专利名称：用乙胺嘧啶及类似物治疗肌萎缩性侧索硬化的制作方法
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本申请要求申请日为2005年3月4日的美国临时申请No.60/658,505的优先权，该申请的全部公开内容在此引入作为参考。
背景技术：
肌萎缩性侧索硬化(ALS)是最经常被确诊的进行性运动神经元疾病。该疾病的特征在于皮质、脑干和脊髓中运动神经元的变性(Principles ofInternal Medicine，1991 McGraw-Hill，Inc.，New York；Tandan等人，(1985)Ann.Neurol，18271-280页，419-431页)。该疾病的病因是未知的，并且只有当患者开始体验到代表发作的非对称四肢软弱和疲劳、上肢局部肌束震颤和/或大腿痉挛时，才可能被确诊为ALS。ALS的至少一些发病情形存在遗传性成分。
在几乎所有的病例中，散发性ALS和常染色体显性家族性ALS(FALS)在临床上是相似的(Mulder等人，(1986年)Neurology，36511-517页)。已经显示在一些但并非所有的FALS谱系中，该疾病与染色体21q上的遗传缺陷有关联(Siddique等人，(1991年)New Engl.J.Med.，3241381-1384页)。
特别地，定位于染色体21q上的SOD-1基因突变似乎与ALS的家族型相关。SOD-1上不同突变的有害作用最大可能是通过毒性作用的增加来介导而不是通过SOD-1活性的丧失而介导的(Al-Chalabi和Leigh，(2000)Curr.Opin.Neurol，13，397-405；Alisky等人，(2000年)Hum.Gene Ther.，11，2315-2329页)。尽管所述毒性尚不清楚，但存在证据提示蛋白质自身的消除将改善所述毒性。
存在开发可以改变神经变性疾病的病程或者延长患有该疾病的患者的存活时间的疗法的需要。特别地，存在减少ALS患者脑和脊髓中SOD-1的产生的需要。防止野生型或突变型SOD-1蛋白质的形成，可能停止疾病的发展并使ALS的症状改善。
发明概述 本发明公开了通过给予药理学试剂来干扰脑、脊髓、脑膜和肌细胞中的蛋白质合成的方法和组合物。特别地，本发明公开了降低SOD-1基因表达的方法和组合物。
本发明的方法和组合物可用于减少或抑制与神经变性疾病相关的蛋白质例如SOD-1的表达，这是通过给予试剂例如乙胺嘧啶，从而抑制SOD-1mRNA的转录或转录物的稳定性。SOD-1mRNA的减少随后导致SOD-1的蛋白质水平降低，这样就减少其在细胞内的蓄积并改善疾病。突变型SOD-1的表达和蓄积是广泛认可的家族性ALS的病理生理学机制，并且还可能在散发性形式的疾病中起作用。
因此，一方面，本发明涉及减少细胞内SOD蛋白产生的方法，所述方法包括向细胞给予核受体调节性药理学试剂，从而使所述试剂与核受体相互作用并且抑制编码SOD蛋白的基因的转录。该细胞可以是例如患有ALS的受试者(如家族性ALS)体内的神经细胞或是脊髓、脑膜组织中的任何细胞或肌细胞。SOD蛋白可以是SOD-1蛋白。细胞的实例包括但不限于神经元、中间神经元、神经胶质细胞、小胶质细胞、肌细胞、与免疫反应相关的细胞等等。
在一种实施方案中，所述药理学试剂是乙胺嘧啶及其功能性类似物。在另一种实施方案中，所述药理学试剂是在苯环上有至少一处修饰的乙胺嘧啶。在又一种实施方案中，所述药理学试剂是在嘧啶环上有至少一处修饰的乙胺嘧啶。
所述基因转录的抑制包括，通过测量SOD蛋白例如SOD-1蛋白的表达水平而监测。可选择地，所述基因转录的抑制包括，监测编码SOD蛋白的核酸分子的水平，例如通过监测核糖核酸或脱氧核酸(deoxynucleic acid)的水平。
另一个方面，本发明涉及预防、改善或治疗受试者中的ALS症状或进展的方法，所述方法是通过向受试者给予治疗有效量的药理学试剂，其中该试剂与细胞的核相互作用并抑制编码SOD-1蛋白的基因的转录。通过测量受试者存活时间的延长，例如通过监测受试者的神经功能评分，可以监测症状的改善。可选择地，可以通过监测SOD-1蛋白的表达水平或编码SOD-1蛋白的核酸分子的水平来测定所述改善。
附图简述
图1是显示通过乙胺嘧啶降低SOD-1蛋白表达的图。
图2是显示以乙胺嘧啶和炔诺酮来减少SOD-1mRNA表达的柱形图。
图3是显示本发明的一些代表性的乙胺嘧啶功能性类似物的图。
图4是显示在HeLa细胞中用乙胺嘧啶和炔诺酮处理之后α-突触核蛋白mRNA的表达减少的柱形图。
图5是显示以乙胺嘧啶慢性治疗(TX)雄性和雌性SOD-93A小鼠之后，SOD-1蛋白表达减少的柱形图。
图6是显示以乙胺嘧啶慢性治疗之后小鼠淋巴细胞中α-突触核蛋白表达减少的柱形图。
图7是显示在SOD-93A小鼠中口服给药乙胺嘧啶后，脊柱SOD-1表达减少的柱形图。
图8是显示在家族性SOD-1患者中口服给药乙胺嘧啶30天后，淋巴细胞SOD-1水平降低的柱形图。
详细描述 除非另外指出，本发明的实践使用了本领域技术中的微生物学、分子生物学和重组体DNA技术的常规方法。这样的技术在文献中有完全的说明。(参见例如Sambrook等人的Molecular CloningA Laboratory Manual(目前版本)；DNA CloningA Practical Approach，Vol.I & II(D.Glover，编辑)；Oligonucleotide Synthesis(N.Gait编辑，目前版本)；NucleicAcid Hybridization(B.Hames和S.Higgins编辑，目前版本)；Transcription and Translation(B.Hames和S.Higgins编辑，目前版本)；CRC Handbook of Parvoviruses，vol.I &II(P.Tijessen编辑)；Fundamental Virology，第二版，Vol.I & II(B.N.Fields和D.M.Knipe编辑))。
为了便于更加清楚地理解本发明，定义了以下术语 术语“神经变性障碍”或“神经变性疾病”在本文中是可互换使用的，该术语是指受试者或受试者群中正常神经功能的损伤或丧失，或者异常神经功能的存在。例如，神经学上的障碍可以是疾病、损伤和/或老龄化的结果。如本文所用的，神经变性障碍还包括引起神经细胞或神经细胞群的形态和/或功能异常的神经变性。形态和功能的异常的非限制性的实例包括神经细胞的自然恶化和/或死亡、神经细胞的异常生长模式、神经细胞之间的物理连接上的异常、由神经细胞产生的一种或多种物质例如神经递质的不足或过量、神经细胞未能产生其正常产生的一种或多种物质、在异常模式或异常时间下电脉冲的传递和/或物质例如神经递质的产生。神经变性可以在受试者脑部的任何区域发生，而且在多种障碍中看到，所述障碍包括例如肌萎缩性侧索硬化(ALS)、多发性硬化、亨延顿(氏)舞蹈病、帕金森病、阿尔茨海默(氏)病、朊病毒相关性疾病(CJD)、脊髓性肌萎缩、脊柱小脑共济失调以及脊髓损伤。
如在本文中使用的术语″药理学试剂″和″核受体调节性药理学试剂″意味着是可以互换使用的，并且这些术语是指选择性地干扰神经脊髓、脑膜或肌细胞中的蛋白质合成的化合物。特别是干扰SOD蛋白如SOD-1蛋白的合成。优选地，所述药理学试剂是乙胺嘧啶及其类似物。
术语“调节”或“正在调节”或“已调节”在本文中可互换使用，也是指改变SOD-1活性或表达，即增加或减少SOD-1活性或表达，从而在受试者或受试者群中调节产生疗效。疗效是这样的，其导致ALS症状或进展的改善。通过定量或定性测量SOD-1蛋白质水平例如通过蛋白印迹分析法，可以测量活性的改变。在药理学试剂例如乙胺嘧啶及其类似物存在下，定量分析可用于测量SOD-1蛋白质水平的向下调节或向上调节。适宜的药理学试剂可以是与对照相比向下调节SOD-1的表达约5％-约50％的试剂。还可以通过定量或定性测量与SOD-1相关的核酸水平来测量表达的改变，例如测量RNA或DNA的表达水平。
通过检查受试者或受试者群的存活，还可以调查研究受试者或受试者群中SOD-1调节的效果。例如，通过在神经变性疾病例如ALS的一个或多个动物模型中测量存活率的改变或存活时间的延长。存活率的改变可以归因于向ALS鼠科动物模型给予药理学试剂如乙胺嘧啶或其功能性类似物。比较已经给予对照试剂或没有给予试剂的对照组ALS小鼠，基于试验组的ALS小鼠的存活天数的增加，可以测定所述药理学试剂的效果。在一种实施方案中，所述药理学试剂或其功能性类似物增加受试者或受试者群(例如，雄性动物群或雌性动物群)的存活率的百分比效应至少2％-约100％。优选地，所述受试者或受试者群的存活率的百分比效应是至少5％-约50％，至少10％-约25％。更优选地，所述受试者或受试者群的存活率的百分比效应为至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％、26％、28％、 30％、32％、34％、36％、38％、40％、42％、44％、46％、48％和50％。SOD-1调节的效果还可以通过检测受试者或受试者群的神经功能评分来测定，例如，通过评估肌肉运动的改善，或者通过检查所述疾病症状的减轻或改善。在一种优选的实施方案中，受试者或受试者群的神经功能评分显著地区别于未经治疗的对照受试者的神经功能评分，如使用标准统计分析方法测定，具有介于p＜0.05至p＜0.0001的显著性。
该术语还可用于指所述核受体在与药理学试剂相互作用时的改变，即核受体活性、结构或核受体的表达、或核受体的亚基中的变化，即核受体活性、或表达的增加或减少，从而在受试者或受试者群中调节产生疗效。
如本文所用的术语“抑制”或“正在抑制”是指靶基因或靶蛋白如SOD-1的表达的可测量的减少。该术语也指靶蛋白质的活性的可测量的降低。优选地，表达的降低为至少约10％。更优选地，所述表达的降低是约20％、30％、40％、50％、60％、80％、90％，且甚至更优选为约100％。
如本文所用的术语“与SOD活性相关的障碍”或“与SOD活性相关的疾病”是指与SOD蛋白(如SOD-1、SOD-2、SOD-3等等)的表达相关的任何疾病状态。特别地，该术语是指与SOD蛋白产生相关的毒性功能的获得。SOD蛋白可以是野生型SOD蛋白或突变型SOD蛋白，而且可以衍生于野生型SOD基因或具有至少一处突变的SOD基因。
如本文所用的术语“受试者”是指任何活的生物，在其中引发免疫反应。术语受试者包括但不限于人类、非人的灵长类如黑猩猩和其他猿类及猴类；家畜类如牛、绵羊、猪、山羊及马；驯养哺乳动物类如狗和猫；实验室动物类包括啮齿类动物如小鼠、大鼠和豚鼠等等。该术语不表示特定的年龄或性别。因此，成年和新生受试者以及胎儿，无论雄性或雌性，均意味着被包括在内。
如本文所用的，“烷基”包括具有一个或多个碳原子的饱和烃类，包括直链烷基(如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等)，环状烷基(或“环烷基”或“脂环基”或“碳环基”)(如环丙基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基等)，支链烷基(异丙基、叔丁基、仲丁基、异丁基等)。除非另作说明，术语烷基既包括“未取代的烷基”又包括“取代的烷基”，其中后者是指具有取代所述烃主链一个或多个碳原子上的一个或更多个氢的取代基的烷基。
本文使用的术语“烷氧基”是指具有一个与其连接的氧原子的烷基。代表性的烷氧基包括具有1-10个碳原子，优选1-6个碳原子的基团，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等。烷氧基的例子包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异-丙氧基、丁氧基、戊氧基。
术语“芳族基团”或“芳基”包括不饱和的芳族环烃与不饱和的包含一个或多个环的芳族杂环。芳基也可能与非芳族的脂环或杂环稠合或桥连从而形成多环(如1，2，3，4-四氢化萘)。芳基也可以与非芳族的脂环或杂环稠合或桥连从而形成多环(如1，2，3，4-四氢化萘)。
“芳基烷基”是被芳基取代的烷基(如苯基甲基(即苄基))。“烷基芳基”部分是被烷基取代的芳基(如，对-甲基苯基(即对-甲苯基))。“烷氧苯基”(或“烷氧基苯基”)是被烷氧基取代的苯基(如对-甲氧基苯基)。“芳基烷氧基”是被苯基取代的烷氧基(如苄氧基)，“芳氧基烷基”是被氧芳基取代的烷基(如苯甲醚(即苯氧基甲基))，“芳氧基苯基”是被苯氧基取代的苯基(如二苯醚(即苯氧基苯基))，“苯氧基”是连接到苯基上的氧原子。
术语“杂芳基”包括不饱和芳族环状基团，其中所述环上的一个或更多个碳原子为除碳以外的元素如氮、硫或氧。
术语″杂环基″包括类似于碳环基团的闭合环状结构，其中所述环上的一个或更多个碳原子为除碳以外的元素如氮、硫或氧。杂环基可以是饱和或不饱和的。另外，杂环基团(如吡咯基、吡啶基、异喹啉基、喹啉基、嘌呤基(purinyl)和呋喃基)可以具有芳香性，在这种情况下可以将它们称为“杂芳基”或“杂芳族基团”。
“杂芳基烷基”是被杂芳基取代的烷基(如4-甲基吡啶)。
“杂芳基烷氧基”是被杂芳基取代的烷氧基(如4-甲氧基吡啶)。
I.神经变性疾病 一方面，本发明涉及通过给予药理学试剂例如核受体调节性药理学试剂来改变细胞中SOD蛋白的表达。所述细胞可以是涉及SOD蛋白的神经变性疾病如肌萎缩性侧索硬化(ALS)中相关的神经细胞。所述核受体可以是以高亲和力结合配体如乙胺嘧啶及其功能类似物的配体活化的转录因子，并且作用于基因组DNA以抑制或激活广谱基因的表达。核受体(如雌激素受体、孕酮受体或孤儿核受体)出现在脊髓以及雄性动物和雌性动物的几乎所有细胞中，因此构成神经变性疾病如ALS的有效治疗靶点。核受体功能的改变可以是处于许多神经变性病症的中心，所述病症包括例如ALS、阿尔茨海默(氏)病、帕金森病、亨延顿(氏)舞蹈病和多发性硬化，将上述病症的每一种描述如下。
肌萎缩性侧索硬化(ALS)，也称为Lou Gehrig氏病，是一种致命性的影响皮质、脑干和脊髓的运动神经元的神经变性疾病(Hirano，(1996)Neurology，47(4Suppl.2)S63-6)。ALS的发病发生于40多岁或50多岁的人(发病的年龄中位数是57)，在确诊后的2-5年之内是致命的(Williams等人(1991)Mayo Clin.Proc，6654-82页)。在美国，ALS每年影响大约30,000个美国人，差不多8,000例报道死亡。ALS病人进行性地丧失所有运动功能--不能够独立地行走、说话或呼吸。
ALS的主要特征是脊柱运动神经元的丧失，其引起在神经元控制下的肌肉变弱并消瘦，导致麻痹。ALS具有家族性(5-10％)和散发性两种形式，并且家族型目前已经联系至若干不同的遗传基因座(Deng等人(1995)Hum.Mo I.Genet.，41113-16页；Siddique等人，(1995)Clin.Neurosci.，3338-47页；Siddique等人，(1997)J.Neural Transm.Suppl.，49219-33页；BenHamida等人，(1990)Brain，113347-63页；Yang等人，(2001)Nst.Genet.29160-65页；Hadano等人.(2001)Nat.Genet.29166-73)。约15-20％的家族型病例被归因于编码Cu/Zn超氧化物歧化酶1(SOD1)的基因的突变(Siddique等人，(199I)N.Engl.J.Med.，3241381-84；Rosen等人，(1993)Nature，36259-62)。
尽管疾病的病因是未知的，但一个理论是ALS中的神经元细胞死亡是由于过量的细胞外谷氨酸的神经元细胞过度兴奋的结果。谷氨酸是由谷氨酰胺能神经元释放的神经递质，并且被摄取进入神经胶质细胞，在其中通过酶谷氨酰胺合成酶转化成谷氨酰胺，然后谷氨酰胺再次进入神经元并由谷氨酰胺酶水解形成谷氨酸，从而再次补充神经递质池。在正常的脊髓和脑干中，在细胞外液中的细胞外谷氨酸水平保持在低微摩尔水平，由于神经胶质细胞部分作用于支持神经元，使用兴奋性的氨基酸2型运载体(EAAT2)蛋白来立刻吸收谷氨酸。将患有ALS病人中正常EAAT2蛋白的缺乏确定为在疾病的病理学上是重要的(参见例如Meyer等人(1998)J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry，65594-596页；Aoki等人.(1998)Ann.Neurol.43645-653；Bristol等人，(1996)Ann Neurol.39676-679页)。EAAT2水平降低的一个解释是，EAAT2被异常剪接(Lin等人，(1998)Neuron，20589-602页)。所述异常剪接产生了缺失45-107个氨基酸的剪接变体，所述缺失的氨基酸位于EAAT2蛋白的C-末端区域(Meyer等人，(1998)Neureosci Lett.24168-70页)。由于EAAT2的缺失或缺陷，细胞外的谷氨酸蓄积，引起神经元不断地发热。谷氨酸的蓄积对神经元细胞具有毒性作用，因为神经元的连续发热导致细胞早期死亡。
尽管对于ALS的病理学已经知道很多，但对于散发型的发病机制和家族型ALS中突变型SOD蛋白的致病性质则几乎未知(Bruijn，等人，(1996)Neuropathol.Appl.Neurobiol，22373-87；Brui jn，等人，(1998)Science2811851-54)。已经推测了很多模型，包括谷氨酸毒性、缺氧、氧化应激、蛋白质聚集体、神经丝和线粒体功能障碍(Cleveland等人，(1995)Nature378342-43页；Cleveland等人，Neurology，47(4 Suppl.2)S54-61页，discussion S61-2(1996)；Cleveland，(1999)Neuron，24515-20；Cleveland等人，(2001)Nat.Rev.Neurosci.，2806-19页；Couillard-Despres等人，(1998)Proa Natl.Acad.Set USA，959626-30页；Mitsumoto，(1997)Ann.Pharmacother.，31779-81页；Skene等人1.(2001)Nat.Genet.28107-8页；Williamson等人(2000)Science，288399)。
目前，不能治愈ALS，也没有证明对预防或逆转疾病的病程有效的疗法。最近，食品药品监督管理局(FDA)批准了多种药物。到目前为止，治疗ALS的尝试包括使用具有细胞保护作用的长链脂肪醇治疗神经元的变性(参见美国专利No.5,135,956)；或者使用丙酮酸盐(参见美国专利No.5,395,822)；以及使用谷氨酰胺合成酶来阻止谷氨酸级联(参见美国专利No.5,906,976)。例如，利鲁唑TM(RiluzoleTM)，一种谷氨酸释放抑制剂，在美国已经批准用于治疗ALS，看起来是延长了至少部分ALS病人的生命。然而，一些报道已经指出，虽然利鲁唑TM治疗可以延长存活时间，但是其似乎没有提供对病人肌肉强度的改善。因此，利鲁唑TM的作用是有限的，因为治疗没有改变病人生活的质量(Borras-Blasco等人，(1998)Rev.Neurol.，271021-1027)。
II.SOD和SOD突变 本发明涉及通过使用药理学调节试剂及其功能性类似物来减少或消除蛋白质的表达，以减少细胞中的SOD-1蛋白(例如突变型SOD-1蛋白)。SOD-1基因定位于染色体21q22.1。SOD-1的序列公开于PCT公开WO94/19493，其是编码SOD-1的寡核苷酸序列，一般性地要求了编码突变型或野生型SOD-1的基因的反义DNA同源序列(homolog)在制备治疗患病病人的医药中的用途。人SOD-1基因的核酸序列可以在Genbank登录号NM_000454中找到。人SOD-1的核苷酸序列还在SEQ ID NO1中给出。相应的SOD-1蛋白序列在SEQ ID NO2中给出。
III.核受体和配体 一方面，本发明涉及使用改变SOD如SOD-1的基因表达或蛋白产生的药理学试剂。所述药理学试剂可以是核受体药理学试剂。所述核受体可以是以高亲和性结合配体的配体活化的转录因子，并且作用于基因组DNA以抑制或激活广谱基因的表达。核受体如雌激素受体和孕酮受体已经在神经变性障碍中涉及。
已经鉴定了核受体超家族成员中的大约70个成员(Moras & Gronemeyer1998)。其中仅有一些是配体结合性的受体，而其他的属于所谓孤儿受体的亚家族(subfamily)，其特异性配体尚未被鉴定或者甚至可能不存在(O’malley & Conneely 1992)。这些核受体中的许多可以通过与靶基因的调节区的特异性元件相互作用而直接调节基因的表达，或者通过激活不同的生长因子信号途径间接地调节基因表达。
核受体超家族的结构特征是相似的。每一受体具有四个主要的功能区N-末端反式激活结构域(TAD)、中心DNA-结合结构域(DBD)、C-末端配体结合结构域(LBD)及连接DBD和LBD的铰链区(Mangelsdorf等人，1995年)。两个自发反式激活功能，即起源于N-末端的组成型活性激活功能(AF-1)和LBD中出现的配体依赖性的激活功能(AF-2)，是造成核受体转录活性的原因(Gronemeyer & Laudet 1995)。
核受体的DBD表现了与该超家族的其他成员高度的氨基酸序列同一性。因而，所述四种受体识别非常相似，如果不同的话，核DNA中的激素应答元件(HREs)。
配体(例如乙胺嘧啶、孕酮或雌激素)结合位于分子C-末端的LBD产生的构型改变，是造成激活配体反应的原因。尽管不同核受体家族的LBDs之间低至20％的低序列同一性，但是所有核受体在此区域分享相似的褶(fold)。它们包含排列在所谓的α-螺旋状夹层中的最多达12个螺旋和小片。AF-1和AF-2的反式激活功能分别位于核受体的TAD和LBD，它们的活性取决于恢复辅助激活因子分子以形成基因转录的活性前起始位点(Onate等人.1998，Bevan等人，1999)。其LBD缺失的受体是构成有效的，这提示了AF-1是不依赖于配体的。已经证实在维甲酸受体(RAR)(Durand等人，1994)、类视黄醇-X受体(RXR)(vom Baur等人，1998年)、维生素D受体(Jimenez等人，1999)、GR(Sheldon等人，1999年)、PR(Onate等人，1998年)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)(Nolte等人.1998年)、雌激素受体(ER)(Tora等人，1989年)及甲状腺激素受体(THR)(Barettino等人，1994年)的LBD中具有强的AF-2，而在AR(Berrevoets等人，1998年，Bevan等人，1999年)中则没有。
通过影响核受体的许多功能特性包括配体选择性和DNA结合能力的辅助调节因子，来影响核受体的转录活性。核受体辅助调节因子参与靶基因的DNA修饰，直接通过组蛋白的修饰或间接通过染色质-修饰复合物的恢复，以及作用于基础转录机器的恢复(Heinlein & Chang 2002年)。一些较好表征的辅助调节因子是p160家族的成员、ARA70、ARA55、ARA54、ARA267-α、Smad-3和AIB1(Yeh等人，1999)。ARA55和ARA70均使得17β-雌二醇(E2)激活雄激素受体，而ARA70是最有效的赋予E2以雄激素活性的辅助激活因子(Miyamoto等人，1998，Yeh等人，1998，Fujimoto等人，1999)。此外，已经揭示ARA55和Smad-3用作转化生长因子-β信号途径及雄激素/雄激素受体作用之间串扰(cross-talk)的桥(Fujimoto等人，1999；Kang等人，2001年)。
(i)配体依赖性的激活 配体，例如雌激素/孕酮和乙胺嘧啶可以进入靶细胞并结合所述核受体。配体结合引发一系列导致通过受体调节靶基因的事件。占有的受体在其LBD中经历变构变化，并且从热休克蛋白如hsp90、hsp70和hsp56中解离(Roy等人，2001年)，复合例如二聚和易位，如果其已经不存在于神经核中。一旦结合核DNA中的激素应答元件(HRE)，受体二聚体恢复辅助激活因子如p160家族以形成活性的前起始复合物并与基础转录机器相互作用来抑制或触发靶基因的转录。
(ii)非配体依赖性的激活 还可以通过在细胞表面发生的信号途径激活核受体。核受体与其他转录因子是通过可逆的磷酸化来调节的(Orti等人，1992)。激酶介导的信号转导途径可能影响核受体的活性(Burastein & Cidlowski 1993年)。某些共有的磷酸化位点可以是DNA依赖性蛋白激酶、蛋白激酶A、蛋白激酶C、丝裂原活化激酶以及酪蛋白激酶II的底物(Blok等人，1996年)。
核受体的几种天然存在的配体是已知的。例如，雌激素受体的天然配体是雌激素配体，但是已经制备合成的化合物如雌二醇，其也用作配体。孕酮受体的天然配体是孕酮配体，但是已经制备合成的化合物如炔诺酮，其也用作配体。除天然配体之外，其它试剂例如乙胺嘧啶，也可以起到核受体配体的作用。
所述配体结合到核受体从而形成受体/配体复合物。该复合物结合至存在于核DNA中的具体基因启动子。一旦与所述DNA结合，该复合物调节mRNA以及由所述基因编码的蛋白的产生。因此，所述核受体调节试剂可以是美国食品药品监督管理局(FDA)批准的治疗剂，所述治疗剂目前用于与SOD-1功能上不相关联的疾病，例如，抗疟药，以及其修饰后的变体。所述核受体调节试剂还可以是改变SOD-1表达的新合成的化合物。
IV.乙胺嘧啶及其功能性类似物 一方面，本发明涉及使用乙胺嘧啶及其功能性类似物作为干扰蛋白质合成的药理学试剂。乙胺嘧啶是抗疟疾药物，其可容易地渗入到身体和脑部的细胞中。已经将乙胺嘧啶用于治疗疟疾、弓形体病和若干其它的微生物感染疾病(综述见Schweitzer等人，(1990)FASEB J 42441-2452页)。乙胺嘧啶的抗微生物作用是其对于二氢叶酸还原酶(DHFR)以及涉及所述叶酸合成路径的酶的抑制作用的结果。疟原虫重新合成叶酸，而所述人宿主必须获得预先形成的叶酸，该宿主不能合成叶酸。该寄生虫不能利用外源性的叶酸，这使叶酸生物合成成为好的药物靶点。DHFR是一种普遍存在的酶，其通过将二氢叶酸还原成为四氢叶酸从而参与叶酸的再循环。所述四氢叶酸随后又被氧化为二氢叶酸，当其参与生物合成反应时(如胸苷酸合酶)。抑制DHFR将防止胸苷酸的形成并且导致DNA合成的休止以及随后的寄生虫死亡。乙胺嘧啶是用作抗疟药物的最常见的DHFR抑制剂。其它DHFR抑制剂包括但不限于磺胺多辛(sulfadoxine)、三甲氧苄二氨嘧啶、磺胺嘧啶、三甲氧苄二氨嘧啶和磺胺甲基异噁唑。
一方面，本发明涉及通过给予药理学调节试剂如乙胺嘧啶来降低SOD-1的表达。如实施例中显示的，乙胺嘧啶是HeLa细胞和小鼠Neuro2A细胞系中SOD-1表达的有效抑制剂。SOD-1降低的作用机制此时尚不知道，但是蛋白和用于编码SOD-1的mRNA的水平均是剂量依赖性地降低。然而，乙胺嘧啶不通过二氢叶酸还原酶抑制来起作用，因为其作用不能使用亚叶酸(DHFR的酶催化产物)被阻止或逆转。此外，氨甲喋呤，一种具有非相关性化学结构的有效的DHFR抑制剂，在HeLa细胞中不减少SOD-1蛋白。最后，乙胺嘧啶是非常弱的人DHFR的抑制剂，其EC50＞70μm。(Schweitzer等人，(1990)，见上文)。已经有文献报道乙胺嘧啶作用于着丝粒DNA并且最可能通过作用于转录因子来抑制SOD-1基因的转录或较少可能是通过对所述基因组DNA本身的直接作用。
尽管不要求提供机制，但相信为了抑制SOD-1的表达，假设乙胺嘧啶及其功能性类似物是通过至今未能确定的核受体起作用，以减少人SOD-1的表达。简而言之，乙胺嘧啶以高亲和性结合到受体蛋白上，激活该受体蛋白并导致其与另一个激活的受体发生二聚化。所述二聚化的受体被转运至细胞核，或是已经在细胞核中并结合到hSOD1的起始密码子的基因组DNA5′。所述转运的受体与在所述SOD-1基因启动子区域回文结构DNA的延伸部位结合，在该位置上所述受体-配体-DNA复合物产生位阻从而防止转录的开始。因此，用于编码SOD1的RNA的生成较少，结果，产生的蛋白较少。随后，突变型SOD1蛋白产生量的减少将阻止其神经毒害作用并且改善ALS疾病的进展。
在一种实施方案中，所述药理学调节试剂是乙胺嘧啶。乙胺嘧啶的药效基团如式I所示。
式I 在另一种实施方案中，该药学调节试剂是乙胺嘧啶的功能性类似物。乙胺嘧啶化合物系列中的结构活性关系(SAR)可以用一组如图3所示的代表性的30个化合物来建立。系统性的SAR研究可以证实这些化合物确实是通过特殊的细胞靶点来起作用的。这些化合物中的一些可以商购获得，而其它的已经使用标准的有机化学方法合成。所述化合物的设计是基于该主要分子(lead molecule)乙胺嘧啶可以分开成为两个主要的结构特征并且各自进行修饰。这两个主要结构特征是(1)所述苯环和(2)所述嘧啶环。已经设计了如下所述的许多类似物或衍生物 (1)所述苯环的最佳修饰 式I的苯环可以用多种不同方式修饰。在一种实施方案中，通过以选自甲基、乙基等的烷基来取代式II中的R。
式II 在另一种实施方案中，就所述取代基的位置和性质而言，实现在所述苯环上的最佳取代。这可以通过在所述苯环上如式III中所示的各种位置上甲基扫描来进行。
R＝H，2-Me，3-Me，4-Me等 式III 在另一种实施方案中，所述化合物可以通过用包括如式IV中所示的杂环的另一个环取代所述环来制备。例如
或
式IV (2)所述嘧啶环的修饰 所述嘧啶环可以单独修饰或是与所述苯环的修饰一起进行修饰。在一种实施方案中，将所述嘧啶环去除式V的烷基(R)，或是以选自H、甲基、异丙基(iPr)等的其它官能团来取代所述烷基，从而进行修饰。
R＝H，Me，iPr等 式V 在另一种实施方案中，可以将所述对位的氨基(就该苯环而言)去除或以氧取代，如式VI所示。例如
和
式VI 在另一种实施方案中，可以将所述邻位的氨基(就该苯环而言)去除或以氧取代，如式VII所示。例如
和
式VII 在另一种实施方案中，如式VIII所示，可以将两个伯胺基团均从所述分子中去除。
式VIII 在另一种实施方案中，如式IX中所示，可以将其中一个桥环氮原子从所述分子中去除。
式IX 在另一种实施方案中，如式X所示，可以将所述伯胺和所述桥环氮原子同时去除。
式X 在另一种实施方案中，如式XI所示，将所述嘧啶环以吡嗪环体系取代。
式XI 所述化合物均包含所述药效基团特征，所述特征存在于如式I所示的主要结构中。所作的这些修饰是为了保留或改善分子的效力、口服活性和药物性质。在其他的实施方案中，使用标准有机合成化学来合成全新的化合物。这些新化合物保留最初的有机药效基团特征。还可以合成所述新化合物的类似物。在一种实施方案中，如式XII所示，可以合成去除了所述两个环之间的旋转自由的结构。
式XII 在另一种实施方案中，如式XIII所示，可以合成在邻位氨基上将所述的两个环紧密结合的结构。
式XIII 在另一种实施方案中，如式XIIII所示，可以合成用异喹啉取代所述嘧啶的结构。
式XIV 在某些实施方案中，本发明至少部分地涉及式XV的化合物
XV 其中R1选自氢、C1-C10的直链烷基、C3-C7的支链烷基、取代或未取代的环烷基、任选地被一个或两个选自C1-C3烷基、卤素、硝基、氰基和烷氧基的取代基所取代的芳基、取代或未取代的芳氧基苯基、取代或未取代的烷氧基苯基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的烷基芳基、取代或未取代的芳基烷氧基、取代或未取代的芳氧基烷基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂芳基烷基、取代或未取代的杂芳基烷氧基、卤素、氰基和NR’R”，其中R’和R”各自独立地选自氢、直链或支链C1-C6烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的芳基烷基。
R2选自氢、C1-C10烷基、羟基、取代或未取代的芳基、氨基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的杂芳基、C3-C6环烷基和NR’R”，其中R’和R”各自独立地选自氢、直链或支链的C1-C6烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳基烷基。
R3选自氢、C1-C10烷基、羟基、羟基-C1-C6-烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的苯氧基和NR’R”，其中R’和R”各自独立地选自氢、直链或支链的C1-C6烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳基烷基。
R4和R5各自独立地选自氢、羟基、直链或支链的C1-C6烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的芳基烷氧基、直链或支链的卤代-C1-C6-烷基、直链或支链的卤代-C1-C6-烷氧基、烷氧基-C1-C6-烷基、羟基-C1-C6-烷基或羧基-C1-C6-烷基，或者可选择地，R4和R5可以和与其键合的氮原子一起形成环，所述环可以选自例如吡啶基、哌啶子基(piperadino)、吗啉代、吡咯烷基、苄氨基和哌嗪基(piperazino)，所述基团可以任选被一个或两个选自如下的取代基所取代C1-C6烷基、羧基(其可以是被保护的)、氨基、氰基、羟基、卤素、取代或未取代的苯甲酰基以及取代或未取代的芳基烷基(如苄基)。
在某些实施方案中，本发明至少部分地涉及式XVI化合物
XVI 其中X和Y形成饱和或不饱和环的一部分；其中X和Y各自独立地选自碳、氮、氧和硫；并且其中碳原子和氮原子可以是取代或未取代的；A是取代或未取代的碳原子；B选自碳、氮、氧和硫；并且其中n为1-3的整数且m为0-2的整数；并且其中n+m等于或小于7。
R2选自氢、C1-C10烷基、羟基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、C3-C6环烷基和NR’R”，其中R’和R”各自独立地选自氢、直链或支链C1-C6烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的芳基烷氧基、取代或未取代的芳氧基烷基、取代或未取代的苯氧基。
R4和R5各自独立地选自氢、羟基、直链或支链C1-C6烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的芳基烷氧基、直链或支链的卤代-C1-C6-烷基、直链或支链的卤代-C1-C6-烷氧基、烷氧基-C1-C6-烷基、羟基-C1-C6-烷基或羧基-C1-C6-烷基，或者可选择地，R4和R5和与其键合的氮原子一起形成环，所述环选自吡啶基、哌啶子基(piperadino)、吗啉代、吡咯烷基和哌嗪基，所述基团可以任选地被一个或两个选自如下的取代基所取代C1-C6烷基、羧基(其可以是被保护的)、氨基、氰基、羟基、卤素、取代或未取代的苯甲酰基、取代或未取代的芳基烷基(如苄基)。
在另一种实施方案中，本发明至少部分地涉及式XVII化合物
XVII 其中X、Y和Z形成饱和或不饱和环的一部分；其中X、Y和Z各自独立地选自碳、氮、氧和硫；并且其中R1选自氢、取代或未取代的C1-C10烷基、支链C1-C6烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的苯氧基、取代或未取代的烷氧基苯基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的芳基烷氧基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂芳基烷基、取代或未取代的杂芳基烷氧基、卤素、氰基、取代或未取代的芳氧基烷基。
R2、R3、R4和R5各自独立地选自氢、C1-C10烷基、C3-C7支链烷基、羟基、氰基、氨基、烷基氨基烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的杂芳基、C3-C6环烷基和NR’R”，其中R’和R”各自独立地选自氢、直链或支链C1-C6烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳基烷基。可选择地，R2和R3，和/或R4和R5都可以是氧原子。
R6和R7各自独立地选自羟基、烷氧基、苯氧基、芳氧基烷基、芳基烷氧基、氨基、NR’R”，R’和R”各自独立地选自氢、羟基、直链或支链C1-C6烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的芳基烷氧基、直链或支链的卤代-C1-C6-烷基、直链或支链的卤代-C1-C6-烷氧基、烷氧基-C1-C6-烷基、羟基-C1-C6-烷基或羧基-C1-C6-烷基，或可选择地，R’和R”可以和与其键合的氮原子一起形成环，所述环可以选自例如吡啶基、哌啶子基(piperadino)、吗啉代、吡咯烷基和哌嗪基，并且可以任选地被一个或两个选自如下的取代基所取代C1-C6烷基、羧基(其可以是被保护的)、氨基、氰基、羟基、卤素、取代或未取代的苯甲酰基、取代或未取代的芳基烷基(如苄基)。
在其他的实施方案中，本发明至少部分地涉及式XVIII化合物
XVIII 其中X、Y和Z形成具有至少一个、两个或三个交替双键的不饱和环的一部分；其中X、Y和Z各自独立地选自碳、氮、氧和硫；这样在C(1)-Z之间的双键要求C(2)和C(3)任选地被两个取代基所取代；其中在C(1)-Z和C(2)-Y之间的双键要求C(3)任选地被两个取代基所取代；并且其中在C(1)-Z、C(2)-Y和C(3)-X之间的双键要求R2、R3和R4各自独立地选自氢、取代或未取代的C1-C10直链烷基、支链C1-C6烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的苄基、取代或未取代的芳氧基苯基、取代或未取代的烷氧基苯基、取代或未取代的烷氧基苯基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的芳基烷氧基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂芳基烷基、取代或未取代的杂芳基烷氧基、卤素、氰基、取代或未取代的苄基。
R1选自氢、取代或未取代的C1-C10直链烷基、支链C1-C6烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳氧基苯基、取代或未取代的烷氧基苯基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的芳基烷氧基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂芳基烷基、取代或未取代的杂芳基烷氧基、卤素和氰基。
可选择地，R2、R3和R4可以各自独立地选自氢、C1-C10烷基、C3-C7支链烷基、羟基、氰基、氨基、烷基氨基烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的杂芳基、C3-C6环烷基和NR’R”，R’和R”各自独立地选自氢、直链或支链的C1-C6烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳基烷基。
在另一种实施方案中，本发明至少部分地涉及式XIX化合物
XIX 其中X、Y、A和B各自独立地选自碳、氮、氧和硫；并且其中R1、R2、R3和R4各自独立地选自C1-C10烷基、C3-C7支链烷基、羟基、卤素、氰基、烷基氨基烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的杂芳基、C3-C6环烷基和NR’R”，R’和R”各自独立地选自氢、直链或支链的C1-C6烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳基烷基(如苄基)。
R5选自氢、卤素、C1-C10烷基、C3-C7支链烷基、直链或支链的卤代-C1-C6-烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳基烷基和NR’R”，其中R’和R”各自独立地选自氢、直链或支链的C1-C6烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳基烷基(如苄基)。
R6和R7各自独立地选自氢、羟基、直链或支链的C1-C6烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的芳基烷氧基、直链或支链的卤代-C1-C6-烷基、直链或支链的卤代-C1-C6-烷氧基、烷氧基-C1-C6-烷基、羟基-C1-C6-烷基或羧基-C1-C6-烷基，或者可选择地，R6和R7和与其键合的氮原子在一起形成环，所述环选自例如吡啶基、哌啶子基(piperadino)、吗啉代、吡咯烷基和哌嗪基，上述基团可以任选地被一个或两个选自如下的取代基所取代C1-C6烷基、羧基(其可以是被保护的)、氨基、氰基、羟基、卤素、取代或未取代的苯甲酰基、取代或未取代的芳基烷基(如苄基)。
在另一种实施方案中，本发明至少部分地涉及式XX化合物
XX 其中X、Y、A、B、C和D各自独立地选自碳、氮、氧和硫；并且其中A、B、C和D形成饱和或不饱和环的一部分。
R1、R2选自氢、具有C1-C10原子的取代或未取代的烷基、具有C3-C7原子的取代或未取代的支链烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代芳基烷基、取代或未取代的芳基烷氧基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的杂芳基烷基、取代或未取代的杂芳基烷氧基、取代或未取代的芳氧基苯基、取代或未取代的烷氧基苯基。
R3和R4各自独立地选自氢、羟基、直链或支链的C1-C6烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的芳基烷基、取代或未取代的芳基烷氧基、直链或支链的卤代-C1-C6-烷基、直链或支链的卤代-C1-C6-烷氧基、烷氧基-C1-C6-烷基、羟基-C1-C6-烷基或羧基-C1-C6-烷基，或者可选择地，R3和R4和与其键合的氮原子一起形成环，所述环选自例如吡啶基、哌啶子基(piperadino)、吗啉代、吡咯烷基和哌嗪基(piperazino)，上述基团可以任选被一个或两个选自如下的取代基取代C1-C6烷基、羧基(其可以是被保护的)、氨基、氰基、羟基、卤素、取代或未取代的苯甲酰基、取代或未取代的苄基。
在其它实施方案中，可以合成上面显示的结构以及图3中的结构和它们的类似物。
这些结构中的一些可以从综合性的化学数据库如可获得的化学品目录(Available Chemical Directory)中商购获得。然而，所述结构中的许多是新的，无法在该数据库中获得的。那些无法商购获得的化合物可以通过非常确实的合成工艺来进行合成。有许多描述所有期望类似物合成的合成方面的文章和专利(参见例如美国专利3,940,393；Sardarian等人，(2003)Org.Biomol.Chem.21960-964；Ross等人，(1976)J.Med.Chem，19723-725)。
V.使用药理学试剂调节神经变性障碍 核受体在神经变性疾病如ALS及与核受体相关的途径的调节中的作用，可能是在ALS或其他神经变性疾病的临床研究中的靶点。实施例部分显示的数据表明乙胺嘧啶及其类似物在降低SOD-1的表达中具有作用。
用于ALS的SOD1 G93A(高度复制)小鼠模型是适合的小鼠，其携带有23复制份的人G93 A SOD突变体并且由内源性启动子所驱动。小鼠中的存活率是复制依赖性的。高度复制的G93A具有大约128天的存活率中位值。突变型SOD蛋白的高分子量的复合物在脊髓中于大约第30天开始出现。在第60天，观察到反应性的星形细胞增生(GFAP反应)；在第90天前观察到活性的小胶质细胞。Gurney等人的研究显示了，在第90天，反应性的星形细胞增生失去了统计学上的显著性，同时小胶质细胞的活化则显著地提高并且持续提高至所述疾病的末期(参见Gurney，等人.(1996年)Ann.Neurol，39147-5739页)。
在该模型中显示了功效的很多药物已经进一步进入人体临床试验。采用在ALS治疗中唯一批准的药物--利鲁唑的经验表明，小鼠ALS模型是很好的临床效果预测器。其他药物如肌酸(Creatine)、西乐葆(Celebrex)、辅酶Q10和米诺环素正处于基于此模型研究的临床评估中。
VI.核受体调节药理学试剂的递送 本发明的药理学试剂可以掺入适合给药于受试者的药用组合物。一般地，所述药物组合物包含核受体调节药理学试剂如乙胺嘧啶以及药学上可接受的载体。如本文所使用的“药学上可接受的载体”包括任何和全部的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等，它们在生理学上是可配伍的。药学上可接受的载体的实例包括水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等中的一种或多种，及其组合。在很多情况下，所述组合物中优选包含等渗剂，例如糖类、多元醇类如甘露醇、山梨醇或氯化钠。药学上可接受的载体可以进一步包含少量的辅助物质如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其增加药理学试剂的货架期或效力。
所述药物组合物可以是多种形式。这些形式包括例如液体、半固体和固体剂型如液体溶液(例如，可注射的和可输注的溶液)、分散体或悬浮液、片剂、丸剂、粉剂、脂质体和栓剂。优选的剂型取决于期望的给药模式及治疗应用。优选的给药模式是胃肠外给药(例如静脉内、皮下、腹腔内、肌肉内)。在一种优选的实施方案中，将所述药理学试剂通过腹腔注射给药。
一般地，将组合物制备为注射剂，如液体溶液或悬浮液；还可以制备为适合于在注射前溶解于或悬浮于液体载体中的固体形式。所述制剂还可以被乳化或胶囊包封在脂质体或微粒如提高佐剂作用的聚交酯、聚乙醇酸交酯或共聚物中(参见例如Langer，Science 249，1527(1990)和Hanes，AdvancedDrug Delivery Reviews 28，97-119(1997))。本发明的试剂还可以是以存贮注射剂或植入制剂的形式给药，其可以这种方式配制来允许活性成分的缓慢或脉冲释放。所述存贮注射剂或植入制剂可以，例如，包含一种或多种乙胺嘧啶化合物或其功能性类似物，或包含不同试剂的组合(如乙胺嘧啶和炔诺酮)。
一般地，所述药物组合物在制造和贮藏条件下必须是无菌的和稳定的。该组合物可以配制为溶液、微乳液、分散体、脂质体或适合高药物浓度的其他有序结构。无菌的可注射溶液可以这样制得，通过将所述活性化合物(即，所述药理学试剂)以所需量掺入含有以上列举的成分之一或其组合的适合溶剂中，如果需要的话，之后过滤灭菌。
通常，分散体是这样制得的，通过把活性化合物掺入无菌赋形剂中，该无菌赋形剂含有基础分散介质和来自以上列举的那些物质中的所需要的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌冻干粉的情况下，优选的制备方法是真空干燥和喷雾干燥，得到活性成分加上任何另外期望的来自先前其无菌过滤溶液成分的粉末。可以保持溶液的适当流动性，例如，通过使用包衣如卵磷脂，通过在分散体的情况下维持需要的粒度，以及通过使用表面活性剂。通过在所述组合物中包含延长吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶，可以带来可注射组合物的延长吸收。
所述核受体调节性药理学试剂可以通过本领域已知的多种方法给药。如本领域技术人员所知，给药的途径和/或方式将根据期望的结果变化。在某些实施方案中，所述活性化合物可以和载体一起制得，所述载体将保护化合物免于快速释放，如控释制剂，包括植入剂、透皮贴片和微囊递送体系。可以使用生物降解和生物相容的聚合物，如乙烯-乙酸乙烯酯共聚物(ethylenevinyl acetate)、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯类及聚乳酸。许多制备这样制剂的方法获得了专利或者是本领域技术人员通常已知的。(参见，例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems，J R.Robinson编辑，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978年；Kabanov等人的美国专利No.6,333,051和6,387,406)。
在某些实施方案中，核受体调节性药理学试剂可以与例如惰性稀释剂或可同化的食用载体一起口服给药。化合物(及其他成分，如果需要)还可以是包封于硬或软壳明胶胶囊中，压成片或直接掺入受试者的饮食。对于口服治疗给药而言，化合物可以掺和赋形剂并以可摄取的片剂、含片、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆、干胶片等的形式使用。为了通过非胃肠外给药来给予本发明的化合物，用防止其失活的材料包衣化合物或者共同给药化合物和该材料可能是必须的。
在某些实施方案中，核受体调节性药理学试剂可以液体的形式给药。所述药理学试剂应当溶于多种溶剂如甲醇、乙醇和异丙醇。提高所述药理学试剂在水和其他水溶液中的溶解度的多种方法是本领域已知的。例如，Al-Razzak等人的美国专利No.6,008,192教导了包含亲水相和表面活性剂或表面活性剂混合物的亲水二元体系，用于改善化合物的给药。
补充的活性化合物也可以掺入组合物中。在某些实施方案中，核受体调节性药理学试剂可以与用于改进所述药理学试剂的药代动力学的一种或多种另外的治疗剂共配制和/或共给药。改进本发明药理学试剂的药代动力学的多种方法是本领域已知的。(参见例如Norbeck等人的美国专利No.6,037,157)。
改进所述药理学试剂的药代动力学的其他方法已经公开在例如以下美国专利中Masters的No.6,342,250、Kabanov等人的6,333,051、Straub等人的6,395,300、Kabanov等人的6,387,406及Reed等人的6,299,900中。Masters公开了一种用于控制释放药理学活性试剂的药物递送装置和方法。Masters公开的药物递送装置是一种膜，所述膜包含一种或多种生物可降解的聚合材料、一种或多种生物相容性的溶剂以及均匀分散在整个膜中的一种或多种药理学活性试剂。在美国专利No.6,333,051中，Kabanov等人公开了共聚物网络，该网络具有至少一种交联多胺聚合物片段、至少一种非离子水溶性聚合物片段及至少一种适合的生物试剂，包括药理学试剂。根据该专利的教导，这种网络，被称为纳米凝胶(nanogel)网络，通过减少副作用和增加治疗作用改进了所述药理学试剂的疗效。在另一篇专利美国专利No.6,387,406中，Kabanov等人还公开了改进多种药理学试剂的口服递送的另一种组合物。
改进所述药理学试剂的递送和给药的其他方法包括改进药理学试剂穿过膜特别是穿过血脑屏障的能力的手段。在一种实施方案中，可以修饰所述药理学试剂以改进其穿过血脑屏障的能力，而在一种可选择的实施方案中，所述药理学试剂可以与其它试剂如抗真菌化合物共同给药，其改进了所述药理学试剂穿过血脑屏障的能力。可选择性地，所述药理学试剂向脑部的特定位点的精确递送，可以通过使用立体定向微注射技术来进行。例如，可以将被治疗的受试者置于立体定向支架基座内(MRI-可匹配的)，然后使用高分辨率MRI成像来测定要治疗的特定区域的三维位置。然后，可以将MRI影像传送到具有适合立体定向软件的计算机，使用大量的影像来测定所述药理学试剂微注射的靶位点和轨迹。该软件将所述轨迹转换成三维坐标，为用于立体定向支架而精确地记录所述坐标。在颅内递送的情况下，将头骨暴露，在进入位点上钻上钻孔，并使用立体定向设备来定位针头并确保在预定深度处植入。可以将所述药理学试剂递送到与所述疾病或障碍相关的区域例如脊髓、脑干或脑部的细胞。例如，靶区域可以包括髓质、脑桥和中脑、小脑、间脑(例如，丘脑、下丘脑)、端脑(例如，纹状体、大脑皮质或皮质内、枕叶、颞叶、顶叶或额叶)或其组合。
可以将药理学试剂单独或组合使用以治疗神经变性障碍。例如，所述药理学试剂可以与例如其他存在的核受体调节剂结合使用，用于产生加和或协同作用。同样地，所述药理学试剂可以单独使用或与另外的试剂联合使用，例如向所述治疗组合物传递有益性质的试剂、例如影响所述组合物的粘度的试剂。如果所述联合使得形成的组合物可以完成其预期的功能，则所述联合也可以包含超过一种的另外的试剂，例如两种或三种另外的试剂。在一些实施方案中，本发明包括将本发明的乙胺嘧啶化合物或其功能性类似物，与例如至少一种与孕酮相关的化合物如炔诺酮，或者至少一种雌激素相关的化合物如雌二醇一起给药。对于这些化合物和给药的说明，参见于2006年3月1日提交的名称为“通过孕酮受体调节神经变性疾病(Modulation ofNeurodegenerative Diseases through the Progesterone Receptor)”和“通过雌激素受体调节神经变性疾病(Modulation of NeurodegenerativeDiseases through the Estrogen Receptor)”的共同未决申请。
本发明的化合物可以结合药学上可接受酸式盐以有助于作为水溶液的长期贮藏和给药。例如，所述盐可以衍生自药学上可接受的酸(如HCl)，使用或没有使用药学上可接受的载体(如水)。这样的盐可以衍生自无机酸或有机酸，包括例如盐酸、氢溴酸、乙酸、柠檬酸、富马酸、马来酸、苯磺酸以及抗坏血酸。由载体和盐的组合获得的药物组合物通常是以引起所期望的生物学效应所需要的剂量来使用。这包括其以治疗有效量使用或当与其他生物活性试剂联合使用时以较少的量使用。
本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的药理学试剂。“治疗有效量”是指在需要的剂量和时间周期下有效地获得期望的治疗效果的量。药理学试剂的治疗有效量可根据多种因素如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及所述药理学试剂在个体中引起期望的反应的能力而变化。治疗有效量还是这样的，其中所述药理学试剂的治疗有益效果大于其任何的毒性或有害作用。“预防有效量”是指在需要的剂量和时间周期下有效地获得期望的预防效果的量。一般地，因为预防性的剂量是在疾病之前或疾病早期用于患者，因此预防有效量将低于治疗有效量。
可以调节剂量方案以提供最佳期望的反应(例如，治疗性反应或预防性反应)。例如，可以给药单次静脉推注剂(single bolus)，随着时间的推移可以给予若干个分开的剂量或者剂量可以按比例地减少或增加，如治疗情形的紧急所表明的。配制剂量单位形式的胃肠外组合物，对于给药方便和剂量均一是特别有利的。如本文所使用的剂量单位形式是指适合作为要治疗的哺乳动物受试者的单一剂量的物理上离散的单位；各个单位含有产生期望疗效的经计算的预定量活性化合物和需要的药物载体。本发明的剂量单位形式的规格决定和直接取决于(a)所述活性化合物的独特特性和要获得的特定的治疗或预防效果，以及(b)在配合用于治疗的这种活性化合物的领域中，个体敏感性的固有限制。
给药于受试者或受试者群的药理学试剂(如乙胺嘧啶)的治疗有效量或预防有效量的示例性、非限制性的范围是5mg/天-约200mg/天，优选是约10mg/天-约150mg/天，更优选是约5mg/天-约20mg/天，且最优选是约3mg/天-10mg/天。优选地，给予治疗有效量的药理学试剂(如乙胺嘧啶)，导致血流中药理学试剂的浓度是1纳摩尔(nM)-100毫摩尔(mM)浓度的范围。例如，约100nM-约10mM、约1nM-约1mM、约1nM-约100微摩尔(μM)、约1μM-约500μM、约1μM-约200μM、或约10μM-约50μM的浓度范围。值得注意的是，剂量值可以根据要缓解的病症的类型和严重程度而变化。进一步理解的是，对于任何特定受试者，根据个体的需要以及给予或监督给予所述组合物的人员的专业判断，应当随着时间的推移而调整具体的剂量方案，并且在此提出的剂量范围仅仅是示例性的，不意味着限制所要求的组合物的范围和实施。
本领域技术人员基于上述的实施方案将会理解本发明进一步的特征和优点。因此，除非在所附的权利要求中指出，本发明不被特定的说明和描述内容所限制。本文引用的所有出版物和参考文献均明确地全文引入本文作为参考。
实施例 实施例1原料和方法 (i)细胞培养 发现人宫颈癌衍生的HeLa细胞系(ATCC)表达SOD-1蛋白质和mRNA，并且将其用作鉴别抑制SOD-1表达的化合物的模型系统。简而言之，将细胞保持在Dulbecco氏最低限度必需培养基中，所述培养基含有高葡萄糖，补充以4mM的谷氨酰胺、10％的经过检验的胎牛血清以及青霉素、链霉素和制霉菌素(均获得自Invitrogen)。孵育条件是37度和99％相对湿度，与5％的CO2。当培养物达到90％融合时，传代培养物。对于药理学实验，在150μl的培养基中以3,500个细胞/孔的密度，将细胞平板接种到无菌的组织培养物处理的96孔板中。
(ii)药物 将所有化合物以10mM的原液浓度溶解于100％的DMSO中。药物获得自Microsource Discovery或Sigma Aldrich。
(iii)实验方案 在平板接种并贴附6小时之后，将药物以10μM的浓度加入培养基中。与所述药物孵育72小时之后，将所述细胞在100x下使用倒置的显微镜和数码相机照相，从而可以评估细胞毒性。在光记录之后，移去所述培养基，将所述细胞用磷酸盐缓冲盐水洗涤一次，然后加入50μl的含有蛋白酶抑制剂混合液的分子生物学等级的水。孵育10分钟之后，将所述平板放置在-80度下从而引起完全的溶胞作用。然后，解冻平板，从各个孔中转移出25μl至用抗人SOD-1抗体包被的maxsorp ELISA平板中，所述平板中含有75μl的磷酸盐缓冲盐水。然后向所述孔中加入第二种抗体对(多克隆的抗-SOD-1/HRP接合的山羊抗-兔)，在室温下进行孵育1小时。在孵育结束时，将平板洗涤三次(来自KPL Inc.的洗涤缓冲液)，加入Sure Blue Reserve HRP底物。孵育5-10分钟之后，通过加入停止试剂(KPL)停止所述反应(其变成不同程度的蓝色)。然后将所述平板轻微振荡5秒钟，在Tecan平板读数器上读取450nm处的吸光度。将每一样本的吸光度与纯化重组体人SOD-1在相同的ELISA平板上测定的标准曲线相对比，通过与标准曲线比较来评估SOD-1的免疫反应性(ng/ml)。
(iv)Bradford蛋白试验 为了确定在SOD-1试验中发现的减量是否只是所述药物治疗的细胞毒性作用的结果，测定各个孔的总蛋白。在进行ELISA孵育时，从各个孔中移出10μl的残留的溶胞产物并放置于另一个空的平板中，向蛋白质中加入BioRad Bradford试剂(100μl)。在室温下孵育15分钟之后，轻微振荡所述平板5秒钟，在Tecan Sunrise平板读数器上读取595nm下的吸光度。通过与在相同平板上得到的蛋白标准样品相比较，从而确定每一孔中的蛋白浓度。
(v)定量的RT-PCR 如上，将96孔板中3500个细胞/孔的HeLa细胞以本发明的化合物处理72小时，然后溶解所述细胞，使用Gentra RNA提取规程和试剂提取总RNA。然后，将所述纯化的RNA用作反转录反应中的模板，所述反应使用以oligoDT为引物(primed with oligoDT)的Superscript IIIMMLV转录酶。在得到的cDNA上进行PCR反应以扩增对应于人SOD-1、人TATA-盒结合蛋白以及人β-2微球蛋白的cDNA。所述PCR反应是在分离的试管中进行20、25和30个循环，并且随后扩增子是在2％的含菲啶溴红的琼脂糖凝胶上进行。以UV光源刺激之后，使用数码相机捕获由菲啶溴红染色条带发射的荧光。使用ImageJ(NIH)分析所述数码图像，将SOD-1的条带与TATA-盒结合蛋白和β2微球蛋白的条带(这些管家基因未受药物影响)相比较，同时在循环的线性范围之内，在这些条件下的25个循环，相对于对照增加或减少。
(vi)基因芯片(GeneChip)实验 总细胞mRNA是从经过处理或未经处理的HeLa细胞制得，所述处理是通过使用Qiagen RNA小型试剂盒之后以oligotex mRNA小型试剂盒处理。双链的cDNA是由2μg的总mRNA合成，按照制造商的推荐，使用带有T7-(dT)24引物的用于cDNA合成的Superscript选择系统(Invitrogen)。通过锁相凝胶(phase lock gel)(PLG)苯酚/氯仿提取清除所述cDNA，并通过乙醇沉淀浓缩所述cDNA。生物素标记的cRNA是由cDNA通过体外转录合成，所述转录是按照售主的推荐，使用生物鉴定高产率RNA转录物标记试剂盒(Affymetrix)来进行的。使用RN easy spin columns(Qiagen)清除体外转录产物，在断裂缓冲液(40mM Tris-醋酸盐、pH 8.1，100mM KOAc、30mMMgOAc)中通过金属诱导的水解而裂成碎片。然后将cRNA碎片经受杂交缓冲液(100mM MES、IM NaCl、20mM EDTA、0.01％Tween-20)中的AffymetrixGeneChip装置。用Affymetrix Microarray Suite V5.0和Affymetrix DataMining Tool V3.0分析GeneChip影像。将所有探针装置的信号强度标度为150的靶点值。Detection Call、Change Call和Signal Log Ratio的结果是通过在用于绝对值分析和对照分析的统计算法中使用缺省参数而获得。
(vii)蛋白质印迹法 将动物以戊巴比妥钠(250mg/kg，i.p.)过剂量给药。解剖脊髓，并在20mM pH 7.5的Tris-HCL、2mM DTT、0.1mg的亮抑蛋白酶肽、1mM EDTA和1mM EGTA中匀浆化。然后将匀浆在14,000xg下离心以沉淀碎片。使用BCA蛋白测定法(Pierce，Rockford，IL)测量蛋白浓度。将来自各个样本的蛋白质(25μg)在4-20％的Tris-甘氨酸凝胶(Invitrogen，San Diego，CA)上跑柱。在转移之后，将所述膜在PBS中洗涤，接着在封阻缓冲液(0.2％I型封阻剂(I-block)(Applied Biosystems，Foster City，CA)，PBS和0.1％Tween 20)中孵育过夜。然后将所述膜以多克隆兔抗牛SOD1(Sigma)抗体在1∶4000稀释度下探测。洗涤数次之后，将所述膜用碱性磷酸酶结合的二抗(1∶5000，于封阻缓冲液中)培养，使用增强的化学发光试剂CDP Star(Western Star kit；Tropix)来显影所述免疫反应信号。曝光之后，扫描膜，然后输入NIH图象用于条带密度的定量。
实施例2抗疟试剂的效果测试 该实施例描述了如何检测所述抗疟药物乙胺嘧啶对于SOD-1活性的体外效应。将人宫颈癌衍生的HeLa细胞系(ATCC)在Dulbecco最低限度必需培养基中培养，所述培养基含有高葡萄糖，补充以4mM的谷氨酰胺、10％的经过检验的胎牛血清，以及青霉素、链霉素和制霉菌素(均来自Invitrogen)。孵育条件是37℃和99％相对湿度，与5％的CO2。当培养物达到90％融合时，将其传代。对于药理学实验，在150μl的培养基中以3,500个细胞/孔的密度，将细胞平板接种到经无菌的组织培养物处理的96孔板中。
用乙胺嘧啶孵育72小时之后，如实施例1(iii)所述将所述细胞照相和处理。如实施例1(iv)中所述使用Bradford试验，测定溶胞产物的总蛋白。该研究的结果如图1所示。这些结果显示，收获细胞前72小时加入HeLa细胞培养基中的乙胺嘧啶显著地降低了SOD-1蛋白的水平，同时总蛋白水平未受影响。这种降低是剂量相关性的，其最大值是10μM，IC50低于3μM。图2显示在72小时的处理后，炔诺酮和乙胺嘧啶(5μM)均导致HeLa细胞中hSOD-1mRNA的剂量相关性的降低。
α-突触核蛋白已经在神经变性障碍中涉及，所述神经变性障碍的特征在于Lewy body内含物如具有Lewy bodies的帕金森氏症(PD)和痴呆。Lewybody样内含物已经在患有肌萎缩性侧索硬化(ALS)病人的脊椎神经元中观察到，并且有报告提示在ALS病人中可能的α-突触核蛋白异常。α-突触核蛋白是一种普遍存在的蛋白，其与蛋白质陪伴分子14-3-3具有显著的生理上和功能上的同源性，并且在脑中特别丰富(OstrerovaN等人，J.Neurosci.，195782页(1990年))。α-突触核蛋白聚集速率的增加可能有助于解释Lewy body疾病中神经变性的机制。关于转基因动物的研究还提示α-突触核蛋白的聚集对于神经元是有害的。据报道，在表达野生型人α-突触核蛋白的转基因小鼠中发生多巴胺能功能障碍(Masliah，E.，等人，Science，2871265-1269页(2000年))，并且，过度表达α-突触核蛋白的果蝇显示了与α-突触核蛋白聚集物的发展相关的多巴胺能功能障碍和多巴胺能神经元的死亡(Feany，M B，等人，Nature 404394-8页(2000年))。有证据提示，含有多巴胺的神经元发展了α-突触核蛋白聚集物并随着这些聚集物的发展而退化。
图4中所示的Genechip分析的结果说明，在治疗4天之后，乙胺嘧啶(ALG-2001)(3μM)和炔诺酮(ALG-3001)(3μM)实质上减少了HeLa细胞中用于α-突触核蛋白的mRNA。因此，本发明的化合物可以减缓Lewy body疾病中的神经变性。这说明，本发明的化合物在减缓ALS及PD的进程或改善ALS及PD效果中的作用。
实施例3测试药理学试剂在体内的功效 (a)SOD-93A鼠类动物模型 在用于ALS的SOD-93A鼠类动物模型的体内测试实施例2中所述的药理学试剂如乙胺嘧啶及其类似物的效果，并且测量所述SOD-1水平的降低。使用标准RT-PCR技术，从引入所述化合物之前和之后的所属领域认可的ALS小鼠模型中分离血样，以监测RNA表达的抑制。使用蛋白质印迹技术采用来自Sigma的抗-SOD-1抗体来测定SOD-1蛋白的表达。
如图5和图6所示，使用乙胺嘧啶的慢性治疗(10毫克/千克，腹腔注射(ip)给药14天)显著性地(P＜0.05，n＝7)降低小鼠淋巴细胞中的SOD-1蛋白和α-突触核蛋白。使用学生t检验分析法，该结果显示出统计学上的显著性。所述对照是载体(盐水)。
如图7所示，在14天的治疗后，慢性的乙胺嘧啶(50毫克/千克/天)显著性地降低G93A小鼠的脊柱SOD-1。将乙胺嘧啶口服给药14天。获取并通过如上所述的蛋白质印迹法分析脊髓。
(b)人家族性ALS病人 在用乙胺嘧啶(100毫克/天，30天)口服治疗后，38岁的家族性ALS病人志愿者显示出SOD-1水平的显著降低。图8显示，与治疗前(药前)相比，在给予所述药物之后(药后)该家族性SOD1病人的淋巴细胞SOD1的水平降低。从该病人采集了大约5-8cc的血液。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)和蛋白质印迹法分析SOD-1的水平。
也可以通过以Renaissance Puritan Bennett肺活量计来测定最大肺活量(FVC)，从而检测受试者的呼吸，以测定体内的效果。还可以使用手持测压计来测量最大吸气力(MIF)。
实施例4神经功能评分 也可以通过以4分等级记录的神经功能评分，来测定所述核受体调节性药理学试剂的效果 0＝下肢上的正常反射(当被提起尾巴时，动物将展开其下肢) 1＝异常反射(当动物被提起尾巴时，没有展开其下肢) 2＝异常反射和可见的麻痹迹象 3＝缺乏反射，下肢的全部麻痹。
4＝当被侧面放置时，在30秒内不能回正自己或者出现死亡。如果活着，动物在此阶段被处死。
可以通过利用ANOVA、Kaplan Meier、t-检验、Cox′s比例风险回归模型(Cox’s proportional hazards regression model)log-对数的和panametric方法及混合的线性模型方法，来进行对于神经功能评分、体重和存活率的统计学分析。所有的统计学分析均是使用本领域已知的标准方法来进行的。
序列表
<110>S.斯科特，D.本杰明
<120>神经变性疾病的调节
<130>106792-0009
<140>尚未指定
<141>2006-03-01
<150>60/658,505
<151>2005-03-04
<160>2
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>2288
<212>DNA
<213>智人
<400>1
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<211>153
<212>PRT
<213>智人
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Ala Thr Lys Ala Val Cys Val Leu Lys Gly Asp Gly Pro Val Gln Gly
1 5 10 15
Ile Ile Asn Phe Glu Gln Lys Glu Ser Asn Gly Pro Val Lys Val Trp
20 25 30
Gly Ser Ile Lys Gly Leu Thr Glu Gly Leu His Gly Phe His Val His
35 40 45
Glu Phe Gly Asp Asn Thr Ala Gly Cys Thr Ser Ala Gly Pro His Phe
50 55 60
Asn Pro Leu Ser Arg Lys His Gly Gly Pro Lys Asp Glu Glu Arg His
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Ile Gly Arg Thr Leu Val Val His Glu Lys Ala Asp Asp Leu Gly Lys
115 120 125
Gly Gly Asn Glu Glu Ser Thr Lys Thr Gly Asn Ala Gly Ser Arg Leu
130 135 140
Ala Cys Gly Val Ile Gly Ile Ala Gln
145 150
权利要求
1.一种用于减少细胞内的SOD蛋白产生的方法，所述方法包括给予所述细胞一种药理学试剂，使得所述试剂与核受体相互作用，并且抑制编码SOD蛋白的基因的转录，其中所述试剂是乙胺嘧啶或其功能性类似物。
2.权利要求1的方法，其中所述细胞选自脑细胞、脊髓细胞、脑膜组织细胞和肌细胞。
3.权利要求1的方法，其中所述细胞是患有ALS的受试者的神经细胞。
4.权利要求1的方法，其中所述SOD蛋白是SOD-1蛋白。
5.权利要求1的方法，其中所述药理学试剂是乙胺嘧啶。
6.权利要求1的方法，其中所述药理学试剂是在苯环中有至少一处修饰的乙胺嘧啶。
7.权利要求1的方法，其中所述药理学试剂是在嘧啶环中有至少一处修饰的乙胺嘧啶。
8.权利要求1的方法，其中所述基因转录的抑制包括监测所述SOD蛋白的表达水平。
9.权利要求1的方法，其中所述基因转录的抑制包括监测编码所述SOD蛋白的核酸分子的水平。
10.权利要求9的方法，其中所述核酸分子选自核糖核酸或脱氧核酸。
11.一种用于在受试者中防止肌萎缩性侧索硬化(ALS)的症状发展或改善肌萎缩性侧索硬化的症状或进展的方法，所述方法包括给予受试者预防或治疗有效量的药理学试剂，其中所述试剂抑制编码SOD-1蛋白的基因的转录。
12.权利要求11的方法，其中所述药理学试剂是乙胺嘧啶或其功能性类似物。
13.权利要求11的方法，其中所述药理学试剂是在苯环中有至少一处修饰的乙胺嘧啶。
14.权利要求11的方法，其中所述药理学试剂是在嘧啶环中有至少一处修饰的乙胺嘧啶。
15.权利要求11的方法，所述方法进一步包括通过监测所述受试者的存活时间的延长来监测ALS的改善。
16.权利要求15的方法，其中所述监测ALS改善的步骤包括监测所述受试者的神经功能评分。
17.权利要求15的方法，其中所述监测ALS改善的步骤包括监测所述SOD-1蛋白的表达水平。
18.权利要求15的方法，其中所述监测ALS改善的步骤包括监测编码SOD-1蛋白的核酸分子的水平。
19.权利要求18的方法，其中所述核酸分子选自核糖核酸或脱氧核酸。
全文摘要
公开了通过给予药理学试剂，从而用于选择性地干扰中枢神经系统细胞、脑膜细胞或肌细胞中的蛋白质合成的方法和组合物。特别地，公开了干扰SOD-1蛋白合成的方法和组合物。
文档编号A61K31/505GK101184493SQ200680015311
公开日2008年5月21日 申请日期2006年3月1日 优先权日2005年3月4日
发明者S·斯科特, D·本杰明 申请人:阿尔斯根公司