肌肉生长抑制素(gdf-8)拮抗剂用于增进创伤愈合和防止纤维变性疾病的用途的制作方法

专利名称：肌肉生长抑制素(gdf-8)拮抗剂用于增进创伤愈合和防止纤维变性疾病的用途的制作方法
肌肉生长抑制素(GDF-8)拮抗剂用于增进创伤愈合和 防止纤维变性疾病的用途发明领域本发明涉及用于增进创伤愈合、并尤其用于防止在创伤自然愈合期间 在受损组织中出现的疤痕形成及由此的功能丧失的方法和组合物。
背景技术：
创伤是典型地与生物物质的丧失相关的对组织完整性的破坏。单纯创 伤包括皮肤的切伤和擦伤，而较深的对肌肉组织、骨骼系统或内部器官的 损伤被定义为复杂伤、无论创伤类型或组织损害程度，每种创伤都有相似的修复过程1，2，3。已 认识到创伤愈合有三个不同阶段。首先是炎性或渗出阶段，以使恶化组织 脱离并清洁创伤；第二是肉芽组织发育的增殖阶段；而第三是分化或再生 阶段，用于成熟和疤痕形成1。炎性阶段的特征在于止血和发炎。组织损伤发生后，由于创伤形成而 被损坏的细胞膜释放出血栓素八2和前列腺素2-a，其为强效血管收缩剂。 该最初的应答帮助限制出血。然后发生毛细血管舒张，而且炎性细胞(血 小板、嗜中性粒细胞、白细胞、巨噬细胞、和T淋巴细胞)迁移到创伤位点。尤其是，嗜中性粒细胞通过吞噬作用而在伤口清洁中起着核心作用。创伤 中接下来出现的细胞是白细胞和巨噬细胞。巨噬细胞对创伤愈合是必需的。大量酶和细胞因子由巨喧细胞分泌，其包括胶原酶，其能对创伤清创； 白细胞介素和胂瘤坏死因子(TNF)，其刺激成纤维细胞(以产生胶原)并促进 血管生成；和转化生长因子(TGF)，其刺激角质化细胞2。该步骤标志着转 换进入组织重建的过程中，即增殖阶段。增殖阶段的特征在于上皮形成、血管生成、肉芽组织形成、和胶原沉 积。TNFa刺激的血管生成对于将营养物递送到创伤位点中及其周围而言是 必需的，并且对有效的创伤愈合而言是关键的。肉芽组织形成是复杂的事 件，其涉及白细胞、组织细胞、浆细胞、肥大细>9包，并尤其涉及成纤维细
胞，其通过产生胶原而促进组织生长。控制增殖阶段的精确步骤和机理是
未知的。 一些牵涉的细胞因子包括血小板衍生的生长因子(PDGF)、胰岛素 样生长因子(IGF)和上皮生长因子(EGF)。它们都是胶原形成所必需的2。
创伤愈合的最后阶段是分化阶段。创伤进行收缩，而且肉芽组织变得 液体和血管越来越少，开始变硬，并进行重塑用以形成疤痕组织。当创伤 包括皮肤损伤时，创伤愈合的最后阶段是上皮形成，其中表皮细胞迁移， 以重新覆盖棵露的表面。当创伤包括骨骼肌损伤时，由新的肌肉细胞通过 分化以形成成肌细胞的卫星细胞而铺成(除了增殖阶段中的肉芽组织)4。在 创伤愈合的最后阶段中，成肌细胞分化以形成肌管，其成熟并4参入肌肉纤 维。尽管该过程能在创伤位点处恢复出一些肌肉功能，而肌肉创伤总是会 丧失肌肉组织、结疤并丧失原有肌肉功能。
当前对组织创伤的治疗包括改善循环、由此4吏氧气和营养物递送到创 伤位点以改善愈合时间的方法。这可由机械来实现，如通过超声波处理、 磁和电刺激、凝涡疗法和氧气疗法。可是，尽管这些疗法能刺激并甚至加 速创伤愈合进程，但它们仍旧会在创伤位点上造成功能和/或美容上的损害
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当前利用细胞因子和生长因子，如TGF-卩、EGF和IGF-1，来研究新的 疗法。TNF激动剂和拮抗剂也可用于改变血管生成，由此提供显著的潜力 来直接增进愈合进程。可是至今，生长因子只在临床实践中起着有限的作 用。当前唯一可用的商品是PDGF,其显示出能减少愈合时间，但其不能成 功地对创伤愈合的美容或功能方面起改善作用2。
因此，有需求提供新的创伤愈合疗法，其能控制创伤愈合进程从而使 新组织替代没有功能或有美容损害的受损组织。
本发明的目的是以某些方式实现该需求和/或为公众提供有用的选择。
发明简述
令人惊讶地，生长因子——肌肉生长抑制素(myostatin), TGF-P家族 的生长因子成员，首次显示出涉及创伤愈合过程中。抑制肌肉生长抑制素 活性被发现能显著增进创伤愈合进程。
因此，本发明提供了增进组织创伤愈合的方法，其包括以下步骤向 有需要的患者施用有效量的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂。本发明可用
于动物和人的创伤愈合中。
在动物和人患者中，通过一种或多种以下机制来增进创伤愈合
(a) 减少创伤恢复的时间；
(b) 加速并增加炎性应答；和
(c) 减少或抑制疤痕组织形成，
由此改善治疗的组织的功能和美容表观。
肌肉生长抑制素拮抗剂可选自任意 一 种或多种已知的肌肉生长抑制素 抑制剂。例如，US 6096506和US 6468535披露了抗肌肉生长抑制素抗体。 US 6369201和WO 01/05820教导了肌肉生长抑制素肽免疫原、月几肉生长抑 制素多聚体和肌肉生长抑制素免疫缀合物，其能引发免疫应答并阻断肌肉 生长抑制素活性。肌肉生长抑制素的蛋白质抑制剂在WO 02/085306中有公 开，其包括截短的II型激活蛋白(Activin)受体、肌肉生长抑制素前域、和 卵泡抑素。其他衍生自肌肉生长抑制素肽的肌肉生长抑制素抑制剂也是已
肌肉生长抑制素抑制齐'J(WO 00/43781);显性阴性的肌肉生长抑制素(WO 01/53350),其包括Piedmontese等位基因(第313位上的半胱氨酸替换为酪氨 酸)和成熟的肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑制素肽在氨基酸第 335至375位上或氨基酸第335至375位之间具有C-末端截短。 US2004/0181033也教导了包含氨基酸序列WMCPP的小肽，而且其能结合 并抑制肌肉生长抑制素。
一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂优选包含一种或多种选自由肌肉生 长抑制素肽和Piedmontese等位基因组成的组的显性阴性产物，所述肌肉生 长抑制素肽在氨基酸第335、 350位上或氨基酸第335、 350位之间被C-末 端截短了。
一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂还可包括肌肉生长抑制素剪接变 体，所述剪接变体包含SEQ ID NO: 8-14之任一项的多肽、或其功能片段 或变体、或与其具有95%、 90%、 85%、 80%、 75%或70%序列同一性的序列。
一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂还可包括与肌肉生长抑制素途径有 关的调节剂，所述调节剂包含多肽SEQ1DNO: 16或SEQIDNO: 18、或 其功能片段或变体、或与其具有至少95%、 90%、 85%、 80%、 75%或70%
序列同一性的序列。
月几肉生长抑制素拮抗剂还可包括反义多核苷酸、干扰RNA分子(例如 RNAi或siRNA)、或抗肌肉生长抑制素核酶，其能通过抑制肌肉生长抑制 素的基因表达来抑制肌肉生长抑制素活性。
当一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂包括抗体时，则抗体可以是源自 哺乳动物或非哺乳动物的抗体，例如源自鲨鱼的IgNAR抗体，或者抗体可 以是人源化抗体、或包含源自抗体的功能片段。
本发明还提供了 一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂在制备用于增进有 需要的患者的创伤愈合的药物中的用途。
一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂可以选自以上公开的肌肉生长抑制 素拮抗剂组。
药物可配制成用于局部或全身施用的配方，例如，药物可配制成向外 伤位点局部施用的配方，或可配制成向内伤位点注射的配方。
本发明进一步提供了组合物，其包含一种或多种肌肉生长抑制素拮抗 剂和药学上可接受的载体，其用于增进有需要的患者的创伤愈合的方法中。
本发明进一步提供了一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂，其用于增进 有需要的患者的创伤愈合的方法中。
现在，本发明将参考所附的附片来更详细地描述，其中
附图简述


图1A显示了对野生型和肌肉生长抑制素缺失的小鼠中对照未受 损肌肉切片的苏木精和曙红染色；
图1B显示了用虎蛇毒素进行创伤后一天(D1)的低倍视野；
图1C显示了与(B)相同的切片的较高倍视野观察结果，染色显示 了肌纤维嗜曙红的(e)细胞质以及细小的细胞内空泡化(v)，细胞内空间增 加和显著的肌纤维断裂(箭头)；
图1D显示了第2天(D2)的肌肉切片，其在肌肉生长抑制素缺失的小鼠的 肌肉中核数目增力吖箭头)。箭头朝向标明了沿着坏死的肌纤维边缘的肌核； 图1E显示了第3天(D3)的肌肉切片，其在野生型和肌肉生长抑制素缺失的 肌肉中都有浸润的单核细胞，但在肌肉生长抑制素缺失的切片中数目 更高。刻度条等于10)im;
图IF显示了第5天的切片(D5),其在肌肉生长抑制素缺失的肌肉切片的 受损伤区域中核数目增加；
图2A显示了在野生型(肌肉生长抑制素+/+)和肌肉生长抑制素缺失(肌肉 生长抑制素,的再生肌肉中的MyoD阳性成肌前体细胞百分比；
图2B显示了在野生型(肌肉生长抑制素+/+)和月几肉生长抑制素缺失(月几肉 生长抑制素勺的再生肌肉中的Mac-l阳性细胞百分比；
图2C显示了用虎蛇毒素造成损伤后最多28天时，MyoD和肌细胞生成 素基因在对照未受损的肌肉(C)和再生野生型(wt)和肌肉生长抑制素缺失(月几 肉生长抑制素缺失)的肌肉中的表达图谱。GAPDH用作为对照来显示所用的 RNA等量；
图3 对野生型组织进行损伤后第14、 21和28天，在得自肌肉生长抑制 素敲除(KO)和野生型(WT)小鼠的组织切片上的免疫荧光，其显示与敲除组 织相比，有较强的着色密度，即有更高的波形蛋白阳性细胞浓度；
图4 显示了用虎蛇毒素进行损伤后2、 3、 7和10天，在用盐水处理和 用肌肉生长抑制素抑制剂350 (显性阴性肌肉生长抑制素肽，其在氨基酸 350位上C-末端截短了 )处理的小鼠中，在痊愈的肌肉中的Macl阳性细胞平 均数；
用肌肉生长抑制素拮抗剂(显性阴性的肌肉生长抑制素肽，其在氨基酸350 位上C-末端截短了 )而得到的恢复；
图6A显示了肌肉生长抑制素对绵羊初级成纤维细胞(primary fibroblast)的化学吸引效应;
图6B显示了肌肉生长抑制素对绵羊初级成肌细胞(primary myoblast) 的化学抑制效应以及利用肌肉生长抑制素拮抗剂(显性阴性的肌肉生长抑 制素肽，其在氨基酸350位上C-末端截短了)而得到的恢复；
图7 显示了第28天的(D28)野生型和肌肉生长抑制素缺失的肌肉切片 的苏木精和曙红染色(H&E)以及Van Geisen(iii)染色的的低倍(i)和高倍(ii)显 微照片。在野生型肌肉切片(ii)中见到了厚的结締组织(箭头)；在野生型M^肉 切片(iii)中见到了胶原(箭头)，刻度条等于10 在(iv)中显示了再生24 天后野生型和肌肉生长抑制素缺失的肌肉的扫描电子显微图；刻度条等于 120拜；
图8显示了从虎蛇毒素进行的肌肉损伤中恢复的小鼠中肌肉生长抑
制素拮抗剂(显性阴性的肌肉生长抑制素肽，其在氨基酸350位上C-末端截 短了)对肌肉重量的影响；
图9A-D显示了得自用虎蛇毒素进行肌肉损伤后正在痊愈的小鼠在第 7天(A-用盐水处理；B-用M^肉生长抑制素拮抗剂350处理)和第10天(C-用盐
色。星号显示了坏死区域；
图10显示了图9肌肉切片的未再生的□和再生的,面积的百分比；
图ll显示了虎蛇毒素进行损伤后第10和28天，在用盐水处理和用月iL肉 生长抑制素抑制剂350处理的小鼠中，再生肌肉中的胶原形成的百分比；
图12显示了虎蛇毒素进行损伤后第28天在用盐水处理和用肌肉生长 抑制素抑制剂350处理的小鼠中，再生的肌纤维平均纤维面积；
图13显示了虎蛇毒素进行损伤后第1、 3、 7、 10和28天，在用盐水 (sal)和肌肉生长抑制素抑制剂350处理的胫骨前肌中，基因Pax7(A)和 MyoD (B)蛋白质水平(通过蛋白质印迹法斗企测)；
图14显示了受损伤后第2和4天受损伤肌肉中的炎性应答增加，以及 (在第21天)在痊愈的肌肉中肌肉质量增加。
图15显示了肌肉生长抑制素在骨骼肌愈合中所起作用的示意性才莫型。
定义
在整个说明书和权利要求书中使用的"创伤(wound)，，指一种或多种组 织的损伤，而且其不限于诸如割伤、擦伤、外科手术切口等开放性的创伤， 而且还包括诸如瘀伤、血肿等内伤以及烧伤。
在整个说明书和权利要求书中使用的"抑制剂"或"拮抗剂"指任何化合 物，其用于全部或部分降低蛋白质活性。它包括能结合并直接抑制蛋白质 活性的化合物，或可用于减少蛋白质的产生或增加其产量，由此影响存在 的蛋白质的量并由此降低其活性。
在整个说明书和权利要求书中使用的"基因表达"指转录起始、将DNA 片段转录成mRNA、并将mRNA翻译成多肽。
在整个说明书和权利要求书中使用的"包含"指'至少部分由……组成，， 也就是指当解释包括该术语的独立权利要求时，每个权利要求中从该术语
开始的特征都需要出现，但其他特征也可以出现。 发明详述
长抑制素显示出是创伤愈合所有3个特征性阶段(即炎性阶段、增殖阶l殳、 和分化阶段)的负调节剂。
例如，当缺少肌肉生长抑制素时，如在肌肉生长抑制素缺失的小鼠中， 或如利用肌肉生长抑制素拮抗剂抑制它，则巨噬细胞数量增加并且巨噬细 胞更早地向创伤位点迁移(炎性阶段)，胶原沉积较少(增殖阶段)并显著减少 疤痕组织形成(分化阶段)。
的功能丧失。没有结疤对于美容目的来说也是重要的，尤其在创伤影响到 了容易被见到的身体外部部分(如脸、颈、手等)的时候。
因此，本发明涉及增进组织创伤愈合的方法，其包括以下步骤向有 需要的患者施用有效量的至少 一种肌肉生长抑制素拮抗剂。患者优选是人
在人或动物患者中，通过一种或多种以下机制来增进创伤愈合
(d) 减少创伤恢复的时间；
(e) 加速并增加炎性应答；和
(f) 减少或抑制疤痕组织形成，
由此改善治疗的组织的功能和美容表观。
肌肉生长抑制素拮抗剂可选自一种或多种分子，其能全部或部分抑制 肌肉生长抑制素活性。
尤其，肌肉生长抑制素拮抗剂可选自任意 一 种或多种已知的肌肉生长 抑制素抑制剂。例如，US 6096506和US 6468535披露了抗肌肉生长抑制 素抗体。US 6369201和WO 01/05820教导了肌肉生长抑制素肽免疫原、肌 肉生长抑制素多聚体和肌肉生长抑制素免疫缀合物，其能引发免疫应答并 阻断肌肉生长抑制素活性。肌肉生长抑制素的蛋白质抑制剂在WO 02/085306中有公开，其包括截短的II型激活蛋白受体、肌肉生长抑制素前 域、和卵泡抑素。其他衍生自肌肉生长抑制素肽的肌肉生长抑制素抑制剂
也是已知的，包括例如，从过量表达肌肉生长抑制素的细胞释放入培养物中的肌肉生长抑制素抑制剂(WO 00/43781);显性阴性的肌肉生长抑制素 (WO 01/53350),其包括Piedmontese等位基因(第313位上的半胱氨酸替换 为酪氨酸)和成熟的肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑制素肽在氨 基酸第335至375位上或氨基酸第335至375位之间具有C-末端截短。 US2004/0181033也教导了包含氨基酸序列WMCPP的小肽，而且所述小肽 能结合并抑制肌肉生长抑制素。优选肌肉生长抑制素拮抗剂是显性阴性的肽。这些肽衍生自亲本蛋白 质，其发挥抑制亲本蛋白质的生物活性的作用。如上所述，肌肉生长抑制 素的显性阴性(dominant negative )的肽是已知的，包括成熟的肌肉生长抑 制素肽(其在氨基酸第335、 350位上或氨基酸第335、 350位之间C-末端 截短了 )和Piedmontese等位基因(其中第3位上的半胱氨酸替换成酪氨酸)。已知肌肉生长抑制素涉及肌肉形成并且它是肌肉生长的负调节剂6'7。 最初产生的肌肉生长抑制素是375个氨基酸的前体分子，其N-末端上具有 分泌信号序列，切掉它后产生无活性的原(pro-)形式。通过弗林蛋白内切 蛋白酶在Arg 266裂解，释放出N-末端的前域(或与潜伏期相关的肽(LAP) 结构域)和成熟的肌肉生长抑制素结构域，由此活化了肌肉生长抑制素。可 是，裂解后，前域仍旧能与成熟的结构域结合成无活性的复合物8。所以，少症。肌肉生长抑制素的剪接变体已经被鉴定出来了 ，其也可用作肌肉生长 抑制素拮抗剂(PCT/NZ2005/000250)。肌肉生长抑制素剪接变体(MSV)由 额外的剪接事件产生，该事件去除了第三个外显子的大部分。产生的MSV 多肽，在绵羊(oMSV; SEQIDNo: 8)和牛MSV (bMSV; SEQIDNo: 11) 中与天然的肌肉生长抑制素前肽共有最开始的257个氨基酸，但具有独特 的64个氨基酸C-末端(绵羊oMSV65, SEQIDNo: 9和牛bMSV65, SEQ ID No: 12)。 mRNA有195个核苷酸的差别，可是，MSV第257位上的缬 氨酸残基与常规的肌肉生长抑制素序列的相同。Belgian Blue牛的MSV (bMSVbb; SEQ ID No: 7)编码短了 7个氨基酸的314个氨基酸长的蛋白质 (SEQ ID No: 14),但是余下的蛋白质序列在两个检测的品种中显示出具有 完全的同源性。在bMSVbb中，独特的65个氨基酸的C-末端肽(SEQ ID No:12)是保守的。也已经发现了对于包括了弗林蛋白内肽酶在内的前肽转变酶(PC 1-7) 来说，(KERK)裂解位点存在于第271至274位上。在第274位上裂解释放 出有47个氨基酸的C-末端成熟的MSV片段(绵羊oMSV47， SEQIDNo: 10和牛bMSV47, SEQIDNo: 13)。65个氨基酸的MSV片段(SEQIDNO: 12)显示出在体外可用作为月几 肉生长抑制素拮抗剂(PCT/NZ2005/000250),而且预计在体内，MSV将可用 于调节肌肉生长抑制素活性。所以，本文公开的MSV多肽可用于抑制月几肉 生长抑制素，由此根据本发明而促进创伤愈合。通过导入干扰转录和/或翻译的多核苷酸，可改变肌肉生长抑制素基因表达。 例如，可导入反义多核苷酸，其包括反义表达载体、反义寡脱氧核糖核 酸、反义硫代磷酸酯寡脱氧核糖核苷酸、反义寡核糖核苷酸、反义^5克代磷 酸酯寡核苷酸、或任何现有已知的其他形式，其包括应用化学修饰以增强 反义多核苷酸的功效。通过现有已知方法9并根据肌肉生长抑制素基因序列 的知识w可产生肌肉生长抑制素的反义分子。将能理解，任何反义多肽不必100%互补于所讨论的多核苷酸，而需要 有足够的同一性以使反义多核苷酸结合于基因上，或结合于mRNA上来破 坏基因表达，而不实质性地破坏其他基因的表达。也可以理解，互补于包 括5'非翻译区域的基因的多核苷酸也可用于破坏肌肉生长抑制素蛋白的翻 译。同样，这些互补的多核苷酸不必100%互补，而要能足以结合mRNA并 破坏翻译，而不实质性地破坏其他基因的表达。基因表达的调节也可通过使用催化性RNA分子或核酶来实现。现有已 知这类核酶可被设计成与特异性靶向的RNA分子配对。核酶结合并裂解靶 向的RNA1Q。现有已知的任何其他调节基因表达和RNA加工的技术也可用于调节肌 肉生长抑制素基因表达。另一种肌肉生长抑制素拮抗剂是衍生自肌肉生长抑制素受体的肽。该 受体衍生的片段通常包括肌肉生长抑制素结合结构域，其随后结合并抑制 野生型肌肉生长抑制素。肌肉生长抑制素受体是IIB型激活蛋白，其肽序列 是已知的8。熟练技术人员无需过多实验就可生产出该受体拮抗剂。 长抑制素的抗体是现有已知的，如上所述，产生该抗体的方法也是现有已知的。抗体可以是哺乳动物或非哺乳动物的抗体，例如鲨鱼的IgNAR类抗 体；或衍生自能结合肌肉生长抑制素的任何这种蛋白质的片段或衍生物。 将可理解，其他涉及肌肉生长抑制素信号传导途径的分子将适用于本称为"强效(mighty)"，其被公开于PCT/NZ2004/000308中，其用于促进 肌肉生长。通过肌肉生长抑制素可抑制"强效"表达，所以它涉及相同的信 号传导途径。所以将可理解，不直接抑制肌肉生长抑制素，而使用对抗肌 肉生长抑制素信号传导作用的肽(例如"强效")可用于促进创伤愈合。能理解，编码"强效"基因的多核苷酸(绵羊SEQIDNo: 15和牛SEQ ID No: 17)可用于在肌肉上进行局部基因治疗，其能永久或瞬时表达"强效"， 或可选地可直接使用"强效"蛋白质(绵羊SEQ ID No.16和牛SEQ ID No.l8)。将可理解，由于遗传密码的冗余性，可产生与SEQ ID No: 15-18 中所公开的那些不完全一样、但具有基本相同活性的序列。另外，也可产 生在非关键结构域上有改变、但具有基本相同的功能的其它肽。改变可包 括插入、缺失、或将一个氨基酸残基变化为另一个。这类变化包含在本发 明的范围内。本发明是基于以下发现的，即肌肉生长抑制素能促进创伤愈合或改善 创伤损害。在人或动物患者中，通过一种或多种以下机制来增进创伤愈合(g) 减少创伤恢复的时间；(h) 加速并增加炎性应答；和(i) 减少或抑制疤痕组织形成，由此改善受处理的组织的功能和美容表观。所以任何已知的或开发中 的肌肉生长抑制素拮抗剂都适用于该方法中。这包括了任何能结合肌肉生 长抑制素的分子，例如，五.co/z'的IMM7免疫蛋白质、或现有已知的任何其 他种类的结合蛋白质。其他能结合并抑制肌肉生长抑制素的肽是已知的， 例如，含氨基酸WMCPP(US2004/0181033)的肽。将能理解，任何能抑制肌肌肉生长抑制素是分泌型生长因子，其主要在骨骼肌肉中被合成。可 是，肌肉生长抑制素也出现在其他组织中，包括心脏、乳腺、脂肪组织和
脑中，而且肌肉生长抑制素受体是普遍存在的。因此预计，肌肉生长抑制 素拮抗剂将能有效促进存在肌肉生长抑制素受体的组织或包括该组织的器 官，如皮肤的创伤愈合。用于本发明方法中的肌肉生长抑制素拮抗剂可用于在下述创伤愈合的 动物模型或体外模型中测试生物活性，其适宜地作为活性化合物配制成药 物组合物。除了本文所述的一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂，本发明的 药物组合物可包括药学上可接受的赋形剂、载体、緩沖液、稳定剂或其他 现有公知的材料。该材料应是无毒的并应当不干扰活性成分的功效。载体 或其他材料的精确性质将取决于药物组合物所需的性质和施用途径，如口 服、静脉内、经皮、皮下、皮内、局部、鼻腔、肺部、肌肉内或腹膜内 施用途径。口服施用的药物组合物可以是片剂、锭剂、胶嚢、粉剂、颗粒剂或液 体形式。片剂或其它固体口服剂型通常将包括固体载体，如明胶、淀粉、 甘露醇、结晶纤维素、或其它药物制备中常用的惰性材料。相似地，液体 药物组合物，如糖浆剂或乳剂， 一般将包括液体载体，如水、石油、动物 或才直物油、矿物油或合成油。对于静脉内、经皮、皮下、皮内或腹膜内注射，活性成分将是可接受 的非肠道水溶液的形式，其不含热原并具有合适的pH、等渗性和稳定性。对于局部施用，活性成分将溶于或悬浮于合适的润滑剂中，并可配制 成乳剂、滚抹剂、洗液、贴剂、喷雾剂、油膏、糊剂、或凝胶的形式，而 且它可直接应用于创伤位点上或通过诸如衬垫、贴片等介质来应用。对于鼻腔或肺部施用，活性成分将是适于吸入的微小粉末或溶液或悬 浮液的形式。可选地，活性成分可以是适于直接应用于鼻粘膜的形式，如 膏剂或乳剂、鼻腔喷雾剂、鼻腔滴剂或气雾剂。一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂治疗肌肉伤的能力能在前述肌肉损 伤的虎蛇毒素模型"中来证实。本发明另 一个优选的应用是治疗皮肤伤。一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂治疗浅表或深层皮肤创伤的能力能 根据已知方法13来证实。本发明另 一个优选的应用是治疗烧伤。
一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂治疗烧伤的能力能在已知的动物才莫型中证实。例如Yang等"所述的。在另一个具体实施方式
中，本发明预见到了将一种或多种其他免疫应 答性化合物与本发明的药物组合物联合施用的用途，从而为治疗方案带来 附加的或协同效应。该免疫应答性化合物通常是诱导免疫应答的物质。该物质的例子包括糖皮质激素，如脱氢皮甾醇和曱基脱氢皮甾醇；非甾族抗 炎药(NSAID); PDGF、 EGF、 IGF、以及第一和第二代抗TNp oc剂。该物质 可与本文所述的至少 一种肌肉生长抑制素拮抗剂分开、顺序或同时联合施 用，这取决于要治疗的创伤类型，这对普通技术人员来说是会理解的。施用本发明的药物组合物优选以"预防有效量"或"治疗有效量"来进行， 其量足以对个体显示出有益效果。实际施用量、和施用速率和时程将取决 于要治疗的肌肉减少症的性质和严重性。开治疗处方，如决定剂量等，在 开业医生和其它内科医生的职责范围内，其典型地将考察要治疗的疾病、 病患个体状况、递送位点、施用方法和其它医师所知的因素。上述技术和 -见牙呈的例子可以在Remington's Pharmaceutical Sciences,第16片反，Oslo, A. (编)，1980中找到。本发明也涉及 一 种或多种肌肉生长抑制素抑制剂在制备用于增进有需 要的患者的创伤愈合的药物中的应用。 一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂 可选自上述肌肉生长抑制素拮抗剂组。药物可配制成用于局部或全身施用的配方，例如，药物可配制成用于 向外部或开放性创伤位点局部施用的配方，或可配制成用于向内部或深层 创伤位点注射的配方。药物可进一步包含一种或多种其他免疫应答性化合物从而对创伤愈合 带来附加的或协同效应，其选自上述免疫应答性化合物的组。药物可以配 制成一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂和一种或多种免疫应答性化合物分 开、顺序或同时施用的配方。不受理论所限，可认为，肌肉生长抑制素拮抗剂能通过作用在创伤愈 合的所有3个公认阶段(即上述炎性阶段、增殖阶段、和分化阶段)而有 效增进创伤愈合。例如，抑制肌肉生长抑制素活性首次显示出对巨噬细胞募集有直接效
用肌肉生长抑制素拮抗剂抑制的时候，巨噬细胞的数量和迁移到创伤位点 的时间增加了。因此，能显著改善创伤愈合的第一阶段(炎性阶段)，预计 这将更快并更有效地清洁创伤并生成血管。另外，抑制肌肉生长抑制素活性，也显示出能在增殖阶段较少沉积胶 原。本文首次显示，肌肉生长抑制素是针对成纤维细胞的化学引诱物。因 此，抑制肌肉生长抑制素活性被认为能使较少的成纤维细胞向创伤位点募 集，由此通过减少成纤维细胞群而较少产生胶原。进一步首次显示了 ，肌肉生长抑制素涉及创伤愈合的分化阶段中的疤 痕组织的形成。特定地，抑制肌肉生长抑制素活性显示出能在恢复的创伤 组织中显著减少疤痕组织形成。另外，也显著减少功能组织的丧失，即抑 制肌肉生长抑制素也能改善组织再生，由此使恢复的组织被替代而不结疤， 因此几乎不造成功能或美容损害。这在美容外科手术中或在治疗可清晰看 见的身体部分(如脸、颈、手等)的创伤中尤其有益。尽管本发明仅用肌肉创伤模型进行示例，但预计它也能相应很好地治 疗其他类型的创伤，如皮肤割伤和擦伤、贯穿皮肤和肌肉的深层伤(包括 外科手术切口 )以及内伤(例如有运动损伤或外伤造成的肌肉和肌腱的损伤)、瘀伤、血肿、和烧伤。本发明也可广义地被认为个别或整体地存在于本申请说明书参考或所 示的部分、元素和特征中，以及两个或更多所述部分、元素或特征的任意 或全部组合，而且本文提及了特定的完整事物，这些完整事物在本发明相 关的现有技术中具有已知的等同物，该已知的等同物被认为纳入本文了 ， 就好像个別描述过一样。本发明存在于前述内容中，并也关注以下仅给出实例的那些内容。实施例实施例1:肌肉生长抑制素拮抗剂增加肌肉创伤愈合中所涉及的炎性 应答和细胞趋化性创伤愈合是高度有序的过程；肌肉组织创伤导致即刻的炎性应答，然 后成肌前体卫星细胞发生趋化性移动。我们在本文中显示了，肌肉生长抑 制素实际能抑制炎性应答和成肌细胞向创伤位点的趋化性移动。因此可证
质量会带来有益效果。 材料和方法对应于牛M^肉生长抑制素267-350位氨基酸的cDNA (下文中一皮称为 "350"或"350蛋白")被PCR扩增出并克隆进pET16-B载体中。350蛋 白的表达和纯化按照制造商(Qiagen)的规程在天然条件下进行。用25%芬太尼(Hypnorm )(柠檬酸芬太尼0.315 mg/ml和氟茴哌丁酮10 mg/ml)和10%速眠安(Hypnovel )(咪哇安定5 mg/ml)的混合物以0.1 ml/10g 体重的量来麻醉6至8周大的雄性C57BL/10和肌肉生长抑制素 一小鼠(每 组11=27)。右腿的胫骨肌前肌用100^1注射器(SGE,澳大利亚)月几肉注射IO ^ 10叫/ml的虎蛇毒素。在第0天(对照)和第1、 2、 3、 5、 7、 10、 14 或28天(每天n二3),从安乐死的小鼠中切下胫骨前肌。胫骨前肌在组织Tec 液中固定，并在用液氮冷冻的异戊烷中冷冻。对于350对创伤进行的试验， 如上所述，用虎蛇毒素注射l岁大的野生型小鼠的左胫骨前(TA)肌肉。在 第1、 3、 5、和7天，用肌肉生长抑制素拮抗剂(350 )以6pg每克体重皮 下注射受创伤的小鼠，或注射等量盐水(对照小鼠)。为了评估350对肌肉康 复的效应，在注射虎蛇毒素后第1、 3、 7、 10和28天使小鼠安乐死，切下 胫骨前肌，进行蛋白质分离或组织切片。冷冻的肌肉样品储存于-80。C。 7pm 的横向切片(nK3)在3个水平进行切割，相隔100nm。然后用苏木精和曙红 或Van Geisen对切片染色。然后用装有DAGE-MTI DC-330彩色照相机 (DAGE-MTI Inc.)的Olympus BX50显微镜(Olympus Optical Co.，德国)检测 切片并拍照。用2%多聚甲醛后固定(postfix)冷冻的肌肉切片(7iim厚)，然后用含 0.3% (v/v) Triton X-100的PBS透化，然后用10% (v/v)正常羊血清-Tris缓冲 盐水(NGS-TBS)于室温封闭1小时。切片与用5% NGS-TBS稀释的抗体一
起于4。C温育过夜。所用的抗体是小鼠抗MyoD, 1: 25稀释度(554130; PharMingen)，它是活化的成肌细胞的特异性标记物(Cooper等，1999; Koishi 等，1995);山羊抗Mac-l， 1: 400稀释度(整联蛋白M-19; SantaCmz), 它是特异于浸润的外周巨噬细胞的抗体(Springer等，1979); 1: 300稀释 度的小鼠抗波形蛋白抗体，它是成纤维细胞的标记物。用PBS洗切片3次， 然后与i: 400稀释度的驴抗小鼠Cy3缀合物(715-165-150; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA,美国)或1: 400稀释度的生物素化的 驴抗绵羊/山羊IgG抗体(RPN 1025; Amersham)—起温育。二级抗体温育后， 与荧光素缀合的抗生物素蛋白链菌素(S-869; Molecular Probes)—起于室温 温育30分钟，所述抗生物素蛋白链菌素稀释度为1: 400,其用5%NGS-TBS 稀释。用PBS漂洗切片3次，用DAPI复染并用Dako 荧光固定介质固定。 用落射荧光显微镜检测胫骨前肌切片。用装有DAGE-MTI DC-330彩色照 相机(DAGE-MTI Inc.， IN,美国)的Olympus BX50显微镜(Olympus Optical Co.，德国)拍下典型的显微照片。用Scion成像程序(MH)对5个随机挑选的 肌肉切片测量出平均肌肉面积，所述肌肉切片是前面来自于对肌肉生长抑 制素 一和野生型小鼠进行免疫组织化学而用的切片。老化^试-發根据公开的规程(Allen等，1997; Partridge, 1997),培养来自于4至 6周大的小鼠的后肢肌肉的初级成肌细胞。简而言之，切石争月几肉并在0.2% 1A 型胶原酶中消化90分钟。通过预先在未包被的平板上铺板3小时来富集培 养物中的成肌细胞。成肌细胞培养物在10%基质胶包被的平板上于 37。C/5% C02培养于补加20。/。胎牛血清(FCS)、 10% HS和1% CEE的生长 培养基(GM)中。48小时后，通过流式细胞术分析培养物中MyoD的表达来 评估培养物纯度程度。用胰蛋白酶收集细胞，以106个细胞/200 pl的浓度 重悬并用5 ml 70%乙醇于-20。C固定过夜。用1: 200的兔多克隆抗MyoD (Santa Cmz)于室温进行染色30分钟，然后用1: 500的Alexa fluor488抗兔 缀合物染色(MolecularProbes)。分析一式两份进行，每个试-睑中收集104个 细胞事件。通过对前向和侧向散射图谱进行射门来排除碎片。通过FACscan (BectonDickinson)来分析细胞。通过腹膜灌洗技术来分离巨噬细胞。根据公 开的规程(Colditz和Movat, 1984)制备酵母聚糖活化的小鼠血清(ZAMS)。
在带有7mm直径的孔的Boyden型单盲孔腔室(Neuro Probe, MD美国)中 进行趋化性实验。彻底洗涤带有8nm洞的聚碳酸酯过滤膜(Neuroprobe;洞 =6%的表面积)，而对于成肌细胞试验，用含1%基质胶的DMEM处理过 滤膜30分钟。然后干燥过滤膜并置于顶层和底层腔室之间。对于成肌细胞的趋化性试验，含5。/。鸡胚提取物(CEE)和透析緩沖液的 DMEM用作为阳性对照。将重组肌肉生长抑制素(2.5和5pg/ml肌肉生长 抑制素)和350蛋白质(5倍肌肉生长抑制素浓度，即，12.5yg/ml和25pg/ml) 加入阳性对照培养基中。纯DMEM用作阴性对照。在24孔板上，用测试 或对照培养基注满底层孔。将七万五千个细胞加入到顶层孔中。于37。C、 5% C02温育平板7小时。用预先湿润的药签清洗膜的顶层表面以去除未迁 移的细胞。然后固定膜，用Gill氏苏木精染色并湿固定在载玻片之上。在 每个膜的4个代表区域上计数迁移的细胞并得出平均数。对于巨噬细胞的趋化性试验，含33%酵母聚糖活化的小鼠血清 (ZAMS))的DMEM和透析缓冲液用作为阳性对照。将重组肌肉生长抑制 素(5pg/ml肌肉生长抑制素)和350蛋白质(2和5倍肌肉生长抑制素浓度， 即，10|ig/ml和25pg/ml)加入阳性对照培养基或纯DMEM中。在24孔板 上，用测试或对照培养基注满底层孔。将七万五千个细胞加入到带有聚对 苯二曱酸乙二醇酯(PET)0.8pm膜的顶层孔中。于37。C、 5%(:02温育平板4 小时。用预先湿润的药签清洗膜的顶层表面以去除未迁移的细胞。然后固 定膜，用Gill氏苏木精染色并湿固定在载玻片之上。在每个膜的4个代表 区域上计数迁移的细胞并得出平均数。从羊羔皮肤外植体上获取初级成纤维细胞。含10pg/ml重组TGF-p的DMEM用作为阳性对照。将重组肌肉生长抑制素(5pg/ml肌肉生长抑制素) 加入到阳性对照培养基中。在24孔板上，用测试或对照培养基注满底层孔。 将八万八千个细胞加入到带有聚对苯二曱酸乙二醇酯(PET) 0.8pm膜的顶层 孔中。于37。C、 5。/。C02温育平板4小时。用预先湿润的药签清洗膜的顶层 表面以去除未迁移的细胞。然后固定膜，用Gill氏苏木精染色并湿固定在 载玻片之上。在每个膜的4个代表区域上计数迁移的细胞并得出平均数。奸考差^《3的i r户O 根据厂商规程用Trizol (Invitrogen)分离总RNA。用Superscript预扩增
试剂盒(Invitrogen)进行反逆转录反应。用1 jil反转录反应液进行PCR，即 94。C30秒，55。C30秒，和72°C 30秒。对于每个基因，利用不同的循环来 确定指数扩增所需的循环数。在琼脂糖凝胶上分离扩增子并转移至尼龙膜 上。通过DNA印迹杂交来检测PCR产物。用3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH) mRNA的丰度来校正每个数据点。结果肌肉生长抑制素影响成肌细胞、巨噬细胞和成纤维细胞的趋化性 在用虎蛇毒素进行创伤后24小时内在野生型和肌肉生长抑制素—一肌 肉中都见到如嗜曙红细胞的出现和成肌细胞迁移所指示的针对肌肉创伤的 炎性应答(图1C)。到第2天，野生型和肌肉生长抑制素一应答在炎性应答 和卫星细胞迁移中的差异变得明显，在肌肉生长抑制素 一肌肉切片中创伤 位点上的核增长具有明显增高(图1D,箭头)。观察到的核数目的增加是由 于巨噬细胞和成肌细胞数目增加而造成的。尤其在肌肉生长抑制素；切片 中，沿着坏死的肌纤维边缘可见到核的最高密度(图1D,箭头)。到第3天， 恢复的野生型肌肉切片也显示出核数目增加了 ，然而仍旧远小于从肌肉生 长抑制素；小鼠中收集的对应组织(图1E)。在野生型和肌肉生长抑制素 一月几肉切片中，虎蛇毒素创伤后单核细胞增加的最高点都出现在第5天(图 1F)。所示的主要效应是巨噬细胞和成肌细胞加速迁移到肌肉生长抑制素 v—肌肉切片中的创伤位点上。在对肌肉创伤进行应答过程中，炎性细胞和卫星细胞迁移到创伤位点 上18。为了确定缺少肌肉生长抑制素是否能增强活化的卫星细胞或炎性细胞 的迁移，定量创伤位点上的炎性细胞和成肌细胞的比例。用免疫组织化学 来检测MyoD (成肌细胞的特异性标记物)19和Mac-l (用于浸润性外周巨 噬细胞)2、未处理的对照肌肉切片对于MyoD免疫染色是阴性的。用DAPI 染色肌肉切片从而计数出核的总数。定量结果证明了与野生型切片相比， 在肌肉生长抑制素-A恢复的肌肉中在第二天，创伤愈合位点上出现了两倍 数量的成肌细胞(MyoD阳性)(图2A)和巨噬细胞(Mac-1阳性)(图2B)。从 创伤愈合的第2天到第5天，肌肉生长抑制素一肌肉切片上比野生型肌肉 有更多的成肌细胞(图2A)。像MyoD阳性细胞一样，在肌肉生长抑制素一 肌肉中，在对创伤应答的更早期(第2天)，可见到巨噬细胞向创伤位点浸润
增加(图2B)。另外，肌肉生长抑制素；肌肉中更迅速减少的炎性细胞数表明，肌肉生长抑制素一小鼠中整个炎性细胞应答过程都加速了(图2B)。 Grounds等(Grounds等，1992)证明了 MyoD和肌细胞生成素的物。因此在正在恢复的组织中确定MyoD和肌细胞生成素的表达。定量 RT-PCR结果确证了肌肉调节因子myoD和肌细胞生成素的表达与野生 型肌肉相比在肌肉生长抑制素-/-月几肉中是在较早时表达的。在肌肉生长 抑制素一肌肉中，在受创伤12小时内检测到了高水平的MyoDmRNA。可 是在野生型肌肉中，直到虎蛇毒素注射后第1天才^f全测到MyoD表达(图 2C)。相似地，在再生的肌肉生长抑制素^肌肉中，在受创伤后12小时 内的非常早期阶段也检测到更高水平的肌细胞生成素mRNA。可是，在野生型再生的肌肉中，直到肌肉创伤后1天才检测到肌细胞生成素mRNA (图2C)。因此，免疫组织化学和基因表达分析的结杲同时表明，肌肉生长 抑制素 一月几肉中成肌细胞向受创伤位点的迁移增加并加速了 。除了成肌细胞，成纤维细胞也会迁移至受创伤位点并在其上扩增。研 究肌肉创伤时肌肉生长抑制素对成纤维细胞迁移动力学的影响。如用波形 蛋白抗体(成纤维细胞的特异性标记)染色的图3所示，与野生型肌肉相比， 在肌肉生长抑制素一小鼠胫骨前肌中的受创伤位点上成纤维细胞的增加 实质上较小。该结果以及以下成纤维细胞迁移试验的数据，清楚证明了肌 肉生长抑制素是用作为成纤维细胞的化学引诱物的。果，虎蛇毒素进行创伤后进行创伤愈合的小鼠用350蛋白处理，并确定炎性 应答。第2天在用350处理过了的受损的肌肉中发现更高百分比的Macl阳性 巨噬细胞(图4)。到第3天，350处理的肌肉中的百分比掉落到盐水处理的第3 天的肌肉之下，并在第7和10天的肌肉中持续更低。该结果显示到第2天在 350处理的肌肉中有早期或更深层次的巨噬细胞募集，然后到第7和10天募 集降低了。这些结果显示350处理加速伤口愈合过程。通过月几肉生长抑制素抑制成月几细胞和巨噬细月包的趋化性并通过350对 其拯救已经证明了创伤后24小时，热创伤(烧伤)组织中的肌肉生长抑制素
水平出现了 3倍增加"。相似地，在由虎蛇毒素进行创伤的肌肉组织中，创伤后24小时在肌肉组织中测量到了显著增加的肌肉生长抑制素水平12。以上提供的结果显示，肌肉生长抑制素^肌肉中巨噬细胞浸润增加并 加速，和成肌细胞向再生区域迁移增加并加速。由于这两种细月包类型已知 都受趋化性因子影响而指导它们的运动22，23，研究肌肉生长抑制素对卫星细 胞衍生的成肌细胞和巨噬细胞的迁移能力的影响。为了测试肌肉生长抑制素是否干扰趋化性信号，使用盲孔(blind-well)趋化性腔室。通过过滤膜 来评估分离的成肌细胞或巨噬细胞针对化学引诱物(针对成肌细胞是CEE， 而针对巨噬细胞是ZAMS活化的血清)的迁移能力。如流式细胞术所测得的， 发现分离的成肌细胞卯o/。是成肌性(MyoD阳性)的。如图5所示，将5)ig/ml肌 肉生长抑制素加入到ZAMS培养基中能完全消除巨噬细胞迁移。当向含 5|ig/ml肌肉生长抑制素的培养基中加入350蛋白时，观察到了肌肉生长抑制 素对巨噬细胞的化学抑制效应的显著拯救(增加了 20倍)。该结果确认了施用 诸如350的肌肉生长抑制素抑制剂能通过降低肌肉生长抑制素对巨噬细胞 迁移的抑制而加速伤口愈合。除了对巨噬细胞迁移的影响，我们在本文中还证明了诸如350的肌肉生 长抑制素拮抗剂也能降低肌肉生长抑制素对成肌细胞趋化性移动的负效 应。向阳性对照培养基中加入2.5和5iLig/ml重组肌肉生长抑制素会分别造成 成肌细胞迁移被抑制了 66和82%。当向含重组肌肉生长抑制素的培养基中加于阳性对照中所观察到的水平，因此证明了诸如350的月几肉生长抑制素拮抗 剂能通过增强成肌细胞迁移而有效地加速创伤愈合。肌肉生长抑制素用作针对成纤维细胞的化学引诱物与巨噬细胞和成肌细胞相反，肌肉生长抑制素可用作成纤维细胞迁移 的化学引诱剂。在肌肉生长抑制素缺失的肌肉中观察到成纤维细胞向创伤 位点迁移的减少支持了这个结果(图6)。为了直接证明肌肉生长抑制素对成 纤维细胞的趋化性效应，利用重组肌肉生长抑制素在体外进行迁移试验。 如图6所示，与緩冲液对照相比，肌肉生长抑制素的加入增加了成纤维细 胞的趋化性移动。 实施例2:对肌肉生长抑制素进行拮抗使得纤维变性减少并增强肌肉 愈合。方法切割创伤模型在每只小鼠(野生型和肌肉生长抑制素缺失)的左胫骨前肌(TA)切开 3mm的横向切口。在损伤后第0、 3、 5、和7天，野生型胫骨前肌在损伤 位点上以2jag/g体重注射350蛋白(总量为85吗/小鼠)或盐水(注射入胫骨前 肌肉)。未受损的右胫骨前肌用作为对照。在切割后第2、 4、 7、 10和21 天收集受损的和对照肌肉，并确定它们的重量。还通过Van Geisen染色来 测定胶原沉积在正在愈合和已经愈合的切割伤口上的程度。扫描电子显微术剔除肌肉样品的脂肪和肌腱，并用含2.5。/。(v/v)戊二醛的10 ml 0.1 M 磷酸盐緩沖液(pH 7.4)固定48小时，期间轻轻摇动。用PBS洗去戊二搭， 洗l小时，然后转移到50ml2MNaOH中，并于25°C恒温温育5天。然后 用PBS洗样品并移入50 ml无菌蒸馏水中。再于25°C恒温保存肌肉4天。 在前36小时，每隔12小时换水，然后每隔24小时换。然后将肌肉转移入 1%丹宁酸，放置2小时，然后用PBS洗3次。用1。/。Os04处理肌肉2小时， 然后用递增梯度的乙醇(50% - 100%)用浸入法脱水3次，每次15分钟。用 二氧化碳干燥肌肉样品并用金包被。检测标本并用带有10kV加速电压的扫 描电子显微镜(HITACHI 4100,日本)拍照。如实施例1所述用VanGeisen在第21天评估野生型相对于缺失型的割 伤胫骨前肌中的胶原积聚。结果缺 沟^长#斜#^#致增强,沟痊奮并减>、^舉^# 在骨骼肌中，纤维变性的发展始于虎蛇毒素创伤后2周并随着时间而 持续24。为了评估肌肉生长抑制素在纤维变性中的作用，虎蛇毒素创伤之后 比较这两种肌肉基因型的组织(参见实施例1中的方法一节)。在第28天， 在苏木精和曙红染色的切片中观察到来自于受伤的野生型肌肉的疤痕组
织，而在肌肉生长抑制素〃-肌肉切片中只观察到非常少的(图7)。 VanGeisen 氏染色进一步确认了结締组织的存在(图7)。在第28天，野生型肌肉切片上 有较大的胶原面积，所以与肌肉生长抑制素一肌肉相比，受伤的野生型组织 中可见到更多疤痕组织。为了进一步确认该结果，用扫描电子显微镜分析 再生的肌肉。第0天(对照)和第24天的再生肌肉的扫描电子显孩t照片，显 示结締组织框架包围着曾一度由肌纤维占据的空间(图7)。在对照(未受损) 的样品中，野生型和肌肉生长抑制素一肌肉在纤维腔周围都没有变厚的结締 组织。可是，到了创伤愈合的第24天，在野生型肌肉中观察到了密集的结 締组织束(图7)，但在肌肉生长抑制素一肌肉中没有观察到。相似地，在割 伤肌肉模型中比较肌肉生长抑制素缺失的与野生型小鼠，在肌肉生长抑制 素缺失的小鼠中，第28天修复的创伤位点上胶原积累的程度显著减少(数据 未提供)。这些结果确认了缺少肌肉生长抑制素会导致创伤后疤痕组织减少。^逻^乂,资y^冷存i #/^效/产举茇#为了研究诸如350的肌肉生长抑制素拮抗剂在增强创伤愈合中的功效， 用虎蛇毒素使1岁大的野生型小鼠(C57 Black)受损伤并注射350 (参见实 施例1中的方法)。典型地，在虎蛇毒素损伤后，肌肉重量起初由于产生的 水肿而增加，然后由于受损的肌纤维坏死而降低，所述受损肌纤维从受损 位点处被清除。这以后，肌肉重量由于新纤维的生长而开始增加。试验结 果显示在第7和10天，350处理的肌肉的重量丧失不如注射对照盐水的肌 肉的多(图8)。这可能是由于较快修复受损的肌肉而造成的。提供的分子数 据(图4)确实支持以下假说即在350治疗的小鼠中，受损的肌肉较快地 愈合是由于巨噬细胞迁移的加速和增强以及较早讨论的其它加速肌肉再生 的过程的组合而造成的，所述其它加速创伤愈合的过程与肌肉生长抑制素 拮抗剂用于创伤愈合的用途有关。组织学分析证实了盐水和350处理的肌肉之间的差异。苏木精和曙红 染色显示了与盐水处理的肌肉相比，在用350处理的肌肉中初生肌纤维较 早的形成了，而且相关地坏死区域较早的减少？(图9)。该结果证实了在 350处理的小鼠中肌肉创伤愈合加速并增强了。分析图9所示的组织学数据 以定量整个肌肉横切面视野区域上的愈合的和未愈合的面积。肌肉切片始 终取自每片肌肉中间饱满部分。图10中所示的分析显示，与350治疗的小
鼠相比，在第7天在盐水治疗的对照小鼠中未再生的面积增加了。结果，与350处理的小鼠相比，在第7天在对照中有相对较多的肌肉组织丧失。 在第IO天也见到了相同的效果。这些结果确认了，用350蛋白质治疗在从 创伤损伤中恢复的肌肉中导致较少的肌肉组织丧失。这预期能导致愈合肌 肉的功能性增强。另外，4企测月交原的Van Geisen染色显示在施用虎蛇毒素后第10和28 天，与盐水处理的肌肉相比，胶原沉积的水平在350处理的肌肉中下降了， 这显示在伤口愈合过程中，350处理能减少纤维变性(图11)。该结果证明 了 ，诸如350的肌肉生长抑制素拮抗剂在创伤愈合期间减少了疤痕组织(纤 维变性)的形成。此外，较少的疤痕组织以及增多的肌肉组织将显著增加用 3 5 0处理的愈合肌肉与对照相比的功能性。利用VanGeisen染色成像，施用虎蛇毒素后第28天测量随机挑选的再 生的纤维区域以评估纤维大小(图12)。得自该分析的结果显示，来自350 处理的肌肉的恢复的肌纤维显著大于盐水处理的肌肉。经修复的肌纤维大 小增加确认了由于通过350抑制肌肉生长抑制素功能而诱导出肌肉细胞的 肥大。为了进一步确认350处理的小鼠中创伤愈合增加部分是由于卫星细胞 活化增加而造成的，我们对Pax7和MyoD蛋白的表达进行了分子分析。 Pax7蛋白是卫星细胞的标记物，而MyoD的表达表示卫星细胞的活化。蛋 白质分析确认卫星细胞水平和活化增加(图13)。用350治疗的Pax7水平 (图13A)在第3、 7、 10、和28天较高，这显示与盐水处理的肌肉相比，卫 星细胞活化增加了。另外，在350处理的肌肉中，Pax7水平在第7和10 天之间增加了，而相反，在盐水处理的肌肉中观察到了下降。这显示了， 在350处理的肌肉中，在第10天左右卫星细胞活化增加了 。用350治疗的 MyoD水平(图13B)在第3、 7、和10天也较高，这显示与盐水处理的肌肉 相比，增加了肌形成。综合考虑，在350处理的组织中较高的Pax7和MyoD 水平支持了卫星细胞活化的观察结果，因此继而肌形成增加了。该结果确 认了用350处理能加速并增强创伤愈合。350诱导创伤愈合增强 为了评估在创伤位点直接应用350对增强创伤愈合的有效性，将350后正在再生的胫骨前肌上。未受损的右胫骨前肌用作为对照。在创伤后第2、 4、 7、 10和21天收集受损的和对照肌肉并确定 它们的重量。在创伤后第2和4天，在注射350和注射盐水的胫骨前肌中 都观察到了由于炎性浸润造成的最初的肌肉重量增力口(图14)。在对肌肉进行 创伤后第7至10天，注射350和注射盐水的胫骨前肌都恢复到它们的正常 重量。可是，在创伤后第21天，与盐水处理的肌肉相比，注射350的胫骨 前肌显示出通过肌肉重量反映出的肌肉大小显著增加。讨论肌肉生长抑制素是有效的肌肉形成负调节剂。令人惊讶地，当前结果 证实了，肌肉生长抑制素也参与调节炎性应答，并从而控制肌肉愈合过程 和疤痕组织形成。作为正常创伤愈合过程的部分，创伤后巨噬细胞立即浸 润创伤位点，并通过释放趋化因子参与愈合过程的关键步骤，如调节皮肤 "和其他组织中的上皮形成、组织重塑和血管生成。组织学数据清楚证明了，与野生型小鼠相比，巨噬细胞和成肌细胞向 肌肉生长抑制素；小鼠的胫骨肌前肌创伤区域的浸润增加并加速(图1)。其 次，在肌肉生长抑制素；小鼠中，新的肌纤维替代了大部分丧失的肌纤维， 而结締组织的积聚减少了(图7)。在受伤的肌肉中，受损的肌纤维会坏死。 在创伤愈合期间，小血管、单核细胞和活化的巨噬细胞侵入坏死区域。这 些活化的淋巴细胞同时分泌几种细胞因子和生长因子，其在趋化性和随之 的创伤愈合过程中起关键作用。更重要的是，在损伤位点上释放生长因子 还调节了成肌细胞迁移、增殖和分化，从而促进肌肉创伤愈合和修复26。本 文显示，肌肉生长抑制素拮抗剂通过增加较早的成肌细胞的积聚而增加组 织修复，从而加速愈合。先前显示，在许多创伤类型中，受创伤后肌肉生长抑制素很快出现在 创伤位点。本文显示在趋化性实验中，肌肉生长抑制素抑制了巨噬细胞和 成肌细胞的迁移。重要的是，加入诸如350的肌肉生长抑制素拮抗剂成功 克服肌肉生长抑制素对成肌细胞和巨噬细胞迁移的负效应。因此当用肌肉 生长抑制素拮抗剂处理损伤组织时，巨噬细胞和成肌细胞向创伤位点的迁 移的加速和增强导致创伤愈合改善。我们的结果显示有效的肌肉生长抑制 素拮抗剂350在注射入正在创伤愈合的小鼠中时，可增进创伤愈合。纤维变性是创伤愈合过程的一部分，但过多的纤维变性导致留下疤痕 并减少组织的功能。成纤维细胞在胶原沉积和创伤的疤痕形成中起主要作 用。研究在此前已经将成纤维细胞积聚的程度与皮肤烧伤创伤的疤痕相关 联"。我们在本文中显示，肌肉生长抑制素是强有力的成纤维细胞化学引诱 物，而以前已显示肌肉生长抑制素在受创伤后不久在创伤组织中以增加的 水平积聚。在肌肉生长抑制素缺失的小鼠中减少了切伤位点处成纤维细胞 的积聚，继而减少了在痊愈的创伤处的疤痕形成。重要的是，本文提供的 数据显示，通过局部和全身施用拮抗剂而得到的拮抗肌肉生长抑制素的能 力在已经历创伤愈合的组织中继而导致减少组织中胶原积聚和疤痕形成。 在许多纤维变性疾病中发现胶原是主要的病理检查所见27。因此预计，通过 施用肌肉生长抑制素抑制剂可以治疗其他医学状况，如嚢性纤维化、胰腺 的纤维嚢性疾病、胰管粘稠物阻塞症、胰嚢性纤维化、骨髓纤维化、特发 性肺纤维变性、肝纤维变性、硬皮病、成骨不全或特征在于胶原和纤维变 性组织过度沉积的任何其他的纤维变性状况。结论本文显示，全身和局部使用的肌肉生长抑制素抑制剂通过加速和增强 几种关键过程来增加创伤愈合的速率。也显示，应用肌肉生长抑制素抑制 剂可在最终痊愈的创伤位点上减少胶原沉积，其防止组织功能的丧失或由 于结疤造成的美容性损害。上述实施例的目的不在于限制本发明的范围。所属领域技术人员将能 认识到，许多变化也是可能的而不超出本发明的范围(如所附权利要求书 所设定的)。参考文献1. 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权利要求
1. 增进组织创伤愈合的方法，包括向有需要的人或非人患者施用有效 量的至少 一种肌肉生长抑制素拮抗剂的步骤。
2. 如权利要求l所述的方法，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂选自 由下列所组成的组-抗月几肉生长抑制素抗体；-肌肉生长抑制素肽免疫原、肌肉生长抑制素多聚体或肌肉生长抑制 素免疫缀合物，其能引发免疫应答并阻断肌肉生长抑制素活性；-肌肉生长抑制素的蛋白质抑制剂，其选自截短的激活蛋白II型受体、 肌肉生长抑制素前域和卵泡抑素、或所述蛋白质抑制剂的功能片段；-从过量表达肌肉生长抑制素的细胞中释放到培养物中的肌肉生长抑 制素抑制剂；-显性阴性的肌肉生长抑制素，其选自Piedmontese等位基因和成熟的 肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑制素肽在氨基酸第335至375位 上或氨基酸第335至375位之间具有C-末端截短；-包含氨基酸序列WMCPP的小肽，而且其能结合并抑制肌肉生长抑 制素；-肌肉生长抑制素的剪接变体；-肌肉生长抑制素途径的调节剂；和-反义多核苷酸、RNAi、 siRNA或抗肌肉生长抑制素核酶，其能通过
3. 如权利要求2所述的方法，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂是显 性阴性的肌肉生长抑制素，所述显性阴性的肌肉生长抑制素选自 Piedmontese等位基因和成熟的肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑 制素肽在氨基酸第335至375位上或氨基酸第335至375位之间具有C-末端截短。
4. 如权利要求3所述的方法，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂是成 熟的肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑制素肽在氨基酸第335或 350位上具有C-末端截短。
5. 如权利要求2所述的方法，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂是肌 肉生长抑制素的剪接变体，所述剪接变体选自多肽SEQIDNO: 8-14、或其 功能片段或变体、或与其具有95%、 90%、 85%、 80%、 75%或70%序列同一性的序列。
6. 如权利要求2所述的方法，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂是肌 肉生长抑制素途径的调节剂，其包含"强效"肽SEQIDNO: 16或SEQIDNO: 18、或其功能片段或变体、或与其具有至少95%、卯％、 85%、 80%、 75% 或70%序列同一性的序列。
7. 如权利要求l-6任一项所述的方法，其用于增进以下的创伤的愈合 浅表皮肤创伤，包括割伤和擦伤；贯穿皮肤和肌肉的深层创伤，包括外科 手术切口；内伤，包括由运动损伤或外伤造成的肌肉和肌腱创伤，挫伤和 血肿；和烧伤。
8. 如权利要求l-7任一项所述的方法，其中一种或多种额外的免疫应答 化合物与至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂分开、顺序或同时联合施用以进 一步增进创伤愈合，所述免疫应答化合物选自由糖皮质激素、非甾族抗炎 药(NSAID)、 PDGF、 EGF、 IGF和TNF-a拮抗剂组成的组。
9. 如权利要求l-7任一项所述的方法，其中至少一种肌肉生长抑制素拮 抗剂配制成用于局部或全身施用。
10. 如权利要求9所述的方法，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂配 制成用于口服、静脉内、经皮、皮下、皮内、局部、鼻腔、肺部、肌肉内 或腹膜内施用。
11. 至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂在制备用于增进有需要的人或非 人患者的组织创伤愈合的药物中的用途。
12. 如权利要求ll所述的用途，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂选 自由下列所组成的组-抗肌肉生长抑制素抗体；-肌肉生长抑制素肽免疫原、肌肉生长抑制素多聚体或肌肉生长抑制 素免疫缀合物，其能引发免疫应答并阻断肌肉生长抑制素活性；-肌肉生长抑制素的蛋白质抑制剂，其选自截短的激活蛋白n型受体、肌肉生长抑制素前域和卵泡抑素、或所述蛋白质抑制剂的功能片段；-从过量表达肌肉生长抑制素的细胞中释放到培养物中的肌肉生长抑 制素抑制剂；-显性阴性的肌肉生长抑制素，其选自Piedmontese等位基因和成熟的 肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑制素肽在氨基酸第335至375位 上或氨基酸第335至375位之间具有C-末端截短；-包含氨基酸序列WMCPP的小狀，而且其能结合并抑制肌肉生长抑 制素；-肌肉生长抑制素的剪接变体；-肌肉生长抑制素途径的调节剂；和-反义多核苷酸、RNAi、 siRNA或抗肌肉生长抑制素核酶，其能通过
13. 如权利要求12所述的用途，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂是 显性阴性的肌肉生长抑制素，所述显性阴性的肌肉生长抑制素选自 Piedmontese等位基因和成熟的肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑 制素肽在氨基酸第335至375位上或氨基酸第335至375位之间具有C-末端截短。
14. 如权利要求13所述的用途，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂是 成熟的肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑制素肽在氨基酸第335或 350位上具有C-末端截短。
15. 如权利要求12所述的用途，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂是 肌肉生长抑制素的剪接变体，所述剪接变体选自多肽SEQIDNO: 8-14、或 其功能片段或变体、或与其具有95%、 90%、 85%、 80%、 75%或70%序列同 一性的序列。
16. 如权利要求12所述的用途，其中至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂是 肌肉生长抑制素途径的调节剂，所述调节剂包含"强效"肽SEQ ID NO: 16 或SEQIDNO: 18、或其功能片段或变体、或与其具有至少95%、 90%、 85%、 80%、 75%或70%序列同 一性的序列。
17. 如权利要求11-16任一项所述的用途，其用于增进以下的创伤的愈 合浅表皮肤创伤，包括割伤和擦伤；贯穿皮肤和肌肉的深层创伤，包括 外科手术切口；内伤，包括由运动损伤或外伤造成的肌肉和肌腱创伤，挫 伤和血肺；和烧伤。
18. 如权利要求11-17任一项所述的用途，其中所述药物进一步包含选 自由糖皮质激素、非甾族抗炎药(NSAID)、 PDGF、 EGF、 IGF和TNF-a拮抗剂组成的组的 一种或多种额外的免疫应答化合物，并且其中该药物配制成 用于至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂和所述额外的化合物分开、顺序或同 时施用。
19. 如权利要求11-17任一项所述的用途，其中该药物配制成用于局部 或全身施用。
20. 如权利要求19所述的用途，其中所述药物配制成用于口服、静脉内、 经皮、皮下、皮内、局部、鼻腔、肺部、肌肉内或腹月莫内施用。
21. 药物化合物，其包含至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂和药学上可接 受的载体，所述药物化合物用于增进有需要的人或非人患者的创伤愈合的 方法中。
22. 如权利要求21所述的药物化合物，其中至少一种肌肉生长抑制素拮 抗剂选自由下列所组成的组-抗肌肉生长抑制素抗体；-月几肉生长抑制素肽免疫原、肌肉生长抑制素多聚体或肌肉生长抑制 素免疫缀合物，其能引发免疫应答并阻断肌肉生长抑制素活性；-肌肉生长抑制素的蛋白质抑制剂，其选自截短的激活蛋白II型受体、 肌肉生长抑制素前域和卵泡抑素、或所述蛋白质抑制剂的功能片段；-从过量表达肌肉生长抑制素的细胞中释放到培养物中的肌肉生长抑 制素抑制剂；-显性阴性的肌肉生长抑制素，其选自Piedmontese等位基因和成熟的 肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑制素肽在氨基酸第335至375位 上或氨基酸第335至375位之间具有C-末端截短；-包含氨基酸序列WMCPP的小肽，而且其能结合并抑制肌肉生长抑 制素；-肌肉生长抑制素的剪接变体；-月几肉生长抑制素途径的调节剂；和-反义多核苦酸、RNAi、 siRNA或抗肌肉生长抑制素核酶，其能通过
23.如权利要求22所述的药物化合物，其中至少一种肌肉生长抑制素拮 抗剂是显性阴性的肌肉生长抑制素，所述显性阴性的肌肉生长抑制素选自 Piedmontese等位基因和成熟的肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑 制素肽在氨基酸第335至375位上或氨基酸第335至375位之间具有C-末端截短。
24. 如权利要求23所述的药物化合物，其中至少一种肌肉生长抑制素拮 抗剂是成熟的肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑制素肽在氨基酸 第335或350位上具有C-末端截短。
25. 如权利要求22所述的药物化合物，其中至少一种肌肉生长抑制素拮 抗剂是肌肉生长抑制素的剪接变体，所述剪接变体选自多肽SEQ ID NO: 8-14、或其功能片段或变体、或与其具有95%、 90%、 85%、 80%、 75%或 70%序列同一性的序列。
26. 如权利要求22所述的药物化合物，其中至少一种肌肉生长抑制素拮 抗剂是肌肉生长抑制素途径的调节剂，所述调节剂包含"强效"肽SEQ ID NO: 16或SEQ ID NO: 18、或其功能片^R或变体、或与其具有至少95。/。、 90%、 85%、 80%、 75%或70%序列同一性的序列。
27. 如权利要求21-26任一项所述的药物化合物，其用于增进以下的创 伤的愈合表面皮肤创伤，包括割伤和擦伤；延伸穿过皮肤和肌肉的深层 创伤，包括外科手术切口；内伤，包括由运动损伤或外伤造成的肌肉和肌 腱创伤，挫伤和血肿；和烧伤。
28. 如权利要求21-27任一项所述的药物化合物，其进一步包含选自由 糖皮质激素、非甾族抗炎药(NSAID)、 PDGF、 EGF、 IGF和TNF-a拮抗剂组 成的组的一种或多种额外的免疫应答化合物，其中该组合物配制成与至少 一种肌肉生长抑制素拮抗剂分开、顺序或同时施用。
29. 如权利要求21-27任一项所述的药物组合物，其配制成用于局部或 全身施用。
30. 如权利要求29所述的药物化合物，其配制成用于口服、静脉内、经 皮、皮下、皮内、局部、鼻腔、肺部、肌肉内或腹膜内施用的配方。
31. 至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂，其用于增进有需要的人或非人患 者的创伤愈合的方法中。
32. 如权利要求31所述的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂，其选自由下 列所组成的组-抗肌肉生长抑制素抗体；-肌肉生长抑制素肽免疫原、肌肉生长抑制素多聚体或肌肉生长抑制 素免疫缀合物，其能引发免疫应答并阻断肌肉生长抑制素活性；-肌肉生长抑制素的蛋白质抑制剂，其选自截短的激活蛋白II型受体、肌肉生长抑制素前域和卵泡抑素、或所述蛋白质抑制剂的功能片段；-从过量表达肌肉生长抑制素的细胞中释放到培养物中的月/L肉生长抑 制素抑制剂；-显性阴性的肌肉生长抑制素，其选自Piedmontese等位基因和成熟的 肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑制素肽在氨基酸第335至375位 上或氨基酸第335至375位之间具有C-末端截短；-包含氨基酸序列WMCPP的小肽，而且其能结合并抑制肌肉生长抑 制素；-肌肉生长抑制素的剪接变体；-肌肉生长抑制素途径的调节剂；和-反义多核苷酸、RNAi、 siRNA或抗肌肉生长抑制素核酶，其能通过
33. 如权利要求32所述的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂，其包含显性 阴性的肌肉生长抑制素，其选自Piedmontese等位基因和成熟的肌肉生长抑 制素肽，所述成熟的肌肉生长抑制素肽在氨基酸第335至375位上或氨基酸 第335至375位之间具有C-末端截短。
34. 如权利要求33所述的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂，其包含成熟 的肌肉生长抑制素肽，所述成熟的肌肉生长抑制素肽在氨基酸第335或350 位上具有C-末端截短。
35. 如权利要求32所述的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂，其包含肌肉 生长抑制素的剪接变体，所述剪接变体选自多肽SEQIDNO: 8-14、或其功 能片段或变体、或与其具有95%、 90%、 85%、 80%、 75%或70%序列同一性 的序列。
36. 如权利要求32所述的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂，其包含肌肉 生长抑制素途径的调节剂，所述调节剂包含"强效"肽SEQIDNO: 16或SEQ ID NO: 18、或其功能片段或变体、或与其具有至少95%、 90%、 85%、 80%、 75%或70%序列同一性的序列。
37. 如权利要求31-36任一项所述的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂， 其用于增进以下的创伤的愈合表面皮肤创伤，包括割伤和擦伤；延伸穿 过皮肤和肌肉的深层创伤，包括外科手术切口；内伤，包括由运动损伤或 外伤造成的肌肉和肌腱创伤，挫伤和血肿；和烧伤。
38. 如权利要求31-37任一项所述的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂， 其与选自由糖皮质激素、非甾族抗炎药(NSAID)、 PDGF、 EGF、 IGF和TNF-a 拮抗剂组成的组的一种或多种其他的免疫应答化合物组合在一起，用于与 至少 一种肌肉生长抑制素拮抗剂分开、顺序或同时施用以进一 步增进创伤 愈合。
39. 如权利要求31-37任一项所述的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂， 其配制成用于局部或全身施用。
40. 如权利要求34所述的至少一种肌肉生长抑制素拮抗剂配制成用于 口服、静脉内、经皮、皮下、皮内、局部、鼻腔、肺部、肌肉内或腹膜内 施用。
41. 治疗纤维变性疾病或病症的方法，其包括向有需要的患者施用治疗 有效量的肌肉生长抑制素拮抗剂。
全文摘要
本发明涉及通过利用一种或多种肌肉生长抑制素拮抗剂抑制肌肉生长抑制素(GDF-8)活性而增进人或动物患者的创伤愈合的方法。本发明还涉及治疗纤维变性疾病或病症的方法，包含施用肌肉生长抑制素拮抗剂。
文档编号A61K38/18GK101146547SQ200680009255
公开日2008年3月19日 申请日期2006年2月7日 优先权日2005年2月7日
发明者亚历克斯·亨内布里, 姆里杜拉·沙玛, 拉维·坎巴德, 莫妮卡·森纳塞勒诺德莫拉 申请人:奥里科有限公司