能够调节tirc7的功能的肽的制作方法

文档序号:1124798阅读:2597来源:国知局

专利名称::能够调节tirc7的功能的肽的制作方法能够调节TIRC7的功能的肽本发明涉及能够调节T细胞免疫应答cDNA7(TIRC7)和/或其配体的功能(例如,信号转导或粘附活性)的肽。特别地,本发明的肽能够抑制被激活的免疫系统细胞的增殖。此外,本发明涉及包含所述肽的组合物和调节免疫细胞增殖和治疗免疫应答相关性疾病的方法。T细胞活化是涉及多个信号转导途径和基因表达的连续性改变从而导致T细胞分化成不同的亚群(即Thl和Th2)的系列过程,所述亚群可通过它们的细胞因子产生模式来区分并且表征所述细胞免疫应答的模式。T细胞应答由抗原特异性T细胞受体(TCR)与抗原递呈细胞用启动。由通过许多统称为共刺激信号(Perez,Immunity6(1997),411-417)的膜蛋白例如CD28/CTLA4和B7、CD40/CD40L、LFA-1和ICAM-1(Lenschow,Science257(1992),789-792;Linsley,A画.Rev.Immunol.11(1993),191-212;Xu,Immunity1(1994),423-431;Bachmann,Immunity7(1997),549-557;Schwartz,Cell71(1992),1065-1068)介导的受体-配体相互作用的网络提供另外的信号。这些膜蛋白可以以不同的方式改变T细月包的活4匕(Bachmann,Immunity7(1997),549-557)和通过整合由这些分子提供的正信号和负信号来调节免疫应答(Bluestone,Immunity2(1995),555-559;Perez,Immunity6(1997),411-417)。在调节细胞免疫应答中有效的许多试剂可干扰T细月包受体(Cosimi,Transplantation32(1981),535-539)阻断共刺激信号转导(Larsen,Nature381(1996),434-438;BlazarJ.Imm画.157(1996),3250-3259;Kirk,Proc.Natl.Acad.Sci.USA94(1997),8789-8794;Linsley,Science257(1992),792-95;Turka,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992),11102-11105)或抑制这些原始细胞膜触发器下游的细胞内活化信号(Schreiber和Crabtree,ImmunologyToday13(1992),136-42)。器官移植和自身免疫性疾病中T细胞激活的治疗性预防依赖于干扰下游细胞内事件的泛免疫抑制(panimmunosupressive)药物。免疫应答的特异性调节仍然是在免疫学研究中的长期目标。考虑到对用于治疗人体免疫应答相关性疾病的治疗方法的需要,本发明的技术问题是提供用于在受试者中调节免疫应答的工具和方法。通过提供在权利要求中表征的和进一步在下面描述的实施方案实现了对所述技术问题的解决。本发明涉及能够抑制外周血单核细胞(PBMC)的增殖的肽,其包含来自T细胞免疫应答cDNA7(TIRC7)蛋白的第三细胞外结构域的氨基酸序列的片段。不希望受理论束缚,据认为来源于TIRC7和此处描述的肽能够通过例如干扰TIRC7和其配体的相互作用来调节TIRC7、其家族成员和/或它们的配体的功能(例如,信号转导或粘附活性)。根据本发明,术语"干扰TIRC7和其配体的相互作用"是指所述肽或其类似物或衍生物能够抑制和/或调节TIRC7和其对应的配体的相互作用。因为TIRC7和其配体的相互作用调节在免疫应答过程中有价值的事件,因此,该肽应当也能够调节免疫应答。根据本发明,所述肽优选与TIRC7-配体相互作用,例如通过特异性结合至所述配体进行相互作用。术语"配体"包括小分子和可溶性结合蛋白以及膜结合受体。"特异性结合"是指"与……特异性相互作用",其中所述相互作用可以是,除其他以外,共价、非共价和/或疏水相互作用。然而,不管作用的分子机制背后的理论如何,本发明的肽的特征可在于(1)具有TIRC7的氨基酸序列的至少6个,优选10个,更加优选12个,更加优选15或20个和最优选至少3Q个,更优选40个,更优选45个连续的氨基酸,和(2)能够在实施例1中所述的测定中抑制有丝分裂原刺激的PBMC的增殖。根据本发明使用的术语"TIRC7"表示参与T细胞活化和/或增殖的信号转导的蛋白和,优选以可溶性形式存在的、能够抑制或压制响应混合淋巴细胞培养中的异构激活(alloactivation)和响应有丝分裂原(当向培养物中外源加入有丝分裂原时)的T细胞增殖的蛋白。体外翻译的TIRC7蛋白能够有效地以剂量依赖性的方式抑制响应混合淋巴细胞培养中的异构激活或响应有丝分裂原的T细胞的增殖。TIRC7对于本领域技术人员来说是已知的并且描述于,尤其是,W099/11782和Utku等人,Immunity9(1998),509-518中。可根据国际申请W099/11782中的图IB和图2中的公开内容确定TIRC7蛋白的第三细胞外结构域。在一个实施方案中,本发明的肽来源于包含图1中所示的氨基酸序列(SEQIDNO:1)或其片段的TIRC7蛋白。活性肽可以以比此处明确描述的肽更大或更小。尽管所述的本肽为大约11至72个氨基酸,但包含相对大量的氨基酸残基例如多至大约50或IOO个氨基酸残基或更多残基的肽、包含所述肽的肽、其部分或类似的肽也可具有生物学活性。类似地,比SEQIDN0:1至5中所示的肽更小的肽也可以具有相似的生物学活性。例如,在一个实施方案中,本发明的肽包含或由SEQIDNO:1中描述的从氨基酸位点1至27的氨基酸序列组成。类似地,具有氨基酸置换或其他改变的肽可阻止所述肽或亲本分子的活性。预期所述肽的环状或其他修饰形式也具有生物活性。优选地,本发明的肽具有SEQIDN0:1的至少前6个,优选至少前10个和最优选至少前11个氨基酸。此外,本发明提供了分离的肽,所述肽包括用SEQIDNO:l至5表示的氨基酸序列或其调节至少一种TIRC7蛋白和/或至少一种其配体的功能的类似物。这些氨基酸序列也可形成更大的肽的部分。此外,它们可以以任何一种肽用于多种组合。优选地,本发明提供了用SEQIDNO:1至5表示的分离的肽或其类似物。据认为,此处描述的某些肽的这些部分明显地促成了肽的活性。本发明的肽优选能够调节,优选抑制外周血单核细胞(PBMC)的增殖。优选地,本发明的肽调节下列功能(所述功能是TIRC7蛋白和/或其配体的功能)中的至少一种嗜中性粒细胞的激活;T细胞、B细胞、NK细胞、LAK细胞、树状突细胞或其他免疫系统细胞的活化或抑制;T细胞、B细胞、NK细胞、LAK细胞、树状突细胞或其他免疫系统细胞的增殖和/或分化;上皮细胞例如乳腺或肠/结肠上皮细胞或角质形成细胞(keratinocyte)的增殖和/或分化。此外这些肽优选能够改变TIRC7蛋白(即,TIRC7家族成员)间的同型和/或异质性粘附或TIRC7蛋白对其他TIRC7配体的粘附。本发明也提供了肽缀合物。经显示,肽与栽体分子或结构(例如微珠、脂质体、生物载体分子、合成聚合物、生物材料和细胞)复合从而形成肽缀合物的能力赋予更大的结构(该结构具有结合表达TIRC7或其配体的细胞的能力)。这样的肽缀合物结合于表达TIRC7蛋白质或TIRC7配体的细胞。本发明的肽或肽缀合物也可包含用于标记(即,标记例如荧光标记、》兹共振标记、》文射性标记、酶催化标记)的分子。这样,这些肽或肽缀合物可用于在体内或体外检测特定靶的诊断方法。本发明也提供了调节(例如,激活或抑制)免疫细胞(例如,T细胞、B细胞、NK细胞、LAK细胞或树突状细胞)的活化、增殖和/或分化的方法,所述方法包括将免疫细胞与上述的肽或肽缀合物接触。优选地,所述肽是由SEQIDNO:1、2、3、4、5、6或7所表示的肽中的一种。此外,一些肽与这些肽相异在于一个或几个氨基酸,并且可与这些活性肽或天然TIRC7蛋白或其配体竟争某些生物学活性。另一个方法包括将治疗性活性剂递送至患者。该方法包括对患者施用至少一种肽或包含肽和治疗性活性剂的肽缀合物,其中所述肽优选包含由SEQIDN0:1至5表示的氨基酸序列或其类似物。优选地,治疗性活性剂选自药物、DNA序列、RNA序列、蛋白、脂质和其组合。更优选地,治疗'性活'性剂是抗菌齐寸(antibacterialagent)、抗炎剂或抗肺瘤剂。本发明的另一个方法包括改变免疫应答。该方法包括将免疫系统细胞与至少一种上述的本发明的肽或肽缀合物接触。可在体外或体内进行此处描述的方法。可单独地或以各种组合和以肽缀合物的形式使用肽。以提供希望的效果的量使用它们。本领域内的技术人员可容易地确定这些量。优选地,对于本发明的各个方法,有用的肽用SEQIDNO:1、2、3、4、5、6或7表示。如此处所用的,"a"或"an"表示一个或多个被l资饰的项(term)。因此,本发明的组合物和方法包含一种或多种肽。同样,此处当认为肽包含氨基酸序列优选包含用SEQIDNO:1至5表示的氨基酸序列或其类似物时,肽可包含一个或多个指定的序列。"氨基酸"此处用于指具有通式NH广CRH-C00H的化合物,其中R(侧链)是H或有机基团。其中R是有机基团,R可变化并且可以是极性的或非极性的(即,疏水的)。本发明的氨基酸到可以是天然存在的或合成的(通常称作非蛋白质生成的)。如此处所用的,有机基团是被分类为脂肪族基团、环状基团或脂肪族和环状基团的组合的烃类基团。术语"脂肪族基团"表示饱和或不饱和线性或分枝的烃基。该术语用于包括例如烷基、烯基和炔基。术语"环状基团"表示分类为脂环族基团、芳香族基团或杂环基团的封闭环状烃基。术语"脂环族基团,,表示具有与脂肪族基团相似的性质的环状烃基。术语"芳香族基团"表示单或多环状芳香族烃基。如此所用的,有机基团可以是取代的或非取代的。如此处所用的术语"多肽"或"肽,,可互换使用并且是指氨基酸的聚合物。这些术语并不含有氨基酸聚合物的特定长度之意。因此,例如,术语寡肽、蛋白和酶包含在多肽或肽的定义范围内,不论所述多肽或肽是使用重组技术、化学和酶合成产生的或天然存在的。该术语也包括已通过例如糖基化、乙酰化、磷酸化等修饰或衍生的多肽。此处,"分离的,,,当其指肽(即,多肽)时,表示该肽从天然存在的蛋白或其他多肽产生并且不含其他生物材料,或其是合成的,通过重组或化学方法合成的。在整个申请中使用下列缩写A-Ala-丙氨酸T=Thr苏氨酸V-Val-缬氨酸C=Cys=半胱氨酸L-Leu=亮氨酸Y=Tyr=酪氨酸I-lie=异亮氨酸N=Asn=天冬酰胺P-Pro=脯氨酸Q=Gin=谷氨酰胺F-Phe=苯丙氨酸D=Asp-天冬氨酸W-Trp=色氨酸E=Glu-谷氨酸M-Met=曱石克氨酸K=Lys-赖氨酸G-Gly=甘氨酸-Arg=精氨酸S=Ser=丝氨酸H=His=组氨酸本发明的方面和优选实施方案的详细描述如前面所述,本发明提供了能够调节免疫应答的TIRC7肽。如由Utku等人(Immunity,1998)所显示的,体外翻译的蛋白TIRC7在MLR中以剂量依赖性的方式显著抑制被激活的T细胞的增殖。为了考察TIRC7肽对被刺激的PBMC的增殖的影响,使用来源于TIRC7蛋白的第三细胞外结构域的TIRC7肽进行相似的测定。因此,本发明提供了分离的来源于TIRC7的调节TIRC7蛋白和/或至少一种其配体的功能的肽,该肽包含用SEQIDNO:1至5(至少其中一个)表示的氨基酸序列或其类似物。如此处实施例1中所描述的,就其抑制丝裂霉素刺激的PBMC的增殖的能力检测肽。因此,在如国际申请W099/11782和W003/025000中所描述的淋巴细胞增殖测定法中检测本发明的来源于TIRC7的肽(也参见上面),并且可令人吃惊地显示来源于TIRC7蛋白的第三细胞外结构域的合成肽在低浓度中具有功能,从而最适合于治疗应用。特别有利的实例是肽D46M(SEQIDNO:3)和A61V(SEQIDNO:4),也参见图1。此外,对应于大多数(如果不是所有的)完整的TIRC7笫三细胞外结构域,和任意地进一步包含TIRC7的C末端结构域的重组产生的TIRC7肽也显示对丝裂霉素C刺激的PBMC的增殖的抑制。周此,本发明的肽预期用于免疫应答的调节。调节免疫系统,如例通过活化或抑制T细胞、B细胞、NK细胞、LAK细胞质、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞或其他免疫系统细胞的增殖和/或分化,调节免疫系统可用于治疗自身免疫性疾病、变应性疾病和用于其中移植物抗宿主或宿主抗移植物效应可以是不想要的移植治疗中。所述肽也可以是背景(setting)例如癌症、传染病、脓毒症、创伤愈合或免疫接种中的免疫刺激剂。备选地,其可以是免疫抑制剂。其也可用于检测炎症,优选通过激活或抑制免疫或炎症细胞的激活来调节炎症。优选方法包括检测(和优选调节)组织例如发炎的脉管系统或白细胞中的炎症。在一个优选实施方案中所述肽和肽缀合物用于诱导或维持受试者中的免疫无应答性。术语"免疫无应答性"包括免疫细胞亚型如T细胞或B细胞、NK细胞、单核细胞和/或巨噬细胞的非-免疫无应答性(non-unresponsiveness)。此处使用的术语"治疗"、"医治"等一般表示获得希望的药理和/或生理效应。该效应在完全或部分预防疾病或其症状方面可以是预防性的和/或在部分或完全治疗疾病和/或归因于疾病的有效害效应方面可以是治疗性的。术语"治疗",如此处所用的,涵盖哺乳动物特别是人中的疾病的任何治疗,并且包括(a)预防在受试者中发生的疾病,所述受试者对该疾病易感但还未纟皮诊断为患有该疾病;(b)抑制疾病,即阻止其发展;或(c)緩解疾病,即使疾病消退。此外,此处所用的术语"受试者"涉及需要改善、治疗和/或预防此处公开的免疫性疾病的动物。最优选地所述受试者是人。因此,本发明提供了来源于TIRC7肽的第三细胞外结构域的、能够调节(即,通过增加、减少等改变)例如免疫细胞活化、细胞增殖、细胞分化或TIRC7对其配体的结合的肽。优选地,本发明提供了包含或用SEQIDNO:1表示的氨基酸序列(参见图l)或其片段组成的分离的肽,例如在一个实施方案中,本发明的肽包含或由SEQIDNO:1中所示的从氨基酸位点1至27的氨基酸序列组成。此外,本发明提供了用SEQIDNO:l至5表示的分离的肽。此外,本发明的肽优选用于IFN-y依赖性免疫反应(所述免疫反应是指与移植排斥、多发性硬化症、I型糖尿病或类风湿性关节炎相关的Thl型免疫应答)的特异性抑制或调节而对Th2免疫反应无调节效应。其他肽据认为具有至少一种此处描述的活性。可向培养中的细胞(体外)加入包含本发明的多肽的组合物或将其用于治疗患者例如哺乳动物(体内)。当将多肽用于治疗患者时,优选地将该多肽与药学上可接受的栽体(例如提高多肽的稳定性的更大的分子)或药学上可接受的緩沖剂(用作多肽的载体)混合在药物组合物中或整合在肽缀合物中,所述肽缀合物具有一个以上的偶联至单个实体的肽。适的表面结构的细胞进行药物定位的潜在候选者的亲和力。该对细胞的靶向和结合可用于治疗性活性剂(包括耙向性药物、DNA序列、RNA序列、脂质体、蛋白(例如,人生长因子)的递送和基因治疗剂/基因的递送。更优选地,治疗性活性试剂是抗炎剂。具有TIRC7肽的特定编号的分子/颗粒可特异性结合表达特定配体组合的细胞/组织,从而可具有诊断和治疗性用途。因此,可标记(例如,荧光、放射性、酶、核磁标记)本发明的肽和将其用于体内或体外(包括"免疫化学"如体外测定法)检测特定的耙。在体内可以以类似于核医学显像技术的方法将它们用于检测表达TIRC7或其配体的组织、细胞或其他材料。本发明的肽可以以其游离酸形式存在或可在C末端羧基将它们酰胺化。本发明也包括例如SEQIDN0:1至5的TIRC7肽的类似物,所述类似物通常与SEQIDNO:1至5中的任一种具有结构相似性。多肽的"类似物"包含至少该多肽的部分,其中所述部分包含一个或多个连续或非连续的氨基酸的缺失或添加,或包含一个或多个氨基酸的置换。本发明的多肽中的氨基酸的置换优选是保守置换,所述置换选自所述氨基酸属于的种类中的其他成员。类似物也可以是整合此处描述的肽的更大的肽。例如,属于具有特定大小或特征(例如电荷、疏水性和亲水性)的氨基酸组群的氨基酸通常可置换另一种氨基酸而基本上不改变多肽的结构在蛋白质生物化学领域内是公知的。为了本发明的目的,保守性氨基酸置换经确定由来自下列残基的种类中的任一种类内的氨基酸残基的交换造成,所述残基种类为种类1:Ala、Gly、Ser、Thr和Pro;种类II:Cys、Ser、Thr和Tyr;种类III:Glu、Asp、Asn和Gln(包含侧链的羧基)种类IV:His、Arg和Lys(代表碱性侧链);种类V:Ile、Val、Leu、Phe和Met(代表疏水侧链);和种类VI:Phe、Trp、Tyr和His(代表芳香族侧链)。所述种类也包括其他相关的氨基酸例如种类VI中的卣代酪氨酸。多肽类似物,当该术语在此使用时,也包括经修饰的多肽。本发明的多肽的修饰包括在一个或多个组成氨基酸上的化学和/或酶催化衍生化,包括侧链修饰、主链修饰和N-和C-末端修饰,包括乙酰化、羟化、甲基化、酰胺化和糖类或脂质部分、辅助因子等的附着。在优选实施方案中,本发明的肽包含D-异构体氨基酸、L-异构体氨基酸或其混合物的组群中的一组。包含D-异构体氨基酸的肽的制备描述于例如Schumacher,Science271(1996),1854-1857。优选的肽类似物的特征在于具有至少一种此处描述的生物学活性。这样的类似物此处称为"生物学活性类似物"或简单称为"活性类似物"。例如,可如实施例1中所述确定肽的生物学活性。本发明的肽可通过固相方法,使用基于叔丁氧羰基(BOC)或9药甲氧羰基(FMOC)保护基团的标准方法合成。该方法学由G.B.Fields等人在SyntheticPeptides:AUser'sGuide,W.M.Freeman&Company,NewYork,NY,pp.77-183(1992)中进行描述。本肽也可通过本领域技术人员熟知的重组技术合成。例如,美国专利5595887描述了通过表达编码融合蛋白的重组基因构建体形成多种相对小的肽的方法,所述融合蛋白包含结合蛋白和一个或多个想要的靶肽的拷贝。在表达后,分离融合蛋白并使用化学和/或酶催化方法进行切割,从而产生想要的靶肽。因此,在一个优选实施方案中,本发明的肽在其N-和/或C-末端包含异源氨基酸或氨基酸序列,例如标记,以帮助纯化本发明的肽,所述异源氨基酸序列可包括,但不限于Arg-标记、B-标记(蓝舌病毒的VP7蛋白区域)、钩调蛋白结合肽、CAT(氯霉素乙酰转移酶)、CBP(纤维素结合结构域)、壳多糖结合结构域、c-myc-标记、DHFR(二氢叶酸还原酶)、DsbA、FLAG-标记、半乳糖结合蛋白、GST(谷胱甘肽S-转移酶)、HAT-标记、His-标记、HSV-标记、KSI、lacZ(P-半乳糖普酶)、乳糖抑制子(lacrepressor)、麦芽糖-结合蛋白质、MBP(麦芽糖-结合蛋白质)、mv、NusA、聚天冬氨酸、聚苯丙氨酸、S-标记、SBP-标记、葡萄球菌蛋白A、链球菌G蛋白、Strep-标记、泛素、T7-标记、T7基因10、石克氧还蛋白、His-patch石克氧还蛋白或trpE。在优选实施方案中,本发明的肽包含SEQIDN0:6或7中所示的氨基酸序列(参见图1)。可以单价状态(例如,游离肽或偶联至载体分子或结构的肽)使用本发明的肽。也可以以具有多于一个(相同或不同的)结合至单个载体分子的肽的缀合物的形式使用所述肽。载体分子或结构可以是微珠、脂质体、生物栽体分子(例如,葡萄胺聚糖、蛋白聚糖、白蛋白等)、合成聚合物(例如,聚烷基乙二醇或合成的色镨仪支持物)、生物材料(例如,适合用于植入哺乳动物或与如体外装置中的生物液体接触的材料)或其他细胞。一般地,卵白蛋白、人血清白蛋白、其他蛋白、聚乙二醇等用作载体。这些修饰可增加肽的表观亲和力和/或改变其稳定性。与各载体締合或结合至各载体的肽片段的数目可变化。此外,如上所述,此处描述的肽的多种混合物和密度的用途可允许产生根据优选配体具有特定结合模式的复合物。可使用本领域技术人员已知的标准方法将肽缀合至其他多肽。可通过使用凝胶过滤柱层析或本领域已知的其他方法将缀合物与游离肽分开。例如,可通过用偶联剂例如碳二亚胺处理肽和载体分子(或结构)的混合物来制备肽缀合物。偶联剂可使肽或载体分子(或结构)上的羧基活化,从而使羧基可与肽缀合物的其他成员上的亲核基团(例如氨基或羧基)反应,从而产生肽和载体分子(或结构)的共价连接。作为另一个示例,可将肽偶联至生物素标记的聚乙二醇,然后再偶联至包含抗生物素蛋白的化合物。在偶联至其他实体的肽的情况下,应当理解设计的活性可依赖于偶联至该实体的肽的末端。本发明也提供了包含一种或多种本发明的活性剂(即,肽)和一种或多种药学上可接受的载体的组合物。可以以单独的或与其他活性剂一起以及与药学上可接受的緩冲剂一起的量给患者施用一种或多种具有已证明的生物学活性的多肽。可将多肽与多种生理可接受的用于递送至患者的载体组合,所述载体包括本领域技术人员已知的多种稀释剂或赋形剂。例如,对于胃肠外给药,等渗生理盐溶液是优选的。对于局部给药,可使用乳青,所述乳膏包含载体例如二曱基亚砜(DMS0)其他合适的载体包括,但不限于醇、磷酸緩冲盐溶液和其他经平衡的盐溶液。可以单位剂型方便地提供制剂和可通过药学领域内熟知的任何方法制备所述制剂。优选地,此类方法包括使活性剂与组成一种或多种配合剂(accessoryingredient)的载体结合的步骤。本发明的方法包括以有效地产生希望的效应的量给患者,优选哺乳动物,和更优选人施用本发明的組合物。可以单剂或以多剂的形式施用肽。可通过比较其体外活性和在动物模型中的体内活性确定活性剂的使用剂量。用于将小鼠和其他动物中的有效剂量外推至人的方法在本领域内是熟知的。在优选实施方案中,本发明的药物组合物包含至少一种第二试剂,优选地,依赖于希望的用途,抑制T细胞刺激的试剂。此类试剂包括,例如,能够阻断或模拟导致T细胞抑制的受体/配体相互作用等的分子。此类试剂包含阻断例如共刺激分子的活性的试剂,例如抗TIRC7抗体和TNF-a阻断剂,例如抗体、整联蛋白、Ig-超家族分子、选择13蛋白和阻断趋化因子与其各自受体的相互作用的药物、阻断IL2/IL2-受体相互作用的药物以及其他常规的免疫抑制药物例如IL-2RmAb、IL-毒素和IL-突变蛋白。共刺激分子和其配体的实例描述于现有技术例如Schwartz,Cell71(1992),1065-1068中。在Blazar,J.Immunol.157(1996),3250-3259;Bluestone,Immunity2(1995),555-559;Linsley,Science257(1992),792-95中描述了通过使用针对CD28对B7-2与CTLA4对B7-l和B7-2之间的相互作用的mAb或可溶性CTLA41g进行的受体/配体相互作用的阻断。由Burden,Nature381(1996),434-435;Kirk,Proc.Natl.Acad.Sci.USA94(1997),8789-8794报导了通过使用针对CD40或CD40L的mAb阻止受体/配体相互作用的实例。在BagoguiLi等人,reviewinAdhesionMolecules,Fusionproteins,NovelPeptides,andMonoclonalAntibodies,RecentDevelopmentsinTransplantationMedicine,第2巻,1995,Physicians&ScientistsPublishingCo.,Inc.中描述了CD2抗原和其酉己体LFA—3,在Bromberg,Transplantation51(1991)219—225中才艮导了通过使用mAb(抗-Leu-5b、0KTll-、Tll)或CD2.lgGl融合蛋白阻断它们相互作用。抗CD4分子的单克隆Ab的用途描述于Cosimi,Surgery108(1990),406-414。由Rheinhold,J.Exp.Med.185(1997),1-11描述了通过mAb进行的CD47的阻断。整联蛋白和Ig-超家族分子包括LFA-1和其配体ICAM-l、-2、-3、Mac-1与其配体ICAM-l、-3;ICAM-l与其配体LFA-l、Mac-1、CD43;ICAM-2与其配体LFA-1;ICAM-3与其配体LFA-1、Mac-1;VLA4和VCAM-1,参见,例如,David,Adams,reviewinAdhesionMolecules,Fusionproteins,NovelPeptides,andMonoclonalAntibodies,RecentDevelopmentsinTransplantationMedicine,第2巻,1995,Physicians&ScientistsPublishingCo.,Inc.;Isobe,Science,255(1992),1125-1127;Cosimi,J.Immunology144(1990),4604-4612;Hynes,Cell69(1992),11-25。此外可使用具有针对ct4整联蛋白链(CD49d)的VLA-4mAb的选14择性干扰剂,P1整联蛋白链(CD29)、或VLA-4的激活诱导的新表位以及可溶性VLA-4配体例如可溶纤连蛋白或其相关肽(GPEILDVPST)、或可溶性VCAM-1或其相关肽。更具选择性的阻断剂是经设计选择性地与胞质oc4、pl或VCAM-1mRNA杂交的反义寡核苷酸;Fedoseyeva,J.Immunol.57(1994),606-612。另一个实例是能够阻断VCAM-1表达的药物己酮可可豆碱(PTX);Besler,J.Leukoc.Biol.40(1986),747-754。此外,VCAM-1mAb、M/K-2、抗鼠类,例如可延长同种异体移植物的存活,0rosz,Transplantation,56(1993),453-460。在Kupiec-Weglinski,reviewinAdhesionMolecules,Fusionproteins,NovelPeptides,andMonoclonalAntibodies,RecentDevelopmentsinTransplantationMedicine,第2巻,1995,Physicians&ScientistsPublishingCo.,Inc.中描述了通过使用mAb进行的整联蛋白家族成员和其配体的阻断。选择蛋白例如L-选择蛋白(CD62L)、E-选择蛋白(CD62E)、P-选择蛋白(CD62P)已描述于Forrest和Paulson,Selectinfamilyofadhesionmolecules.In:Granger和Schmid-Schonbein,编著.PhysiologyandPathophysiologyofLeukocyteAdhesion.NewYork,OxfordPress,1995,pp68-146中。可如Cosimi,Transplantation32(1981),535-539;Shield,Transplantation38(1984),695-701,和Graft,June2001,第4巻(4)中所述使用常MJL疫抑制药物例如ATG、ALG、0KT3、氮杂硫代嘌呤、麦考酚酸莫酯(Mycophenylate)、Mofetyl、环孢霉素A、FK506、西罗莫司(Rapamune)、皮质激素的组合。在Luster,Chemokines-chemotacticcytokinesthatmediateinflammation,NewEngl.J.Med.Feb.(1998),436-445中综述了通过使用mAb进行的趋化因子与其各自的受体的相互作用的阻断。因此,可根据本发明的药物组合物或此处描述的方法和用途使用上面定义的和通过实例引用的任何试剂。优选地将本发明的试剂配制在药物组合物中,然后根据本发明的方法,将其以多种适合于选择的施用途径的形式给患者例如人患者施用。所述制剂包括,但不限于适合用于口服、经直肠、阴道、局部、鼻、眼或胃肠外(包括皮下、肌内、腹膜内、瘤内、器官内、动脉内和静脉内)施用的制剂。适合用于胃肠外施用的制剂通常包括优选地与受者的血液等渗的活性剂的无菌水制剂或活性剂的无菌粉剂的分散体。可通过包含用于延迟的试剂例如单硬脂酸铝和明胶获得活性剂的延长时期的吸收。适合于口服施用的本发明的制剂可以以分开的单位例如片剂、药片、胶囊、锭剂、糯米纸嚢剂或扁嚢剂形式提供,其各自包含预先确定量的以粉剂或颗粒形式存在的活性剂如包含活性剂的脂质体,或以水溶液或非水溶液中的溶液或悬浮液形式存在的活性剂如糖浆剂、酏剂、乳剂或饮剂。这些组合物和制剂通常包含至少大约o.lwt-y。的活性剂。多肽(即,活性剂)的量是剂量水平对于在患者中产生希望的结果是有效的量。气雾剂制剂例如鼻腔喷雾制剂包括活性剂与防腐剂和等渗剂的纯化的水溶液或其他溶液。优选地将此类制剂调节至与鼻粘膜相容的pH和等渗状态。可以以具有适合的载体的栓剂形式提供用于直肠或阴道施用的制剂。此外,本发明涉及包含来源于TIRC7蛋白的第三细胞外结构域的氨基酸序列的肽的用途,所述肽用于制备用于在受度者中抑制免疫应答,优选地用于治疗移植物抗宿主病、自身免疫性疾病、变应性疾病、传染病、脓毒症,用于治疗肿瘤,用于改善创伤愈合或用于诱导或保持免疫无应答性的药物组合物。根据本发明的方法治疗的病症的其他实例包括,但不限于,免疫系统病症例如炎症、光化性角化病、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、阿狄森氏病、成人呼吸窘迫综合征、变态反应、强直性脊柱炎、淀粉样变病、贫血、动脉硬化、哮喘、动脉粥样硬化、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性曱状腺炎、支气管炎、滑嚢炎、胆嚢炎、肝硬化、接触性皮炎、克罗恩病、异位性皮炎、皮肌炎、糖尿病、肺气肿、胎儿母红血球增多症、结节性红斑、萎缩性胃炎、肾小球肾炎、肺出血肾炎综合征、痛风、突眼性甲状腺肿、桥本曱状腺炎、阵发性睡眠性血红蛋白尿、肝炎、嗜伊红细胞增多症、肠易激综合征(irritablebowelsyndrome)、发作性淋巴细胞减少伴淋巴细胞毒素(episodiclymphopeniawithlymphocytotoxin)、混合性结締组织病(MCTD)、多发性硬化症、重症肌无力、心肌或心包炎症(myocardialorpericardialinflammation)、骨髓纤维化、骨关节炎、骨质疏松症、胰腺炎、真性红细胞增多症、多发性肌炎、牛皮癣(银屑病)、莱特尔(氏)综合征、类风湿性关节炎、硬皮症、舍格伦综合征、全身性过敏反应、系统性红斑狼疮、系统性硬化病、原发性血小板增多症、血小板减少性紫癜、溃疡性结肠炎、眼葡萄膜炎、沃纳综合征、癌症的并发症(complicationsofcancer)、血液透才斤、和体夕卜循环、夕卜4另和造血性癌症(hematopoieticcancer)包括淋巴瘤、非白血性白血病、和骨髓瘤;生殖病症例如催乳素产生性病症、不孕症包括输卵管疾病、排卵缺陷(ovulatorydefects)和子宫内膜异位、动情周期的打断、月经周期的打断、多嚢性卵巢综合征、卵巢过度刺激综合征、子宫内膜或卵巢肿瘤、子宫肌瘤、自身免疫性疾病、异位妊娠、和畸形发生、乳腺癌、纤维嚢性乳房疾病、和乳溢、精子发生的破坏、畸形精子生理学、睾丸癌、前列腺癌、良性前列腺增生(症)、前列腺炎、佩罗尼氏病、阳痿、男性乳腺癌、和男子女性型乳房;神经系统疾病例如癫痫、缺血性脑血管疾病、中风、脑肿瘤、阿尔茨海默病、皮克氏病、亨丁顿舞蹈症、痴呆、帕金森病和其他锥体外障碍洗眼杯疾病、肌萎缩性(脊髓)侧索硬化和其他神经元病症、进行性神经性肌萎缩、色素性视网膜炎、遗传性共济失调、多发性硬化症和其他脱髓鞘性病、细菌引起的脑膜炎和病毒性脑膜炎、脑脓肺、硬脑膜下积脓、硬膜外腺月中、化脈性卢贞内血检性静乐K炎(suppurativeintracranialthrombophlebitis)、脊髓炎和脊神经才艮炎、滤过性毒菌引起的中枢神经系统疾病、朊病毒病包括库鲁病、克罗伊茨费尔特-雅各布病,痉挛性假性硬化、和脑三叉神经综合征、致命性家族性失眠症、神经系统的营养和新陈代谢疾病、神经纤维瘤病、结节性硬化、小脑视网膜的成血管细胞瘤病、脑三叉神经综合征(encephalotrigeminalsyndrome)、智力发育障碍和中枢神经系统的其他发育病症、脑性麻痹、神经骨駱病症、自主神经系统病症、脑神经病症、脊髓疾病、肌营养不良和其他神经肌肉障碍、周围神经系统病症、皮肌炎和多发性肌炎、遗传性、代谢性、内分泌和中毒性肌病、重症肌无力、周期性麻痹、精神紊乱(精神紊乱)包括情绪、焦虑和精神分裂性障碍、静坐不能(akathesia)、健忘症、紧张症、糖尿病神经病变、迟发性运动障碍、张力障碍、偏执型精神病、带状疱渗后神经痛和图雷特(氏)精神障碍;细胞信号转导病症包括内分泌病症例如由损伤导致的下丘脑和脑下垂体的病症例如原发性脑肿瘤、腺瘤、妊娠相关梗塞、垂体摘除术、动脉瘤、血管畸形、血栓症、感染、免疫病症和由头部创伤引起的并发症;垂体功能尤进相关病症包括肢端肥大症、巨大症(giantism)、和通常由良性腺瘤引起的不适当抗利尿激素(ADH)分泌(SIADH)的综合征;甲状腺功能减退相关病症包括曱状腺肿、粘液(性)水肿、细菌感染相关性急性曱状腺炎;甲状旁腺功能亢进相关病症包括Conn病(慢性骨痂增生);胰脏病症例如I型或11型糖尿病和相关的并发症;肾上腺相关病症例如超常增生、癌,或肾上腺皮质腺瘤、碱中毒相关高血压;性腺类固醇激素相关病症例如在妇女中,异常催乳素的产生、不孕、子宫内膜异位、月经周期的干扰、多嚢卵巢病、高催乳素血症、单一性促性腺激素缺乏症、闭经、乳溢、两性同体、多毛症和男性化、乳腺癌,和,在经绝后的妇女中,骨质疏松症;和,在男性中,莱迪希细胞缺乏、男性更年期、和生殖细胞不发育症、莱迪希细胞肿瘤相关性腺;t/L能亢进病症(hypergonadaldisordersassociatedwithLeydigcelltumors)、雄性激素受体缺乏才目关性雄激素抗性(androgenresistanceassociatedwithabsenceofandrogenreceptors)、5a-还原酶的综合征、和男子女性型乳房;和细胞增殖病症例如光化性角化病、血管硬化、动脉粥样硬化、滑囊炎、肝硬化、肝炎、混合性结締组织病(MCTD)、骨髓纤维化、阵发性夜间血红蛋白尿、真性红细胞增多症、牛皮癣、原发性血小板增多,和癌症包括腺癌、白血病、淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、肉瘤、畸胎癌,和,特别地,肾上腺、膀胱、骨、骨髓、脑、乳腺、宫颈、胆嚢、神经中枢、胃肠道、心脏、肾、肝、肺、肌肉、卵巢、胰腺、曱状旁腺、阴茎、前列腺、涎腺、皮肤、脾脏、睾丸、胸腺、曱状腺和子宫的癌症。在其他方面,本发明涉及用于预防或治疗受试者的上述疾病的任一种的治疗剂(优选免疫抑制剂)的用途,其中所述受试者已^皮检测为阳性。本发明的描述和实施例公开和包括了这些和其他实施方案。使用例如电子设备可从公共图书馆和数据库检索到关于根据本发明使用的任何一种材料、方法、用途和化合物的其他文献。例如可利用由在美国国立卫生研究院的美国国家生物技术信息中心和/或美国国立医学图书馆拥有的公共数据库"联机医学文献分析与检索系统(Med1ine)"。其他数据库和网址,例如为欧洲分子生物学实验室(EMBL)的部分的欧洲生物信息研究所(EBI)的数据库和网址对本领域技术人员来说是已知的并且也可通过使用国际互联网检索引擎获得。在Berks,TIBTECHl2(1994),352-364中提供了生物技术学的专利信息的综述和用于回顾搜索和最新文献通报的专利信息的相关来源的纵览。在整个本说明书的文本中引用了几份参考资料。所有引用的参考资料(包括在整个本申请中引用的文献来源、发行的专利、公布的专利申请书和厂商的详述、技术说明书等)的内容明确地在此引用作为参考;然而,不承认引用的任何资料对于本发明确实是现有技术。上面的公开内容通常描述了本发明。可通过参考下列特定的实施例获得更完全的理解,所述实施例在此处只是为了说明而提供的而不希望限定本发明的范围。实施例常规方法例如此处所用的方法的详细描述可见于引用的文献中;也参见"TheMerckManualofDiagnosisandTherapy",第17版,由Beers和Berkow(Merck&Co.,Inc.2003)编著。除非另外指出,本发明的实践将使用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术,所述技术在本领域技术人员的能力范围之内。分子遗传学和基因工程中的方法通常描述于当前版本的MolecularCloning:ALaboratoryManual,(Sambrook等人,(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,ColdSpringHarborLaboratoryPress);DNACloning,第I和II巻(Glover编著,1985);OligonucleotideSynthesis(Gait编著,1984);NucleicAcidHybridization(Hames和Higgins编著.1984);TranscriptionAndTranslation(Hames和Higgins编著.1984);CultureOfAnimalCells(Freshney和Alan,Liss,Inc.,1987);GeneTransferVectorsforMammalianCelIs(Mi1ler和Calos,编著.);CurrentProtocolsinMolecularBiologyandShortProtocolsinMolecularBiology,第3版(Ausubel等人,编著.);和RecombinantDNAMethodology(Wu,编著,AcademicPress)。GeneTransferVectorsForMammalianCelIs(Miller和Calos,编著,1987,ColdSpringHarborLaboratory);MethodsInEnzymology,第154和155巻(Wu等人,编著.);ImmobilizedCellsAndEnzymes(IRLPress,1986);Perbal,APracticalGuideToMolecularCloning(1984);论文,MethodsInEnzymology(AcademicPress,Inc.,N.Y.);ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology(Mayer和Walker,编著,AcademicPress,London,1987);HandbookOfExperimentalImmunology,第I至IV巻(Weir和Blackwell,编著,1986)。本公开内容中提及的用于基因操作的试剂、克隆载体和试剂盒可从商业售主例如BioRad、Stratagene、Invitrogen和Clontech商购获得。细胞培养和培养基收集中的一般技术概述于LargeScaleMammalianCellCulture(Hu等人,Curr.Opin.Biotechnol.8(1997),148);Serura-freeMedia(Kitano,Biotechnology17(1991),73);LargeScaleMammalianCellCulture(Curr.Opin.Biotechnol.2(1991),375);和SuspensionCultureofMammalianCells(Birch等人,BioprocessTechnol.19(1990),251);ExtractinginformationfromcDNAarrays,Herzel等人,CHAOS11,(2001),98—107。图1:A.TIRC7第三细胞外结构域。B.合成的短肽。C.在大肠杆菌(Aco//)中表达的TIRC7细胞外结构域,图的C部分中的+C和-C表示TIRC7的C末端的存在或不存在。带有或不带有包含了跨膜结构域的TIRC7的C末端(核苷酸位点2058至2616,即558bp的额外片段)的情况下在大肠杆菌中克隆和表达第三细胞外结构域(对应于基因库登记号AF025374中公开的基因TIRC7cDNA序列,核苷酸位点1857至2057,ATG位于核苷酸位点537)。为了在大肠杆菌中克隆和表达,可使用常规的栽体和质粒,例如可从商业提供商例如Stratagene、Qiagen商购获得的PCR-Script、pQE30、pQE60、pQE40。实施例说明本发明。实施例l:来源于TIRC7的肽抑制细胞增殖的效力的评估用丝裂霉素(刺激剂)使新分离的PBMC失活或用CFSE(反应者)对其进行染色。将细胞与如图l中描述的肽(将所述肽溶解在PBS中并滴定至pH7.3)—起温育6天。然后,基本上如国际申请W099/11782和WO03/025000中所述进行体外测定(混合淋巴细胞反应(MLR))以分析受试的来源于TIRC7的肽抑制免疫应答的功效。对于图l中显示的所有肽,可观察到增殖的显著抑制。这证明包含TIRC7蛋白的第三细胞外结构域的氨基酸序列的合成肽和重組产生的肽在抑制免疫细胞的活性中具有生物学活性,从而具有治疗功用。权利要求1.能够抑制外周血单核细胞(PBMC)的增殖的肽,该肽包含来自T细胞免疫应答cDNA7(TIRC7)蛋白的第三细胞外结构域的氨基酸序列的片段。2.权利要求1的肽,其包含SEQIDNO:1中显示的氨基酸序列的片段。3.权利要求1或2的肽,其包含或由SEQIDNO:1至5中任一个中显示的氨基酸序列或其片段组成。4.权利要求1至3中任一项的肽,其中所述肽包含D-异构体氨基酸、L-异构体氨基酸或其组合的组群中的一个组群。5.权利要求1至4中任一项的肽,其在其N-和/或C-末端进一步包含异源氨基酸或氨基酸序列。6.权利要求1至5中任一项的肽,其中所述异源氨基酸序列包含His-标记或DHFR。7.权利要求1至6中任一项的肽,其中所述肽包含SEQIDN0:6或7的氨基酸序列。8.包含至少一种权利要求1至7中任一项的肽的组合物。9.权利要求8的组合物,其是药物组合物并且还包含药学上可接受的载体。10.权利要求9的药物组合物,其还包含免疫抑制剂。全文摘要本发明提供了能够抑制外周血单核细胞(PBMC)增殖的肽,描述了来源于T细胞免疫反应cDNA7(TIRC7)共刺激分子的第三细胞外结构域的肽。提供了包含此类肽的组合物和其用于治疗免疫性疾病的用途。文档编号A61P37/00GK101262875SQ200680022256公开日2008年9月10日申请日期2006年5月17日优先权日2005年5月17日发明者N·乌特库申请人:塞尔艾克特制药有限公司
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