专利名称：：通过引起rna干扰的化合物治疗肠病症的制作方法
技术领域：
：本发明涉及通过RNAi直肠内给药技术对肠疾病进行治疗的方法和组合物。本发明的组合物包括短干扰核酸分子(siNA)和相关的化合物，包括但不限于，小干扰RNAs(siRNA)。具体地说，本发明的组合物能够被用于肠疾病的治疗，其中包括过度增殖性疾病，特别是结肠直肠癌；自身免疫和炎性肠病(IBD)，特别是局限性回肠炎；结肠炎，特别是溃疡性结肠炎；肠易激综合征；感染性肠疾病，例如假膜性结肠炎，阿米巴病或肠结核；结肠息肉；憩室病；便秘；肠梗阻；吸收不良综合征；直肠疾病和腹泻。在某些实施方案中，由一种与1型辅助T(Thl)细胞免疫反应相关的细胞因子——白细胞介素-12(IL-12沐平的增高所引起的肠病症，例如自身免疫疾病和IBD，是用此方法来进行治疗的。本发明提供了治疗与IL-12过量表达有关的疾病的组合物和方法，特别是局限性回肠炎，其中包括siRNA和耙向IL12-p40亚基和/或IL12-p35亚基的相关化合物。
背景技术：
：以RNAi作为工具来调节基因的表达RNA干扰是指由双链RNA(dsRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程。在20世纪90年代初期发现了植物具有此现象后，AndyFire和CraigMello证明了在Cae"oAak//to线虫中dsRNA能够以一种非常高效的方式特异性地、有选择性地抑制基因的表达(Fireetal.，1998)。第一条链(有义RNA)的序列与目标信使RNA(mRNA)的对应区域的序列相一致。第二条链(反义RNA)与mRNA互补。这样形成的dsRNA证明比相应的单链RNA分子(具体地说，反义RNA)的效率高几个数量级。RNAi过程起始于DICER酶与dsRNA相遇并将其切成称为小干扰RNAs或siRNA的片段。此蛋白质属于核糖核酸酶III核酸酶家族。蛋白质复合体将这些siRNAs聚集起来，并利用它们的编码作为指导去搜寻和破坏细胞中具有匹配序列的RNA，例如目标mRNA(见Bosher&Labouesse，2000;禾卩Akashietal"2001)。在应用RNAi进行基因击倒的尝试中，经过验证，哺乳动物细胞已经发展了多种抗病毒感染的保护机制，其可阻碍这种方法的使用。的确，极低的病毒dsRNA水平的存在触发一种干扰素的反应，导致全面非特异性的翻译抑制，进而触发调亡(Williams，1997，Gil&Esteban,2000)。2000年，dsRNA被报道特异性地抑制小鼠卵母细胞和早期胚胎中的3个基因。翻译停滞，和从而引起的PKR反应，当胚胎继续发育时没有被观察至U(Wianny&Zernicka-Goetz,2000)。RibopharmaAG(Kulmbach，Germany)的研究证明了哺乳动物细胞中RNAi的功能性，其功能在于利用短(20-24碱基对)dsRNAs切断人类细胞基因，而又不启动急性期反应。其他的研究小组也进行了类似的试验，并验证了这些结果(Elbashira2001;CaplenW"/.,2001)。经过在人类和小鼠的多种正常和癌症细胞品系中的测试证明短发夹结构RNAs(shRNAs)能够和它们的siRNA负体同等高效率地使基因沉默(Paddisonetal.，2002)。最近，另外一组小RNAs(21-25碱基对)被显示能够引起对基因表达的负调节作用。这些RNAs，即小时序控制的RNAs(stRNAs)，对Cae朋Aa6A^线虫发育过程中基因表达的时间选择具有调节作用(关于综述参见Banerjee&Slack,2002;和Grosshans&Slack,2002)。科学家们已经在一些系统中使用了RNAi,其中包括C"em^"k/to线虫，果蝇，锥体虫，和其它的无脊椎动物。几个研究小组近期提出了RNAi在不同的哺乳动物细胞系(特别是HeLa细胞)中对蛋白质生物合成的特异性抑制，从而证明了RNAi是一种可广泛应用的在体外使基因沉默的方法。在这些结果的基础上，RNAi已经快速地成为了一种著名的确认(识别和分配)基因功能的工具。使用短dsRNA寡核苷酸的RNAi有助于对仅被部分测序的基因功能的理解。最近，Krutzfeldt和他的同事们的研究显示一类被称为antagomirs的特别设计合成的化合物能够有效地使微小RNAs(miRNAs)沉默，其中微小RNAs为控制基因表达的非编码RNA片段(Krutzfeldtetal.，2005)。前文所述内容是对与RNAi有关的相关技术的讨论。提出这个讨论仅仅是为了对下文所述之发明的理解，但并不承认所描述的任何工作是对本发明的现有技术。白细胞介素-12和局限性回肠炎白细胞介素-12(IL-12)是一种70kDa的异源二聚体糖蛋白(IL12-p70)，由一个40kDa的亚基(命名为IL12-p40)和一个35kDa的亚基(命名为IL12-p35)通过对IL-12的生物活性具有重要意义的二硫键的连接而组成。IL-12是控制细胞介导的免疫反应和1型辅助T(Thl)细胞炎性反应的关键细胞因子(Gatelyetal.，1998;Trinchieri,1998)。IL-12对Thl细胞发育的强促进作用使它成为在对Thl细胞介导的疾病，例如自身免疫疾病和炎性肠病(IBD)，进行治疗时理想的靶标。一种特殊的IBD是局限性回肠炎，其病理学特征在于由肠组织中抗原呈递细胞引起的IL-12生成量的增加，以及由肠淋巴细胞和巨噬细胞引起的干扰素-Y和肿瘤坏死因子-a(TNF-a)生成量的增加(Faisetal.，1994;Fussetal"1996;Monteieoneetal.，1997;Parronchietal.,1997;Pievyetal.，1997)。局限性回肠炎会引起小肠炎症。此炎症能够引起疼痛，并能够频繁地引起肠空虚，进而引起腹泻。尽管也有可能出现直肠出血、体重减轻和发烧的症状，但局限性回肠炎最常见的症状是腹痛和腹泻。出血症状可能是严重而持久的，从而导致贫血。患有局限性回肠炎的儿童可能会遭受延迟发育和矮小生长的痛苦。大多数人是首先通过含有一种帮助控制炎症的物质5-氨基水杨酸的药物进行治疗的。最常使用的药物是柳氮磺吡啶。病情不能得到改善或不能忍受此药物的患者可以接受其它含5-氨基水杨酸的药物的治疗，普遍使用的是5-ASA剂，例如美沙拉秦片,Dipentum或颇得斯安。5-氨基水杨酸制剂可能的副作用包括恶心、呕吐、腹泻和头痛。有些患者使用皮质类固醇来控制炎症。这些药物是对活性局限性回肠炎最为有效，但是它们能引起严重的副作用，其中包括对感染更高的易感染性。一些抑制免疫系统的药物也被用于治疗局限性回肠炎。最普遍的处方是6-巯基嘌呤和一种相关药物一一硫唑嘌呤。免疫抑制剂是通过阻断引起炎症的免疫反应而起作用的。这些药物可能导致如恶心、呕吐和腹泻的副作用，并可能降低人体对感染的抵抗力。手术切除部分肠子能够对局限性回肠炎有所帮助，但并不能治愈它。由于当前对局限性回肠炎治疗方法的副作用以及疗效的缺乏，研究人员继续寻找更加有效的治疗方法。对IL-12作用的抑制已经被显示能够在许多自身免疫和慢性炎症的实验模型中抑制疾病的发展和临床进程(Caspi,1998)。这些模型包括实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE)、实验性自身免疫眼色素层炎(EAU)、胶原质诱导的关节炎(CIA)、自身免疫肾炎、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)和IBD的不同模型(Vandenbroecketa1.,2004)。在这些模型中，内生IL-12的角色已经通过IL-12p40敲除小鼠或通过施用抗IL-12抗体而被提出了。具体地说，在患局限性回肠炎的动物模型中抗体靶向IL-12是一种对肠炎症有效的治疗(Mannonetal.，2004)。因此，患有由三硝基苯磺酸盐诱导的结肠炎的小鼠具有Thl介导的肠炎症，其特征在于IL-12、干扰素-Y和肿瘤坏死因子-ci(TNF-a)生成量的大量增加。在小鼠中，对抗IL-12的单克隆抗体的使用能够引起已形成的结肠炎消退，并且如果引起结肠炎的时刻使用，能够阻止炎症的形成(Neurathetal.,1995)。抗白细胞介素-12还能够阻止和治疗出现在由Thl介导产生炎症的模型中的自发性结肠炎，这种模型例如包括过量表达人类CD3e基因的小鼠和白细胞介素-10缺陷型小鼠(Davidsoneta1.，1998;Simpsonetal.，1998)。从较早2期研究获得的数据提供了一些用抗IL-12p40的单克隆抗体进行治疗并使局限性回肠炎的患者产生临床反应和康复的证据(Mannonetal.,2004)。这种治疗与在疾病位点上由Thl介导的炎性细胞因子的减少有关。以前从动物模型中获得的证据，以及抗IL-12在局限性回肠炎患者中的临床效果(Mannonetal.，2004)，都强调了IL-12作为目标对未来局限性回肠炎的治疗的重要性。依靠siRNA对IL-12水平的调制靶向IL-12表达的siRNA已经被用于获得修饰的树突细胞(DC)。这种修饰的树突细胞(DC)可以被用于通过多种治疗学的体夕卜、先体外后体内(exwVo)和体内的方法来调节T细胞活性，因此已经被用到治疗动物实验体的免疫紊乱的治疗方法中(WO03/104456;Hilletal.,2003)。在成熟的DC中靶向IL-12表达的siRNA已经显示了IL-12在由成熟DC促进的自然杀伤细胞干扰素Y(IFN-Y)分泌上关键性的作用(Borgetal，2004)。此夕卜，IL-12p35抑制因子，包括siRNA，已经令人惊讶地证明能够阻断前脂肪细胞到脂肪细胞的分化以及脂肪细胞中甘油三酸酯的积累(WO03/104495)。靶向IL-12p40的siRNA通过脂质体包囊作用被成功地传递到鼠类腹膜腔，以调节经内毒素挑战后的局部和全身的炎症反应(Flynnetal.，2004)。然而，据我们所知，并不存在早期关于直肠内施用siRNA对IL-12的负调节作用的证据，也没有涉及到肠病理学的任何其它基因的证据。我们已经研制了在体内对IL-12表达进行负调节的技术，以用于治疗肠紊乱；我们还研制了通过直肠内给药使siRNA靶向肠的技术。发明概述本发明提供了利用直肠内施用RNAi技术治疗肠疾病的方法和组合物。本发明的组合物包括短干扰核酸分子(siNA)和相关的化合物，包括但不仅限于，siRNA。具体地说，本发明的组合物能够被用于制备药物以治疗肠疾病，其中包括增殖疾病，特别是结肠直肠癌；自身免疫和炎性肠病(IBD)，特别是局限性回肠炎；结肠炎，特别是溃疡性结肠炎；肠易激综合征；感染性肠疾病，例如假膜性结肠炎，阿米巴病或肠结核；结肠息肉；憩室病；便秘；肠梗阻；吸收不良综合征；直肠疾病和腹泻。本发明包含使用siNA的组合物和方法，其中siNA包括但并不仅限于短干扰RNA(siNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNAs(miRNAs)、antagomirs和能介导RNA干扰现象的短发夹结构RNA(shRNA)分子。本发明的方法包括对有需要的患者施用有效量的一种或多种本发明所述的siNA来治疗肠病症。在优选的实施方案中，本发明的方法包括治疗剂siNA的直肠内施用。在一个实施方案中，本发明与siNA或相似的化学合成实体有关，这些实体被指定用于干扰细胞因子IL-12的p35或p40亚基mRNA表达并最终调节蛋白质的生成量。包含上文提到的siRNA和相关化合物的组合物和方法被计划用于治疗与IL-12过量表达有关的疾病，例如自身免疫疾病和炎性肠病(IBD)，特别是局限性回肠炎。附图简述图1本发明所包括的靶向IL-12p35和p40亚基的siRNA分子的寡核苷酸序列。图中所示SEQIDNo涉及有义链(5'》3');典型的是siRNA将被作为dsRNA来施用，因此将包括有义链和它的互补链。图2在体外系统中siRNA对IL-12p35亚基表达的作用。siRNA处理降低IL-12p35基因的转录水平。RNA由经过不同时间siRNAs处理的SW480细胞制备而来。利用特异性引物通过RT-PCR来分析样品。数据显示的是不同的转录在以18S作为管家基因进行标准化后的平均表达水平。图3在体外系统中siRNA对IL-12p40亚基表达的作用。A:siRNA处理降低IL-12p40基因在人类细胞中的转录水平。RNA由SW480细胞经过不同时间的剂量为200nM的siRNASEQID67禾BSEQID79的处理制备而来。这些数字显示的是不同的转录在以18S作为管家基因进行标准化后的平均表达水平，以及siRNA干扰后标准化后的mRNA水平相对于对照组基因表达的平均百分数和中间标准误差(SEM)。B:siRNA处理降低IL-12p40基因在鼠科动物细胞中的转录水平。RNA由C2C12细胞经过不同时间的剂量为100nM的siRNASEQID86禾QSEQID87的处理制备而来。SEQID86同源于人类SEQID67，且靶向鼠类IL-12p40亚基。此外靶向鼠类IL-12p40亚基的SEQID87是鼠类中评分最高的siRNA，并且它不具有人类siRNA的同源二聚体。siNA分子SEQID86和SEQID87描述如下，具有2个胸腺嘧啶核苷酸3'突出端。数值代表的是siRNA干扰后用18S标准化的mRNA水平相对于对照组基因表达的平均百分数和中间标准误差(SEM)。图4siRNA处理降低GFP基因在小肠中的转录水平。从OCT中收集的组织利用显微镜方法来进行分析，并利用Photoshop软件进行测量。数据显示了单剂量siRNA的处理(小鼠2-3)和重复剂量siRNA的处理(小鼠4-5)。数据显示了每只小鼠的25张典型图片与未经处理的小鼠对照组相比较后的表达水平。图中还显示了数据的标准误差。图5siRNA处理降低GFP基因在小肠中的转录水平。从RNAlater中收集的组织通过RT-PCR进行分析。数据显示了单剂量siRNA的处理(小鼠2-3)和重复剂量的处理(小鼠4-5)。图中还显示了标准误差。图6siRNA处理降低GFP基因在大肠中的转录水平。从OCT中收集的组织利用显微镜方法来进行分析，并利用photoshop软件进行测量。数据显示了单剂量siRNA的处理(小鼠2-3)和重复剂量的处理(小鼠4-5)。数值显示了每只小鼠的25张典型图片与未经处理的小鼠对照组相比较后的表达水平。图中还显示了数据的标准误差。fe7siRNA处理降低GFP基因在大肠中的转录水平。从RNAlater中收集的组织通过RT-PCR进行分析。数据显示了单剂量siRNA的处理(小鼠2-3)和重复剂量的处理(小鼠4-5)。图中还显示了标准误差。图8从OCT媒介(medium)中收集的样品的数据。图9从RNAlater媒介中收集的样品的数据。发明详述本发明涉及利用直肠内施用RNAi技术来治疗肠疾病的方法和组合物。本发明的组合物包括了调节与肠内壁病症有关的耙基因表达的短干扰核酸分子(siNA)。本发明的方法包括对有需要的患者施用有效量的一种或多种本发明所述的siNA。siRNA的设计根据本发明，例如当siNA选择性地降低或阻止一个基因的表达时，该基因被siNA"靶向"。或者，当siNA在严格的条件下与基因的转录物杂交时，siNA靶向该基因。siNA在体外或体内都具有能够进行测试其耙向基因的能力。在1999年，Tuschl等解译了siRNAs的沉默作用，显示出它们的效率是一个与二聚体的长度、3'末端突出端的长度以及这些突出端的序列有关的函数。在靶向基因中选择同源区域的正确性与沉默效应的精确性具有很大的相关性。一个目标基因序列的短片段(例如，长度为19-40个核苷酸)被选择来作为本发明所述的siNA的序列。在一个实施方案中，这个siNA是siRNA。在这个实施方案中，目标基因序列的短片段是目标基因mRNA片段。在优选的实施方案中，从目标基因mRNA中选择序列片段作为siRNA分子候选者的标准包括1)一个由从天然mRNA分子的5'或3'末端含有至少50-100个核苷酸的目标基因mRNA得到的序列；2)—个由G/C含量在30%和70°/。之间，最优为大约50%的目标基因mRNA得到的序列；3)一个由不含有重复序列(例如，AAA,CCC,GGG，TTT，AAAA,CCCC,GGGG，TTTT)的目标基因mRNA得到的序列；4)一个由在mRNA中易接近的目标基因mRNA得到的序列；和5)—个由对于该目标基因唯一的目标基因mRNA得到的序列。目标基因mRNA的序列片段可以达到一种或几种上述识别标准，在优选的实施方案中，siRNA的G/C含量低于60%并且/或者缺乏重复序列。实际上，目标基因在一个预测程序中作为核苷酸序列被提出。这个预测程序考虑了上文所描述的用于设计最佳寡核苷酸的所有变量。此程序扫描允许被siRNA靶定的区域中任意的mRNA核苷酸序列。此分析的输出为可能的siRNA寡核苷酸的分数。最高的得分被用于设计典型地以化学合成制备的双链RNA寡核苷酸(尽管其它长度也有可能，但典型的长度为21bp)。我们计划测试一些本领域公知的化学修饰。这些修饰是以提高dsRNA寡核苷酸的稳定性或可用性为目的的。寡核苷酸候选者能够进一步地根据种间序列的保守性进行过滤，以促进从动物到人类临床研究的转变。除与目标区域完全互补的siNA之外，简并的siNA序列可以被用于耙向同源区域。WO2005/045037描述了耙向这样的同源序列的siNA分子的设计，例如通过惨入不规范碱基对，比如错配和/或摆动碱基对，以提供额外的目标序列。例如在错配被确定的位置，不规范碱基对(如错配和/或摆动碱基)能够用于产生靶向多于一个基因序列的siNA分子。在一个非限制的例子中，不规范碱基对，如UU和CC碱基对，被用于生成具有耙向共享序列同源性的不同目标序列能力的SiNA分子。同样地，利用本发明所述siNAs的一个优势是单个siNA能够被设计为包含与在同源基因中保守的核苷酸序列互补的核酸序列。通过这种方法，使用单个siNA，而不是使用多个siNA分子，就能够抑制多于一种基因的表达，从而靶向不同的基因。序列的同一性可以由在本领域中熟知的序列比较和比对运算法则(见Gribskov和Devereux，《序列分析引物》，StocktonPress,1991，以及其中引用的参考文献)，以及通过例如在BESTFIT软件中用默认参数执行的计算核苷酸序列间百分比差异的Smith-Waterman运算法则来计算(例如，Wisconsin大学遗传计算小组)。优选的是在siNA和目标基因部分之间高于90%,95%,或99%的序列同一性。或者，siNA和天然RNA分子间的互补性可以通过杂交被功能性地定义，也可以通过它降低或抑制目标基因表达的能力来功能性地定义。siNA影响基因表达的能力能够在体内或体外以经验来确定。本发明中优选的siNA分子是双链结构的。在一个实施方案中，双链siNA分子含有平头末端。在另一个实施方案中，双链siNA分子含有突出的核苷酸(例如，l-5个核苷酸的突出端，优选为2个核苷酸的突出端)。在一个特殊的实施方案中，突出的核苷酸为3'突出端。在另一个特殊的实施方案中，突出的核苷酸为5'突出端。任何类型的核苷酸能够成为突出端的一部分。在一个实施方案中，突出的核苷酸是核糖核酸。在另一个实施方案中，突出的核苷酸是脱氧核糖核酸。在优选的实施方案中，突出的核苷酸是胸腺嘧啶核苷酸。在另一个实施方案中，突出的核苷酸是修饰的或非经典型核苷酸。这些突出的核苷酸可能含有非经典型核苷酸间键(例如除去磷酸二酯键以外的其它键)。siNA二聚体的合成siNA能够通过本领域内任何已知的方法合成。RNA更优选利用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规DNA/RNA合成仪化学合成。另外，siRNA能够通过商业的RNA寡聚物合成供应商获得，包括但不限于Proligo(汉堡，德国)，DharmaconResearch(Lafayette,CO，美国)，GlenResearch(Sterling,VA，美国)，ChemGenes(Ashland,MA,美国)，Cruachem(Glasgow,英国)，Qiagen(德国)Ambion(美国)以及Invitrogen(苏格兰)。或者，本发明所述的siNA分子能够通过含有在启动子的控制下的siNA反式互补序列的载体对细胞转染来进行表达。一旦被表达，siNA能够通过本领域中熟知的技术从细胞中提取出来。当对单链RNA分子进行操作时，退火步骤是必要的。为了将RNA退火，浓度为50yM的各种RNA寡聚物溶液各30n1混合于100mM的乙酸钾，30mMpH值为7.4的HEPES-KOH和2mM的乙酸镁中。此溶液再在90。C培育1分钟后，离心分离15秒，之后再在37t:培育1小时。在siRNA是短发夹结构RNA(shRNA)的实施方案中，siRNA分子的两条链可以由一个连接体区域所连接(例如，核苷酸连接体或非核苷酸连接体)。siNA的化学修饰本发明所述的siNA可能包含一个或多个被修饰的核苷酸和/或非磷酸二酯键。在本领域中所熟知的化学修饰具有提高siNA稳定性、可用性和/或细胞获取的能力。技术人员会意识到可能掺入RNA分子中的其它类型的化学修饰(关于这些修饰类型的总述参见国际公布WO03/070744和WO2005/045037)。在一个实施方案中，修饰能够被用于提高的抗降解能力和吸收能力。这种修饰的例子包括核苷酸间的硫代磷酸酯键、2'-0-甲基核糖核苷酸(特别是在双链siRNA的有义链上)、2'-脱氧-氟基核糖核苷酸、2'-脱氧核糖核苷酸、"通用碱基(universalbase)"核苷酸、5-C-甲基核苷酸和反向脱氧脱碱基残基结合(通常见于GB2406568)。在另一个实施方案中，修饰能够增强siRNA的稳定性或提高耙向效率。修饰包括siRNA的两条互补链间的化学交叉连接，siRNA—条链3'或5'末端的化学修饰，糖修饰，核碱修饰和/或主链修饰，以及2'-氟基修饰的核糖核苷酸和2'-脱氧核糖核苷酸(通常见于国际公布WO2004/029212)。在另一个实施方案中，修饰能够增强或降低目标mRNA和/或互补siNA链中的互补核苷酸间的亲和力(通常见于国际公布W02005/044976)。例如，未修饰的嘧啶核苷酸能够被2-硫代，5-炔基，5-甲基，或5-丙炔基嘧啶取代。另外，未修饰的嘌呤能够被7-deza，7-垸基，或7-链烯基嘌呤所取代。在另一个实施方案中，当siNA是双链siRNA时，3'-末端突出核苷酸被脱氧核糖核酸所替代(通常见于Elbashireta1.,2001)。siRNA二聚体的体外测试为了检测siRNA干扰作用的特异性，釆用了表达目标基因的细胞培养物。在检测IL-12p35和p40亚基的情形中，用于实验的细胞是人类SW480细胞和鼠科动物肌肉细胞C2C12。这些细胞经过与相应的siRNA二聚体的温育后，对p35和p40的表达水平进行了分析。为了在培养的细胞中将siRNA击倒作用与特异性表现型联系起来，有必要证明目标蛋白质的减少或至少证明目标mRNA的减少。目标基因的mRNA水平量能够通过实时PCR(RT-PCR)来测定。此外，蛋白质水平能够利用本领域中熟知的多种方法来确定，例如对不同目标的特异性抗体的Western印迹分析法允许了对目标蛋白质的减少的直接监视。siRNA能通过本领域中任意熟知的转染技术被引入细胞中。单一的siRNA二聚体转染的是能够被操作的，例如利用阳离子脂质，如Lipofectamine2000试剂(Invitrogen)，随后再进行在转染后24，48和72小时的沉默效率的测定。典型的转染流程操作如下在6孔平板的一个孔中，我们对鼠科动物C2C12细胞使用最终浓度为100nM的siRNA，或者对人类SW480细胞使用最终浓度为200nM的siRNA来进行转染。按照Lipofectamine2000试剂流程的指导，在转染的前一天，我们在每个孔中的3ml适宜的含有DMEM、10%血清、抗生素和谷氨酰胺的培养基中接种2-4xl05个细胞，并在标准的生长条件(37"C和5%的C02)下进行细胞培养。在转染的当天，细胞必须汇合30-50%。我们在250u1的DMEM中稀释12.5u1浓度为20yM的siRNA二聚体(相当于最终浓度为100nM)或25y1浓度为20uM的siRNA二聚体(相当于最终浓度为200nM)，并混匀。6u1的Lipofectamine2000也被稀释于250u1的DMEM中，并混匀。经过室温下5分钟的培养后，在20分钟的室温培养过程中，使稀释后的低聚物(siRNA二聚体)和稀释后的Lipofectamine结合以形成复合体。然后，我们将此复合体滴加到在2ml新鲜的培养在低抗生素含量的培养基中的细胞上，并通过前后摇动培养皿轻轻地使之混匀，以确保转染复合物的均匀分布。我们在标准的生长条件下培养细胞，在转染的后一天，去除这些复合物并添加新鲜和完全的培养基。为了监视基因沉默，在转染后24,48和72小时收集细胞。转染的效率可能依赖于细胞类型，但也可能依赖于传代数和细胞的汇合。形成siRNA-脂质体复合物的时间和方式(例如倒置混合法对比旋涡混合法)也至关重要。低转染效率是沉默失败最为常见的原因。良好的转染是非平凡的问题，需要对每一个新的待用的细胞品系进行仔细地检査。转染效率可以利用转染报道基因，例如CMV-驱动的EGFP表达质粒(例如来自Clontech)或B-Gal表达质粒，来测定，并在下一天通过相差和/或荧光显微镜方法来估算。依赖于目标蛋白质的充足性和寿命(或周转更新)，在1-3天后或更晚时，击倒表现型可能会变得明显起来。在没有观察到表现型的情形中，可以通过免疫荧光检验法或Western印迹法观察到蛋白质的缺失。转染后，从细胞中提取的总RNA片段经过脱氧核糖核酸酶I的预处理，并通过随机引物进行反转录。利用至少覆盖一个外显子-外显子连接区的特异性引物对扩增的PCR被用作扩增前mRNA的对照。也需要非耙向的mRNA的RT-PCR作为对照。mRNA有效的缺失和无法觉察的目标蛋白质的减少可以显示出在细胞中可能存在大储量的稳定的蛋白质。或者，RT-PCR扩增能够更精确地测定mRNA减少和消失。RT-PCR能够最明确地，最敏感地和最高重复率地定量测定模板初始数量。在光循环仪器中，RT-PCR在每个PCR循环中监控在反应过程中发射的、作为扩增子生成的指示剂的荧光。这个信号与在反应中PCR产物的量成正比例增加。通过在每个循环中记录荧光发射的量，有可能监控在指数生长期中PCR反应，其中PCR产物的量的第一次显著增加与目标模板的初始量相关。为了校验差异表达的IL-p35和p40基因在细胞培养物中的干扰模式，实施了定量RT-PCR。在定量RT-PCR反应中，大约500ng的总RNA被用于进行反转录，随后进行由反应中每个基因的特异性引物引导的PCR扩增。PCR条件包括一个初始的在95"反应30秒的步骤，以及随之其后周期性重复40次在95°(3反应5秒，62'C反应10秒和72'C反应15秒。18SmRNA的量化被用作管家基因，并作为对照来标准化数据。在样品中，当被选定内生/内在对照基因的表达与总RNA的比例更充足并保持恒定时，相关基因表达的比较表现最佳。通过利用无变化的内生对照作为活性参考，mRNA目标的量化能够被用于标准化每个反应中总RNA加入量的差异。根据制备商提供的流程，由光循环仪获得的扩增曲线与对照试剂盒DNA结合起来进行分析，其中对照试剂盒DNA靶向体外转录beta珠蛋白DNA模板。为了估计扩增的PCR产物的特异性，进行了解链曲线分析。由此产生的解链曲线允许了引物二聚体和特异性PCR产物间的辨别。siNA的直肠内给药直肠内siNA递送的研究是在GFPC57BL/6-TG(ACTB-EGFP)小鼠中进行的。此转基因小鼠品系是从"Jackson实验室"购买而来的。之所以使用转基因小鼠是因为此转基因的纯合小鼠在出生后两周内就会死亡。此转基因小鼠品系含有一个在鸡的beta肌动蛋白启动子和巨细胞病毒增强子的控制下"增强的"GFP(EGFP)cDNA，使得除了红血球和毛发之外的所有组织都在激发光下呈现绿色。此品系产生自C57BL/6小鼠。此品系编码增强绿色荧光蛋白(EGFP)的cDNA与鸡的beta肌动蛋白启动子和巨细胞病毒增强子邻接。此构建体还包括牛的珠蛋白多腺苷酸化信号。含有EcoRl位点的PCR引物被用于将扩增的EGFPcDNA引入到pCAGGS表达载体中，此载体含有鸡的beta肌动蛋白启动子和巨细胞病毒增强子，beta肌动蛋白内含子和牛的珠蛋白多腺苷酸化信号。利用Bam-Hl和Sail酶切，并凝胶纯化此含有启动子和编码序列的完整的插入片段。用于小鼠肠内注射的siRNA二聚体是从Dharmacon购买而来的。Dharmacon研究公司(Lafayette,CO)己经研制出能在体内用作治疗剂的新一代被修饰的siRNA，并命名为siSTABLEv2。Dharmacon的siSTABLEv2siRNA与未被修饰的siRNA相比，己经显示出在血清中更强的稳定性。常规的siRNA在含有血清的环境中通常在几分钟内就会降解，使siRNA在体内的使用产生问题。正如Dharmacon的网页(http:〃www.dharmacon.com/docs/siSTABLEo/o20v2o/o20Flier.pdf)所描述的，此siSTABLEv2的修饰巨大的提高了siRNA在血清中的稳定性。用于负调节EGFPmRNA表达的siRNA靶向EGFPmRNA中的下列序列5'画GGCUACGUCCAGGAGCGCACC-3'(SEQIDN088)。siRNA二聚体的有义链为5'-PGGCUACGUCCAGCGCACC-3'(SEQIDNO89)，反义链为5'隱PUGCGCUCCUGGACGUAGCCUU-3'(SEQIDNO卯)。这个序列是由Dharmacon作为合成前对照siRNA绿色荧光蛋白二聚体提供的。在直肠内递送实验中使用了C57BL/6-TG(ACTB-EGFP)小鼠(雄性，8周)。直到实验的前一天，这些动物生活在能自由获取食物和水源的笼子中。为了直肠内治疗的沉默，小鼠在接受处理的前一天禁食。典型的给药方式是小体积(120UL)的直肠内注射。对照组小鼠仅经过赋形剂处理。所有的动物都在第一次注射的两天后被脱颈椎处死。siRNA在小鼠中的应用流程如下在每次实验施用中，60ul的siRNA二聚体与60yl的NaCl(1.8%w/v)预混和，以达到生理水平。所有的动物都在第一次注射的两天后被处死。下表显示了使用的实验条件。每个条件都被重复分析过两次。小鼠2和3是经过与GFP相比单次，剂量为250ug(19nanomols)的siRNA的直肠内处理的。而小鼠4和5是经过连续两天内两次，每次剂量为125ug的siRNA处理的。小鼠序号直肠内治疗处理1赋形剂对照剂量2单次，剂量为250ng的siRNA3单次，剂量为250ug的siRNA4两次，剂量为每24小时125ug的siRNA5两次，剂量为每24小时125ug的siRNA表直肠内siRNA递送实验条件的示意性分布。表中显示了siRNA样品组织是通过两种方法收集和分析的一种是在OCT媒介中，另一种是在RNAlater(Ambion)中。直到数据处理前，OCT块被储存于-8(TC。OCT块在-2(TC下被恒冷切片机(LeicaCM1850)切割成12um的薄片。收集到的薄片在与数码相机相(DP70)连接的荧光显微镜(OlympusBX51)中，通过488nm滤光器进行分析。为了进行样品间的比较，对所有样品的感光条件(IS0200)、分辨率图像尺寸(2040xl536)和曝光时间都作了相同的设定。利用AdobePhotoshop(版本8.0)软件以GFP表达为指数进行绿色荧光的测量。通过这种方法对每个被分析的组织收集了25个不同的数据。从RNAlater中提取的组织储存于-2(TC。RNAlater在提取RNA之前已经被去除了。RNA是根据制备商提供的流程，利用Trizol试剂(Invitrogen)提取而来的。在通过上述的RT-PCR测量GFP表达前，进行了脱氧核糖核酸酶的处理。药物制剂和给药途径本发明可以包括一个或多个种类的siNA分子的同时施用。这些种类可以被挑选出来去靶向一个或多个目标基因。在一个实施方案中，在本发明所述的治疗方法中施用了单一类型的siNA。在另一个实施方案中，本发明中的一个siNA与本发明中的另一个siNA，以及/或者一个或多个对肠内壁疾病状态具有治疗、预防或控制作用的非siNA治疗剂联合施用。短语"联合"并不仅限于多种治疗剂在精确的同一时刻施用，而是指本发明所述的siNA和其他的试剂按照某种顺序，在一定的时间间隔内施用于患者，以使联合使用的疗效高于用其他方法施用这些试剂的疗效。例如，每个治疗剂可以同时或者按照任意的顺序在任意的时间点进行顺序施用。但是，如果不同时施用，它们的施用应该在时间上充分的接近，以提供预期的治疗效果。每种治疗剂都能够以任意的适当形式和合适的途径单独施用。本发明中的siNA可以通过任何本领域已知的常规技术配制为药物组合物(例子参见，Alfonso,G.etal.,1995,in:TheScienceandPracticeofPharmacy,MackPublishing,EastonPA,19thed.)。在本发明所述方法应用中含有一个或多个siNA的制剂可以具有多种形式，并可能依赖于不同的患者特异性因子(例如，患者的紊乱类型和严重性、施用的siNA的类型、年龄、体重、反应和过去的病史)，制剂中siNA的数量和类型，组合物的形式(例如，液态、半液态或固态)，治疗方案(例如，治疗剂是随着时间缓慢输注给药；还是单一推注，一天一次，一天多次或几天一次给药)，以及/或者给药途径(例如，局部、口服、静脉内、肌肉内、动脉内、骨髓内、鞘内、经皮肤、皮下、腹膜内、鼻内、肠内或舌下等途径)。本发明所述的siNA分子以及其制剂或组合物可以直接或局部的施用，如本领域所公知。例如，siNA分子可以包括递送媒介物，包括脂质体，用于施用于受试者。载体和稀释物以及它们的盐能够以制药学可接受的制剂形式存在。核酸分子能够通过不同的为本领域技术人员所知的方法在细胞中施用，这些方法包括，但不仅限于，脂质体的包囊作用，离子电渗疗法或与其他媒介物的结合，如与能生物分解的聚合体、水凝胶、环糊精聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)和PLGA微球体、能生物分解的毫微胶囊、以及生物粘合微球体的结合，或者通过protdnaceous载体。在另一个实施方案中，本发明所述的核酸分子也能够与聚乙烯亚胺及其衍生物配制或复合，例如聚乙烯亚胺-聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-GAL)或聚乙烯亚胺-聚乙二醇-三-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-triGAL)衍生物复合。本发明所述的siNA分子可以与膜破坏剂和/或阳离子脂质或协助脂质分子复合。可以在本发明中使用的递送系统包括，比如说，含水或不含水凝胶，膏状物，多种乳状液，微乳状液，脂质体，油膏，含水或不含水的溶液，洗剂，气溶胶，碳氢化合物基质及粉末，而且还包括赋形剂，例如增溶剂、渗透增强剂(例如，脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)，和亲水聚合体(例如，聚卡波非和聚乙烯吡咯垸酮)。在一个实施方案中，制药学上能接受的载体是脂质体或透皮增强剂。本发明所述的药物制剂的形式是适合施用的，例如，系统或局部的施用，进入细胞或受试者，包括如人。适合的形式部分地依赖于用途和进入的途径，例如口服、经皮肤或注射。本领域已知的其他因素还包括一些需要考虑的事项，例如毒性以及阻止此组合物或制剂发挥作用的形式。本发明还包括制备用于储存或施用的组合物，此组合物包括在制药学上可接受的载体或稀释剂中药物有效量的所需化合物。用于治疗应用的可接受的载体或稀释剂在制药领域已被熟知。例如，防腐剂、稳定剂、染料和调味剂都能够被提供。这些包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸酯。另外，还能够使用抗氧化剂和悬浮剂。药学有效剂量是指阻止、抑制发生、或治疗(在某种程度上减轻症状，最好消除所有的症状)疾病状态所需要的剂量。药学有效剂量依赖于疾病的种类，所用的组合物，给药途径，被治疗的哺乳动物的种类，考虑的特别的哺乳动物的生理特征，协作的药物治疗，以及医学领域中的技术人员将会识别的其他因素。本发明所述的制剂能够以包含常规无毒性药学可接受载体、佐剂和/或媒介物的剂量单位形式进行给药。制剂能够制成适合于口服的形式，例如片剂、锭剂、糖锭、水性或油性悬浮液、可分散的粉末或颗粒、乳状液、硬的或软的胶囊、或者糖桨或酏剂。预期为口服的组合物能够根据制药领域中任何已知的方法来制备，并且此组合物还能够含有一个或多个甜味剂、调味剂、着色剂或防腐剂以使得制出的药物美观且美味。片剂含有有效成分和无毒的药学可接受赋形剂的混合物，此赋形剂适合于片剂的制备。这些赋形剂可为，例如惰性稀释物；如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；制粒和崩解剂，如玉米淀粉或褐藻酸；粘合剂，如淀粉、凝胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可为未包被的或利用己知技术进行包衣。在一些情形中，利用已知技术制备的这种包衣能够延迟药片在胃肠内的崩解和吸收，从而提供更长时间的持续作用。例如，能够使用时间延迟物质，如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。用于口服的制剂也能够以硬明胶胶囊的形式出现，在此胶囊中，活性成分与惰性固态稀释剂混合，例如与碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合。或者，用于口服的制剂也能够以软明胶胶囊的形式出现，在此胶囊中，活性成分与水性或油性的媒介物混合，例如与花生油、液体石蜡或橄榄油混合。水性悬浮液是含有活性材料和适合于制备水性悬浮液的赋形剂的混合物。这种赋形剂为悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、氢丙烷基-甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪胶和阿拉伯树胶；为天然产生的磷脂的分散或润湿剂，例如卵磷脂，或烯化氧和脂肪酸的縮合产物，如聚氧乙烯硬脂酸酯，再或者为氧化乙烯与长链脂族醇的縮合产物，如十七碳乙烯氧基鲸蜡醇(heptadecaethyleneoxycetanol)，又或者为氧化乙烯和源自脂肪酸的偏酯类以及己糖醇的縮合产物，例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，还或者为氧化乙烯和源自脂肪酸的偏酯类以及己糖醇酐的縮合产物，例如聚乙烯失水山梨糖醇单油酸酯。水性悬浮液还能含有一种或多种防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯，一种或多种着色剂，一种或多种调味剂，以及一种或多种以蔗糖或糖精为例的甜味剂。油性悬浮液能够通过在以花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油为例的植物油中悬浮有效成分来配制，又或者悬浮于矿物油中，如液体石蜡。油性悬浮液可以含有增稠剂，例如蜂蜡、固体石蜡或十六垸醇。还能加入甜味剂和调味剂以提供可口的口服制剂。这些组合物还能够通过添加例如抗坏血酸的抗氧化剂被保存。适合于通过添加水而制备水性悬浮液的可分散性粉末和颗粒是活性成分与分散剂或润湿剂，悬浮剂和一种或多种防腐剂的混合物。适合的分散剂、润湿剂或悬浮剂已于上文中举例说明了。另外的赋形剂，如甜味剂、调味剂和着色剂也能被添加。本发明所述的药物组合物也能呈现为水包油型乳状液的形式。其中油相可为植物油或矿物油或它们的混合物。适合的乳化剂可为例如阿拉伯树胶或黄芪胶的天然形成的树脂，例如大豆、卵磷脂，源自脂肪酸和己糖醇的酯或偏酯的天然形成的磷脂，例如山梨聚糖单油酸盐的酐，以及例如聚氧乙烯山梨聚糖单油酸盐的上述偏酯和氧化乙烯的浓缩产物。此乳化剂也能含有甜味剂和调味剂。糖浆和酏剂能够利用甜味剂配制，如丙三醇、丙二醇、山梨醇、葡萄糖或蔗糖。此制剂还能含有缓和剂、防腐剂、调味剂和着色剂。此药物组合物可为无菌可注射水性或油性悬浮液形式。此悬浮液能够根据已知技术利用上述适合的分散剂或润湿剂以及悬浮剂来制备。无菌可注射制剂也能为在无毒的parentally可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如在1，3-丁二醇中的溶液或悬浮液。在这些被使用的可接受的媒介物和溶剂中包括水、Ringer's溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌固体油也可作为溶剂或悬浮媒介来常规施用。为达到这个目的，任何无刺激性的固体油都能够被施用，例如人工合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸，如油酸，也用在注射剂的配制中。本发明所述的核酸分子能以栓剂的形式施用，例如直肠给药。这种组合物能够通过混合药物与适合的无刺激的赋形剂制备而成。此种赋形剂在平常的温度下为固态，但在直肠温度下为液态，从而在直肠中融化并释放药物。这种材料包括可可油和聚乙二醇。本发明所述的核酸分子能够在无菌媒介中肠胃外给药。依赖于媒介物和使用浓度，这种药物能悬浮或溶解于该媒介物中。有利地，例如局部麻醉剂的佐剂、防腐剂和缓冲剂能够被溶于媒介物中。对除人类以外的动物给药时，此组合物也能被加入到动物的词料和饮用水中。可以便利的是配制动物饲料和饮用水组合物，使得动物就能够与它们的饮食一起获得治疗适宜量的组合物。将组合物制成能够添加在饲料和饮用水中的预混合物也是一种很方便的方法。本发明所述的核酸分子也能够与其他治疗化合物联合起来对某个个体用药，从而提高整体治疗效果。利用多种化合物处理适应症能够在降低副作用的同时提高有益作用。或者，本发明所述的某些siNA分子能在细胞内从真核的启动子表达。具有表达siNA分子能力的重组载体能够被递送并持久的保存于目标细胞中。或者，载体能够被用于瞬间表达核酸分子。这样的载体能够根据需要重复施用。siNA分子一经表达就会与目标mRNA相互作用并引起RNAi反应。表达siNA分子的载体的传递是系统性的，例如，通过静脉或肌内给药，通过对从受试者移植出来的目标细胞给药、接着再引入该受试者中，或者通过其它任何允许导入预期的目标细胞的方法。结果实施例l.siNA的设计对应于IL-12p35(白细胞介素12A，天然杀伤细胞刺激因子l，细胞毒性淋巴细胞成熟因子l，p35)和p40(白细胞介素12B，天然杀伤细胞刺激因子2，细胞毒性淋巴细胞成熟因子2，p40)亚基的GenBank登记号分别为NM—000882和NM—002187。在上述的有专利权的预测程序中导入了对应的mRNA核苷酸序列，并且获得了针对目标IL-12p35和p40亚基的siNA分子。此分析的输出为可能的siNA寡核苷酸的分数，最高分数被用于设计通常由化学合成的双链RNA寡核苷酸(典型的长度为19个碱基)。在一个优选的实施方案中，本发明所述的siNA组合物是图1中SEQIDNOs:1-81的任意一个；典型的是以有义链和反义链的二聚体的形式给药。本发明也包括含有40或更少个核苷酸的siNA并包含SEQIDNOs:1-81的任何一个的核苷酸序列。在一个特殊的实施方案中，siNA的长度为21-30个核苷酸，并且包括图1中SEQIDNOs:1-81的任意一个。下文所描述的实验中用到的全部siNA分子被设计为含有2个胸苷核苷酸3'突出端。实施例2.IL-12p35的体外测定为了确定IL-12p35目标基因的抑制作用，在细胞培养物中分析了图1中的一组siRNA。具有最佳特性的siRNA被选定进行检验，并被应用于适当的细胞培养物，例如SW480。依据制备商的流程指导利用RT-PCR分析了siRNA对于目标基因的作用。以18S作为管家基因对基因目标转录水平进行了标准化。图2包括被检验的一些不同的siRNA以及它们能干扰目标基因的不同功效。这些结果对应于在表达p35的SW480细胞中与图1的SEQID8和SEQID17。这些数值代表的是siRNA干扰后标准化后的mRNA水平相对于对照组基因表达的平均百分数和.中间标准误差(SEM)。在与对照细胞相比的SW480中，siRNA处理后p35转录水平随着SEQID8和SEQID17的siRNA的加入而急剧下降。基因表达的降低依赖于siRNA沉默作用的效率。事实上，与对照组相比，siRNASEQID8的处理经过24小时会将p35的基因表达降低为56%。实施例3.IL-12p40的体外测定为了确定IL-12p40目标基因的抑制作用，分析了图1中含有的一组siRNA。由己描述方法设计的具有最佳特性的siRNA在人类和鼠类细胞中被进行检验。利用RT-PCR分析p40的转录水平，并以18S作为管家基因对其进行标准化。这些结果对应于在表达p40的SW480细胞中的SEQID67和SEQID79(图3A);和在表达p40的C2C12细胞中的SEQID86和SEQID87(图3B)。siNA分子SEQID86和SEQID87如图所描述，含有2个胸苷核苷酸3'突出端。在SW480中，经用对应于SEQID67的siRNA处理后p40转录水平与对照细胞相比急剧下降可达到65%。在C2C12细胞中，与对照组相比，经对应于SEQID86的siRNA处理48小时将使基因表达降低为61%。值得注意的是，SEQID67和SEQID86分别对应于人类和鼠类IL-12p40基因的同源区域。图2和图3实验的总结被示于下表中<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>实施例4.体内测定。小肠分析。为了确定适合的siRNA肠内递送进行了siRNA的应用。为了确定siRNA的作用，在OCT媒介中收集了小肠样品，并利用前述方法对其进行了分析。由于其目的是为了确定GFP基因转录的负调节作用，在siRNA的应用后对荧光水平进行了测定。在实验流程中没有观察到动物中的次级作用。第一实验组(动物2和3)经单次剂量为250yg的siRNA处理，并于48小时后被处死。结果显示了与对照组小鼠相比荧光量的显著降低。此夕卜，当siRNA(250Pg)以两次，每次剂量为125ug的方式给药并在第一次注射后48小时进行分析时，GFP的表达与单次给药后的情形相似。结果显示于图4中。对于每种实验条件，显示的为数据的平均值。同时，还利用从RNAlater中收集小肠样品来确认上述数据。利用RT-PCR测定mRNA水平。这些结果显示于图5中，证实了上述由荧光分析而得到的数据。如图5所示，通过单次或两次给药所达到的250ug的siRNA剂量足以能并充分地负调节小肠中GFPmRNA水平，从而证实了在小肠中通过肠内给药而实现siRNA的递送。当这个分析是通过RT-PCR来完成的时候，负调节水平高于对照组，这是由于此技术的较高敏感性所造成的。实施例5体内测定。大肠分析。利用与小肠同样的分析方法对大肠进行了进一步的分析。为确定siRNA在大肠中的作用，通过在siRNA的应用后对荧光进行测定来分析从OCT媒介中收集的样品，从而确定GFP负调节作用。结果显示了与对照组小鼠相比荧光量的显著降低(图6)。此外，当以两次，每次剂量为125ug的方式给药并在第一次注射后48小时进行分析时，降低水平与单次siRNA给药后的情况非常相似，从而证明了此处理的效力。与在小肠中一样，也从RNAlater中收集大肠样品，mRNA水平的数据显示于图7中。由RT-PCR获得的数据确认了上述由荧光分析而得到的数据。这些结果开辟了一个利用治疗剂siRNA给药来治疗肠疾病的新途径。从OCT媒介和RNAlater中收集的样品的数据被分别概括于图8和9中。我们还研究了在小鼠的其他被选定的组织中是否存在任何GFP表达的负调节作用；并没有在膀胱、肾、肺、卵巢和肝脏组织中观察到此负调节作用。这些结果暗示直肠内siRNA给药能够用于特异性靶向肠组织。参考文献AkashiH,MiyagishiM，TairaK.RNA干扰在培养的植物细胞中对基因表达的抑制作用。AntisenseNucleicAcidDrugDev，2001，11(6):359-67.BanerjeeD，SlackF.小时序RNA对发育时机的控制一个由RNA介导的基因表达调节范例。Bioessays，2002，24(2):119-29.BosherJM,LabouesseM.RNA干扰遗传的指挥棒和监视器。NatCellBiol,2000,2(2):E31-6.BorgC，JalilA,LaderachD,MaruyamaK，WakasugiH,CharrierS，RyffelB，CambiAlFigdorC,VainchenkerW，GalyA，CaignardA，ZitvogelL.树突细胞(DCs)对NK细胞的活化作用要求DC细胞中形成通向IL-12极化突出。Blood，2004Nov15;104(10):3267-75.Caplen，NJ.,Parrish，S.,Imani，F.，Fire，A.&Morgan,R.A.小双链RNA在无脊椎动物和脊椎动物系统中对基因表达的特异性抑制。Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2001，98:9742-9747.CaspiRR.自身免疫中的IL-12。ClinImmunolImmunopathol.,1998;88(1):4-13.DavidsonNJ，HudakSA,LesleyRE,MenonS，LeachMW，RennickDM.IL-12,但并非IFN-gamma，在持续IL-10缺陷型小鼠的结肠炎慢性阶段担当重要角色。JImmunol.,1998;161(6):3143-9.ElbashirSM，LendeckelW，Tus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