用炔诺酮及其类似物治疗肌萎缩性侧索硬化的制作方法

专利名称：用炔诺酮及其类似物治疗肌萎缩性侧索硬化的制作方法
用炔诺酮及其类似物治疗肌萎缩性侧索硬化 相关申请本申请要求2005年3月4日提交的美国临时申请No. 60/658,630的优先权的权益，其全部公开内容在此引入作为参考。发明背景肌萎缩性侧索硬化(ALS)是最常见诊断的进行性运动神经元疾病。该 疾病特征在于皮质、脑千和脊髓中运动神经元的变性(Principles of Internal Medicine, 1991 McGraw-Hill, Inc., New York; Tandan等人， (1985)y4m . A/e〃ra/' 18:271-280页，419-431页)。疾病的病因是未^口的， 而且当患者开始经历不对称的四肢软弱和疲劳，上肢的局限的肌束震颤和 /或大腿的痉挛状态时，其是表示发作，才可能诊断ALS。对于ALS的至 少一些发病率存在遗传组分。在几乎所有的病例中，散发性ALS和常染色体的显性家族性ALS (FALS)在临床上相似(Mulder等人，(1986年)Neurology, 36:511-517 页)。已经显示了，在一些并非所有FALS谱系中，此疾病是与染色体21q 上的遗传缺陷相关联(Siddique等人，(1991年)New Engl.丄Med., 324:1381-1384页)。特别地，位于染色体21q上的SOD-1基因的突变，似乎是与ALS 的家族型相关。SOD-1上的不同突变的有害作用最大可能是通过毒性作 用的增加而不是SOD-1活性的丧失介导的(AI-Chalabi和Leigh, (2000) Curr. Opin. Neurol, 13, 397-405; Mxsky等人，(2000年)H隐GeneTher.， 11， 2315-2329页)。尽管毒性不清楚，但存在证据表明蛋白质自身的消除 将改善毒性。需要开发可改变神经变性疾病的病程或延长患有该疾病的患者的存 活时间的疗法。特别地，需要减少ALS患者脑和脊髓中产生的SOD-1。 预防野生型或突变型SOD-1蛋白质的生成，可以停止疾病发展并可改善 ALS症状。发明概述本发明公开了通过调节神经细胞内孕酮受体的活性治疗神经变性疾 病的方法和组合物。孕酮受体是配体活化的转录因子，其以高亲和力结合孕酮及其类似物并直接作用于基因组DNA以抑制或激活广谱的基因的表 达。孕酮受体见于神经细胞，例如脊髓的神经元细胞，和雄性动物和雌性 动物的几乎所有这种细胞，由此构成治疗神经变性疾病例如ALS的有用 的治疗草巴点。本发明的方法和组合物可用于减少或抑制与神经变性疾病相关的蛋 白质例如SOD-1的表达，这是通过给药孕酮相关的化合物例如炔诺酮， 其通过孕酮受体作用以抑制SOD-1 mRNA转录或转录物的稳定性。 SOD-1 mRNA的减少然后导致SOD-1的蛋白质水平降低，这样就减少其 在细胞内的蓄积并改善疾病。突变型SOD-1的表达和蓄积是广泛认可的 家族ALS的病理生理学机制，还可能在散发性型的疾病中起作用。因此，在一方面，本发明涉及减少细胞内SOD蛋白质产生的方法， 包括向细胞给药孕酮受体调节药物，以便药物与孕酮受体相互作用并抑制 编码SOD蛋白质的基因的转录。该细胞可以是例如患有ALS的受试者(例 如，家族型ALS)体内的神经细胞或脊髓、脑膜(meningial)组织或肌肉 细胞中的任何细胞。SOD蛋白质可以是SOD-1蛋白质。细胞的实例包括， 但不限于神经元、中间神经元、神经胶质细胞、小神经胶质细胞、肌肉细 胞、与免疫反应相关的细胞等等。孕酮受体调节药物可选自左炔诺孕酮、18-曱基炔诺酮、去氧孕烯、 3-酮基去氧孕烯、炔诺酮、孕二烯酮、炔诺酮乙酸盐、炔诺將酯、奥沙特 隆、醋酸环丙孕酮、曲美孕酮、地诺孕素、屈螺酮、诺美孕酮或(17-脱乙 酰基)炔诺肟酯及其类似物。在一个实施方案中，孕酮受体调节药物是孕 酮及其类似物。在另一个实施方案中，孕酮受体调节药物是炔诺酮及其类 似物。抑制基因的转录包括，通过测量SOD蛋白质例如SOD-1蛋白质的 表达水平的监测。选择性地，抑制基因的转录包括，监测编码SOD蛋白 质的核酸分子的水平，例如通过监测核糖核酸或脱氧核酸水平。在另一个方面，本发明涉及预防、改善或治疗受试者的ALS的症状 或进展的方法，该方法是通过向受试者给药治疗有效量的孕酮受体调节药 物，其中该药物与孕酮受体相互作用并抑制编码SOD-1蛋白质的基因的 转录。通过测量受试者存活延长，例如通过监测受试者的神经功能评分，可以监测症状的改善，选择性地，通过监测SOD-1蛋白质的表达水平或 编码SOD-1蛋白质的核酸分子的水平可以监测改善。附图简述

图1是显示了使用炔诺酮减少SOD-1蛋白质表达的图。图2是柱状图，显示了炔诺酮与孕酮拮抗剂米非司酮(RU-486)的剂量相关的逆转作用。图3是柱状图，显示了使用乙胺嘧啶(ALG-2001)和炔诺酮(ALG-3001)治疗之后，HeLa细胞中用于a-突触核蛋白(alpha-synudein )的mRNA表达减少o图4是柱状图，显示了 G93A小鼠腹膜内注射(ip)炔诺酮治疗14天 之后，小鼠脊髓中SOD-1蛋白质的减少。发明详述子生物学和重组体DNA技术的常规方法。这样的技术在文献中有完全的 i兌明。(参见，例3口 Sambrook等人的Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Current Edition); DNA Cloning: A Practical Approach, Vol. I & II (D. Glover编辑)；Oligonucleotide Synthesis (N. Gait编辑，Current Edition); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins编辑， Current Edition); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins 编辑，Current Edition); CRC Handbook of Parvoviruses, vol. I & II (P. Tijessen编辑)；Fundamental Virology,第二版，Vol. I & II (B. N. Fields 和D. M. Knipe编辑))。为了更清楚地理解本发明，定义了以下术语术语"神经变性障碍"或"神经变性疾病"在本文中是可互换使用的， 指的是单个受试者或受试者群中正常神经功能的损伤或丧失，或者异常神 经功能的存在。例如，神经学上的障碍可以是疾病、损伤和/或老化的结 果。如本文所用的，神经变性障碍还包括引起单个神经细胞或一群神经细 胞的形态和/或功能异常的神经变性。形态学和功能的异常的非限制实例 包括神经细胞的自然衰退和/或死亡、神经细胞的异常生长模式、神经细 胞之间的物理连接上的异常、神经细胞产生的 一种物质或多种物质例如神经递质的不足或过量、神经细胞未能产生其正常产生的一种物质或多种物 质、在异常才莫式或异常时间下的电脉冲的传递和/或物质例如神经递质的 产生。神经变性可以在受试者脑部的任何区域发生，而且在多种疾病中看到，所述疾病包括例如肌萎缩性侧索硬化(ALS)、多发性硬化、亨延顿(氏) 舞蹈病、帕金森病、阿尔茨海默(氏)病、朊病毒相关性疾病(CJD)、脊髓 性肌萎缩、脊柱小脑性共济失调以及脊髓损伤。术语"调节"或"正在调节"或"已调节"在本文中可互换使用，还 指的是改变SOD-1活性或表达，即增加或减少SOD-1活性或表达，使 得在单个受试者或受试者群中，调节产生治疗效应。疗效是这样的，其导 致ALS症状或进展的改善。通过定量或定性测量SOD-1蛋白质水平例如 通过蛋白印迹分析，可以测量活性的改变。在孕酮受体调节剂如炔诺酮存 在下，定量分析可用于测量SOD-1蛋白质水平的向下调节或向上调节。 适合的孕酮受体调节剂可以是这样的，通过与对照相比向下调节SOD-1 表达约5%-约50 0/。。还可以通过定量或定性测量与SOD-1相关的核酸水 平来测量表达的改变，例如通过测量RNA或DNA的表达水平。通过检查单个受试者或受试者群的存活，还可以调查研究孕酮受体调 节对于单个受试者或受试者群的效果。例如，通过在神经变性疾病例如 ALS的一个或多个动物模型中测量存活率的改变或存活的延长。存活率 的改变可以归因于向ALS鼠科动物模型给药孕酮受体调节剂如炔诺酮。 比较已经给予对照剂或没有给予药物的对照组的ALS小鼠，基于试验组 的ALS小鼠的存活天数的增加，可以确定孕酮受体药理学调节剂对于孕 酮受体的作用。在一个实施方案中，孕酮受体调节剂增加单个受试者或受 试者群(例如，雄性动物群或雌性动物群)的存活率的百分比效应至少2%-约100%。优选地，单个受试者或受试者群的存活率的百分比效应是至少 5%-约50%，至少10%-约25%。甚至更优选地，单个受试者或受试者群 的存活率的百分比效应是至少3%、 4%、 5%、 6%、 7%、 8%、 9%、 10%、 12%、 14%、 16%、 18%、 20%、 22%、 24%、 26%、 28%、 30%、 32%、 34%、 36%、 38%、 40%、 42%、 44%、 46%、 48%和50%。孕酮受体 调节的效应还可以通过检查单个受试者或受试者群神经功能评分确定，例 如，通过评估肌肉运动的改善，或者通过检查疾病症状的减轻或好转。在 一个优选的实施方案中，单个受试者或受试者群的神经功能评分显著地不 同于未治疗的对照受试者的神经功能评分，具有介于p<0.05至p<0.001的显著水平，如使用标准统计分析方法确定。该术语还可以用于指孕酮受体活性、结构或孕酮受体的表达、或孕酮 受体的亚基中的变化，即孕酮受体活性、或表达的增加或减少，以便在单 个受试者或受试者群中调节产生疗效。如本文所用的术语"药物"和"孕酮受体调节药物"意在可互换使用， 这些术语是指用于调节受试者体内孕酮受体活性的单个化合物或多种化 合物。优选地，孕酮受体调节药物是孕酮，例如炔诺酮。术语"药物"和 "孕酮受体调节药物"还意在包括与孕酮具有相似结构和功能的其他化合 物。如本文所用的术语"抑制"或"正在抑制"是指靶基因或靶蛋白质例如SOD-1的表达的可测量的减少。该术语还指耙蛋白质的活性的可测量 的降低。优选地，表达的降低是至少约化％。更优选地，表达的降低是 约20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 80%、 90%，且甚至更优选是约100%。 如本文所用的术语"与SOD活性相关的障碍"或"与SOD活性相 关的疾病，，是指与SOD蛋白质(例^口， SOD國1、 SOD画2、 SOD画2、 SOD画3 等等)的表达相关的任何疾病状态。特别地，该术语是指与SOD蛋白质产 生相关的毒性功能的获得。SOD蛋白质可以是野生型SOD蛋白质或突变 型SOD蛋白质，而且可以衍生于野生型SOD基因或具有至少一种突变 的SOD基因。如本文所用的术语"受试者"是指任何活的生物，在其中引发免疫反 应。术语受试者包括，但不限于人类、非人的灵长类如黑猩猩和其他猿类 及猴类；家畜类如牛、绵羊、猪、山羊及马；驯养哺乳动物类如狗和猫； 实验室动物类包括啮齿类动物如小鼠、大鼠和豚鼠等等。该术语不表示特 定的年龄或性别。因此，成年和新生受试者，以及胎儿，无论雄性或雌性， 都意味着被包括在内。I.神经变性疾病在一个方面，本发明涉及通过给药孕酮受体调节药物来改变细胞中 SOD蛋白质的表达。该细胞可以是牵涉SOD蛋白质的神经变性疾病如肌 萎缩性侧索硬化(ALS)中相关的神经细胞。所述孕酮受体是配体活化的转 录因子，其以高亲和力结合孕酮及其类似物并直接作用于基因组DNA以 抑制或激活广谱基因的表达。孕酮受体是在脊髓及雄性动物和雌性动物的几乎所有细胞中发现的，因此构成神经变性疾病例如ALS的有效治疗靶 点。孕酮受体功能的改变可以是处于许多神经变性的病症的中心，所述病 症包括例如ALS、阿尔茨海默(氏)病、帕金森病、亨延顿(氏)舞蹈病和多 发性硬化，各自在以下描述。肌萎缩性侧索硬化(ALS),也称为Lou Gehrig病，是一种致命的影响 皮质、脑干和脊髓的运动神经元的神经变性疾病(Hirano， (1996) Neurology, 47(4 Suppl. 2): S63-6)。 ALS的发病发生于40岁或50岁的 人(发病的年龄中位数是57),在诊断后2-5年之内是致命的(Williams等 人(199" Mayo Clin. Proc， 66: 54-82页)。每年在美国，ALS影响大约 30,000个美国人，差不多8,000人报道死亡。ALS病人进行性地丧失所 有运动功能-不能够独立地行走、说话或呼吸。ALS的主要特征是丧失脊柱的运动神经元，其引起在神经元控制下 的肌肉变弱并消瘦，导致麻痹。ALS具有家族型(5-10。/o)和散发性型，且 家族型目前已经是连接若千不同的遗传基因座(Deng，等人(1995) Hum. Mol. Genet.， 4: "13-16页；Siddique,等人(1995) Clin. Neurosci.， 3: 338-47页；Siddique,等人(1997)丄Neural Transm. Suppl,， 49: 219-33 页；Ben Hamida,等人(1990) Brain, 113: 347-63页；Yang，等人(2001) Nat. Genet. 29: 160-65页；Hadano,等人(2001) Nat. Genet. 29: 166-73)。约15-20%的家族型病例是归因于编码Cu/Zn超氧化物歧化酶 1 (SOD1)的基因的突变(Siddique,等人(199l)N. Engl.丄Med., 324: 1381-84; Rosen,等人(1993) Nature, 362: 59-62)。尽管疾病的病因是未知的， 一个理论是ALS中的神经元细胞死亡是 神经元细胞过度兴奋的结果，这是由于过量的细胞外谷氨酸所致。谷氨酸 是由谷氨酰胺能神经元释放神经递质，并摄取进入神经胶质细胞的，在其 中通过酶谷氨酰胺合成酶转化成谷氨酰胺，谷氨酰胺然后再进入神经元并 由谷氨酰胺酶水解形成谷氨酸，由此再补充神经递质池。在正常的脊髓和 脑干中，在细胞外液中细胞外的谷氨酸水平保持在低微摩尔水平，因为神 经胶质细胞，其部分作用于支持神经元，使用兴奋性的氨基酸2型运载 体(EAAT2)蛋白质来立刻吸收谷氨酸。将患有ALS病人中正常EAAT2 蛋白质的缺乏确认为在疾病的病理学上是重要的(参见，例如Meyer等人 (1998)丄Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 65: 594-596页；Aoki等人 (1998) Ann. Neurol. 43: 645-653; Bristol等人(1996) Ann Neurol. 39:676-679页)。EAAT2水平降低的一个解释是，EAAT2被异常剪接(Lin等 人(1998) Neuron， 20: 589-602页)。异常剪接产生了缺失45-107个氨基 酸的剪接变体，所述氨基酸位于EAAT2蛋白质的C-端区域(Meyer等人， (1998) Neureosci Lett. 241 : 68-70页)。由于EAAT2的缺乏或缺陷，细 胞外谷氨酸蓄积，引起神经元不断地发热。谷氨酸的蓄积对神经元细胞具 有毒性作用，因为神经元的连续发热导致细胞早死亡。尽管对于ALS的病理学是详细知道的，对于散发性型的发病机制和 家族型ALS中突变型SOD蛋白质的病因性质几乎未知(Bruijn，等人(1996) Neuropathol. Appl. Neurobiol' 22: 373-87; Bmijn，等人(1998) Science 281: 1851-54)。推测了很多模型，包括谷氨酸毒性、缺氧、氧化应激、 蛋白质聚集体、神经丝和线粒体的功能障碍，Cleveland,等人(1995) Nature 378: 342-43页；Cleveland,等人，Neurology, 47(4 Suppl. 2): S54-61页，discussion S61-2(1996); Cleveland, (1999) Neuron, 24: 515-20; Cleveland,等人(2001) Nat. Rev. Neurosci.， 2: 806-19页； Couillard-Despres,等人(1998) Proa Natl. Acad. Set USA, 95: 9626-30 页；Mitsumoto, (1997) Ann. Pharmacother.， 31: 779-81页；Skene，等人 (2001) Nat. Genet. 28: 107-8页；Williamson,等人(2000) Science, 288: 399)。目前，不能治愈ALS,也没有证明对预防或逆转疾病的病程有效的 疗法。最近，食品药品监督管理局(FDA)批准了多种药物。到目前为止， 治疗ALS的尝试包括使用具有细胞保护作用的长链脂肪醇治疗神经元的 变性(参见美国专利No. 5,135,956);或者使用丙酮酸的盐(参见美国专利 No. 5,395,822);并使用谷氨酰胺合成酶来阻止谷氨酸级联(参见美国专利 No. 5,906,976)。例如，利鲁唑TM ( Riluzole ), —种谷氨酸释放抑制剂， 在美国已经批准用于治疗ALS,看起来是延长了至少部分ALS病人的生 命。然而， 一些报道指出，即使利鲁唑tm治疗可以延长存活时间，其似 乎没有提供病人肌肉强度的改善。因此，利鲁唑tm的作用是有限的，因 为治疗没有改进病人的生活质量(Borras-Blasco等人(1998) Rev. Neurol.， 27: 1021-1027)。II. SOD和SOD突变本发明涉及通过使用孕酮受体调节剂及其类似物减少或消除蛋白质的表达，减少细胞中的SOD-1蛋白质(例如，突变型SOD-1蛋白质)。 SOD-1基因集中于染色体21q22.1。 SOD-1序列公开于PCT公布W〇 94/19493中，是编码SOD-1的寡核苦酸序列，通常要求的是编码突变型 或野生型SOD-1的基因的反义DNA同源序列(homolog)在制备用于治 疗患病病人的医药中的用途。人SOD-1基因的核酸序列可以在Genbank 登录号NM—000454中找到。人SOD-1的核苷酸序列还在SEQ ID NO: 1 中给出。相应的SOD-1蛋白质序列在SEQ ID NO: 2中给出。III.通过核受体抑制SOD表达的化合物在一个方面，本发明涉及使用改变SOD例如SOD-1的基因表达或 蛋白质生成的孕酮受体调节剂。孕酮受体是配体激活的转录因子，其以高 亲和力结合孕酮及其类似物并直接作用于基因组DNA来抑制或激活广谱 基因的表达。孕酮受体在神经变性障碍中涉及。在啮齿类动物和人类中， 孕酮受体基因编码称为PRA和PRB的两种蛋白质。两种同种型是两种 选择性启动子的转录及在两种不同AUG密码子处开始翻译的结果。根据 其结构和功能特性，它们的生理学作用是不同的。PRA和PRB可激活不 同的基因，其表达的比例在细胞命运中是重要的(Richer等人(2002) J Biol Chem 277:5209-5218页和Shyamala等人(20(D0) Proc Natl Acad Sci USA, 97:3044-3049页)。孕酮受体属于核受体超家族。核受体超家族成员的大约70个已经鉴 别(Moras & Gronemeyer 1998)。其中仅有一些是配体-结合受体，而其 他的属于所谓孤儿受体的亚家族，其特异性配体尚未识别或甚至可能不存 在(O'malley & Conneely 1992)。孕酮受体可通过与靶基因的调节区的特 异性元件相互作用直接调节基因表达，或者通过激活不同的生长因子信号 途径间接地调节基因表达。核受体超家族的结构特征是相似的。各自具有四种主要功能区N-末端反式激活结构域(TAD)、中心DNA-结合结构域(DBD)、 C-末端配体 结合结构域(LBD)及连接DBD和LBD的铰链区(Mangelsdorf等人，1995 年)。两个自发反式激活功能，即起源于N-末端的组成型活性激活功能 (AF-1)和LBD中出现的配体依赖性的激活功能(AF-2),是造成核受体转 录活性的原因(Gronemeyer & Laudet 1995)。核受体的DBD表现出与超家族其他成员高度的氨基酸序列同一性。因而，四种受体识别非常相似，如果不同的话，核DNA中的激素应答元 件(HREs)。配体(例如，孕酮或雌激素)结合位于分子C-末端的LBD产生的构形 变化，是造成激活配体应答的原因。尽管不同核受体家族的LBDs之间低 至20%的低序列同源性，但是所有核受体在此区域分享相似的褶(fold)。 它们包含排列在所谓的a-螺旋状夹层中的最多至12个螺旋和小片。AF-1 和AF-2反式激活功能是分别位于核受体的TAD和LBD,它们的活性取 决于恢复辅助激活因子分子以形成基因转录的活性前起始位点(Onate等 人，1998， Bevan等人，1999)。其LBD缺失的受体是构成有效的，揭示 了 AF-1是不依赖于配体的。在维曱酸受体(RAR)(Durand等人，1994)、 类视黄醇-X受体(retinoic-X receptor) (RXR)(vom Baur等人，1998年)、 维生素D受体(Jimenez等人，1999)、 GR(Sheldon等人，1999年)、 PR (Onate等人，1998年)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARy) (Nolte 等人，1998年)、孕酮受体(ER) (Tora等人，1989年)及曱状腺激素受体 (THR)(Barettino等人，1994年)而不在AR (Berrevoets等人，1998年， Bevan等人，1999年)的LBDs中证明了强的AF隱2。通过影响核受体许多功能特性包括配体选择性和DNA结合能力的辅 调节因子影响核受体的转录活性。核受体辅调节因子参与靶基因的DNA 修饰，直接通过组蛋白的修饰或间接通过染色质-修饰复合物的恢复，以 及作用于基础转录机器的恢复(Heinlein & Chang 2002年)。 一些较好表 征的辅助调节因子是p160家族的成员、ARA70、 ARA55、 ARA54、 ARA267-a、 Smad誦3和A旧l (Yeh等人，1999a)。 ARA55和ARA70均 通过17P-雌二醇(E2)激活雄激素受体激活雄激素受体，而ARA70是最有 效的赋予E2雄激素活性的辅助激活因子(Miyamoto等人，1998， Yeh等 人，1998, Fujimoto等人，1999)。此外，已经揭示ARA55和Smad-3 用作转化生长因子-卩信号途径及雄激素/雄激素受体作用之间串扰 (cross-talk)的桥(Fujimoto等人，1999，Kang等人，2001年)。(i)依赖配体的激活配体，例如雌激素/孕酮扩散入靶细胞并结合核受体。配体结合引发 一系列导致通过受体调节靶基因的事件。占有的受体在其LBD中经历变构变化，并从热休克蛋白如hsp90、 hsp70和hsp56中解离(Roy等人.2001年)，复合例如二聚和易位，如果其早已不存在于神经核中。 一旦结 合核DNA中的激素应答元件(HRE),受体二聚体恢复辅助激活因子如 p 160家族以形成活性的前起始复合物并与基础转录机器相互作用来抑制 或触发靶基因的转录。(ii)不依赖配体的激活还可以通过在细胞表面发生的信号途径激活核受体。核受体，连同其 他转录因子一起，是通过可逆的磷酸化调节(Orti等人，1992)。激酶介导 的信号转导途径可能影响核受体的活性(Burnstein & Cidlowski 1993年)。 某些共有的磷酸化位点可以是DNA依赖性蛋白质激酶、蛋白激酶A、蛋 白激酶C、丝裂原活化激酶及酪蛋白激酶II的底物(Blok等人，1996年)。孕酮受体的天然的孕酮受体调节剂是孕酮配体，但是已经制得合成的 化合物如醋酸甲羟孕酮或左炔诺孕酮、炔诺酮，它们也用作配体。在一个 实施方案中，配体包括，但不限于Amen (孕激素曱羟孕酮)、Aygestin (孕激素炔诺酮)、Crinone(孕激素孕酮)、CombiPatch (雌激素/孕激 素组合雌二醇/炔诺酮乙酸盐经皮系统)、Curretab(孕激素甲羟孕酮)、 Cycrin (孕激素甲羟孕酮)、得普乐(Depo-Provera)(孕激素曱羟孕 酮)、Gesterol 50 (孕激素孕酮)、Gesterol LA 250(孕激素:羟孕酮)、 己酸羟孕酮注射剂(孕激素羟孕酮)、长效黄体酮制剂(孕激素羟孕酮)、 梅格施(孕激素曱地孕酮)、Pro-Span(孕激素羟孕酮)、Prodrox(孕激 素羟孕酮)、口服孕酮制剂(Prometrium)(孕激素孕酮)、普维拉 (Pro vera)(孕激素甲羟孕酮)。孕酮相关化合物的进一步实例包括， 但不限于第一代孕激素炔诺酮(例如，Ortho-Novum)和异炔诺酮 (Enovid);第二代孕激素炔诺酮乙酸盐(例如，Loestrin)和二乙酸炔诺醇 (例如，Demulen);第三代孕激素左炔诺孕酮(例如，Triphasil)、消旋-18-甲基炔诺酮(例如，Ovral);第四代孕激素去氧孕烯(例如，Desogen)、 孕二烯酮、炔诺肟酯(例如Ortho-Cyclen)、孕甾烷孕激素(Pregnane Progestin)、醋酸氯地孕酮、醋酸曱地孕酮及醋酸曱羟孕酮。特别是左炔 诺孕酮、18-曱基炔诺酮、去氧孕烯、3-酮基去氧孕烯、炔诺酮、孕二烯 酮、炔诺酮乙酸盐、炔_诺肟酯、奥沙特隆、醋酸环丙孕酮、曲美孕酮、地 诺孕素、屈螺酮、诺美孕酮或(17-脱乙酰基)炔诺將酯。在另一个实施方案中，配体是配体的组合，如雌激素和孕酮的组合。实例包括，但不限于倍美力(雌激素结合雌激素类)、倍美安(雌激素/孕 激素组合结合雌激素类和曱羟孕酮)、Premique (雌激素/孕激素组合结 合雌激素类和曱羟孕酮)、Premphase (雌激素/孕激素组合结合雌激素 类和甲羟孕酮)、Prempro (雌激素/孕激素组合结合雌激素类和曱羟孕 酮)，和Provelle 28(雌激素/孕激素组合结合雌激素类和甲羟孕酮)。配体结合孕酮受体以产生受体/配体复合物。这种复合物结合存在于 核DNA中的特定基因启动子。 一旦结合至DNA,该复合物调节mRNA 的生成及由该基因编码的蛋白质。因此，孕酮受体调节剂可以是FDA批 准的治疗药，其当前用于与SOD-1功能不相关的疾病，及其修饰的变体。 孕酮受体调节剂还可以是新合成的改变SOD-1表达的化合物。孕酮受体 调节剂可以是存在的已知与孕酮受体相互作用的治疗药，例如炔诺酮。激活的孕酮受体恢复一 系列重要的调节蛋白，其可以用作辅助激活因 子或辅阻遏物如SRC-1、 SRC-2和SRC-3， CBP/p300及其他。这些辅 调节蛋白可以调节组蛋白乙酰化/去乙酰化及染色质改型，且可能具有另 外的作用。孕酮受体复合物将结合特异性DNA序列、孕酮-响应元件，而 且将引发靶基因的转录。孕酮受体通过其天然配体激活的传统机制的全面 回顾已经广泛地在别处描述(Giangrande等人，(1999) Recent Prog Horm Res, 54:291-313页)。这种复合物激活序列提供了多个步骤，在其中可以 整合孕酮信号途径的其他调节机制。孕酮受体激活包括孕酮受体的四个位点，其在人类中是基础磷酸化的 (Ser81、 Ser162、 Ser 190和Ser 400),并在激素治疗上显示了快速的 双重增加。其他位点(Ser102、 Ser 294和Ser 345)是激素可诱导的，需 要1-2小时的治疗以达到最大的磷酸化。它们响应于激素的不同动力学揭 示了，这两组的磷酸化位点是不同信号途径和激酶的耙点，且起不同的功 能结构作用。磷酸化可能不可用作转录活性的调控开关，而是起放大或 减弱活性的作用(Clemm等人，(2000) Mol Endocrinol, 14:52-65)。已经 描述了涉及具有不同生长因子、神经递质和多肽激素的常规核PR途径的 几种串扰机制。大多数的研究指出，孕激素在细胞表面上调生长因子和细 胞因子受体。它们还在细胞质水平起作用以调节几种细胞内效应物，这是 通过增加例如Stat 5的水平和改变例如Stat 5的亚细胞区室化，且通过 加强丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)和Janus激酶活性(Lange等人，(1999) Mol Endocrinol 13:829-836页)。类固醇受体可以相互串扰(Migliaccio等人，(1998) EMBO J 17:2008-2018页)。Migliaccio等人描述了 PRB、 ERa和Src在细胞膜水平的相互作用，对于类固醇诱导的细胞的S-相进入其将是必需的。PR非 基因组机制的作用已经描述于不同的系统(Mailer等人，(2001) Proc Natl Acad Sci LK4;98:8-10页)。在一个方面，本发明涉及用孕酮受体调节剂例如孕酮或炔诺酮靶向孕 酮受体，以降低SOD-1表达。孕酮及激活孕酮受体的相关化合物已经显 示了在蛋白质和mRNA水平为SOD-1表达的有效抑制剂。认为这些化合 物是通过孕酮受体起作用，因为炔诺酮减少SOD-1的作用可以通过米非 司酮阻断，所述米非司酮是一种孕酮受体拮抗剂。实施例部分显示了， SOD-1的表达是在RNA水平受抑制；炔诺酮治 疗之后RNA水平的降低揭示了这可能是通过减少转录物的转录或稳定性 发生。炔诺酮依赖于孕酮受体的作用，通过米非司酮拮抗作用证实，强有 力地揭示了激活的孕酮受体抑制转录的直接作用。SOD-1 mRNA的减少 然后导致SOD-1蛋白质水平的降低。降低水平的SOD-1蛋白质减少其 在细胞内的蓄积，并期望改善疾病。突变型SOD-1的表达和蓄积是家族 型ALS的广泛接受的病理生理学机制，还可能在散发型的疾病中具有作 用。孕酉同受体见于脊體(Monks等人，(2001) Horm.已ehav 40:490-496) 以及雄性动物和雌性动物的几乎所有细胞，由此构成所有家;^型和可能的 散发性ALS中的有用治疗靶点。IV.使用孕酮受体调节剂调节神经变性障碍孕酮受体在神经变性疾病如ALS及与孕酮受体相关的途径的调节中 的作用，还不是在ALS或其他神经变性疾病中临床调查的目标。实施例 部分给出的数据指出孕酮受体在降低SOD-1的表达中具有作用。用于ALS的SOD1 G93A (高度复制)小鼠模型是适合的小鼠，其携 带23复制份的人G93 A SOD突变且受内源性启动子驱动。小鼠中的存 活率是依赖于复制的。高度复制G93A具有大约128天的中位值存活率。 突变型SOD蛋白质的高分子量复合物是在开始大约30天的脊髓中发现。 在第60天，观察到活性的星形细胞增生(GFAP活性)；在第90天前观察 到活化小胶质细胞。Gurney等人的研究显示了 ，在第90天，活性的星形细胞增生失去了统计的显著性，而小胶质细胞激活显著地提高且持续提高至疾病的末期(参见Gumey，等人，(1996年)Ann. Neurol， 39: 147-5739页)。在这个模型中显示了疗效的很多药物已经进入人临床试验。采用在 ALS治疗中唯一批准的药物--利鲁唑的经验表明，小鼠ALS模型是临 床效力的很好的预测器。其他药物如肌酸(Creatine )、西乐葆(Celebrex )、 辅酶Q10和米诺环素正处于基于此模型研究的临床评估中。VI.孕酮受体调节药物的递送本发明的药物可以掺入适合对受试者给药的药物组合物。 一般地，药 物组合物包含孕酮受体调节药物例如炔诺酮及药学上可接受的载体。如本 文所用的"药学上可接受的载体"包括任何和全部溶剂、分散介质、包衣、 抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等等，它们在生理学上是可配伍的。 药学上可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐緩冲盐水、葡萄糖、甘 油、乙醇等中的一种或多种，及其组合。在很多情况下，优选在组合物中 包含等渗剂，例如糖类、多元醇类如甘露醇、山梨醇或氯化钠。药学上可 接受的载体可以进 一 步包含较少量的辅助物质如润湿剂或乳化剂、防腐剂 或緩沖剂，其增强药物的货架期或效力。药物组合物可以是多种形式。这些包括，例如液体、半固体和固体剂 型如液体'溶液(例如，可注射的和可输注的、溶液)、分散体或悬浮液、片剂、 丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。优选的剂型取决于期望的给药方式及治疗应 用。优选的给药模式是胃肠外给药(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌肉 内)。在优选的实施方案中，药物是通过腹膜内注射给药。一般地，将组合物制备为注射剂，如液体溶液或悬浮液；也可以制备 为在注射之前适合溶解于或悬浮于液体媒介物的固体形式。制剂还可以被 乳化或胶嚢包封在脂质体或微粒如提高佐剂作用的聚交酯、聚乙醇酸交酯 或共聚物中(参见，例如Langer' Science 249， 1527 (1990)和Hanes， Advanced Drug Delivery Reviews 28， 97-119 (1997))。本发明的药物还 可以以贮存注射剂或才直入制剂的形式给药，其可以这种方式配制来允许活 性成分的持续或脉沖释放。贮存注射剂或植入制剂，例如，可以包含一种 或多种本发明的化合物，或包含不同药物的组合(例如，乙胺嘧啶和炔诺 酮)。一般地，药物组合物在制造和贮藏条件下必须是无菌的和稳定的。组 合物可以配制为溶液、微乳液、分散体、脂质体或适合高药物浓度的其他 有序结构。无菌的可注射溶液可以这样制得，通过把活性化合物(即，药 物)以所需量掺入含有以上列举的成分之一或组合的适合溶剂中，如果需 要，之后过滤灭菌。通常，分散体是这样制得，通过把活性化合物掺入无菌赋形剂中，该 无菌赋形剂含有基础分散介质和来自以上列举那些的所需的其他成分。在 用于制备无菌可注射溶液的无菌冻千粉的情况下，优选的制备方法是真空 干燥和喷雾千燥，得到活性成分加上任何另外期望的来自先前其无菌过滤 溶液成分的4分末。可以保持溶液的适当流动性，例如，通过使用包衣如卵 磷脂，在分散体的情况下维持需要的粒度，和通过使用表面活性剂。通过 在组合物中包含延长吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶，可以带来可注射 组合物的延长吸收。孕酮受体调节药物可以通过本领域已知的多种方法给药。如本领域技 术人员所知，给药的途径和/或方式将根据期望的结果变化。在某些实施 方案中，活性化合物可以与载体一起制得，所述载体将保护化合物免于快 速释放，如控制释放制剂，包括植入剂、透皮贴片和微嚢包封的递送系统。 可以使用可生物降解和生物相容的聚合物，如乙烯-乙酸乙烯共聚物(ethylene vinyl acetate)、聚肝类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯类及聚乳 酸。制备这种制剂的许多方法是获得专利的或者是本领域技术人员通常已 #口的。(参见,例^口 Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J R. Robinson编辑，Marcel Dekker， Inc., New York, 1978年； Kabanov等人的美国专利No. 6,333,051和6,387,406)。在某些实施方案中，孕酮受体调节药物可以与例如惰性稀释剂或可同 化的食用载体一起口服给药。化合物(及其他成分，如果需要)还可以是包 封于硬或软壳明胶胶嚢中，压成片或直接掺入受试者的饮食。对于口服治 疗给药而言，化合物可以掺和赋形剂并以可摄取的片剂、含片、锭剂、胶 嚢、酏剂、混悬剂、糖浆、干胶片等的形式使用。为了通过非胃肠外给药 来给予本发明的化合物，用防止其失活的材料包衣化合物或者共同给药化 合物和该材料可能是必须的。在某些实施方案中，孕酮受体调节药物可以液体的形式给药。药物应 溶于多种溶剂如曱醇、乙醇和异丙醇。改进药物在水和其他水溶液中的溶解度的多种方法是本领域已知的。例如，Al-Razzak等人的美国专利No. 6,008,192教导了含亲水相和表面活性剂或表面活性剂混合物的亲水二 元体系，用于改善化合物的给药。补充的活性化合物还可以掺入组合物中。在某些实施方案中，孕酮受 体调节药物可以与用于改进药物的药代动力学的一种或多种另外的治疗 剂共配制和/或共给药。改进本发明药物的药代动力学的多种方法是本领 域已知的。(参见，例如Norbeck等人的美国专利No. 6,037,157)。改进药物的药代动力学的其他方法已经公开在例如以下美国专利中 Masters的No. 6,342,250、 Kabanov等人的6,333,051 、 Straub等人的 6,395,300、 Kaba隨等人的6,387,406及Reed等人6,299,900。 Masters 公开了 一种用于控制释放药理学活性成分的药物递送装置和方法。 Masters公开的药物递送装置是一种膜，该膜包含一种或多种生物可降解 聚合物材料、 一种或多种生物相容的溶剂和均匀分散在整个膜中的一种或 多种药理学活性成分。在美国专利No. 6,333,051中，Kabanov等人公 开了共聚物网络，其具有至少一种交联的多胺聚合物片段、至少一种非离 子水溶性聚合物片段和至少一种适合的生物剂，包括药物。根据这篇专利 的教导，这种网络，称为纳米凝胶(nanogel)网络，通过减少副作用并 增加治疗作用改进了药物的疗效。在另一个专利--美国专利No. 6,387,406中，Kabanov等人还公开了改进多种药物口服递送的另 一种组 合物。改进药物递送和给药的其他方法包括改进药物穿过膜，特别是穿过血 脑屏障的能力的手段。在一实施方案中，可以修饰药物以改进其穿过血脑 屏障的能力，而在一选择性实施方案中，药物可以是与另外的药物例如抗 真菌化合物共同给药，其改进了药物穿过血脑屏障的能力。选择性地，可 以使用立体定向樣i注射4支术使药物精确递送到脑的特定位点。例如，可以 将被治疗的受试者置于立体定向支架基座内(MRI-可配合)，然后使用高分 辨率MRI成像以确定要治疗的特定区域的三维位置。然后，可以将MRI 影像传给具有适合立体定向软件的计算机，大量的影像用于确定耙点和药 物微注射的轨迹。软件把轨迹转换成三维坐标，将该三维坐标精确记录用 于立体定向支架。在颅内递送的情况下，将头骨暴露，在进入位点上钻上 钻孔，立体定向设备用于定位针头并确保在预定的深度植入。药物可以递 送到区域如与疾病或障碍相关的脊髓、脑干或脑部的细胞。例如，靶区域可以包括髓质、脑桥和中脑、小脑、间脑(例如，丘脑、下丘脑)、端脑(例 如，紋状体、大脑皮质或皮质内、才光叶、颞叶、顶叶或额叶)或其组合。孕酮受体调节药物可以单独或组合使用以治疗神经变性障碍。例如， 药物可以与例如其他存在的孕酮受体调节剂结合使用，用于产生协同作 用。同样地，药物可以单独使用或与另外的试剂组合使用，所述另外的试 剂是例如赋予治疗组合物有益性质的试剂、例如影响组合物的粘度的试 剂。如果组合使得形成的组合物可以完成其预定的功能，则该组合也可以 包含多于一种另外的试剂，例如两种或三种另外的试剂。在一些实施方案 中，本发明包括给药至少一种孕酮相关的化合物，如炔诺酮，连同例如至 少 一种乙胺嘧啶化合物或其功能类似物，或者连同至少 一种雌激素相关的化合物如雌二醇。对于这些化合物和给药的描述，参见2006年3月1日 提交的标题为"通过孕酮受体调节神经变性疾病(Modulation of Neurodegenerative Diseases through the Progesterone Receptor)"和 "神经变性疾病的调节(Modulation of Neurodegenerative Diseases )，，的共同未决申请。本发明的化合物可以结合药学上可接受酸式盐以有助于作为水溶液 的长期贮藏和给药。例如，该盐可衍生自药学上可接受的酸(例如，HCI), 使用或不使用药学上可接受的载体(例如，水)。这样的盐可以衍生自无机 酸或有机酸，包括例如盐酸、氢溴酸、乙酸、柠檬酸、富马酸、马来酸、 苯磺酸及抗坏血酸。由载体和盐的组合获得的药物组合物通常将是以引发 期望的生物学效应所需的剂量使用。这包括其以治疗有效量使用或当与其 他生物活性剂组合使用时以较少的量使用。本发明的药物组合物可以包括"治疗有效量"或"预防有效量，，的本 发明的药物。"治疗有效量"是指在需要的剂量和时间周期下有效地获得 期望的治疗效果的量。药物的治疗有效量可根据多种因素如个体的疾病状 态、年龄、性别和体重及药物引起个体中期望的响应的能力而变化。治疗 有效量还是这样的，在其中药物的治疗有益效果大于任何毒性或有害作 用。"预防有效量"是指在需要的剂量和时间周期下有效地获得期望的预 防效果的量。 一般地，因为预防用药剂量是在疾病之前或疾病早期用于受 试者，预防有效量将是低于治疗有效量。可以调节给药方案以提供最佳期望的应答(例如，治疗反应或预防反 应)。例如，可以给药单次静脉推注剂(single bolus),随着时间的推移可以给药多个分开剂量或者剂量可以按比例地减少或增加，如治疗情形的 紧急所表明的。配制易于给药和剂量均 一的剂量单位形式的胃肠外组合物 是特别有利的。如本文所用的剂量单位形式是指适用作要治疗的哺乳动物受试者的单一剂量的物理上离散的单元；各个单元含有伴随需要的药物载 体的计算产生期望疗效的预定量的活性化合物。本发明剂量单位形式的规格是直接取决于和由下列决定(a)活性化合物的独特特征和要获得的特 定治疗或预防效果，以及(b)在配合用于治疗的这种活性化合物的领域中， 个体敏感性的固有限制。给药于单个受试者或受试者群的药物(例如，孕酮或炔诺酮)的治疗有 效量或预防有效量的示例性、非限制性范围是0.5 mg/天-约20 mg/天， 优选是约0.100 mg/天-约15 mg/天，更优选是约0.100 mg/天-约12 mg/ 天，且最优选是约0.3 mg/天-4 mg/天。优选地，给药治疗有效量的药物(例 如，孕酮或炔诺酮)，导致血流中药物的浓度是1纳摩尔(nM)-100毫摩尔 (mM)浓度的范围。例如，约10nM画约10mM、约1 nM-约1mM、约1 nM画 约100微摩尔(IJM)、约1pM画约500|jM、约1yM画约200|jM、或约10|jM-约50|jM的浓度范围。值得注意，剂量值可以根据要减轻病症的类型和严 重度而变化。进一步理解的是，对于任何特定受试者，应当根据个体需要 和给予或监督给予组合物的人员的专业判断，随着时间调节具体的给药方 案，而且在此提出的剂量范围仅仅是示例性的，不意欲限制要求保护的组 合物的范围或实践。本领域技术人员基于上述实施方案将理解本发明进一步的特征和优 点。因此，除了如附加权利要求指出的之外，本发明不限于具体示出和描 述的内容。本文引用的所有^^开出版物和参考文献明确地全部引入本文作 为参考。实施例实施例1:原料和方法 (i)细胞培养物发现人宫颈癌衍生的HeLa细胞系(ATCC)表达S0D-1蛋白质和 mRNA,其用作鉴别抑制SOD-1表达的化合物的模型系统。简要地，细 胞保养在Dulbecco最低限度的必需培养基中，所述培养基含有高葡萄糖， 用4 mM的谷氨酰胺、10%的经过检验的胎牛血清，及青霉素、链霉素 和制霉菌素(所有均来自lnvitrogen)补充。培育条件是37度和99%相对湿度，与5%的C02。当培养物达到99%融合时，传代培养物。对于药 理学实验，在150 iJl培养基中以3,500个细胞/孔的密度，将细胞平板接 种入无菌的组织培养物处理的96孔板中。(ii) 药物将所有化合物以10 mM的原液浓度溶解于100%的DMSO中。药物 是从Microsource Discovery或Sigma Aldrich获得。(iii) 实验方案:在平板接种和附着6小时之后，将药物以10 |jM的浓度加入培养基。 与药物孵育72小时之后，将细胞在100x下使用倒置显微镜和数码相机 照相，以便可以评估细胞毒性。在光记录之后，移去培养基，将细胞用磷 酸盐緩沖盐水洗涤一次，然后加入50 |j|的含有蛋白酶抑制剂混合液的分 子生物学等级的水。孵育10分钟之后，将平板放置于-80度中以引起完 全的溶胞。然后，解冻平板，从各个孔中转移25 |j|至用抗人SOD-1抗 体涂层的maxsorp ELISA板中，板中含有75 pl的磷酸盐緩冲盐水。然 后向孔中加入第二种抗体对(多克隆的抗-SOD-1 /HRP接合的山羊抗-兔)，在室温下孵育1小时。在孵育结束时，洗涤平板三次(来自KPLInc. 的洗涤緩冲液)，力。入Sure Blue Reserve HRP底物。孵育5-10分钟之 后，通过加入停止试剂(KPL)停止反应(其变成不同程度的蓝色)。然后将 平板轻微地振摇5秒钟，在Tecan平板读数器上读取450 nm处的吸光度。 将各个样品的吸光度与在相同ELISA平板上测定的纯化重组体人SOD-1 的标准曲线进行比较，通过与标准曲线比较来评估SOD-1免疫反应性 (ng/ml)。(iv) Bradford蛋白质测定为了确定在SOD-1试验中发现的减量是否只是药物治疗的细胞毒效 应的结果，测定各个孔的总蛋白质。当ELISA將育进行时，从各个孔中 移去10jjI的剩下的溶胞产物并放置于另一个空的平板中，向蛋白质中加 入BioRad Bradford试剂(100 pl)。在室温下聘育15分钟之后，将平板 轻微振摇5秒钟，在Tecan Sunrise平板读数器中读取595 nm下的吸光 度。通过比较在相同平板上得到的蛋白质标准，由此确定各个孔中的蛋白质浓度。(v) 定量的RT-PCR:如上，将96孔板中3500个细胞/孔的HeLa细胞用炔诺酮处理72 小时，然后溶解细胞，使用Gentra RNA提取方案和试剂提取总的RNA。 然后，将纯化的RNA用作反转录反应中的模板，所述反应使用以oligoDT 为引物(primed with oligoDT)的Superscript III MMLV專争录酵。在4f到 的cDNA上进行PCR反应以扩增对应于人SOD-1、人TATA-盒结合蛋白 及人(3-2微球蛋白的cDNA 。 PCR反应是在单独的试管中进行20、 25 和30个周期，然后扩增子是在2。/。的含菲啶溴红的琼脂糖凝胶上进行。 将UV光源刺激之后菲啶溴红染色带发射的焚光使用数码相机捕获。使用 ImageJ (NIH)分析数字化图片，将SOD-1的带与TATA-盒结合蛋白和(32 微球蛋白的带(这些管家基因未受药物影响)进行比较，同时在周期的线性 范围之内，这些条件下的25个周期，相对于对照增加或减少。(vi) 基因芯片(GeneChip)实验:总细胞mRNA是从HeLa细胞制得，使用Qiagen RNA微型试剂盒， 接着用oligotexmRNA小型试剂盒处理或没有处理。双链的cDNAs是由 2 |jg的总mRNA合成，该合成是按照制造商的推荐，使用具有T7-(dT)24 引物的cDNA合成用的Superscript选捧系统(lnvitrogen)。通过锁相J疑月交 (phase lock gel) (PLG)苯酚/氯仿提取清除cDNAs,并通过乙醇沉淀浓 缩。生物素标记的cRNA是由cDNA通过体外转录合成，该合成是按照 售主的推荐，使用生物鉴定高产率RNA转录物标记试剂盒(Affymetrix)。 体外转录产物使用RN easy spin columns (Qiagen)清除，在断裂緩冲液 (40 mM Tris-醋酸盐、pH 8.1 ， 100 mM KOAc、 30 mM MgOAc)中通过金 属诱导的水解而裂成碎片。然后将cRNA碎片接受杂化緩冲液(100 mM MES、 IM NaCI、 20 mM EDTA、 0.01% Tween-20)中的Affymetrix GeneChip i殳置。用Aflymetrix Microarray Suite V5.0和Affymetrix Data Mining Tool V3.0分析GeneChip影像。所有探针装置的信号强度按比例 成150的輩巴点Y直。Detection Call、 Change Call和Signal Log Ratio的结 果是通过在绝对和比较分析的统计算法中使用缺省参数获得。(vii)蛋白质印迹法.动物使用戊巴比妥钠(250mg/kg， i.p.)超剂量给药。解剖脊髓，在pH 7.5的20 mM Tris-HCL、2 mM DTT、0.1 mg的亮抑蛋白酶肽、1 mM EDTA 和1 mM EGTA中匀浆化。匀浆然后在14,000 x g下离心以沉淀碎片。 使用BCA蛋白测定法(Pierce， Rockford， IL)测量蛋白质浓度。来自各个 样品的蛋白质(25 ijg)在4-20%的Tris-甘氨酸凝胶(lnvitrogen， San Diego, CA)上跑柱。转移之后，在PBS中洗涤膜，接着在封闭緩冲液(0.2%卜 封闭(Applied Biosystems， Foster City, CA)， PBS和0.10/。 Tween 20)中整 夜孵育。然后多克隆兔抗牛SOD1(Sigma)抗体在1:4000稀释度下^:测薄 膜。洗涤数次之后，将膜用碱性磷酸酶-接合的第二种抗体(封闭緩沖液中 1:5000)培养，使用增强的化学发光试剂CDP Star显影免疫反应信号 (Western Star kit; Tropix)。曝光之后，扫描膜，然后输入NIH图象用于 定量带的密度。实施例2:测验孕酮受体的效应该实施例描述了如何检查孕酮受体药物例如炔诺酮对于SOD-1活性 的体外效应。将人宫颈癌衍生的HeLa细胞系(ATCC)在Dulbecco最低 限度的必需培养基中培养，其含有高葡萄糖，用4 mM的谷氨酰胺、化 %的经过检验的胎牛血清，及青霉素、链霉素和制霉菌素(所有均来自 lnvitrogen)补充。培育条件是37度和99。/。相对湿度，与5%的C〇2。当 培养物达到99%融合时，传代培养物。对于药理学实验，在150iJl培养 基中以3,500个细胞/孔的密度，将细胞平板接种入无菌的组织培养物处 理的96孔—反中。用药物孵育72小时之后，根据实施例1(iii)所述照相和处理细胞。通 过实施例1(iv)中所述的Bradford测定法，测定溶胞产物的总的蛋白质。 该研究的结果如图1所示。这些结果表明，采集之前72小时加入HeLa 细胞培养基中的炔诺酮显著地降低了 SOD-1蛋白质的水平，同时总蛋白 质水平未受影响。这种降低是剂量相关的，最大值是3pM, IC5o是2nM。a-突触核蛋白已经在特征在于Lewy body内含物如具有Lewy bodies的帕金森病(PD)和痴呆的神经变性障碍中涉及。Lewy body样内 含物已经在患有肌萎缩性侧索硬化(ALS)病人的脊推神经元中观察到，报 告揭示了在ALS病人中可能的a-突触核蛋白异常，a-突触核蛋白是一种普遍存在的蛋白质，其与蛋白质陪伴分子共享显著的物理和功能同源性，14-3-3，而且在脑中是特别丰富的(Ostrerova N等人，丄Neurosci.， 19:5782 (1990年))。增加的a-突触核蛋白聚集速率可能有助于Lewy body疾病中神经变性的机制。关于转基因动物的研究还揭示了 a-突触核 蛋白的聚集对于神经元是有害的。据报道，多巴胺能功能障碍发生于表达 野生型人a-突触核蛋白的转基因小鼠中(Masliah， E.等人，Science, 287:1265-1269页(2000年))，以及过度表达a-突触核蛋白的果蝇显示了 与a-突触核蛋白聚集物的发育相关的多巴胺能功能异常和多巴胺能的神 经元死亡(Feany， M B等人，Nature 404:394-8 (2000年))。证据揭示了 ， 含有多巴胺的神经元发育了 a-突触核蛋白聚集物并随着这些聚集物的发 育而退化。图3中所示的Genechip分析的结果说明，治疗4天之后，乙胺嘧啶 (ALG-2001)(3iJM)和炔诺酮(ALG-3001)(3ijM)基本上减少了 HeLa纟田胞 中用于a-突核蛋白的mRNA。因此，本发明的化合物可以减緩Lewy body疾病中的神经变性。这说明，本发明的化合物在减緩进程或改善 ALS及PD效果中的作用。实施例3:测试化合物在体内的功效SOD-93A鼠类动物模型实施例2中所述的孕酮受体调节剂(例如，炔诺酮)及其类似物的功效是在用于ALS的SOD-93A鼠类动物模型的体内测试，测量SOD-1水平的降低。通过从使用标准RT-PCR技术引入化合物之前和之后的小鼠中分离血样，监测RNA表达的抑制。使用蛋白质印迹法采用来自Sigma的抗-SOD-1抗体测定SOD-1蛋白质的表达。长期给药炔诺酮(100 mg/kg/d)14天显著地(p-0.000351， n-5/组)减少了 G93A雄性小鼠中脊柱的SOD-1，如图4所示。口服给药炔诺酮14天。采集脊髓，并通过上述的ELISA和蛋白印迹分析进行分析。对照组仅仅给予媒介物(盐水)。体内效应还可以通过监测受试者的呼吸来测定，这是通过使用Renaissance Puritan Bennett Spirometer测量最大月争活量(FVC)。最大的吸气力(MIF)还可以使用手持的测压计测量。实施例4:神经功能评分通过^f艮据4-分等级记录的神经功能评分，也可以确定孕酮受体调节剂的功步丈0=下肢上的正常反射(被提起尾巴时，动物将展开其下肢) 1=异常反射(当动物被提起尾巴时，没有展开其下肢). 2=异常反射和可见的麻痹迹象。 3=缺乏反射，下肢的全部麻痹。4=当被侧面放置时，在30秒内不能回正自己或者出现死亡。如果活 着，动物在此阶段被处死。神经功能评分、体重和存活率上的统计分析可以是通过利用ANOVA、 Kaplan Meier、 t画检验、Cox's比例风险回归模型(Cox's proportional hazards regression model) log-只于凄t的禾口 panametric方法及〉、昆合的线'性 模型方法进行。所有统计分析是使用本领域已知的标准操作进行。
权利要求
1. 一种减少细胞中SOD蛋白质生成的方法，包括向细胞给药孕酮受体调节药物，以便药物与孕酮受体相互作用并抑制编码SOD蛋白质基因的转录。
2、 权利要求1的方法，其中所述细胞是选自脑中的细胞、脊髓中的 细胞、脑膜组织中的细胞、肌肉中的细胞。
3、 权利要求1的方法，其中所述细胞是患有ALS的受试者体内的神 经细胞。
4、 权利要求1的方法，其中所述SOD蛋白质是SOD-1蛋白质。
5、 权利要求1的方法，其中所述孕酮受体调节药物是孕酮及其类似物。
6、 权利要求1的方法，其中所述孕酮受体调节药物是炔诺酮及其类 似物。
7、 权利要求1的方法，其中所述孕酮受体调节药物是选自左炔诺孕 酮、18-甲基炔诺酮、去氧孕烯、3-酮基去氧孕烯、炔诺酮、孕二烯酮、 炔诺酮乙酸盐、炔诺將酯、奥沙特隆、醋酸环丙孕酮、曲美孕酮、地诺孕 素、屈螺酮、诺美孕酮或(17-脱乙酰基)炔诺將酯及其类似物。
8、 权利要求1的方法，其中所述抑制基因的转录包括监测SOD蛋 白质的表达水平。
9、 权利要求1的方法，其中所述抑制基因的转录包括监测编码SOD 蛋白质的核酸分子的水平。
10、 权利要求9的方法，其中所述核酸分子是选自核糖核酸或脱氧 核酸。
11 、 一种在患者中预防症状发展或改善肌萎缩性侧索硬化(ALS)的症 状或进展的方法，包括向患者给药预防治疗有效量的孕酮受体调节药物， 其中药物与孕酮受体相互作用，并抑制编码SOD-1蛋白质基因的转录。
12、 权利要求11的方法，其中所述孕酮受体调节预防或治疗药物是 孕酮及其类似物。 '
13、 权利要求11的方法，其中所述孕酮受体调节药物是炔诺酮及其 类似物。
14、 权利要求11的方法，其中所述孕酮受体调节药物是选自左炔诺孕酮、化-甲基炔诺酮、去氧孕烯、3-酮基去氧孕烯、炔诺酮、孕二烯酮、 炔诺酮乙酸盐、炔诺坊酯、奥沙特隆、醋酸环丙孕酮、曲美孕酮、地诺孕素、屈螺酮、诺美孕酮或(17-脱乙酰基)炔诺坊酯及其类似物。
15、 权利要求11的方法，进一步包括通过监测患者的存活延长监测 ALS的改善。
16、 权利要求15的方法，其中所述监测ALS改善的步骤包括监测 患者的神经功能评分。
17、 权利要求15的方法，其中所述监测ALS改善的步骤包括监测 SOD-1蛋白质表达水平。
18、 权利要求15的方法，其中所述监测ALS改善的步骤包括监测 编码SOD-1的核酸分子的水平。
19、 权利要求18的方法，其中所述核酸分子是选自核糖核酸或脱氧 核酸。
全文摘要
提供了一种调节激素途径的方法，该途径涉及患有神经变性障碍的受试者体内的孕酮受体。通过向受试者给药有效量的孕酮受体调节药物调节孕酮受体活性，以便孕酮受体调节药物与孕酮受体相互作用，并改变与神经变性疾病相关的蛋白质的表达。
文档编号A61P25/00GK101232888SQ200680015310
公开日2008年7月30日 申请日期2006年3月1日 优先权日2005年3月4日
发明者D·本杰明, S·斯科特 申请人:阿尔斯根公司