由同二聚体、同四聚体或二聚体的二聚体组成的稳定连接复合体的生产方法及用途的制作方法

专利名称：由同二聚体、同四聚体或二聚体的二聚体组成的稳定连接复合体的生产方法及用途的制作方法
由同二聚体、同四聚体或二聚体的二聚体组成的 稳定连接复合体的生产方法及用途
背景技术：
本发明公开了一种平台技术，用于制备可具有多重功能或结合特 异性或二者均具有，且适于雄^"和沐力应用的稳定束绰结构(satbly tethered structure)。在一个实施方案中，这种稳定束缚结构制备为任何有机物质的同二聚体，其可为蛋白质或非蛋白质。下文中称为a2的这种 同二聚体由两个相同亚基组成，两个亚基通过其中的独特肽序列相互连
接，这种独特肽序列称为二聚^b和停靠域(dimerization and docking domain) (DDD)。通过重组技术或化学缀合经间隔基团(spacer gro叩)将 DDD序列连接于感兴趣的前体，制成能够自締合形成二聚体的结构从 而构建这种亚基。实施例2和3中描述了用称为DDDl (图la, SEQ ID NO:)的DDD序列制成的代表性的32构建体。
0005]在另一个实施方案冲，这种稳定束缚结构主要制备为蛋白质或非 蛋白质的任何有机物质的同源四聚体。下文中这种同源四聚体称为a4, 包括用称为DDD2 (图lb, SEQ ID NO:2)的DDD序列制成的两个相同的 a2构建体，4个亚基中每个均包舍DDD2。实施例4和5中描述了 5个 这种a4构建体。通常，类型7类别内产物适于多种应用，其中两种不同非免疫球 蛋白蛋白的组合比每个单独的相应非免疫球蛋白都更适用。例如，包括 IL-4R (sIL-4R)的受体的可溶性组分的两个拷贝和IL-13 (sIL-13R)的受体 的可溶性组分的两个拷贝的a2a，2产物为治疗哮喘或变态反应的潜在治 疗剂。另一个实例为包括Api2-28P的两个拷贝和Tf的两个拷贝的a2a，2 产物。添加Tf到Api2-28P预期能够使所得复合物穿过血脑屏障用于有 效治疗阿尔茨海默病。
0015j本发明的稳定束缚结构，包括其缀合物，适于广泛应用在治疗和 诊断中。例如基于抗体结合域的a2、 34或a2a，2构建体可以与棵抗体
19(naked antibody)相同的方式治疗，其中这种构建体未缀合于添加的功能 剂上。或者这些稳定束绰结构可用一种或多种功能剂衍生化用于治疗或 诊断。添加的药物可使用常规缀合化学共价连接于稳定束缚结构上。
稳定束缚结构的使用方法可包括检测、诊断和/或治疗疾病或其他 病症。这些病症包括但不限于癌、增生、糖尿病性视网膜病、黄斑变 性、炎性肠病、局限性回肠炎、溃痴性结肠炎、类风湿性关节炎、肉状 瘤病、哮喘、水胂、肺动脉高血压、银屑病、角膜移植片排斥、新生血 管性青光眼、Osier-Webber综合征、心肌血管发生、蚀斑新生血管形 成、再狭窄、血管创伤后新内膜形成、毛细血管扩张、血友病性关节、 血管纤维瘤、与慢性炎症有关的纤维变性、肺纤维化、深部静脉血栓形 成或伤口肉芽发生。
|00171在特定的实施方案中，公开的方法和组合物可用于治疗自身免疫 性疾病，例如急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性 紫癜、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病、重症肌无力、系统性红斑狼疮、狼 疮性肾炎、风湿热、多腺体综合;f正、大疱性类天疱疮、青少年糖尿病、
亨诺-许兰二氏紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑(erythema nodosurn)、高安氏动脉炎、阿狄森氏病、类风湿性关节炎、多发性硬化 症、肉状瘤病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉 炎、强直性脊柱炎、古德帕斯彻综合征、血栓闭塞性脉管炎 (thromboangitisubiterans)、斯耶格伦综合征、原发性胆汁性肝硬变、桥 本氏曱状腺炎、曱状腺毒症(即格雷夫斯病)、硬皮病、慢性活动性肝 炎、多发性肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常天疱疮、韦格納肉芽肿病、膜 性肾病、肌萎缩性脊髓侧索硬化、脊髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性 贫血、急进性肾小球性肾炎、银屑病或纤维化肺泡炎。
-Fab-hMN-14含有两个活性结合位点。
在某些实施方案中，标准的肽键连接可被一种或多种其它连接基团取代，例如CHrNH、 CH2-S、 CH2-CH2、 CH=CH、 CO-CH2、 CHOH-CH2等。已熟知用于制备肽模拟物的方法(例如Hruby, 1982, 31:189-99; Holladay等，1983, re〖ra/7ec/raw Le". 24:440卜04; Jennings-White 等， 1982， 7^ra/^t/ra"23:2533; Ahnquiest等，1980,丄A/ec/. C/7em. 23:1392-98; Hudson等，1979, 丄尸e- 14:177-185; Spatola等，1986， 38:1243-49;美国专利第5,169，862号、第
5,539,085号、第5,576,423、第5,051,448号、第5,559,103号，各自通 过引用并入本文中)。与其肽类似物相比，肽模拟物可显示出提高的体 内的稳定性和/或吸收。
0080j或者，可通过使用N-末端和/或C-末端加帽以防止肽链端解酶活 性，从而口服给予肽。例如C-末端可使用酰胺肽加帽，而N-末端可通 过肽乙酰化加帽。也可将肽环化来阻断肽链端解酶，例如通过形成环状 酰胺、二硫化物、醚、硫化物等。
10081J也可通过用D-氨基酸替换天然存在的L-氨基酸稳定肽，特别是 在已知的肽链内切酶作用部位替换。本领域已知肽链内切酶结合和切割 的序列，且已经描述了制备和使用结合D-氨基酸的肽的方法(例如 McBride等2004年6月14号申请的美国专利申请号20050025709,通 过引用并入本文中)。在某些实施方案中，肽和/或蛋白质可通过与蛋白 水解酶抑制剂和/或肽酶抑制剂共制备，口服给予。
|0082j在Mehta ("Oral delivery and recombinant production of peptide
hormones,，，(肽激素的口服给药和重组制备)2004年6月，B/oP/wm Intemational)中公开了治疗性肽的口服给药的其他方法。给予包有肠溶 衣的固体剂型形式的肽和赋形剂，其中赋形剂调节肠蛋白水解活性并提 高肽的跨肠壁转运。使用这种技术完整肽的相对生物利用度在给药剂量 的1%-10%范围内。使用包有肠溶衣的微胶嚢已经成功的给予狗胰岛素 和牛胆酸钠与蛋白酶抑制剂(Ziv等，1994,丄6o"eyW7"er化& 18 (Suppl. 2):792-94)。已经使用酰基肉毒碱作为渗透促进剂及肠溶衣完成肽口服给 药(Eudmgit L30D-55, Rohm Pharma Polymers,参l Mehta, 2004)。用于
34口服给予肽的赋形剂可通常包括一种或多种肠蛋白酶/肽酶的抑制剂、去 污剂或其他药物从而提高肽的溶解度或吸收，其可包装于包有肠溶衣的
胶嚢或片剂中(Mehta, 2004)。胶嚢中可包括有机酸，当胶嚢在肠中溶解 时酸化肠且抑制肠蛋白酶活性(Mehta, 2004)。用于口服递送肽的的另一 种选择包括缀合于基于聚乙二醇(PEG)的两性分子低聚物，增加吸收并 抑制酶的降解(Soltero和Ekwuribe， 2001,尸/7ami rec/ "o/. 6:110)。
本文所用"氨基酸残基"指本领域已知的任何天然存在的氨基 酸，任何氨基酸衍生物或任何氨基酸模拟物。在某些实施方案中，蛋白 质或肽的残基为连续的，没有任何中断氨基酸序列的非氨基酸。在另一 些实施方案中，序列可包含一种或多种非氨基酸部分。在特定的实施方案中，蛋白质或肽的残基序列可^f皮一种或多种非氨基酸部分中断。相应的，术语"蛋白质或肽"指氨基酸序列，该序列包含至少一 种在天然存在的蛋白质中发现的20种普通氨基酸，或至少一种包括但 不限于下列所示的修饰的或不常见氨基酸。
修饰的和不常见氨基酸缩写氨基酸缩写氨基酸 ，
Aad2-氨基己二酸EtAsnN-乙基天冬酰胺
Baad3-氨基己二酸Hyl羟赖氨酸
Bala(3-丙氨酸，(3-氨基丙酸AHyl异-羟赖氨酸
Abu2-氨基丁酸3Hyp3-羟脯氨酸
4Abu4-氨基丁酸，y-氨基丁酸 (piperidinic acid)4Hyp4-羟脯氨酸
Acp6-氨基己酸Ide异锁链素
Ahe2-氨基庚酸AIie异-异亮氨酸
Aib2-氨基异丁酸MeGlyN-曱基甘氨酸，肌氨酸
Baib3-氨基异丁酸MelleN-甲基异亮氨酸
Apm2-氨基庚二酸MsLys6-N-曱基赖氨酸
Dbu2,4-二氨基丁酸MeValN-申基缬氨酸
Des锁链素Nva正缬氨酸
Dpm2,2'-二氨基庚二酸Nle正亮氨酸
Dpr2,3-二氨基丙酸Orn鸟氨酸
EtGlyN-乙基甘氨酸
10087|可通过本领域已知的任何技术制备蛋白质或肽，包括通过标准分 子生物学技术表达蛋白质、多肽或肽，从天然来源分离蛋白质或肽或化 学合成蛋白质或肽。以前已经公开了与各种基因相对应的核苷酸、蛋白 质、多肽和肽序列，且本领域普通技术人员可在计算机化数据库中找 到。 一种这样的数据库为National Center for Biotechnology Information's Genbank and GenPept databases (www.ncbi.nlm.nih.gov/》可使用本文公 开的技术或为本领域技术人员已知的技术扩增和/或表达已知基因的编码 区。或者本领域技术人员知道各种商品化的蛋白质、多肽和肽制剂。 农樹踏
0088]制备多肽的另一种实施方案为使用肽模拟物。模拟物为模拟蛋白 质二级结构元件的含有肽的分子。参见例如Johnson等，"P印tide Turn
36Mimetics" in B/<97^C//M9L(9Gf 乂7VD P/WM^4CY, Pezzuto等，Eds., Chapman和Hall, New York (1993),通过引用并入本文。肽模拟物的使 用基本原理是，蛋白质的肽主链的存在主要用来定向氨基酸侧链以便于 分子间相互作用，例如抗体和抗原见的相互作用。预期肽模拟物能使分 子间相互作用类似于天然分子。 融合蛋冷
|00891各种实施方案可涉及融合蛋白。这些分子通常具有肽的全部或实 质部分，在其N-末端或C-末端连接于第二种肽或蛋白质的整体或部分 上。本领域技术人员已熟知产生融合蛋白的方法。例如可使用双功能交 联剂通过化学结合，通过完整融合蛋白的从头合成，或者通过编码第一 种蛋白质或肽的DNA序列连接于编码第二种肽或蛋白质的DNA序 列，然后表达这种完整融合蛋白制成这种蛋白质。 合成屋
|00卯1可根据常规技术在溶液中或在固体支持物上合成完整或部分蛋白 质或肽。根据已知资料可商业购得并可使用各种自动合成仪。参见例如 Stewart和 Young, (1984， Solid Phase Peptide Synthesis, 2d. ed., Pierce Chemical Co.); Tam等，(1983, J. Am. Chem. Soc.， 105:6442); Merdfield, (1986, Science, 232: 341-347); Bamny和Mernfield (1979, The Peptides, Gross and Meienhofer, eds., Academic Press, New York,第1-284页)。通过 这种方法可容易的合成通常约6至约35-50个氨基酸的短肽序列。或 者，可采用重组DNA技术，其中编码感兴趣肽的核苷酸序列插入到表 达载体中，转化或转染适当的宿主细胞，并培养在适当条件下进行表 达。 抗体在某些实施方案中，双特异性构建体和可靶向构建体可有利 于治疗和/或成像正常或患病组织或器官，例如使用在美国专利第 6,126，916号、第6,077,499号、第6,010,680号、第5，776,095号、第 5,776,094号、第5,776,093号、第5,772,981号、第5,753,206号、第 5,746,996号、第5,697,902号、第5,328,679号、第5,128,119号、第 5,101,827号和第4,735,210号中所述方法，各自通过引用并入本文中。 在1999年6月22号申请的美国专利申请系列号09/337,756和2001年4 月3号申请的美国专利申请系列号09/823,746中描述了其它方法。 适体
100107
在某些实施方案中，用于构建体形成的前体可包含适体。构 建及确定适体结合性质的方法为本领域所熟知。例如在美国专利第5,582，981号、第5,595,877号和第5,637,459号中描述了这种技术，各自 通过引用并入本文中。
00108j可通过任何已知方法包括合成、重组和提纯方法制备适体， 并可单独使用或与相同靶向特异性的其他配体组合使用。通常至少大约 3个核苷酸，优选至少5个核苷酸为影响特异性结合所必需的。虽然可 优选10、 20、 30或40个核苷酸的适体，但是小于10个碱基的适体序 列可能是适宜的。 已经熟知制备和筛选结合于特定的感兴趣耙点的适体的方 法，例如美国专利第5，475,096号和美国专利第5,270,163号的方法，各 自通过引用并入本文中。这种技术通常涉及从候选适体混合物中选择及 分步重复结合、自未结合适体分离出结合的适体并扩增。因为在混合物 中仅有少量相应于最高亲和力适体的序列(可能仅有一分子的适体)，通 常需要设定分配标准使分离期间混合物中保留显著量的适体(约5%-50%)。每个循环导致对靶标具高亲和力的适体的富集。可重复进行3-6 个选择和扩增循环，以产生高亲和力及特异性结合于靶标的适体。Avimers
100112
在某些实施方案中，本文所述前体、组分和/或复合体可包含 一种或多种avimer序列。Avimers为一类对多种萃巴分子的亲和力和特异性 多少类似于抗体的结合蛋白。通过沐〃外显子改组和噬菌体展示自人细 胞外受体开发(Silverman等，2005， Nat. Biotechnol. 23:1493-94; Silverman 等，2006, Nat. Biotechnol. 24:220.)。所得多域(multidomain)蛋白可包含亲 和力(一 些情况下亚纳摩尔(subnanomolar))和特异性比单-表位结合蛋白 提高的多个独立结合域。(似)在各种实施方案中，avhners可连接于例 如在要求保护的方法和组合物中使用的DDD和/或AD序列。例如在美国 专利申请公开号20040175756 、 20050048512 、 20050053973 、 20050089932和20050221384中公幵了关于avimers构建和使用的详细方 法，每个文献的实施例部分通过引用并入本文。 疾病组织检测、诊断和成^象的方法
差于蛋冷^#^^ 餘
标记部分可为放射性同位素，通过使用y计数器或(3-闪烁计 数器或通过放射自显影法检测。在优选的实施方案中，诊断性缀合物为 Y辐射同位素、f3辐射同位素、或正电子-辐射同位素。标记部分是指在 预定条件下产生信号的分子。标记部分的实例包括放射性同位素、酶、 荧光标记、化学发光标i己、生物发光标记和顺》兹性标记。可通过本领域 已知标准技术完成标记部分结合于稳、定束缚结构。Kennedy等，Clin. Chim. Acta 70: 1 (1976)， Schurs等，Clin. Chim. Acta 81: 1 (1977), Shih等, Int'U. Cancer 46: 1101 (1990)中描述了这方面的典型方法论。
差于祐凝的##梦錄001171在一些实施方案中，稳定束缚结构可结合核酸部分。在特定实
施方案中，特别是使用核酸扩增方法分析核酸可用来确定结合水平。本 领域已知多种形式的扩增并且可使用任何这些已知方法。通常扩增涉及 使用 一种或多种选择性杂交或特异性靶向待扩增核酸序列的引物。
已熟知用标记性肽或MAbs的诊断性成像的方法。例如在免 疫闪烁成像技术中，用Y辐射放射性同位素标记配体或抗体并引入患者 体内。使用Y射线照相机检测Y辐射放射性同位素的定位和分布。参见 例如Srivastava (ed.), RADIOLABELED MONOCLONAL ANTIBODIES FOR IMAGING AND THERAPY (Plenum出版1988), Chase, "Medical Applications of Radioisotopes,)放射性同位素的医学应用)in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第18版，Gennaro等 (eds.),第624-652页(Mack Publishing Co., 1990)，和Brown, "Clinical Use of Monoclonal Antibodies,"(单克隆4元体的临床应用)in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY 227-49, Pezzuto 等(eds.) (Ch叩man & Hall ]993)。也优选^f吏用发射正电子的放射性核素(PET同位 素)，例如具有511 keV的能量，例如"F、 68Ga、 6401和1241。可通过直 接标记稳定束绰结构，或通过如在Goldenberg等，"Antibody Pre-targeting Advances Cancer Radioimmunodetection and Radioimmunotherapy,"(预先靶向抗体放射免疫检测和放射免疫治疗晚期 癌症)(J Clin Oncol 2006;24:823-834)中所述的预先耙向(pretargeted)成像 方法介导这种成像，也参见美国专利公开第20050002945号、第 20040018557号、第20030148409号和第20050014207号，各自通过引 用并入本文中。 通过选择能够使半衰期最短、体内存留最少及允许检测和精 确测量的同位素的量最少这三者达到最佳组合的同位素，将递送到患者 体内的放射剂量维持在尽可能低的水平。适于诊断性成像的放射性同位 素的实例包括""Tc和川In。为体内诊断目的，稳定束缚结构或结合于它们的半抗原或载 体也可用顺磁性离子及各种放射性造影剂标记。特别适于核it共振成像 的造影剂包含钆、锰、镝、镧或铁离子。其它药物包括铬、铜、钴、 镍、铼、铕、铽、钬或钕。配体、抗体及其片段也可缀合于超声造影剂/增强剂。例如一种超声造影剂为包含人源化IgG或其片段的脂质体。也 优选这种超声造影剂为充填气体的脂质体。 本领域已知许多适当的显像剂及将其连接于蛋白质或肽的方 法(参见例如美国专利笫5,021,236号和第4,472,509号，二者内容通过 引用并入本文)。某些连接方法涉及使用例如采用有机螯合剂比如连接 于蛋白质或肽的DTPA金属螯形络合物(美国专利第4,472,509号)。在偶 联剂例如戊二醛或高碘酸盐存在下，蛋白质或肽也可与酶反应。在偶联 剂存在下或通过与异硫氰酸酯反应制备用荧光素标记的缀合物。 I00123J潜在的用作显像剂的顺磁性离子的非限制性实例包括铬(III)、
锰(ii)、铁(in)、铁(n)、钴(ii)、镍(n)、铜(n)、钕(m)、衫(in)、镱 (ni)、礼(ni)、钒(ii)、铽(in)、镝(in)、钬(m)、铒(m),特别优选钆。 利于文中其它部分例如x线显l象使用的离子包括但不限于镧(ni)、金 (m)、铅(ii),及特别的铋(in)。
1001241 用于成像的潜在的放射性同位素或治疗剂包括砹2M、碳"、
Cr51、氯36、钴"、钴58、铜62、铜64、铜67、 EU152、氟18、镓6 、镓 68、氬3、碘123、碘124、碘'25、石典'31、铟"'、铁52、铁59、镥'"、磷 32、磷33、铼,、铼'88、 SC47、硒75、银川、硫35、锝9，锝"m、钇86 和钇9°、锆，由于其能量低且适于大范围测量，I125经常优选用在某 些实施方案中，锝，和铟111也经常优选使用。 可根据本领域中熟知技术制备放射性标记蛋白质或肽。例如 它们可通过与碘化钠或碘化钾及化学氧化剂例如次氯酸钠或酶氧化剂例
如乳酸过氧化物酶接触而碘化。可用锝99m通过配体交换方法标记蛋 白质或肽，例如通过用二价锡溶液还原性高锝酸盐(pertechnate),将还原
的锝螯合到葡聚糖凝胶柱上并将肽上柱，或者通过直接标记技术，例如 通过孵育高锝酸盐、还原剂例如SNC12、缓沖液例如酞酸钠-钾溶液和肽 进行标记。经常用于将以金属离子形式存在的放射性同位素与肽结合的 中间功能团包括二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、 DOTA、 NOTA、卟啉螯合剂和乙二胺四乙酸(EDTA)。也考虑使用荧光素标记，包括若丹明、异
硫氰酸荧光素和肾造影剂。 在某些实施方案中，蛋白质或肽可连接于第二种结合配体或 酶(一种酶标签)产生 一种与显色底物有关的显色产物。适当的酶的实例 包括尿素酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶。优选的 第二种结合配体为生物素和卯白素或抗生蛋白链菌素化合物。使用的这 些标记为本领域技术人员所熟知且在例如美国专利第3,817,837号、第 3,850,752号、第3,939,350号、第3,996,345号、第4,277,437号、第 4,275,149号和第4,366,241号中得到描述，各自通过引用并入本文中。 这些荧光标记优选用于体外，但是也可于体内应用，特别是内窥镜检查 或血管内检测步骤。在某些实施方案中，必须给予受试者有效量的治疗药物。
"有效量"是产生所需效应的药物的量。有效量依赖于例如药物的效力 和期望效应。与为减少或消除实体瘤或为防止或减少其转移的治疗癌症 所需的量相比，可需要例如较少量的抗血管生成剂用于治疗增生性疾 病，例如黄斑变性或子宫内膜异位。可使用本领域技术人员熟知的方法 确定用于特定目的的特定药物有效量。
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皮质类固醇激素可提高其它化学治疗剂的效力，因而其时常
联用治疗。强的松和地塞米松为皮质类固醇激素的实例。黄体酮例如己 酸羟孕酮、乙酸美屈孕酮、乙酸甲地孕酮已经用于子宫内膜和乳腺癌的 治疗。雌激素例如己烯雌酚和乙炔雌二醇已经用于治疗癌症例如前列腺 癌。抗雌激素药例如他莫昔芬已经用于治疗癌症例如乳腺癌。雄激素例 如丙酸睾丸素和氟曱睾酮已经用于治疗乳腺癌。
00135在某些实施方案中，可使用抗血管生成剂为血管他丁、 baculostatin、 canstatin、乳腺丝抑蛋白、抗VEGF抗体、抗P1GF肽和抗 体、抗血管生长因子抗体、抗-Flk-l抗体、抗-Flt-l抗体或肽、层粘连蛋 白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、 干扰素、白介素12、 IP-IO、 Gro-(3、血小板反应蛋白、2-曱氧基雌二 醇、增殖素相关蛋白、carboxiamidotriazole、 CM101 、马立马司他、戊 聚糖多硫酸酯、促血管生成素2、干扰素-a、除莠霉素A、 PNU14556E、 16K催乳素片段、利诺胺、沙利度胺、己酮可可碱、金 雀异黄素、TNP-470、内皮他丁、紫杉醇、accutin、血管他丁、西多福 韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板因子IV或米诺环素。 本文所用术语"免疫调节剂"包括细胞因子、干细胞生长因 子、淋巴细胞毒素和血细胞生成因子例如白介素、集落刺激因子、干扰 素(例如干扰素-a、干扰素-P和干扰素-力及表示为"S1因子"的干细胞 生长因子。适当的免疫调节剂部分的实例包括IL-2、 IL誦6、 IL-IO、 IL-12、 IL-18、 IL-21、干扰素-Y、 TNF-a等。 术语"细胞因子"为一种作为细胞间调节剂作用于另一细胞 的细胞群释放的蛋白质或肽的总称。如本文广泛使用的细胞因子的实例 包括淋巴因子、单核因子、生长因子和常用的多肽激素。细胞因子包括 生长激素例如人生长激素、N-曱硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状200680019840.6
旁腺激素、曱状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、糖蛋白
激素例如促卯胞生成激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、促黄体发生激素 (LH);肝生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳激素、胎盘 催乳激素、OB蛋白、肿瘤坏死因子-ot、肿瘤坏死因子-P、苗勒氏抑制 物质、小鼠促性腺素相关肽、抑制素、活化素、血管内皮生长因子、整 联蛋白、血小板生成素(TPO)、神经生长因子(NGF)例如NGF画p、血小 板生长因子；转化生长因子(TGF)例如TGF- ot、 TGF- (3;胰岛素样生长 因子-I、胰岛素样生长因子-II、促红细胞生成素(EPO)、骨诱导因子；干 扰素例如干扰素-a、干扰素-P、干扰素-y、集落刺激因子(CSF)例如巨噬 细胞-CSF (M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF (GM-CSF)、粒细胞-CSF (G-CSF);白介素(IL)例如IL-1、 IL-la、 IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL隱7、 IL-8、 IL-9、 IL-IO、 IL-ll、 1L-12、 IL-13、 IL画14、 IL-15、 IL画16、 IL陽n、 IL-18、 IL-21、 LIF、 G画CSF、 GM-CSF、 M-CSF、 EPO、 kit-配体 或FLT-3、血管他丁、血小板反应蛋白、内皮他丁、胂瘤坏死因子和 LT。如文中所用的，术语细胞因子包括得自天然来源或得自重组体细胞 培养的蛋白质以及天然序列细胞因子的生物活性等效物。 1001381 趋化因子通常作为化学引诱物用于募集免疫效应细胞到趋化 因子表达位点。趋化因子包括但不限于RANTES、 MCAF、 MIPl-a、 MIP1-P、 IP-IO。技术人员将认识到某些细胞因子也具有化学引诱物效 应并也可归类到术语趋化因子下。类似的，术语免疫调节剂和细胞因子 在其各自成员间互有交叉。
法^^^射义^^f法 |001391 在一些实施方案中，肽和/或蛋白质可适用于放射性核素治疗 或放射免疫疗法(参见Govindan等，2005, 7>c/7/io/ogy ,力C朋cer 7 eseaA:'/7 cSr r簡加e《4:375-91 ; Sharkey和Goldenberg, 2005, J. Wwc/.她d 46:115S-127S; Goldenberg等(J Clin Oncol 2006; 24:823-834), "Antibody Pre-targeting Advances Cancer Radioimmunodetection and Radioimmunother叩y,"(预先耙向抗体的晚期癌放射免疫检测和放射免疫
52疗法)，各自通过引用并入本文)。在特定实施方案中，稳定束缚结构可 直接用放射性同位素标记并给予受试者。在可选择的实施方案中，可用 上面所述的预先靶向方法给予放射性同位素，给予双特异性稳定束縛结 构定位在患病组织内增加表达的位点后，放射标记并注射使用的半抗原 肽或配体。
00140]适于治疗患病组织的放射性同位素包括但不限于山In、 177Lu、 212Bi、 213Bi、 211At、 62Cu、 67Cu、 90Y、 125I、 131I、 32P、 33P、 47Sc、 山Ag、 67Ga、 142Pr、 153Sm、 161Tb、 166Dy、 166Ho、 186Re、 188Re、 189Re、 212Pb、 223Ra、 225Ac 、 59Fe、 75Se 、 77As 、 89Sr 、 "Mo 、 105Rh、 109Pd 、 143Pr、 149Pm、 169Er、 194Ir、 198Au、 199Au和2llPb。这种治疗性放射性核素 优选具有在20-6,000 keV范围内的衰变能量，对于俄歇发射体优选范围 为60-200 keV，对于(3-发射体优选100-2,500 keV,对于a发射体优选 4,000-6,000 keV。适当的P-粒子发射核素的最大衰变能量优选20-5，000 keV，更优选100-4，000 keV，最优选500-2,500 keV。也优选基本用俄歇 粒子衰变的放射性核素。例如Co-58、 Ga-67、 Br-80m、 Tc-99m、 Rh-103m、 Pt-109、 In陽lll、 Sb-119、 1-125、 Ho-161、 Os-189m和Ir-192。 适当的|3-粒子发射核素的衰变能量优选<1,000 keV，更优选<100 keV, 最优选<70 keV。也优选基本用cx^i子发射衰变的放射性核素。这种放射 性核素包括但不限于Dy-152、 At-211、 Bi-212、 Ra-223、 Rn-219、 Po-215、 Bi-21〗、Ac-225、 Fr-221、 At-217、 Bi-213和Fm-255。适当的a粒 子发射放射性核素的衰变能量优选2,000-10,000 keV，更优选3,000-8,000 keV,最优选4,000-7,000 keV。其他可能的放射性同位素包括"C、 13N、 150、 75Br、 198Au、224Ac、126j、"3j、77Br、113mIn、95Ru 、97Ru 、朋Ru 、则Ru 、'O Hg 、
203Hg、 '2i，e、 i22mTe、 125，" 165Tm 、 167Tm 、 168TiTi 、 197Pt、 109Pd、105Rh、 142Pr、 l43Pr、 l6lTb、 l66Ho 、 l99Au、 "Co 、 58Co 、 51Cr、 59Fe 、75Se、 201T1、 225Ac、 76Br、 ,Yb等。 具有载硼附加物(boron addend-loaded)的载体的肽、抗体、抗体片,爻或融合蛋白用于热中子激活治疗(thermal neutron activation therapy)
正常的将以类似方式起作用。可是，在进行中子辐射前清除非定向的免疫缀合物是有利的。使用结合于配体的抗体可加速清除率。参见美国专利第4,624,846号中关于这种一4殳原则的叙述。例如硼附加物比如碳硼烷可与抗体连接。如同本领域所熟知的可在侧链上用羧基制备碳硼烷。可通过激活碳硼的羧基并与载体上的氨基缩合而制得连接于载体例如氨基右旋糖酐的碳硼烷。这种过渡性的缀合物然后缀合于抗体上。给予这种缀合物后，热中子辐射激活硼附加物并转化为a发射衰变的放射性原子从而产生高度毒性、短期的效应。试剂盒
100145
各种实施方案可涉及含有适于治疗或诊断患者患病组织的组分的试剂盒。示例性试剂盒可含有至少一种稳定束缚结构。如果含有给药组分的组合物并非制备为经消化道例如通过口服使用，可包括能够通过其他途径递送试剂盒组分的装置。 一类用于非胃肠道给药的装置是注射器，用来将组合物注射进受试者体内。也可使用吸入装置。001461 试剂盒部分可共同包装或分开包装于两个或多个独立的容器内。在一些实施方案中，容器可为容纳适于重建的组合物的无菌、低压冻干制剂的小瓶。试剂盒也可含有适于重建和/或其他反应剂稀释的一种或多种緩冲液。其他容器可包括但不限于小药袋、托盘、盒子、试管
54等。试剂盒部分可包装或无菌維护于容器中。另一部分可包括介绍给使用者使用试剂盒的产品说明书。
实施例
00147]提供下列实施例用来举例说明，并非限制本发明的权利要求。
实施例l.用于制备带有附加到Fd链的C-末端或N-末端的DDD序列的基于Fab的亚基的通用策略
100148] 将带有附加到Fd链的C-末端或N-末端的DDDl序列(SEQ IDNO:l)的基于Fab的亚基制备为融合蛋白。质粒载体pdHL2已经用于制备许多抗体和基于抗体的构建体。参见Gillies等，J Immunol Methods(1989)， 125:191-202; Losman等,Cancer (Pl]ila) (1997), 80:2660-6。这种双顺反子的哺乳动物表达载体指导IgG的重链和轻链的合成。对于许多不同的IgG-pdHL2构建体，载体序列大部分相同，仅在可变域(VH和VL)序列存在差异。使用本领域技术人员已知的分子生物学工具，通过用铰链的头4个残基、14个残基的Gly-Ser接头和人RIIa的头44个残基的编码序列置换铰链、重链的CH2和CH3域的编码序列，可将这些IgG-pdHL2表达载体转化为Fd-DDDl-pdHL2或Fd-DDD2-pdHL2表达载体。如下所述，设计穿梭载体CH1-DDD1 -pGemT从而促进IgG-pdHL2载体(图2a)转化为Fd-DDD 1 -pdHL2载体(图2b)。
穿梭载体CHl-DDDl-pGemT的产生，时新务1个残基后的DDD1的氨基酸序列(SEQ ID NO:l)，接头肽的头两个密码子包含BamHI限制位点的。终止密码子和Eagl限制位点附加到3'末端。下列显示了编码的多肽序列。
LREARA (SEQ ID NO:6)
100152]两种寡核苷酸，表示为RIIA1-44顶部(top)和RIIA1-44底部(bottom), 二者在其3'末端有30个的碱基对的重复，经合成(SigmaGenosys)并组合而成包含中间154个碱基对的174 bp DDD1序列。寡核普酸退火并用Taq聚合酶进行引物延伸反应。琉部
CAG-3' (SEQ ID NO :7)G-3， (SEQIDNO:8)
00153
引物延伸后，使用下列引物通过PCR扩增双链体
5，-GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGT-3， (SEG ID NO:9) "4加;？ ii'ag^"
5，-CGGCCGTCAAGCGCGAGCTTCTCTCAGGCG-3' (SEQ ID NO: 10) 用BamHI和Notl限制酶自pGemT切下编码DDD1序列的 l卯bp片段，然后连接进入CHl-pGemT内相同位点从而产生穿梭载体 CHl-DDDl-pGemT。
CHl-DDDl克隆进基于pdHL2的载体
编码CH1-DDD1的序列可如下所述掺入pdHL2载体中的任何 IgG构建体。通过从pdHL2清除SacII/Eagl限制性酶切片段(CH1-CH3) 并用从各自pGemT穿梭载体切下的CH1-DDD1的SacII/Eagl片段置 换，从而用CH1-DDD1置换整个重链恒定域。-Fd-hMN-14-pdHL2制备的载体片段。最后的表达载体为N-DDD1-Fd-hMN-14-pDHL2。
N-DDDl-Fab-hMN-14和C-DDDl-Fab-hMN-14的产生、纯化和 鉴定两种融合蛋白均使用亲和色谱纯化。AD1-C是一种特异性结
59合于含有DDD1的32构建体的肽。图5中显示了 AD1-C(SEQIDN0:3) 的氨基酸序列。巯基和氯乙酸酐反应后，AD-C偶联到亲和胶(Affigel) 上。在上ADl-C-亲和胶柱前，通过超滤法浓缩培养上清液约10倍。柱 子用PBS冲洗至基线，用0.1 M甘氨酸(pH 2.5)洗脱C-DDD-Fab-hMN-14。这种一步亲和提纯法自1.2升的滚瓶培养物中产生约81 mg的C-DDDl-Fab-hMN-14。洗脱液的SE-HPLC分析(图6)显示，保留时间为 (8.7分钟)的单个蛋白质峰与107-kDa蛋白质一致。也通过还原SDS-PAGE确认纯度(图7),仅显示两条分子大小的条带，预计为C-DDD1-Fab-hMN-14的两条多肽组分。
|001681 用上述提纯C-DDDl-Fab-hMN-14的方法提纯N-DDD1-Fab-hMN-14，从1.2升的滚瓶培养物产生10 mg。洗脱液的SE-HPLC分析 (图8)显示，保留时间为(8.77分钟)的单个蛋白质峰类似于C-DDD1-Fab-hMN-14,与107-kDa蛋白质一致。还原性SDS-PAGE仅显示两条 分子大小的条带，预计为C-DDDl-Fab-hMN-14的两条多肽组分。 |00169| 对样品进行SE-HPLC分析，确定C-DDDl-Fab-hMN-14的结 合活性，样品中检品与各种量的WI2混合。通过混合0.75:1摩尔比的 WI2 Fab和C-DDDl-Fab-hMN-14制备的样品显示三个峰，分别归为未 结合的C-DDDl-Fab-hMN14 (8.71分钟)、结合一个WI2 Fab的C-DDDl-Fab-h画-14(7.95分钟)和结合两个WI2 Fab的C-DDD1-Fab隱 hMN14 (7.37分钟)。在分析含有摩尔比为4的WI2 Fab与C-DDD1-Fab-hMN-14的样品时，只观察到在7.36分钟的单峰。这些结果(图9)证 明C-DDDl-Fab-hMN-14为二聚体且具有两个活性结合位点。当用N-DDDl-Fab-hMN-14重复这个实验就获得了非常相似的结果(

图10)。
通过电穿孔法将R叩-hPAM4-Fd-DDDl-pdHL2载体转染入 NS0骨髓瘤细胞。Rap-hPAM4-Fd-DDDl-pdHL2是一种双顺反子的表达 载体，其指导Rap-融合的hPAM4轻链和hPAM4-Fd-DDDl的合成和分 泌，二者结合形成R叩-Fab融合蛋白。每种融合蛋白经DDD1域的相互 作用形成一种稳定的同二聚体，称为R叩-hPAM4-Fab-DDDl。 100173
电穿孔后,将细胞置于96-孔组织培养板并用0.05 |liM曱氨蝶 呤(MTX)选择转染子克隆。通过ELISA使用包被有WS (—种大鼠的抗 hPAM4的抗-独特型单克隆抗体)的微量滴定板对克隆进行蛋白质表达筛 选，用ML98_1 (—种抗Rap的小鼠单克隆抗体)和缀合HRP的山羊抗小 鼠Fc检测。
N-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2为用于产生下文称为四价N-DDD2-Fab-hMN-14的34构建体的表达载体，其包含融合蛋白的4个拷 贝，其中DDD2序列经柔性肽间隔基团附加到hMN-14 Fab的Fd链的 N-末端。如下设计这种表达载体。合成两种重叠的互补寡核苷酸 (DDD2上部和DDD2下部)，其包含DDD2的]-13残基。寡核苷酸退火 并用T4多核苷酸激酶(PNK)磷酸化，在5'末端和3'末端产生凸出端， 适于与分别用限制性内切酶NcoI和PstI消化的DNA连接。
GCA-3' (SEQ ID NO: 15)—
Z)DD2 r部 (SEQIDNO:16)如下设计这种表达载体。合成两种重叠的互补寡核香酸，其 包含部分接头肽(GGGGSGGGCG)和DDD2的1-13残基的编码序列。 寡核苷酸退火并用T4 PNK磷酸^b,在5'末端和3'末端产生凸出端，适 于与分别用限制性内切酶BamHI和Pstl消化的DNA连接。 G必-D/m承
ATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCTGCTGCA-3' (SEG ID NO: 17)
dDDD2 7"孝
CCGCCAGACCCGCCACCTCCG-3， (SEQ IDN0:18) 双链DNA与通过用BamHI和Pstl消化制备的穿梭载体CH1-DDDl-pGemT连接，从而制成穿梭载体CHl-DDD2-pGemT。用SacII 和EagI自CHl-DDD2-pGemT切下一个507bp的插入片段，并连接通过 SacII和Eagl消化制备的IgG表达载体hMN14(I)-pdHL2。最终表达构 建体为C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2。
C誦DDD2-Fd-hA20-pdHL2的构建 |00183C-DDD2-Fd-hA20-pdHL2为用于产生下文称为四价C-DDD2-Fab-hA20的34构建体的表达载体，其包含融合蛋白的4个拷贝，其中 DDD2序列经柔性肽间隔基团附加到hA20-Fab的Fd链的C-末端。
64hA20为CD20特异性的人源化单克隆抗体。
100184] 如下以3个步骤改造这种表达载体。首先用Sac2和Ndel消 化表达载体hA20-IgG-pdHL2从而产生7578-bp片段。然后，用Sac2和 Ndell消化表达载体C-DDD2-hMN-14-Fd-pdHL2并分离编码CH1-DDD2 的509-bp片段。第三步，7578-bp片段连接于509_bp片段从而产生C-DDD2-Fd-h A20-phHL2 。
C-DDD2-Fd-hMN-3-pdHL2的构建
R、 VEFGR函- VEGFR2/KDR、 VEGRF3/Flt-4 、 CD3、 CD16、 CD64、 CD89、 CD2、腺病毒纤结、M13外壳蛋白、GpIIb/IIIa、碱性磷酸酶、 辣根过氧化物酶、P-半乳糖苷酶、tpA、链激酶、水蛭素或尿激酶的结 合亲和力。
42. 权利要求34的组合物，其中第一前体具有对细胞表面抗原的 亲和力，所述细胞表面抗原选自CEA、 ED-B纤连蛋白、CD20、 CD22 、 CD19 、 EGFR 、 IGF1R 、 VEFGR1/Flt曙l 、 VEGFR2/KDR 、 VEGR藩lt-4 、 HER2/neu 、 CD30 、 CD33 、 PfMSP-l 、 HN歸V 、 EpCAM/17-lA、 hTR、 IL-2R/Tac、 CA19-9、 MUC1、 HLA类II、 GD2、 G250、 TAG-72、 PSMA、 CEACAM6、 HMWMAA、 CD40、 Ml3外壳 蛋白和GPIIb/IIIa;第二前体或者具有对选自组胺-琥珀酰-甘氨酸(HSG) 和铟-DTPA的半抗原的亲和力，或者具有对选自CD22、 CD20、 EGFR 、 IGF1R 、 VEFGR1/Flt画l 、 VEGFR2/KDR 、 VEGRF3/Flt-4 、 CD3、 CD16、 CD64、 CD89、 CD2和腺病毒纤结的细胞表面抗原的亲和 力。
43. 权利要求34的组合物，其中笫一前体或者具有对选自M13外 壳蛋白和GpIIb/IIIa的细胞表面抗原的亲和力，或者具有对选自^s威性磷酸 酶、辣根过氧化物酶、(3-半乳糖苷酶、tpA、链激酶、水蛭素、尿激酶 的生物分子的亲和力；第二前体或者具有对选自M13外壳蛋白和 GpIIb/IIIa的细胞表面抗原的亲和力，或者具有对选自碱性磷酸酶、辣根 过氧化物酶、P-半乳糖苷酶、tpA、链激酶、水蛭素、尿激酶的生物分子的亲和力。
44. 权利要求34的组合物，其中第一前体具有对选自CD3、 CD74、 CD19、 CD22、固C1 、 EGP-1 、 IGF1R CD30 、 CD25/Tac 、 LeY、间皮蛋白、Erb-B2、 EpCAM、 GP240、 GPIIb/IIIa和p97的细胞表面抗原的亲和力；第二前体选自核糖核酸酶、豹蛙酶、细菌毒素、植物 毒素、PE38、 dgA、 DT390、磷脂酶C (PLC)、白树毒素、溶解凝块蛋 白、tPA、尿激酶和水蛭素。
45. 权利要求34的组合物，其中第一前体具有对与疾病或病症有 关的任何细胞表面抗原的亲和力，第二前体选自细胞因子、生长因子、 羧肽酶G2、青霉素酰胺酶、p-内酰胺酶、胞嘧啶脱氨酶、硝基还原 酶、P-半乳糖苷酶、绿色荧光蛋白(GFP)或其各种工程类似物、碱性磷 酸酶、辣根过氧化物酶和链霉抗生物素蛋白。
46. 权利要求34的組合物，其中第一前体选自核糖核酸酶、细菌 毒素、植物毒素、细胞因子、生长因子和表面活性蛋白D (Sp-D),第二
47. 权利要求34的组合物，其中第一前体和第二前体选自细胞表 面受体配体、IL匿4、 VEGF121、可溶性受体组分、sIL國4R、 sIL-13R、毒 素、PE38、志贺样毒素和白喉毒素。
48. 权利要求34的组合物，其中第一和第二前体相同且选自 CD14的结合分子、CDll/结合素-l、叶酸受体oc、 gpl20、 IL-6、 IL-5、 IL-8、 CD154、 IgE、 LFA-1、 (3-类胰蛋白酶、CD105/内皮糖蛋白、 GpIIb/IIIa、 TNFa、 RSV F-蛋白、CEA的A1B1和CEA的N-域。
49. 权利要求34的组合物，其中第一和第二前体相同且选自细胞 因子、生长因子、可溶性受体组分、tPA、 TPO、 EPO和sTNFa-R。
50. —种方法，包括a) 获得权利要求1的同二聚体，及b) 将该同二聚体给予患病受试者； 其中同二聚体对疾病有治疗效果。
51. 权利要求50的方法，其中疾病为癌、增生、糖尿病性视网膜病、青少年糖尿病、黄斑变性、炎性肠病、局限性回肠炎、溃疡性结肠 炎、类风湿性关节炎、肉状瘤病、哮喘、水肿、肺动脉高血压、银屑病、角膜移植片排斥、新生血管性青光眼、Osier-Webber综合征、心肌 血管发生、蚀斑新生血管形成、再狹窄、血管创伤后新内膜形成、毛细 血管扩张、血友病性关节、血管纤维瘤、与慢性炎症有关的纤维变性、 肺纤维化、深部静脉血栓形成或伤口肉芽发生。
52. 权利要求51的方法，其中疾病为癌且前体具有对肺瘤相关抗 原的结合亲和力，所述抗原选自-炭酸酐酶IX、甲胎蛋白、A3、 A33抗 体特异性抗原、Ba 733 、 BrE3-抗原、CA125、 CD1 、 CDla、 CD3 、 CD5、 CD5、 CD16、 CD19、 CD20、 CD21 、 CD22、 CD23 、 CD25、 CD30、 CD33、 CD38、 CD45、 CD74、 CD79a、 CD80、 CD138、结肠特 异性抗原P(CSAp)、 CEA (CEACAM5)、 CEACAM6、 EGFR、 EGP陽1、 EGP-2、 Ep-CAM、 Flt-l、 Flt-3、叶酸受体、G250抗原、HLA-DR、人 体绒毛膜促性腺激素(HCG)及其亚基、HER2/neu、低氧诱导因子(HIF-1)、 Ia、 IL-2、 IL-6、 IL-8、胰岛素生长因子-1 (IGF-1)、 KC4-抗原、KS--抗原、KSl-4、 Le-Y、巨噬细胞抑制因子(MIF)、 MAGE、 MUC1 、 MUC2、 MUC3、 MUC4、 NCA66、 NCA95、 NCA90、 PAM-4抗体特异 性抗原、胎盘生长因子、p53、前列腺酸磷酸酶、PSA、 PSMA、 RS5、 SIOO、 TAC、 TAG-72、生腱蛋白、TRAIL受体、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肿瘤坏死抗原、VEGF、 ED-B纤连蛋白、17-1 A-抗 原、血管发生标记、癌基因标记及癌基因产物。
53. 权利要求52的方法，其中癌为急性淋巴细胞性白血病、急性 骨髓性白血病、肾细胞癌、胆嚢癌、脑癌、乳腺癌、子宫颈癌、慢性淋 巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、结肠直肠癌、 子宫内膜癌、食管癌、胃癌、头和颈部癌、何杰金氏淋巴瘤、肺癌、髓 质曱状腺癌、非何杰金氏淋巴瘤、卵巢癌、睾丸癌、胰腺癌、神经胶质 瘤、肝癌、前列腺癌、黑素瘤或膀胱癌。
54. 权利要求53的方法，进一步包括与同二聚体联合使用一种或 多种抗癌治疗方法。
55. 权利要求54的方法，其中治疗方法包括给予化学治疗剂、细 胞因子、放射治疗、免疫治疗、放射免疫疗法、局部高温、激光辐射、 抗血管生成剂或外科切除。
56. —种方法，包括a) 获得权利要求34的四聚体，及b) 将该四聚体给予患病受试者； 其中四聚体对疾病有治疗效果。
57. 权利要求56的方法，进一步包括给予受试者能够结合第二前 体的半抗原。
58. 权利要求57的方法，其中在四聚体定位到疾病相关组织后给 予半抗原。
59. 权利要求58的方法，其中半抗原连接于选自以下的物质抗 血管生成剂、化学治疗剂、细胞因子、药物、前体药物、毒素、酶、寡 聚核苷酸、放射性同位素、免疫调节剂、抗生素、抗病毒剂、抗真菌 剂、激素、结合分子、类脂、聚合物、胶粒、脂质体、纳米微粒或其组 合。
60. 权利要求59的方法，其申疾病由于真菌引起。
61. 权利要求60的方法，其中真菌为V、子萄^ffMzcra^onw7j 、 发# (7h'c/ o/ /^w ;,衷发# ,4 (^/ /fifem ，/ )4環J ,孫子纟漭 (^戶raf/7/lx: sc/2ertc鄉、新型德承斷C，tococc船"eq/br廳"^),霧fU0CC,'力(9Z'(5fes' /W7附//7^ 、关if逾i^/《,霧f7/,'Wo/7/oy附c7 ca/ww/c^ww, >
62. 权利要求59的方法，其中疾病由于病毒引起。
63. 权利要求62的方法，其中病毒为人免疫缺陷病毒(HIV)、疱 渗病毒、细胞巨化病毒、狂犬病病毒、流感病毒、人乳头瘤病毒、乙型 肝炎病毒、丙型肝炎病毒、仙台病毒、猫白血病病毒、呼吸道肠《瓜儿病毒、脊髓灰质炎病毒、人血清微小样病毒、猿猴病毒40、呼吸道合胞体病毒、小鼠乳腺瘤病毒、水痘-带状疱渗病毒、登革热病毒、风渗病毒、麻渗病毒、A，病毒、人T细月包白血病病毒、i矣巴病毒、鼠白血病病 毒、腮腺炎病毒、水泡性口膜炎病毒、辛德比斯病毒、淋巴细胞性脉络 丛脑膜炎病毒或蓝舌病病毒。
64. 权利要求59的方法，其中疾病由于细菌引起。
65. 权利要求64的方法，其中细菌为^症并,fS""〃ws a涵rac/、)) > 尤真链承谬f5"加,coccw, aga/ac"'— > 嗜单嫂莩厉病,Yf ,Bf^/ewo/ /"7w /"y/wewzfle B」，y^#^^##(7>e/w"ew" po〃,'(iw" 」 > 莱姆 氏病螺旋体(Lyme disease spirochetes)、 绿,教卓應,fRs"e"6/麵o"oy c/( n/g/歸'cr, > 羞W为、#并霧(M少'cf / (2c,e〃'画/e/ ,— >《€ , ， # # f7 n/c'e〃o cr/ ortu^ 、 ^凝为、乂^f芽fA/少co6ac^T/力附m/;ercw/asts))Jb'乂y^^1
66. 权利要求59的方法，其中疾病为自身免疫性疾病。
67. 权利要求66的方法，其中自身免疫性疾病为急性特发性血小 板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、西登哈姆氏舞 蹈病、重症肌无力、系统性红斑3良疮、狼疮性肾炎、风湿热、多腺体综 合征、大疱性类天疱疮、青少年糖尿病、亨诺-许兰二氏紫癜、链球菌 感染后肾炎、结节性红斑、高安氏动脉炎、阿狄森氏病、类风湿性关节 炎、多发性硬化症、肉状瘤病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾 病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、古德帕斯彻综合征、血栓闭塞性 脉管炎、斯耶格伦综合征、原发性胆汁性肝硬变、桥本氏曱状腺炎、曱 状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多发性肌炎/皮肌炎、多软骨炎、 寻常天疱疮、韦格纳肉芽肿病、膜性肾病、肌萎缩性脊髓侧索硬化、脊 髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球性肾炎、4艮屑病或纤维化肺泡炎。
68. 权利要求59的方法，其中疾病为心肌梗塞、缺血性心脏病、 动脉粥样硬化斑块、移植排斥、阿尔茨海默病、特应性组织或由活化的 粒细胞、单核细胞、淋巴样细胞或巨噬细胞的添加性生长引起的炎症。
69. —种"^断疾病的方法，包括a) 获得权利要求34的四聚体，其中第一前体能够结合于与疾病 有关的靶向分子、组合体、聚集体、细胞、抗原或组织上，第二前体能 够结合于诊断性半抗原上；b) 将四聚体给予怀疑患病的受试者；c) 给予同一受试者能够结合第二前体的诊断性半抗原；及d) 检测结合于四聚体的半抗原的存在；其中半抗原定位到与疾病有关的组织是受试者患病的诊断依据。
70. 权利要求69的方法，其中半抗原连接于放射性核素上，所述 放射性核素选自18F、 45Ti、 52Fe、 62Cu、 64Cu、 67Cu、 67Ga、 68Ga、 86Y、 89Zr、 94mTc、 94Tc、 99mTc、出In、 l23I、 125I、 154—158Gd、 177Lu、 32P、 188Re和
71. 权利要求70的方法，其中放射性核素通过使用同位素检测器 检测，或使用Y闪烁扫描法、单光子发射计算体层摄影或正电子发射断 层摄影成像。
72. 权利要求69的方法，其中疾病为癌且第一前体能够结合肺瘤 相关抗原，所述抗原选自碳酸酐酶IX、甲胎蛋白、A3、 A33抗体特异 性抗原、Ba 733 、 BrE3匿抗原、CA125、 CD1 、 CDla、 CD3 、 CD5 、 CD15、 CD16、 CD19、 CD20、 CD21、 CD22、 CD23 、 CD25、 CD30、 CD33、 CD45、 CD74 、 CD79a、 CD80、 CD138、结肠特异性抗原P (CSAp)、 CEA (CEACAM5)、 CEACAM6 、 CSAp 、 EGFR、 EGP誦1 、 EGP-2、 Ep-CAM、 Flt-l、 Flt-3、叶酸受体、G250抗原、HLA-DR、人 体绒毛膜促性腺激素(HCG)及其亚基、HER2/neu、低氧诱导因子(HIF-1)、 Ia、 IL-2、 IL-6、 IL-8、胰岛素生长因子-1 (IGF-1)、 KC4-抗原、KS-l-抗原、KSl-4、 Le-Y、巨喧细胞抑制因子(MIF)、 MAGE、固C1 、 而C2、固C3、 MUC4、 NCA66、 NCA95、 NCA90、 PAM-4抗体特异 性抗原、胎盘生长因子、p53、前列腺酸磷酸酶、PSA、 PSMA、 RS5、 SIOO、 TAC、 TAG-72、生腱蛋白、TRAIL受体、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肺瘤坏死抗原、VEGF、 ED-B纤连蛋白、17-lA-抗 原、血管发生标记、癌基因标记及癌基因产物。
73. 权利要求69的方法，其中半抗原缀合于磁共振成像(MRI)造 影剂并通过MRI检测与四聚体结合的半抗原。
74. 权利要求73的方法，其中mri造影剂为铬(in)、锰(ii)、铁 (m)、铁(ii)、钴(n)、镍(ii)、铜(ii)、钕(m)、钐(iii)、镱(m)、礼(iii)、 钒(ii)、铽(m)、镝(m)、钬(m)或铒(ni)。
75. 权利要求69的方法，其中半抗原缀合于超声成像增强剂并通 过超声成像检测与二元复合体結合的半抗原。
76. 权利要求6'9的方法，其中第一前体或第二前体具有对 CD19、 CD20、 CD22或IL-17的亲和力。
77. 权利要求56的方法，其中给予该四聚体诱导靶细胞群中的细 胞凋亡。
78. 权利要求77的方法，其中四聚体包含选自以下的抗体或抗体 片段的组合抗-CD74 X抗-CD20、抗-CD74 X抗-CD22、抗-CD22 X抗 -CD20、抗-CD20 X抗-HLA-DR、抗-CD19 X抗-CD20、抗-CD20 X抗-CD80、抗-CD2 X抗-CD25、抗隱CD8 X抗-CD25和抗-CD2 X抗画 CD147。
79. 权利要求77的方法，其中第一和/或第二前体具有对抗原的 结合亲和力，所述抗原选自CD2、 CD3、 CD8、 CDIO、 CD21、 CD23、 CD24、 CD25、 CD30、 CD33 、 CD37、 CD38、 CD40、 CD48、 CD52、 CD55、 CD59、 CD70、 CD74、 CD80、 CD86、 CD138、 CD147、 HLA-DR 、 CEA 、 CSAp 、 CA-125 、 TAG-72 、 EFGR 、 HER2 、 HER3 、 HER4、 IGF-1R、 c-Met、 PDGFR、固C1 、固C2、 MUC3 、固C4、<formula>formula see original document page 15</formula>
全文摘要
本发明涉及组成确定的稳定束缚结构的制备方法和组合物，该稳定束缚结构可具有多种功能和/或结合特异性。特定实施方案涉及包含含有连接于前体的二聚化和停靠域的单体的同二聚体。前体实际上可为任何分子或结构，例如抗体、抗体片段、抗体类似物或模拟物、适体、结合肽、结合蛋白的片段、蛋白质或其它分子的已知配体、酶、可检测标记或标签、治疗剂、毒素、药物、细胞因子、白介素、干扰素、放射性同位素、蛋白质、肽、肽模拟物、多核苷酸、RNAi、寡聚糖、天然或合成的聚合物质、纳米微粒、量子点、有机或无机化合物等。其它实施方案涉及包含可相同或不同的第一和第二同二聚体的四聚体。本公开的方法和组合物提供了制备实际上可具有任何功能性和/或结合特异性的同二聚体、同四聚体和异四聚体的简便通用方法。
文档编号A61K39/00GK101484182SQ200680019840
公开日2009年7月15日 申请日期2006年3月24日 优先权日2005年4月6日
发明者C·H·争, D·M·戈登伯格, E·A·罗西, W·J·麦布赖德 申请人:Ibc药品公司