实施方式中，在不形成细胞层的一侧的羊膜表面附着有粘附成分(纤维 蛋白原等)。
在该实施方式中，使用去除了上皮的羊膜。因此，在上皮存在的一 侧形成细胞层。此处的细胞层由活体来源的细胞构成。构成细胞层的细 胞的来源没有特别限定。例如，由角膜上皮、结膜上皮、皮肤表皮、毛 嚢上皮、口腔粘膜上皮、虹膜色素上皮、视网膜色素上皮、呼吸道粘膜 上皮或者肠管粘膜上皮来源的细胞构成细胞层。可以由相互不同的二种 以上的细胞构成细胞层。这样，通过含有来源不同的二种以上的细胞来 构成，本说明书中也称为"杂化(hybridization)",经杂化的细胞层中 的细胞的含有形态(杂化状态)没有特别限定，例如，各细胞可以分散， 任意细胞(或者多种类的细胞)可以具有一定的聚集而存在。此外，各 细胞的含有率在细胞层整体中可以不是均匀的。细胞层可以是单层，也 可以是多层(多层化的状态)。
具有经杂化的细胞层时，构成细胞层的细胞种类，以构建用作角膜 上皮的再建的本发明的片状组合物的情况为例，详述如下。
经杂化的细胞层含有二种以上的细胞。因此，为了方便j兌明，把细 胞层所含有的细胞种类之一当作第1细胞，把与其种类不同的细胞种类
当作第2细胞。首先，使用自体细胞作为第1细胞。本说明书中的"自 体"是指应用本发明的片状组合物的对象，即接受移植的人(recipient )。 另一方面，这样的"自体"以外的人称为"他人"。只要在与后述的第2 细胞杂化时能够形成角膜上皮样的粘膜上皮层，则第1细胞的种类没有 特别限定。作为第l细胞的例子，可以举出来源于口腔粘膜上皮、结膜 上皮、鼻腔粘膜上皮等粘膜上皮的细胞，或者来源于能够构建这样的粘 膜上皮的未分化细胞(即粘膜上皮的干细胞)的细胞。在此"来源于或 者来源的"是为了特别指定起始材料而使用的.因此，例如，如果说来 源于口腔粘膜上皮的(或者口腔粘膜上皮来源的)细胞，则是指以口腔 粘膜上皮细胞为起始材料而得到的细胞。此外，本发明中的"能够构建 粘膜上皮的未分化细胞"是指具有向构成该粘膜上皮的细胞分化的能力 的细胞。例如，如果说能够构建口腔粘膜上皮的未分化细胞，则是指能 够向口腔粘膜上皮细胞分化的细胞。作为未分化细胞的具体例，可举出 口腔粘膜上皮或结膜上皮等、构成特定组织的细胞的前体或者干细胞、 或者分化度更低的上皮系干细胞等。
经杂化的细胞层可以含有不同的二种以上的第1细胞。例如，可以 在含有来源于口腔粘膜上皮的细胞和来源于结膜上皮的细胞的状态下
构建细胞层。
本发明中的"口腔粘膜上皮"包括口腔内缘粘膜上皮部、口唇部、 口上颚部、颊部等。其是来源于口腔粘膜上皮的细胞，可以以表达口腔 粘膜上皮特异性的角蛋白4、或角蛋白13为指标来确认。或者，还可以 以表达角蛋白3为指标。已知这种角蛋白3是角膜特异性的角蛋白之一， 但在口腔粘膜上皮中也确认其有表达。另外，从表达这种作为角膜特异 性角蛋白的角蛋白3的角度讲，可优选使用口腔粘膜上皮细胞作为制作 角膜上皮移植用的组合物的材料。
另一方面，通过研究口腔粘膜上皮细胞特异性的基因的表达，可以 确认其为口腔粘膜上皮来源。
另外，来源于口腔粘膜上皮以外的组织的细胞，也同样地可以通过 研究该组织中特异性的标记或者基因的表达来确认其来源。
作为第2细胞的具体例，可以举出来源于角膜上皮、结膜上皮、或 者羊膜上皮的细胞。其中，优选第2细胞为来源于角膜上皮或者结膜上 皮的细胞。这是因为，对于由来源于眼表面组织的细胞而构建的细胞层 来说，可具有与角膜上皮更接近的特性。特别优选第2细胞为来源于角 膜上皮的细胞。这是因为，可成为与角膜上皮更近似特性的细胞层.
第2细胞可以是自体细胞或者他人细胞的任何一种。如果是由自体 细胞构建而得的细胞层，则会形成没有或很少免疫排斥问题的细胞层。 如果是由他人细胞构建而得的细胞层，由于作为原材料的细胞容易获 得，所以形成在其制作方面有利的细胞层。本发明的细胞层可以含有不 同的二种以上的第2细胞。例如，可以在含有来源于角膜上皮的细胞和 来源于结膜上皮的细胞的状态下构建细胞层。
本发明的片状组合物中的细胞层含有来源于角膜上皮的细胞，可以 以例如角膜上皮特异性的角蛋白3或者角蛋白12的表达为指标来确认。 此外，还可以以表达角蛋白4为指标。
另外，来源于角膜上皮以外的组织的细胞也同样地可以通过调查该 组织中特异性的标记或者基因的表达来确认其来源。
本发明的片状组合物由于使用羊膜作为支持体，所以可以构建成非 常薄的状态。可以将本发明的片状组合物制备成如下厚度不含细胞层 时制备成例如lOjim ~ 100fim的厚度，含有细胞层时制备成例如20jim ~ 200fim的厚度。这样，非常薄也是本发明的一大特征。由于具有该特征， 可以在各种用途中应用。特别是，可以利用高的透明性在眼表面的再建 等中应用。
本发明的片状组合物的状态没有特别限定，可以是干燥状态(例如 冻干状态)、半干燥状态、湿润状态(例如被浸在溶液中的状态)中的 任意一种。例如，羊膜中可以只是粘附成分的附着面为干燥状态，或者
可以羊膜整体为干燥状态。含有细胞层时，细胞层部分优选为湿润状态， 其他部分可以为例如半干燥状态或者干燥状态。具体地说，例如可以将 细胞层制成湿润状态，将羊膜中纤维蛋白原等的附着面(包含纤维蛋白 原等)制成干燥状态或者半干燥状态，将羊膜的其他部分制成湿润状态。
还可以在装在玻璃或塑料等的容器中的状态、或者用透明膜或遮光 片等包装的状态下来提供本发明的片状组合物。优选在密封状态下提供 本发明的片状组合物。此外，通常在事前进行灭菌处理的基础上提供。
也可以使用具有与羊膜同等性状(薄度、透明性等)的胶原片代替
羊膜来构建片状组合物。羊膜由于富含IV型胶原，所以可以举出IV型
胶原含有率高的物质作为这样的胶原片的例子。例如，可使用牛、猪、 或马的胶原来构成该片。
本发明的片状组合物被用作组织的再建用的移植材料等。作为本发 明的片状组合物的应用领域可以举出眼科领域、消化器官外科领域、妇 科领域、皮肤科领域。这些各领域的应用部位、对象疾病及用途的例子
如下所示。
1. 眼科领域
不具有细胞层的片状组合物可以应用于巩膜或角膜的再建(对于翼 状胬肉或角膜上皮缺损等的治疗)、防止睑球粘连。另一方面，具有细 胞层的片状组合物可以应用于角膜或视网膜的再建(对于史蒂芬强森综 合症、热化学外伤、眼类天疱疮、视网膜脱落、老年性黄斑变性症、青 光眼、视网膜色素变性症等的治疗)。
2. 皮肤科领域
不具有细胞层的片状组合物可以应用于皮肤(表皮)溃疡、烫伤时 的被覆。另一方面，具有细胞层的片状组合物可以应用于表皮-糖尿病 性溃疡(表皮)、表皮水疱症、或者烫伤的治疗。
本发明的其他方面涉及片状组合物的制作方法。本发明的制作方法 包括下面的步骤。即，(a)制备羊膜的步骤和(b)在上述羊膜的表面附着 纤维蛋白原及凝血酶的步骤。
"羊膜"是哺乳动物中覆盖子宫和胎盘的最表层的膜，在胶原丰富 的实质组织上形成基底膜、上皮层而构成。作为羊膜，优选使用人羊膜。 人羊膜可以从例如分娩时产后得到的人胎膜、胎盘等中获取。具体地说， 通过将分娩后立即得到的含有人胎膜、胎盘及脐带的 一体物进行处理、
精制，可以制备人羊膜。处理、精制方法可以采用特开平5-5698号中 记载的方法等公知的方法。即，可以从分娩时得到的胎膜剥离羊膜，通 过超声波清洗等物理处理及酶处理等将残存组织去除，经过适当的清洗 工序来制备人羊膜。
这样制备得到的人羊膜可以冻结保存到使用时为止。人羊膜的冻结 可以在例如-80t:、将DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) 和甘油以等体积比混合而得的溶液中进行。通过冻结保存可提高操作性 是勿庸置疑的，还有望降低抗原性。
还可以直接利用羊膜，优选使用通过进行刮除处理等从羊膜上去除 了上皮的羊膜。由于去除上皮，所以抗原性降低。例如，将如上那样冻 结保存的人羊膜解冻之后，用EDTA或蛋白分解酶处理，緩解细胞间的 粘附，接着用细胞刮器等刮除上皮，从而可以制备去除了上皮的人羊膜。
优选预先干燥处理羊膜。通过使用干燥状态的羊膜，可以更良好地 附着纤维蛋白原等粘附成分。此处的干燥处理可以举出例如冻干、风干、
真空干燥、减压干燥。其中，优选采用冻干。这是因为冻干处理时羊膜 的柔软性不易降低。
纤维蛋白原及凝血酶向羊膜表面的附着可分别单独进行或者同时 进行。附着方法没有特别限定。作为附着方法的例子，可以举出将附着 成分的溶解液涂布、滴加、或者喷雾到羊膜表面的方法，或者将羊膜浸 渍在附着成分的溶解液中的方法。此外，将纤维蛋白原自身(或者凝血 酶自身)、或者将纤维蛋白原(或者凝血酶)溶解到适当的溶剂中之后 而析出的成分添加(涂抹)到羊膜表面，从而可以使纤维蛋白原(或者 凝血酶)附着在羊膜表面。
优选如下制备这2种成分的混合液，使用该混合液来涂布、滴加 等，由此使纤维蛋白原及凝血酶同时附着在羊膜表面。以下，说明这样 的使2种成分同时附着的方法的具体例。
首先，制备纤维蛋白原溶解液。具体地说，将纤维蛋白原溶解在乙
醇(例如94%乙醇)等的溶剂中，使之达到所希望的浓度。除了乙醇之 外，还可以使用无水乙醇、异丙醇、甲醇等醇类或丙酮等作为溶剂。另 一方面，以同样的顺序另外制备凝血酶溶解液。作为此时的溶剂，可以 使用例如乙醇(例如99.5%乙醇)、无水乙醇、异丙醇、甲醇等醇类或 丙酮等。
接着，混合以以上的顺序准备好的纤维蛋白原溶解液及凝血酶溶解 液。使用如此得到的混合液，如上所述，实施向羊膜上的涂布、滴加等。
作，此时，优选注意不让混合液中的水分量增多.如果混合液中的水分 量增多，则在附着操作前会发生纤维蛋白原、凝血酶间的反应，给附着 操作带来障碍。此外，为了移植后获得良好的粘附力，优选在事前不发 生作用的状态下将纤维蛋白原和凝血酶附着在羊膜上。如果考虑以上方 面，则优选采用水溶性且水分量少的挥发性溶剂分别作为纤维蛋白原的 溶剂及凝血酶的溶剂。
合液的涂布、滴加等，典型地说，是对羊膜表面的全部区域均匀地实施， 但例如也可以仅在一部分区域实施(例如，以点滴的方式间隔设置并在 多个区域实施，或仅在周边部实施)，或以不同的附着量来实施。
在上述方法中，纤维蛋白原及凝血酶的附着同时进行，也可以在个 别的工序中附着各自的成分。即，可以把纤维蛋白原的附着和凝血酶的 附着作为2个阶段的步猓来实施。是，在能够简化操作方面以及可以 将纤维蛋白原和凝血酶以更均匀的^t状态来附着方面，优选使用纤维 蛋白原和凝血酶的混合液在1个步骤中进行附着操作。
应说明的是，纤维蛋白原及凝血酶可以依照常规方法由血液来制 备。还可以使用重组体的纤维蛋白原等，此时可以由适当的培养细胞的 培养液或者细胞破碎液通过常规方法来制备。此外，还可以使用市售的 纤维蛋白原等。例如，人来源的纤维蛋白原可以从Baxter公司购入。 同样地，人来源的凝血酶可以从Baxter公司购入。
除了纤维蛋白原及凝血酶以外，还可以使抑肽酶附着在羊膜表面。
液，使用混合液来实施附着操
即，在该实施方式中，进一步实施使抑肽酶附着的步骤(步骤b-l)。抑 肽酶的附着可以通过与纤维蛋白原等同样的方法及顺序来实施。即，通 过采用抑肽酶溶解液的涂布、滴加、喷雾、浸渍等，可以在羊膜表面附 着抑肽酶。抑肽酶溶解液可以通过将抑肽酶溶解在氯化钠溶液(例如
0.85%溶液)、氯化钾溶液、氯化鈣溶液、氯化镁溶液等中来制备。
应说明的是，抑肽酶可以依照常规方法由牛的胰脏来制备。还可以 使用重组体的抑肽酶，此时可以由适当的培养细胞的培养液或者细胞破 碎液通过常规方法来制备。此外，还可以使用市售的抑肽酶。例如，牛 来源的抑肽酶可以从Bayer药品7〉司购入。
使抑肽酶附着的步猓还可以单独实施，优选与使纤维蛋白原及凝血 酶附着的步骤同时实施。这是因为，整体简化粘附成分的附着操作。此 外，还因为，能够将纤维蛋白原、凝血酶及抑肽酶以更均匀分散的状态 附着在羊膜表面。例如，制备纤维蛋白原、凝血酶、及抑肽酶的混合液， 将其涂布等，从而可以实施这3种成分向羊膜的同时附着。这3种成分 的混合顺序没有特别限定。
纤维蛋白原等的附着可以对羊膜的单面或者两面实施。在前者的情 况下，作为原则，无论羊膜中有无上皮，在与上皮侧(上皮存在的一侧) 呈相反侧的表面(即绒毛膜侧)进行纤维蛋白原等的附着。
附着纤维蛋白原及凝血酶(根据情况还有抑肽酶)之后，根据需要 实施干燥处理。如此，形成保存稳定性优异的片状组合物。此外，成为 在处理(输送、移植操作等)方面也优选的形态。
作为干燥处理，可以釆用风干、真空干燥、减压干燥、冻干等一般 的干燥处理方法。
在本发明的一种实施方式中，在羊膜上形成使用活体来源的细胞的 细胞层。这种细胞层在对羊膜表面附着凝血酶等的操作之前先形成。即， 在该实施方式中，在羊膜上形成细胞层之后，将凝血酶等的粘附成分附 着在羊膜表面(不形成细胞层的一侧的表面)。
形成细胞层的步骤可以以下面的顺序实施。首先，准备适当的活体 来源的细胞(制备活体来源的细胞的步骤)。作为活体来源的细胞，使
用适合最终得到的片状组合物的用途的细胞。例如，制作皮肤表皮组织 的再生用片时，优选使用皮肤表皮细胞(包括其干细胞、前体细胞)或 毛嚢上皮细胞(包括其干细胞、前体细胞)等。同样地，以角膜上皮组
织的再生为目的时，优选使用角膜上皮细胞(包括其干细胞、前体细胞); 以粘膜上皮组织的再生为目的时，优选使用粘膜上皮细胞(包括其干细 胞、前体细胞)。作为粘膜上皮细胞的例子，可以举出口腔粘膜上皮细 胞、肠管粘膜上皮细胞、呼吸道粘膜上皮细胞等。
对于活体来源的细胞的制备方法，以皮肤表皮细胞、角膜上皮细胞、 口腔粘膜上皮细胞、肠管粘膜上皮细胞及呼吸道粘膜上皮细胞为例进行 说明。
(皮肤表皮细胞)
首先，采取皮肤时，预先用聚乙烯吡咯酮碘等消毒药预防性地消毒 釆取部位，进行抗真菌剂的外用涂布之后，依照皮肤活检采取小皮肤片。 培养表皮角化细胞时，用剪子从皮肤片中尽可能地剔除脂肪组织和真 皮，用杜氏磷酸緩冲液(PBS)清洗数次。在70%乙醇中浸泡1分钟来 进行灭菌。切成长方条状，浸于分散酶液中，在4TC下静置一晚。接着 将表皮从真皮上剥离。把剥离得到的表皮清洗后，切碎表皮片，调配表 皮角化细胞悬浮液。把细胞悬浮在无血清培养基中，播种于胶原被覆培 养i上，进行传代培养。
(角膜上皮细胞)
角膜上皮细胞可从角膜缘部组织中获得。例如，从角膜缘部组织剥离 去除内皮细胞，切除结膜，制作单一细胞悬浮液。然后把它保存于氮罐中， 接着迅速在371C下融解来调配角膜上皮细胞悬浮液。根据需要，进行传代 培养。对传代培养而言，比如，可使用无血清培养基EpilifeTM (CASCADE 公司)、MCDB153培养基(日水制药林式会社)或改变这些培养基的M 酸组成等而制成的培养基等。
(口腔粘膜上皮细胞)
作为口腔粘膜上皮细胞，可以使用存在于齿根部的细胞(口腔内缘 粘膜上皮细胞)、口唇部细胞、口上颚部细胞、颊部细胞等。其中，口
腔内缘粘膜上皮细胞因其增殖能力高且抗原性低，而特别优选使用它。 口腔粘膜上皮细胞可以用手术刀等切除目标细胞存在的部位，或通过进
行刮除来采取。对于口腔内缘粘膜上皮细胞，可以通过将拔牙上附着的 口腔粘膜上皮从牙釉质牙骨质移行部分离来采取。在此，为了去除结締
组织等杂质，优选进行用分散酶或胰蛋白酶等酶的处理或过滤器处理。
(肠管粘膜上皮细胞)
肠管粘膜上皮细胞是在;^^窺镜下从肠管上皮活检组织中采取，或 者用腹腔手术时常规的手法采取。还可以用激光捕捉显微解剖(lazer capture microdissection)方法从组织中切除上皮细胞。本发明技术也应用 于用食道、胃、十二指肠、小肠、大肠的人的所有消化道上皮细胞而制作 的活体组织片。由于溃疡和炎症等人的消化道上皮受到损伤时，骨髄来源 细JJ&iL挥应对紧急事态的急救作用，从而上皮被修复。消化道上皮细胞的 一部分也可以由骨髄制作。从这个意义上可以认为本发明的意义与使用角 膜上皮细胞等同。通常1000个中只有少数几个可以由骨髄生成的上皮细 胞，在胃溃疡、U炎等引起的消化道内面的溃疡(伤口)治愈的过程中 增加50倍到100倍，确认大约10个中有1个消化道上皮细胞为骨髄来源。 这里制作的消化道粘膜上皮细胞来源活体组织片，认为对于指定为难症的 重症肠管感染症、溃疡性大肠炎、克隆病、贝切特病等肠道病的难治溃疡、 炎症而言，M肠管上皮的再生也是非常有意义的。也期待着对肠管变态 反应的可4吏用性。
(呼吸道粘膜上皮细胞)
呼吸道粘膜上皮细胞容易从呼吸道粘膜的活检组织中得到，与上述的 组织相同，为了去除结締组织等杂质，优选进行用^ft酶或胰蛋白酶等酶 处理或过滤器处理。呼吸道粘膜上皮细胞通过P防御素的生物合成、释放 等，对各种感染症病情iLH^重要的作用。而且，呼吸道粘膜上皮对哮喘、 变态^^应疾病中所起的作用也高。对受到组织损伤的呼吸道粘膜提供本发 明的由呼吸道粘膜上皮细胞制作的活体组织片，不仅是应急对应，还可用 于人工呼吸道的提供。尤其羊膜上制作的片所具有的免疫抑制作用是有益 的。
口腔粘膜上皮细胞、肠管粘膜上皮细胞等，特别是在采取组织之后，
为了去除结締组织等杂质，优选进行用^t酶或胰蛋白酶等酶的处理或过 滤器处理。
活体来源的细胞优选由接受活体组织片移植的受者(recipient)制备。 即、优选活体来源的细胞的，和活体移植片的受者是相同的人。通过使 用这样的自体细胞，可解决免疫排斥的问题。
制备好的活体来源的细胞被播种到羊膜上(将活体来源的细胞播种 到羊膜上的步骤)，供给其后的培养(培养经播种的活体来源的细胞并 使其增殖的步骤)。
在该实施方式中，特别优选使用去除了上皮的羊膜。通过去除上皮， 可以期待抗原性的降低，此外，通过事前去除不需要的细胞，可以良好 地形成目的细胞层。使用去除了上皮的羊膜时，优选在去除上皮而显出 的面侧(即基底膜侧)播种活体来源的细胞。这是因为，在该面侧含有 丰富的IV型胶原，认为播种的活体来源的细胞的增殖、多层化会良好 地进行。
在此，也可以通过使用二种以上的细胞，形成经杂化的细胞层。对 于这种情况的细胞层的具体形成方法，以制作角膜上皮再建用的片状组 合物为例，详述如下。
首先，作为细胞层形成中使用的细胞种之一 (第1细胞)，优选使 用口腔粘膜上皮细胞、结膜上皮细胞、鼻腔粘膜上皮细胞、或其他粘膜 上皮细胞、或者可以构建这些任意一种粘膜上皮的未分化细胞。另一方面， 作为与第1细胞一起用于细胞层形成的细胞种(第2细胞)，优选使用 角膜上皮细胞、结膜上皮细胞、或羊膜上皮细胞。这些细胞从其存在的 活体组织中采取。具体地说，例如，用手术刀等釆取目的细胞存在的组 织的一部分之后，经过结締组织的去除、细胞的分离等处理，制备成细 胞悬浮液的形态。在此，作为第1细胞可以使用不同的二种以上的细胞。 对于第2细胞也同样地可以使用不同的二种以上的细胞。
在优选作为第1细胞采取源的口腔粘膜上皮中提示有干细胞的存在， 可认为容易实施向形成上皮样细胞层的细胞分化诱导。另外，利用口腔粘 膜上皮细胞，具有如下优点容易采取，可大量采取细胞，进而在处置双
眼性患者的情况下也可以用自体的细胞制备移植材料等。尤其是，对于不 能采取角膜上皮细胞的患者，可以应用自体细胞来源的移植材料，其优点 是，可以大幅度地解除临床上极其重要的排斥反应的问题。
作为口腔粘膜上皮细胞可以采用存在于齿根部的细胞(口腔内缘粘膜 上皮细胞)、口唇部细胞、口上颚部细胞、颊部细胞等。其中，口腔内缘 粘膜上皮细胞由于其增殖性能高，而且抗原性低，故特别优选采用它。口 腔粘膜上皮细胞可以从目的细胞存在的部位用手术刀等切除，或进行刮除 来采取。对于口腔内缘粘膜上皮细胞，可以通过把拔牙上附着的口腔粘膜 上皮从牙釉质牙骨质移行部分离来采取。在此，为了去除结締组织等杂质， 优选实施用^t酶或胰蛋白酶等酶处理或过滤器处理。
可以釆用从准备移植本发明制作的片状组合物的患者以外的口腔所采 取的口腔粘膜上皮细胞，但若考虑免疫排斥反应，优选从患者自身的口腔 采取口腔粘膜上皮细胞进行培养。
口腔粘膜增殖能力高，通常，术后数日内服抗生剂，通过漱口药水
(Isodine)消毒等来治愈创伤，因而认为采取粘膜引起的患者自身的侵害 是轻度的。
另一方面，作为第2细胞，可以优选用他人(alio)的角膜上皮细胞。 这样的角膜上皮细胞，例如可以从眼库(Northwest eye bank等)中获得 没有感染症的供者的目狄。作为第2细胞可以使用的细胞不限于角膜上皮 细胞，也可以使用结膜上皮细胞、羊膜上皮细胞等。但是，若采用作为在 活体中构成角膜上皮的细胞的角膜上皮细胞、或在其附近存在的结膜上皮 细胞，则认为可构建更好地再现角膜上皮特性的片状组合物。本发明人等 的研究结果表明，使用角膜上皮细胞作为第2细胞时，确认可以构建类似 于角膜上皮的细胞层。这一事实支持上述的预想，并且印证了特别优选角 膜上皮细胞作为第2细胞。另一方面，使用羊膜上皮细胞作为笫2细胞时， 也被确认可形成良好地再现角膜所要求的特性的细胞层。这一事实表明， 可以优选使用羊膜上皮细胞作为第2细胞。
可以利用自体的细胞作为第2细胞，但是如果采用他人的细胞则可以 更容易获得细胞。例如，为双眼性患者制作治疗用片状组合物时，也可以 获得作为第2细胞的角膜上皮细胞。
将分别调制好的第1细胞和第2细胞(以下，把这些统称为"第1细 胞等")播种在羊膜上，供于培养。通常，调制成细胞悬浮液形态的第1 细胞和第2细胞分别往羊膜上滴加，实施培养。
典型地说，第1细胞的播种和第2细胞的播种同时(这里的"同时" 当然包括文字所表示的同时，也包括一方播种后没有实质性的时间间隔而 播种另一方的情况)实施，例如，在播种第l细胞后经过数分 数小时的 时间，播种第2细胞等，也可以在不同的时机播种两者。这样通过错开播 种时期，例如构建富有来源于第1细胞的细胞的区域局部存在的细胞层等， 可以改变或调整细胞层的构成以及伴随其的特性。
播种的第1细胞等的比率没有特别限定，典型地说，播种大体等数的 第1细胞和第2细胞。应说明的是，在釆用口腔粘膜上皮细胞作为第1细 胞，采用角膜上皮细胞作为第2细胞的实验中，比较第1细胞数与第2细 胞数的比为3:7的情况、5:5的情况以及7:3的情况，结M明，在细胞增 殖及多层化方面，它们之间没有明显的差异(未出示数据)。
通过在羊膜上培养第1细胞及第2细胞，这些细胞增殖而形成细胞 层(认为该过程中至少一部分细胞分化)。形成细胞层之后，实施使该 细胞层的表层接触空气的步稞。在本说明书中也将该步骤称为空气上举 (Air-lifting)。该步骤是为了使形成细胞层的细胞分化以及诱导屏障功能 而实施的。
该步骤可以如下进行通过用滴液管、移液管等暂时去除一部分培养 液而使培养液表面降低，由此使细胞层的最上层暂时露出于培养液外。或 者，可以通过将细胞层连同羊膜层^往上提升，将M层暂时从培养液 表面露出。进而，可以用管等把空气^培养液中，使细胞层的最上层与 空气接触。从操作容易性的观点出发，优选通过降低培养液表面而使细胞 层的最表层露出的方法进:行。
进行该步骤的时间，即使多层化细胞层的^^层与空气接触的时间， 根据细胞的状态和培养条件等而变化，例如3天~2周左右，优选为1周 以内，更优选为3曰以内。
;fll据以上的本发明的方法，在羊膜上，形成第1细胞等多层化的角膜
上皮样的细胞层。这样得到的片状组合物，可以与作为第1细胞等的培养 基质而采用的羊膜一起用作对于损伤、缺损角膜等的患者的移植材料(代 替角膜上皮)。在这种情况下，以羊膜成为眼球侧的方式移植到角膜上皮 缺损部位。
在本发明的一种实施方式中，在支持细胞的存在下进行活体来源的
细胞的培养。所谓支持细胞也称饲养(feeder)细胞，在培养液中供给成 长因子等。由于在与支持细胞的共存下培养，所以提高细胞的增殖效率。 支持细胞可以使用例如3T3细胞(瑞士小鼠3T3细胞、小鼠NIH3T3细胞、 3T3J2细胞等)等。其中，从增殖效率和操作容易等观点出发，优选使用 小鼠NIH3T3细胞作为支持细胞。
优选预先用丝裂酶素C等对支持细胞实施非活性化。这是为了防止 随着支持细胞自身增殖而阻碍活体来源的细胞的增殖，来提高活体来源 的细胞的增殖效率。这种非活性化也可以通过放射线处理等来实施。
支持细胞的细胞密度可以是，如约1 x 102个/ 112以上，优选约1 x 102 个/cm2 ~约1 x io7个/cm2，更优选约1 x io3个/cm2 ~约1 x 10s个/cm2。用 与第l细胞等的对比来说，例如，可以在使用的支持细胞数相对于活体来 源的细胞的总数为1/103倍~1><102倍、优选1/102~ 1倍的条件下进行培
养。若支持细胞数少，则活体来源的细胞的增殖率降低，在过少的情况下， 得不到活体来源的细胞良好的增殖及多层化。另一方面，在支持细胞数过 多的情况下，活体来源的细胞的增殖率反而下降，因而不优选。
在支持细胞共存的条件下进行活体来源的细胞的培养时，优选支持细 胞与羊膜之间设置支持细胞不能通过的孔径尺寸的隔离膜。通过利用该隔 离膜，在培养时可防止支持细胞^A到羊膜侧(即活体细胞侧)。其结果， 不用担心最终获得的片状组合物内混有支持细胞。这就意味着可以制作没 有支持细胞所致的免疫排斥问题的片状组合物，在临床上有非常重要的意 义。
作为隔离膜，可以适当选择使用具有支持细胞不能通过的孔径尺寸 的众所周知的隔离膜。例如，可以使用聚碳酸酯制的、孔径尺寸约
0.4fim 3.0^im的膜。隔离膜的材质没有特别限定，除了聚碳酸酯以外， 也可以是聚酯等。这样的隔离膜在市场上出售，可以容易得到。
作为4吏用隔离膜时的培养方法的例子可举出以下的方法。首先，通过 在培^JIL等容器中(第l容器)中播种培养非活性化的支持细胞，在容器
表面形成支持细胞层。其次，把用隔离膜形成底面的第2容器设置于第1 容器内。这时，调整第2容器的位置，使得第2容器的底面处于培养液中。 继而，在第2容器的底面、即隔离膜上栽置或附着羊膜。然后，在羊膜上 播种活体来源的细胞，进行培养。
在第2容器的底面预先栽置或附着羊膜(例如，在第2容器的底面 载置去除了上皮的羊膜，在该状态下进行干燥处理)，将该第2容器设置 于播种了支持细胞的第1容器内，然后可以在羊膜上播种活体来源的细胞， 进行培养。
培养活体来源的细胞时使用的培养液，只要能使该细胞增殖、多层 化就没有特别限定。例如，可以使用如下的培养基以规定比例混合在 上皮细胞的成长中通常使用的DMEM (Dulbecco，s modified Eagle，s medium)和Ham，s F12培养基(Ham，s F12 medium )，添加FBS、成长 因子、抗生素等而得到的培养基。具体例可举出，添加有FBS(10。/。)、 胰島素(5mg/ml )、霍乱毒素(0.1nM)、上皮细胞生长因子(EGF )(10ng/ml) 以及青霉素—链霉素(50IU/ml)的、DMEM和Ham，s F12培养基的混 合培养基(混合体积比1:1 )。此外，还可以使用进一步添加有三碘曱状 腺原氨酸(例如2nM )、谷氨酰敏例如4mM )、转铁蛋白(例如5 mg/ml )、 腺嘌呤(例如0.18mM)和/或氢化可的松(例如0.4mg/ml )的 DMEM/Ham，s F12混合培养基。
还可以在异种动物细胞不存在的条件下进行活体来源的细胞的培 养。本发明中的"异种动物细胞不存在的条件下"是指，作为培养活体 来源的细胞时的条件，不使用对该活体来源的细胞来说为异种的动物细 胞。具体地说，是指使用人细胞(例如人皮肤表皮细胞或人角膜上皮细 胞)作为活体来源的细胞时，小鼠或大鼠等、人以外的动物种的细胞在 培养液中不存在(并存)的条件。通过在这样的条件下实施培养，不用 担心在最终得到的移植材料(即片状组合物)中混入异种来源的成分(包 括异种细胞自身)。
培养活体来源的细胞时使用的培养基，只要能使该细胞增殖就没有 特别限定。例如，可以使用如下培养基MCDB153培养基(日水制药
林式会社)、或EpiLife (Cascade公司)、改变这些培养基的氨基酸 组成等而制成的培养基、以规定比例混合上皮细胞的成长中通常使用的 DMEM ( Dulbecco，s modi打ed Eagle's medium)和Ham's F12培养基 (Ham's F12 medium)而得的培养基等。特别优选在本发明中^^吏用无 血清且不含异种动物来源的蛋白质的培养基。另一方面，可以使用添加 有成长因子或抗生素等的培养基。但是，优选使用不含血清的培养基。 即，优选采用无血清培养法作为本发明中的培养方法。这是因为，可以 避免因混入血清来源的成分而导致的免疫排斥等问题。还可以在含有血 清的培养基中培养，此时，优选使用同种来源的血清(培养人的活体来 源的细胞时人来源的血清)、或者使用自体血清。当然，只要可能，优 选使用不会担心引起免疫排斥反应的自体血清。
为了良好地增殖活体来源的细胞，在培养步猓过程中也可以变更培 养条件。
培养步猓的结果是活体来源的细胞在羊膜上增殖。在有必要将这样 得到的细胞层的表层角化时(例如使用皮肤表皮细胞制作皮肤表皮片 时、使用角膜上皮细胞制作角膜上皮片时)，可以实施上述的空气上举 (Air-lifting )。
将活体来源的细胞播种到羊膜上，使得例如细胞密度达到约lxl03 个/ 112以上、优选约lxl()3个/cm2 约lxl()7个/cm2、进一步优选约lx104 个/cm2 ~约lxl06个/cm2。
在优选的一种实施方式中，在预先制备好的含有人成纤维细胞的胶 原基质上载置羊膜，其后，在羊膜上播种活体来源的细胞，进行培养。 即，在该实施方式中，实施如下步骤在胶原凝胶内培养人成纤维细胞 的步猓(步骤B)及在上述胶原凝胶上载置羊膜之后，将上述活体来源 的细胞播种或载置在该羊膜上的步骤(步猓C)。按这样的顺序制成的 片状组合物含有在栽置于含有人成纤维细胞的胶原凝胶上的羊膜上增 殖的活体来源的细胞。该实施方式的片状组合物在去除胶原基质之后可 以用作移植材料。此外，可以与胶原基质一起用作移植材料。
"胶原凝胶"是作为人成纤维细胞的培养基质而发挥作用。作为J!^^ ^原材料的胶原种类没有特殊限定，可以使用I型胶原、III型胶原、IV
型胶原等。也可以使用多种胶源混合存在的胶原。这些胶原可以通过酸溶 解法、碱溶解法、酶溶解法等从猪、牛、羊等动物的皮肤、软骨等结締组 织中提取、精制。在此，为了降低抗原性，优选使用通过用胃蛋白酶或胰 蛋白酶等分解酶处理来去除端肽的、所谓的组织修复胶原
(a也erocollagen )。作为胶原:^的材料，可以使用羊膜来源的、特别是 人羊膜来源的胶原。在此，所谓的羊膜来源是指广义的以羊膜为初始原材 料而得到的物质。
J!^f、皿所含有的人成纤维细胞的来源没有特别限定，只要产生J!^^ 则哪一种组织来源都可以，例如可以使用由皮肤组织、口腔粘膜组织等制 备得到的人成纤维细胞。
示出J!^^^质的制作方法的具体例子。首先，按以下的顺序制^^人成 纤维细胞。采取皮肤，接着从皮肤剥离真皮。把真皮切细，使其附着于I 型J^^M试i。静置培养，将从真皮片游离的人成纤维细胞进行传代培 养。使细M试i底面剥离，调配细胞悬浮液，播种于细胞培养用试i。 适当地冻存(例如在液氮中M)细胞。
另一方面，用I型胶原调制中和胶原液(参照后述的实施例)。把它 添加到培养容器(例如培养嵌套)中，在室温中静置10分钟左右，使其凝 胶化。接着，用上述方法将预先培养好的对数增殖期的人成纤维细胞混合 于该亂欧中，再次使其凝胶化。然后，静置培养。通过以上顺序得到含有 人成纤维细胞的胶原基质。通过该创意努力，形成了有必需的强度、且能 够载置羊膜层和活体来源的细胞的胶原基质，成为本发明的基础。在J^^、 基质上栽置(附着)另外准备的羊膜。其后，按上述顺序实施细胞的播种、 培养。
以下，说明本发明的实施例(包括实验例)。 实施例
1.粘附剂附着片的制作 l-l.粘附成分混合液的制备
首先，将纤维蛋白原(Baxter公司制)84mg和94%乙醇700fil混
合，用均化器进行搅拌之后，在4"静置20小时(A液)。另一方面， 将凝血酶(Baxter公司制)2mg和100%乙醇35jtl混合，通过移液操作 来搅拌之后，在-30'C静置16小时(B液)。
将A液及B液混合，接着添加7jd调配为3000 KlU/ml的抑肽酶 (Baxter公司制)。将这样得的3种成分的混合液用于后述的附着处理。
1-2.粘附成分附着-带上皮的羊膜片的制作
按以下的顺序制备在羊膜(具有上皮)上附着有粘附成分的片(以 下也称为"粘附成分附着-带上皮的羊膜片")。
1-2-1.羊膜的采取
对于没有全身合并症的准备剖腹产的孕妇事先会同妇产科医生进g 真的说明、取得同意后，在手术室剖腹产时釆取羊膜。^Mt要注意清洁， 按手术操作洗手后穿上手和炮。^4fc前准备清洁的采取羊膜用搪瓷盘和清 洗用生理盐水。M后将胎盘组织移到搪瓷盘上，用手把羊膜组织从胎盘 剥离。羊膜与胎盘的愈:合牢固的部分用剪刀切除。
1-2-2.羊膜的处理
羊膜处理的过程按(1)清洗、(2)修整、(3)保存的顺序实施。 在全部过程中，优选在清洁的通风橱内操作，全部使用经灭菌的容器和 器具，培养皿等使用经灭菌的一次性(可任意处理的)培养亚。用生理
盐水边清洗边去除附着于所采取的羊膜上的血液成分，再用足够量的生 理盐水(添加0.005 %氧氟沙星)清洗。接着把羊膜移到培养皿内的磷 酸緩冲液(PBS)中，用剪刀进行约4x3cm左右的分割。分割后进一 步在数个培养i中浸入保存液，从中选择状态好的羊膜。
1-2-3.羊膜的保存
在2cc的灭菌低温管中各注入lcc的保存液，把每一片采取、清洗 后选出的羊膜装入、进行标记后，保存于-80lC的水箱中。保存液使用 有50。/。灭菌完的甘油的DMEM(Dulbecco，S Modofied Eagle Medium: GIBCOBRL公司)。保存的羊膜使用期限是3个月，若过期就进行焚烧 处理。
1-2-4.干燥处理
用一组灭菌完的塑料框架挟持之后，用夹子固定。与框架一起转移 到-80'C的强力冷冻机内，确认羊膜冻结之后，用真空冻干机(Yamato， NEOCOOL)进行冻干处理(-110'C、约1小时)。根据使用说明书设 定条件，以便获得充分的干燥物。
1-2-5.将粘附成分向干燥羊膜片涂布
将在1 — 1.中制备好的A液、B液及抑肽酶液混合，进行充分的吸 移操作(混合液)。接着，以扩展到在1-2-4.中制成的干燥羊膜的几 乎整个表面(绒毛膜侧)的方式，将该混合液滴加之后(纤维蛋白原的 附着量5.5mg/cm2、凝血酶的附着量0.13mg(1.4U)/cm2、抑肽酶的附 着量1.4KIU/cm2)，在常温下减压干燥2小时。接着，将干燥羊膜从 框架中摘除，转移到由外侧为聚酰胺尼龙、内侧为聚乙烯构成的二层构 造的袋中，用家庭用真空封袋器(Flaem Nouva、 MAGIC VAC)进行 真空包装。对这样得到的真空袋状态的羊膜照射Y射线(约25kGy)来 进行灭菌。将灭菌处理后的羊膜直接以真空封袋状态常温保存到使用前 为止(粘附成分附着—带上皮的羊膜片)。
1-3.粘附成分附着-无上皮的羊膜片的制作
按以下的顺序制备在去除了上皮的羊膜上附着有粘附成分的片(以 下也称为"粘附成分附着-无上皮的羊膜片")。
1-3-1.去除羊膜上皮
按上述的顺序(1-2-1. ~1-2 - 3.)将采取、保存的羊膜在室 温下解冻之后，用培养i内灭菌完的磷酸緩冲液(PBS)充分清洗。清 洗后在0.02 % EDTA溶液(Nacalai tesque公司)中于37'C保存2小时， 然后使用细胞刮器(cell scraper、 Nunc公司USA)机械地刮除上皮。 对于这样得到的、不含上皮的羊膜，按上述的顺序(1-2-4.及1-2 -5.)实施干燥处理、粘附成分的涂布(纤维蛋白原的附着量 0.5mg/cm2、凝血酶的附着量12jig/cm2 、抑肽酶的附着量 0.12KIU/cm2),得到真空封袋状态的、粘附成分附着—无上皮的羊膜片。
1-4.制作粘附成分附着-细胞层形成羊膜片(l)(粘附剂附着-培养 角膜片)
来源于角膜上皮细胞的细胞层在羊膜(无上皮)上形成，进而，按 以下的顺序制备在羊膜的表面附着有粘附成分的片(以下也称为"粘附 成分附着-培养角膜片")。
1-4-1.羊膜上皮的去除
按上述的顺序(1-2-1. ~1-2-3.)将采取、保存的羊膜在室 温下解冻之后，用培养i内灭菌完的磷酸緩冲液(PBS)充分清洗。清 洗后在0.02 % EDTA溶液(Nacalai tesque公司)中于37'C保存2小时， 然后使用细胞刮器(Nunc公司USA)机械地刮除上皮。使用这样得到 的、不含上皮的羊膜作为以下的细胞培养基质。
1-4-2.回收角膜上皮细胞
用手术刀从6周龄的日本白色家兔的角膜缘部采取约5xl0mm的角 膜缘部组织片。将采取的组织片在含有50IU/ml的青霉素-链霉素、庆 大霉素的磷酸緩冲液(PBS)中于30分钟、室温的条件下浸渍2次。 然后，在37TC的条件下将组织浸渍在含有1.2U分散酶(Nacalai tesque 公司)的磷酸緩冲液(PBS)中1小时，继续用0.05。/o胰蛋白酶-EDTA 溶液(GIBCOBRL公司)浸渍处理15分钟，分离细胞。通过浸渍在含 有10%胎牛血清(FBS)的DMEM中的方法使酶活性终止。其后，用 60jim的细胞滤器去除多余的组织，分离出角膜上皮细胞(角膜上皮细 胞悬浮液)。
l-4-3.制备共培养细胞
作为共培养细胞(支持细胞)，使用NIH-3T3细胞(以下简称"3T3 细胞")。将事前培养的长满75F烧瓶(BD Falcon公司)的3T3细胞在 0.05。/。丝裂酶素C溶液中浸渍2小时，抑制3T3的增殖活性。接着，用 磷酸緩冲液(PBS)清洗数次去除丝裂酶素C之后，用0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液处理，从而调制3T3细胞悬浮液。
l-4-4.细胞培养及粘膜上皮的诱导
将在1-4-1.中得到的、刮除了上皮的人羊膜作为基质，将角膜 上皮细胞和实施了上述处理的3T3细胞按以下的步骤进行共培养。培养器 具使用6孔的培养皿(culture dish) ( Corning公司，NY)和培养嵌套 (培养插入容器)(聚碳酸酯制、平均孔径尺寸3.0jim、 Corning公司， NY )。
首先，在培#^上以约1 x 10"个/cn^的细胞密度播种3T3细胞悬浮液， 在371C、 5。/。C02的条件下培养。此外，在培养嵌套上将经刮除的上皮侧 朝上将羊膜基质静置贴附，在室温下干燥10分钟。其后，在贴附羊膜的 培养嵌套上分别以约1 x 104个/ 112的细胞密度播种角膜上皮细胞悬浮液。
以上操作后，如图1所示，在培#^内设置培养嵌套，在同一个培养 基中培养3T3细胞以及角膜上皮细胞。图l是表示培养中的状态的模式剖 面图。培养嵌套2静置于培养i 1内，在培养m 1底面形成3T3细胞层5。 此外，还显示了如下状态在培养嵌套2的底面上静置羊膜3，在其上培 养有角膜上皮细胞4。符号6为培养基。
使用如下培养基在DMEM/Ham，s F12混合培养基(混合体积比 1:1)中添加10%FBS、胰岛素(5mg/ml)、霍乱毒素(O.lnM)、青霉 素-链霉素(50IU/ml)、人重组上皮细胞生长因子(EGF) (10ng/ml)。
在上述的培养基中培养了约7天(Submerge),其后，为了分化诱 导粘膜上皮，利用所谓的空气上举(Air - lifting)法培养约3天。所谓 空气上举法是将培养基的液面达到在羊膜上形成的细胞层面为止，把该 细胞层的表面暴露在空气中的方法。Submerge中隔天更换培养基，空 气上举后每天更换培养基进行培养。
通过用以上的方法进行培养，大约10天(包括用空气上举法培养 的3天)就形成了 5~6层的多层化细胞层(培养角膜片)。
1-4-5.附着粘附成分
将以上结果得到的培养角膜片从培养液中取出之后，通过利用吹风 进行的风干使与其细胞层形成侧呈相反侧的表面(绒毛膜侧)形成半干 燥状态。接着，将半干燥状态的羊膜表面浸渍在纤维蛋白原、凝血酶及 抑肽酶的混合液(按与1-2-5.同样的顺序来制备)中，继续进行风
干，形成半干燥状态。在该一系列的作业中，将细胞培养面维持在湿润 状态。以上的操作结果，得到与形成细胞层的一侧呈相反侧的羊膜表面 附着有粘附成分的片状组合物(粘附剂附着-培养角膜片)。
1-5.制作粘附成分附着-细胞层形成羊膜片(2)(粘附成分附着-培 养表皮片)
在羊膜(无上皮)上形成来源于表皮角化细胞的细胞层，进而，按
以下的顺序制备在羊膜表面附着有粘附成分的片(以下也称为"粘附成 分附着-培养角膜片")。
1-5-1.去除羊膜上皮
将按上述顺序(1-2-1. ~1-2 - 3.)采取、保存的羊膜在室温 下解冻之后，用培养i内灭菌完的磷酸緩冲液(PBS)充分清洗。清洗 后在37"下于0.02 %EDTA溶液(Nacalai tesque公司)中保存2小时， 然后用细胞刮器(Nunc公司USA)机械地刮除上皮。使用这样得到的、 不含上皮的羊膜作为以下的细胞培养基质使用。
1-5-2.表皮角化细胞的制备
1-5-2-L皮肤的采取
预先对釆取部位预防性地用聚乙烯吡咯酮硪进行消毒、抗真菌剂的 外用涂布3天左右之后，依照皮肤活检采取小皮肤片.
1-5-2-2.表皮角化细胞的无血清培养法
用剪子从皮肤片中尽可能地剔除脂肪组织和真皮，用杜氏磷酸緩冲 液(PBS)清洗数次。在70%乙醇中浸泡1分钟来进行灭菌。用PBS 清洗后，切成宽3mm、长10mm左右的长方条状，浸于分散酶液(分 散酶II、合同酒精社、250单位/ml杜氏改良MEM培养基；DMEM) 中，在41C下静置一晚(18~24小时)。第二天，用镊子将表皮从真皮 上剥离。剥离得到的真皮用于成纤维细胞培养。把剥离得到的表皮用 DMEM清洗后，接着用PBS清洗，然后浸于0.25%胰蛋白酶溶液中， 在37'C下进行10分钟处理。用镊子将表皮转移到装有胰蛋白酶中和液 的塑料培养皿中，切碎表皮片，转移到50ml的灭菌管中。添加PBS， 调配表皮角化细胞悬浮液。计算细胞数，以1000rpm离心5分钟，使 细胞沉淀。吸出上清，用作为无血清培养基的MCDB153培养基悬浮细 胞，以每100mm胶原被覆培养皿(ASAHI TECHNO GLASS CORPORATION, I型胶原被覆试皿；4010-010) 2 ~ 3xl06细胞/10ml 培养液的比例进行播种。第二天更换培养液，以后隔l天更换一次培养 液。在细胞密度达到70~80%左右时进行传代培养。
1-5-3.制备成纤维细胞
将剥离得到的真皮用DMEM清洗后，用手术刀细切，使得一边为 l~2mm。把细切得到的真皮片在I型胶原被覆试皿中以约lcm的间隔 使其附着。在CO2孵育箱中静置30分钟，使其完全附着。其后，添加 含有10%胎牛血清的DMEM培养基约5ml，静置7天。第7天进行第 一次培养液更换。确认成纤维细胞从真皮片中游离出来。细胞增殖，在 游离到真皮片周围5mm的阶段进行传代。用PBS清洗后，添加3ml 含有0.125%胰蛋白酶、0.05V。EDTA的溶液，在371C下处理3分钟。 用显微镜确认细胞从试皿底面剥离后，添加3ml胰蛋白酶抑制剂，回收 细胞，移到50ml的管里。用PBS回收残余细胞，以1000rpm离心处理 5分钟，使细胞沉淀，吸出上清后，添加含10%胎牛血清的DMEM培 养基，调配细胞悬浮液，播种于细胞培养用试皿中。传代细胞的密度设 为大约1:3左右。适当冻存细胞。使用含10 %甘油、20%FCS 、 70%DMEM 的冻存液，在液氮中保存。
1-5-4.中和胶原凝胶的制作
相对于6体积的l型胶源溶液(细il&^质型1A: 3mg/ml:新田明胶)， 以1体积的0.1N的NaOH、 1体积的8倍浓度DMEM、 10体积的20% FCS/DMEM比例在41C下制作中和胶原液(胶原的最终浓度lmg/ml )， 向直径24mm的培养嵌套(Corning-Costar公司)中各添加lml,在室温 下静置10分钟，使其^l^化。将预先培养好的对数增殖期的成纤维细胞(由 经分歉酶处理、剥离表皮的残存真皮，用outgrowth法进行培养，使用传 代5-10代的细胞)调配为5 x 105细胞/1111、 10%FCS/DMEM的浓度，相 对于2体积的该细胞悬浮液，以8体积的中和胶原液的比例进行混合，调 制包含细胞的中和胶原溶液(胶原的最终浓度0.8mg/ml)。每培养嵌套中 各添加该溶液3.51111，在C02孵育箱内(37X:、 5%<:02)中静置。约30分钟
后确i^^化。其后，加入10。/oFCS/DMEM到浸没:^J欧的程度(培养嵌 套内侧加3ml，培养嵌套外侧加3ml)，静置培养5天。培养第2 M皿 开始收缩，在相位差显^t镜下可以观察到成纤维细胞的增殖。
l-5-5.粘附羊膜
培养开始5 ^J^JI^^皿的底面附着于膜，而^^^上部收缩，其 厚度变成2 3mm。将M的羊膜(按与1-3 - 1.相同的顺序制备的、去 除了上皮的羊膜)用PBS清洗2次，再用角化细胞用培养液清洗l次。把 羊膜的实质细胞侧朝下移到培养嵌套中，用镊子使其与J!^^亂欧附着.用 镊子展平以使之不起皱，在培养嵌套的侧壁上附着羊膜的周边。移到co2 孵育箱内，在37TC下静置30分钟。
1-5-6.角化细胞的播种
将在1 - 5 - 2.中制成的角化细胞用胰蛋白酶 EDTA从^a上剥离、 回收。以1000rpm离心5分钟，吸出上清，以200万个/(K25ml的浓度悬 浮细胞。在培养嵌套内侧的羊膜上播种0.25ml的细胞悬浮液，移到C02 孵育箱内，为使角化细胞附着在羊膜，在孵育箱中静置1.5~2.0小时，然 后将lml表皮细胞增殖用培养M緩地添加到培养嵌套内侧，进一步向培 养嵌套外侧添加lml。第二天^JJC细胞增殖用培养M慢地追加到培养 嵌套内侧，进一步向培养嵌套外侧^1> lml。
l-5-7.气相下培养
将表皮细胞播种于羊膜后第3天实施空气曝露(空气上举)。在用于空 气膝露的维持容器中设置经灭菌的滤纸，把多层化用培养基添加到浸没滤 纸的程度(约9ml)。非常仔细地去除在培养嵌套内侧的培养液，M养嵌 套移到滤纸上，在C02孵育箱中进行培养。每隔一天更换培养液.经7~ 14天的空气膝露完成三维培养皮肤。多层化用培养液的调配如下。杜氏改 良MEM培养基F画12培养基-l:l、钾浓度1.95mM、乙醇胺O.lmM、 邻裤酸乙醇胺O.lmM、胰岛素5ug/ml、氢化可的松0.4ug/ml、 L-谷 氨酖胺4mM、腺噤呤0.18mM、转铁蛋白5ug/ml、亚硒酸53nM、 三碘甲状腺原氨酸20pM、丝氨酸lmM、氯化胆碱0.64mM、亚油酸 2ug/ml、 FCS: 2%。
以上操作结果所得到的培养表皮片容易从试皿底面或从l^f基质上剥
离。在以往的技术中发生片收缩，因此有必要将甲壳质膜(BESCHITIN W) 作为支持体使用，还有很多破损情况，通过以上的方法可制作坚固的片， 由于没有片的收缩，因而不需JH吏用支持体。
用以上的方法制成培养表皮片，结果在空气膝露后第7天表皮形成 5~8层，可确认角层形成，呈现与正常人皮肤几乎同样的构造。多层化 的角化细胞的组织观察确认可看到一层的基底细胞样细胞和在其上 5~8层的多层化的分化的细胞构建。用传代3代的细胞制作培养表皮片 时，在采取皮肤后约4周可以使用培养表皮片，通过计算，培养面表面 积增加到数千倍。
制成的培养表皮片与载体一起或者无载体、用少量的保存液就可以 进行冻结。具体地说，首先，用-80"的制冷器进行冻存，第二天，用 -150"的超低温制冷器进行保存。在-150。C的保存中，能够长期以片 形保存，实际上可得到充分的治疗效果。此外，还可以使用在活体组织 保存中使用的保存液在4"下保存，在这种情况下，优选预先添加抗氧 化物质。
1- 5-8.附着粘附成分
将从胶原基质中剥离得到的培养表皮片取出之后，通过利用吹风进 行的风干使与该细胞层形成侧呈相反侧的表面形成半干燥状态。接着， 将半干燥状态的羊膜表面浸渍在纤维蛋白原、凝血酶及抑肽酶的混合液 (按与1-2-5.同样的顺序来制备)中，继续进行风干，形成半干燥 状态。在该一系列的操作中，将细胞培养面维持在湿润状态。以上的操 作结果，得到与形成细胞层的一侧呈相反侧的羊膜表面附着有粘附成分 的片状组合物(粘附成分附着-培养表皮片)。
2.使用粘附成分附着片的移植实验
2- 1.应用于猪眼巩膜
对于粘附成分附着-带上皮的羊膜片(1-2-5.)的粘附性，以猪 巩膜为应用部位进行研究。
采用因食用而屠宰的猪的眼(死后经过约6-10小时)的组织。使 用剪子从该猪眼切除结膜，使巩膜露出(棵露的状态)。治疗翼状胬肉 时，通常是剥离异常结膜，并用正常结膜被覆结膜去除部位，经如上所 述处理的猪眼被广泛用作翼状胬肉的临床模型。
作为移植用片，使用粘附成分附着-带上皮的羊膜片(1-2-5.)。 移植用片的应用方法如下。首先，用棉棒擦拭经实施上述处理的猪眼的 巩膜表面的水分，使组织处于半干燥状态。在此，通过目视观察来判断， 以看不到细小水滴的程度为标准。在该巩膜上，以干燥状态直接载置在 1-2-5.中制备的粘附成分附着-带上皮的羊膜片，使其粘附成分附 着面侧朝下。接着，使用镊子轻压片， 一边注意不让气泡进入一边使全 部区域与巩膜接触。通过以上的操作，片上附着的粘附成分被巩膜上残 存的微量水分润湿，而使组织与片粘附。
栽置片一周后进行以下的两个试验，评价粘附性。
(1) 移动试验用棉棒压，沿水平方向施力，研究片是否从组织 上偏移。
(2) 牵拉试验用镊子夹住片，沿垂直方向施力，研究片是否从 组织上剥离。
研究的结果表明，片没有偏移、剥离现象，确认良好的粘附性。
接着，为了研究粘附成分的量与粘附性的关系，准备多片附着粘附 成分量不同的片，按与上述同样的顺序实施移植及粘附性的评价。评价 结果示于图2的表中。表中的纤维蛋白原量为每1 112片的附着量。表 中的+表示片既没有偏移也没有剥离，-表示片偏移(即使有少许偏移 也评价为—)。在此，调整凝血酶附着量及抑肽酶附着量，使得全部试 验组的附着成分比率(纤维蛋白原附着量凝血酶附着量抑肽酶附着 量)相同。
如图2的表所示，只要纤维蛋白原附着量为0.5mg/cm2 (凝血酶附 着量12吗/cm2、抑肽酶附着量0.12KIU/cm2)以上，则片不会从组 织偏移、剥离，认为有非常良好的粘附性。即，纤维蛋白原附着量如果 为0.5mg/cm2，则表明可以获得充分的粘附性。
2-2.应用于兔子巩膜
对于粘附成分附着—无上皮的羊膜片(1 - 3 - 1.)的粘附性及作用， 以兔子巩膜作为应用部位来进行研究。
首先，将兔子麻醉，用剪子切除眼结膜约lxlcm，使巩膜露出(棵 露的状态)，制作翼状胬肉模型。接着用棉棒擦拭巩膜表面的水分及血 液，使巩膜表面成半干燥。收集出血，以通过目视观察看不到水分为标 准，直到片即将应用之前进行干燥作业。
在该巩膜上，以干燥状态栽置在1-3-1.中制备的粘附成分附着 -无上皮的羊膜片，并使其粘附成分附着面侧朝下。接着，使用镊子轻 压片， 一边注意不让气泡进入一边使全部区域与巩膜接触。试验期间， 对兔子给予抗菌剂(Tarivid软骨)、甾体类制剂(Rinderon软骨)，一 天一次。
施术后，为了研究片的粘附性及生理作用，实施采用照相机拍摄的 表面观察(从片移植之日起第1、 2、 4周)。照相机拍摄按以下的顺序 实施。将兔子麻醉后，用Medical Nikol ( Nikon公司制)或Slit Lamp
(OLYMPUS公司制)拍摄片^A部位。此时的观察项目为片的残存、 有无血管新生、有无炎症这3项。接着滴加一滴荧光素，观察片上有无 上皮被覆。移植4周后采取片应用部位的组织，通过免疫染色来研究片
(羊膜)的粘附、残存、纤维蛋白原的残存。
研究结果表明，本片移植后立即粘附于巩膜，移植第1周，在片(羊 膜)移植部的全部区域发生上皮化。另一方面，没有观察到血管新生及 炎症的发生。在第2、 4周，片也维持粘附状态、并维持上皮化的状态。 在第2、 4周，也没有观察到血管新生及炎症。此外，由免疫染色的结 果可知，在第4周纤维蛋白原被生物降解。另一方面，羊膜残存在巩膜 上。此外，在羊膜上确认正常的上皮化，结膜的被覆也正常。综合以上 的结果，通过本片的应用，可判定1.可获得充分的粘附性，2.上皮 化正常发生，3.不诱发血管新生及炎症，4.片上附着的纤维蛋白原至 少4周以内被生物降解，5.结膜的被覆正常发生。由此可知，本片可 以发挥作为眼表面再建用移植材料的令人满意的作用。
2-3.应用于兔子角膜
对于粘附成分附着-培养角膜片(1-4-6.)的粘附性及作用，以 兔子角膜为应用部位进行研究。
对于家兔，使用月型刀从距离缘部4mm的外侧将角膜和结膜上皮 以100nm的厚度全部去除。通过该操作，由于含有角膜上皮干细胞的 上皮细胞消失，所以可认为再现人为的眼表面干细胞疲条症。接着，将 粘附成分附着-培养角膜片从缘部移植到稍内侧的区域。术后，涂布抗 菌剂(Tarivid软骨)和甾体类制剂(Rinderon软骨)，1次/天。
片移植后立即粘附于眼表面。此外，移植后第4周还维持粘附性。 另一方面，血管新生及炎症的产生为轻度。
2-4.应用于皮肤
对于粘附成分附着-培养表皮片(1-5-8.)的粘附性及作用，可 以把兔子皮肤作为应用部位按以下的顺序来进行研究。
首先，将兔子背的一部分剃毛后，剥离该部分的表皮。接着，移植 粘附成分附着-培养表皮片(1-5-8.)。移植后，轻压片，使其与全 部区域接触。术后，进行抗菌剂的外用涂布， 一天一次。通过观察移植 后的粘附状态及粘附状态的经时变化，可以评价本片的粘附性及作用。
产业上的利用可能性
本发明提供的片状组合物可用作组织再建用的移植材料等。本发明 的片状组合物的应用领域可举出眼科领域、消化器官外科领域、妇科领 域、皮肤科领域。
本发明的片状组合物的粘附性优异。因此，应用后在短时间内就粘 附于周围组织，而且可期待长期维持良好的粘附状态。因此，不并用缝 合等也可获得高的治疗效果。根据应用对象的不同即使要求更高粘附 力、认为应当并用缝合等的情况下，也可以用比较简便的方法来处理， 可以减轻医生及患者的负担。
该发明不限于上述发明的实施方式及实施例的说明。在不超出权利
要求书的记栽、本领域技术人员能容易想到的范围内，各种变形方式都包 括在发明中。
本说明书中写明的论文、公开专利公才ML专利公报等的内容，通过援 引其全部内容而引用。
(1) 本发明第17项所述的制作方法，其中，上述步骤A包括以下的
步骤
(A-l)制备活体来源的细胞的步骤；
(A-2)在上述羊膜上播种上述活体来源的细胞的步猓；
(A-3)培养经播种的上述活体来源的细胞而使其增殖的步骤。
(2) 本发明第17项所述的制作方法，其中，上述步骤A包括以下的
步骤
(A-l)制备活体来源的细胞的步骤；
(B) 在JiL^皿内培养人成纤维细胞的步骤；
(C) 在上述J&^皿上栽置上述羊膜后，在该羊膜上播种上述活体来源 的细胞的步骤；
(A，3)培养经播种的上述活体来源的细胞而使其增殖的步骤。
(3) 如上述(1)或者上述(2)所述的制作方法，上述步骤A-3在 不存在异种动物细胞的条件下实施。
U)如上述(l) ~上述(3)中任一项所述的制作方法，进一步包括 以下的步骒
(A-4)上述活体来源的细胞增殖之后，使*^层与空气接触的步骤。
(5如上述(1) ~上述(4)中任一项所述的制作方法，上述步骤A-3 使用无血清培养基来实施。
(6) 如上述(1) ~上述(4)中任一项所述的制作方法，上述步骤 A-3使用仅含有来源于受者的血清的培养基作为血清成分来实施。
(7) 如本发明第17项及上述(1) ~ (6)中任一项所述的制作方法， 上述活体来源的细胞为角膜上皮、结膜上皮、皮M皮、毛嚢上皮、口腔 粘膜上皮、虹膜色素上皮、视网膜色素上皮、呼吸道粘膜上皮或者肠管粘 膜上皮来源的细胞。
权利要求
1、一种片状组合物，具有表面附着纤维蛋白原及凝血酶的羊膜。
2、 如权利要求1所述的片状组合物，在所述羊膜中，所述纤维蛋 白原及所述凝血酶的附着面为干燥状态。
3、 如权利要求2所述的片状组合物，所述羊膜为干燥状态。
4、 如权利要求l-3中任一项所述的片状组合物，所述羊膜的表面 进一步附着抑肽酶。
5、 如权利要求1~4中任一项所述的片状组合物，所述羊膜为去除 了上皮的羊膜。
6、 如权利要求5所述的片状组合物，在所述羊膜上形成含有活体 来源的细胞的细胞层，在与该细胞层形成面呈相反侧的羊膜表面上附着 所述纤维蛋白原及所述凝血酶。
7、 如权利要求6所述的片状组合物，所述活体来源的细胞为角膜 上皮、结膜上皮、皮肤表皮、毛囊上皮、口腔粘膜上皮、虹膜色素上皮、 视网膜色素上皮、呼吸道粘膜上皮或者肠管粘膜上皮来源的细胞。
8、 如权利要求1~7中任一项所述的片状组合物，所述纤维蛋白原 的附着量为每lcm2所述羊膜0.5mg ~ 20mg。
9、 如权利要求1~8中任一项所述的片状组合物，所述凝血酶的附 着量为每lcm2所述羊膜ljig ~ lmg。
10、 如权利要求l-9中任一项所述的片状组合物，厚度为10jim-200,。
11、 如权利要求1~10中任一项所述的片状组合物，其对于人組织 具有粘附性，移植时不需要缝合。
12、 一种片状组合物的制作方法，包括以下的步骤(a) 制备羊膜的步骤；(b) 在所述羊膜的表面附着纤维蛋白原及凝血酶的步骤。
13、 如权利要求12所述的制作方法，进一步包括以下的步骤(c) 步骤b之后，进行干燥处理的步骤。
14、 如权利要求12或13所述的制作方法，进一步包括以下的步骤 (b-l)在所述羊膜的表面附着抑肽酶的步骤。
15、 如权利要求12~14中任一项所述的制作方法，所述步骤a包括以下的步骤(a-l)从羊膜上去除上皮的步骤。
16、 如权利要求12~15中任一项所述的制作方法，所述步骤a包 括以下的步骤(a-2)使羊膜干燥的步骤。
17、 如权利要求12~16中任一项所述的制作方法，在所述步骤a 与所述步骤b之间，实施以下的步骤(A)在所述羊膜上形成含有活体来源的细胞的细胞层的步骤。
全文摘要
本发明提供一种可应用于广泛用途、而且通过简便的移植手术就能够移植的片状组合物。其是在羊膜的表面附着纤维蛋白原和凝血酶的片状组合物。在其一种实施方式中，在与粘附成分附着侧呈相反侧的羊膜上形成细胞层。
文档编号A61L27/00GK101102800SQ20068000224
公开日2008年1月9日 申请日期2006年1月11日 优先权日2005年1月14日
发明者中村隆宏, 栗原英司, 羽室淳尔 申请人:阿如布勒斯特有限公司