专利名称：腹膜保护剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有吡哆胺等吡哆素类作为有效成分的腹膜保护剂。
技术背景长期腹膜透析(PD)患者中，会逐渐引发腹膜功能低下，其特征在于 通过腹膜的葡萄糖依赖性渗透压梯度的消失亢进以及超滤能力丧失[非 专利文献1和2]。上迷衰竭症的腹膜功能的特征性变化的最大的表现形 式是血液和透析液之间的小分子溶质(尿素、肌酸酐、葡萄糖)交换的功 能性面积(即所谓的"有效腹膜表面积(EPSA)")增大[非专利文献3]。这样 的变化是由于血管生成亢进以及腹膜血管扩张引起的[非专利文献4]。作为腹膜功能衰竭基础的分子性机理尚未了解清楚。长时间的伴随 有炎症性变化的腹膜炎再发对腹膜有损伤[非专利文献1和5]，但这并 不是超滤衰竭症的发病条件[非专利文献4和6]。通过最近的研究，对 长期PD患者腹膜功能低下推断并明确了其机理[非专利文献7-14]。慢 性尿毒症本身引起腹膜变化，使EPSA增加[非专利文献8]。腹膜的生物 化学变化至少部分是由于尿毒症性循环以及PD液两者导致的反应性非 常高的羰基化合物(RCO)的超负荷("腹膜的羰基应激")[非专利文献 9-M]。血浆RCO在尿毒症性循环中蓄积，逐渐向腹腔内扩散，在后期 引发糖化终产物(AGE)的修饰[非专利文献15-21]。 PD中，由于葡萄糖 PD液的加热灭菌而产生的RCO进入到腹膜内。它们由于透析处理本身 导致的血清RCO物质移动的增加而不断补充。该腹膜的羰基应激结构 性地促进了对腹膜蛋白质的不可逆性AGE修饰。该RCO进一步刺激细 胞因子和增殖因子(VEGF等)的生成，可见到对腹膜细胞中一氧化氮合 成酶(NOS)的表达的调节[非专利文献22-25]。 VEGF与一氧化氮(NO)共 同刺激血管生成，使透过性增加，使腹膜毛细血管扩张[非专利文献 23-25]。这些综合性的变化导致EPSA增大，由此使得渗透压相对于正 常情况更快地消失，最终无法进行超滤。FGF-2和TGF-(3的正调节也会 刺激腹膜间质的纤维化[非专利文献24和26]。非专利文献l:Davies SJ 等人Wdney Int 54: 2207-2217, l998非专利文献:2:Krediet RT,等人Perit Dial Bull 6:61-65, 1986非专利文献3:Rippr B,等人Peritoneal physiology: Transport of solutions. 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图1所示。将6周龄、体重为200±3 g的 Sprague-Dawley雄性大鼠(CLER Japan, Inc.、东京)随机分成才莫拟手术的 对照大鼠(第l组n=6)、未进行腹膜透析的尿毒症大鼠(第2组n=12) 和进行腹膜透析的尿毒症大鼠(11=24)。再将进行腹膜透析的尿毒症大鼠 进一步分成用4.25 。/。Dianeal(注册商标)(3.86。/。葡萄糖、2.5 mEq/CAPD 液。Baxter Health care Corp.、 'J / 4州，,> 々)透析的组(第3组: n=12)、和用1 L的4.25% Dianeal (注册商标)中含有5 mg吡。多胺 (Pirdorine、 Biostratum Inc.、北卡罗来纳州)的液体进行腹膜透析的组(第 4组nH2)。如已报道的[Lameire N，等人、Kidney Int 54:2194-2206, 1998;和 KleinknechtC，等人、Kidney Int 47:S51-S54, 1995]，尿毒症模型通过摘除 5/6肾制备。使大鼠自由摄取含有1.06%钩、0.9%磷酸盐、21%蛋白质的 实验大鼠标准铒料(CE2: CLER Japan，Inc、东京)和自来水直至被杀死的 前夜。第13周，在异氟烷麻醉下将连接有13.5 cm导管的Rat-o-ports (Access Technologies, Norefolk Medical、 Illinois skokie)植入所有的大鼠 中。Rat-o-ports植入颈部皮下， 一周后用30 ml透析液开始每天两次的 腹膜透析，持续6周[Zweers MM，等人、Nephrol Dial Transplant 16:651-654, 2001]。腹膜透析开始前，在第2组、第3组、第4组中分别有4只、5只、2只大鼠死亡。最终得到了模拟手术对照组(第1组 n=6)、未进行腹膜透析的尿毒症组(第2组n-8)、进行腹膜透析的尿毒 症组(第3组n=7)、使用5 mg吡。多胺进行腹膜透析的尿毒症组(第4组 n,。(2) 组织采集进4亍6周PD,然后由接口处注入4.25% Dianeal (注册商标)，实施 腹膜平衡试验(60分钟)。然后通过麻醉使大鼠安乐死。从在第21周采 集的肝素血中分离血浆。摘出肠系膜，通过光学显微镜检查或免疫组织 化学检查进行评价。(3) 血浆和腹膜透析液的分析血浆和腹膜透析液中葡萄糖、肌酸酐、尿素、总胆固醇以及三甘油 的浓度通过自动分析仪(Hitachi型号730-60、日立电子林式会社)测定。(4) 通过HPLC进行的戊糖素的测定 按照已报道的方法[MiyataT,等人、J. Am. Soc. Nephrol 7: 1198-1206，1996],使用HPLC对大鼠腹膜中戊糖素含量进行评价。用1.5 ml氯仿/ 曱醇(2:1)、然后用l.Oml甲醇将腹膜组织(100mg)进行匀浆，除去脂质， 真空下干燥，在ll(TC下用500 ml6NHCl进行16小时的水解。将酸解 产物在真空中干燥，用400 iiil 10 mM HC1重新构建，用孔径0.5pm的 滤器过滤，用PBS稀释。将稀释的样品注入到HPLC装置中，通过C18 反相柱(5 ^un、 4.6x250 mm: Waters、东京)进行分离。将洗脱液用荧光 检测器(RF-10A:岛津制作所、东京)和激发/发光波长335/385 nm进行 监控。使用合成戊糖素(《> 卜i/'" )[Miyata T，等人、J. Am. Soc. Nephrol 7: U98-1206, 1996]制作标准曲线。(5) 免疫组织化学分析使用用甲醛固定、用石蜡包埋的切片进行免疫组织化学分析。由石 蜡块制备4 pm的切片，脱石蜡，浸泡在呈梯度浓度的乙醇中进行脱水。 使用抗PGF-卩1抗体(l:40、 Santa CruzBiotechnology、加利福尼亚州Santa Cruz)、抗血管性血友病因子抗体(1:400、 Daco、 f》7 —々々"kX卜，':/ -)、抗VEGF抗体(1:100、 Santa Cruz Biotechnology)、抗FGF-2抗体(1:400、 Santa Cruz Biotechnology),抗AGE抗体(l :200、株式会社卜5 > ^ in 二 々、熊本)作为第一抗体。将切片用二甲苯脱石蜡，用乙醇脱水。将切片 在室温下、在含有0.3%^02的甲醇中浸泡10分钟，抑制内源性过氧化物酶活性。通过加热进行抗原性活化。用磷酸緩冲生理盐水(pH 7.4)清 洗，然后将切片(抗TGF-卩1、血管性血友病因子、FGF2、 VEGF抗体) 在O.Ol M柠檬酸緩沖液(pH6.0)中、在微波炉(500 W)中、在IOO'C下加 热10分钟。加入第一抗体，在室温下温育1小时，然后沖洗切片，与 第二抗体(二于k一東京)一起温育45分钟，浸泡在0.2% 3，3-二氨基联苯 胺四盐酸盐(DAB)中，然后用苏木精进行对比染色。用未免疫兔或山羊 IgG进行免疫标记的特异性研究。
(6) 血管数量的评价
血管数量是在对血管性血友病因子进行染色的切片中，通过使用 WinROOF软件(三谷商事、东京)的图像分析进行评价。在每个皮质区内 随机选择20个视野，使用40倍的物镜估算毛细血管数的平均值。结果 以是正常对照动物的多少倍来表示。
(7) VEGF和FGF-2表达的检测
通过半定量反转录聚合酶链反应(RG-TCR)对VEGF或FGF2 (肠系 膜)的mRNA表达进行定量。使用IS0GEN(二"7fOi;—:/、東京)从肠系 膜中提取总RNA。使用随机引物(LIFE TECHNOLOGIES),用200单位 的MMLV反转录酶(BioLabs. Inc.)反转录2貼RNA。 PCR扩增按照已报 道的方法[Inagi R,等人、FEBS Letters 463: 260-264, 1999]进行。寡核苷酸 引物的序列如下。VEGF的引物
5，—ACT GGA CCC TGG CTT TAC 丁GC-3' (SEQ ID NO. 1) 5'-TTG GTG AGG TTT GAT CCG CAT G-3， (SEQ ID NO. 2) 扩增片段的全长为310bp FGF2的引物
5，-CAA GCA GAA GAG AGA GGA GTT-3， (SEQ ID NO. 3) 5,-TCA AGC TCT TAG CAG ACA TTG-3' (SEQ ID NO. 4) 扩增片段的全长为276bp 大鼠P-肌动蛋白的引物
5，-GTGTGATGGTGGGTATGGGTCAGAAGGACT-3' (SEQ ID NO. 5) 5'-ATG GCA TGA GGG AGC GCG TAA CCC TCA TAG-3' (SEQ ID NO. 6) 扩增片段为402bp
使用(3-肌动蛋白作为可以使不同试样中的RNA量进行比较的内部 标准。试样是使用DNA热循环仪(Perkin Elmer Cetus、〕才、于力'乂卜州/ —々才一々)，为VEGF或FGF2时以94°C1分钟、58°C1分钟，为卩-肌动 蛋白时以60°C1分钟、72°C1分钟的适当循环进行扩增。在预备实验中， 将RNA的量进行各种改变，将反转录和PCR扩增进行18、 21、 25、 28、 31、 34、 36个循环。由该实验中可知，在VEGF或FGF2的mRNA扩增 中以35个循环、在(3-肌动蛋白的mRNA的扩增中以16或21个循环扩 增，则PCR产物信号差异与所使用的RNA保持定量关系。用2%琼脂 糖电泳进行分离，用溴化乙锭进行染色，将所得PCR产物通过使用定量 程序(NIH image软件)的信号强度测定进行定量。mRNA是测定三个检 样，对每种实验将结果进行平均。对各实验条件均进行共3-4次的独立 实验，将结果平均，以平均土SD表示。 (8)统计学分析
结果均以平均土SD表示。各组间差异的统计学显著性是通过 Wilcoxon的非参数检验(平均值为2个时)或者克鲁斯凯-沃利斯(々，又 力a々才m;0检验(平均值为3个或以上时)进行评价。本实施例的统计 学分析中，显著差异的检测是利用SPSS软件(SPSS Inc、伊利诺伊州芝 加哥)。低于0.05的P值视为显著。(B)结果 (1)功能分析肾部分摘除的尿毒症大鼠生物化学数据和体重如表1所示。尿毒症 大鼠(第2-4组)中，与非尿毒症大鼠(第1组)比较，血浆肌酸酐、尿素、 总胆固醇量显著增加，体重减轻。对尿毒症组的有否进行PD和/或是吡 。多胺处理之间的统计学进行分析，这些值中均未见显著差异。葡萄糖和 三甘油的血浆浓度在所有的组之间均没有统计学差异。表l:生物化学数据和体重(21周)组 血浆肌酸酐血浆尿素血浆葡萄糖甘油三酯 总胆固醇 体重 _(mg/dl) (咖/dl) (咖/dl) (鹏/dl) (邮/dl) (g)1 (n=6) 0.3土0.0 16.0±2.4185. 5±64.9 141. 7±13. 5 71.0±13.5 530±372 (n-8) 1. 3±0. 6* 68. 0±35. 7 137. 5±31. 9 146, 6士46. 9 117. 3±25. 6* 416±56*3 (n=7) 1，6±0.3* 62.8±13.0* 121.1±36.5 157.1士58.4 143.1±33.9* 435±10*4 (n-lO)l. 3±0.6* 70. 1±23.4* 155. 2±20. 5 122. 5土50. 2 12S.4±31.8* 419±29= *:相对于第一组pO.Ol在肾部分摘除后13周，对已评价的腹膜(PM)的功能参数进行评价， 尿毒症大鼠(第2组)的来自血浆的小分子溶质(即肌酸酐、尿素)的转运速 度(图2A和B)以及来自透析液的葡萄糖的吸收速度(图2C)比对照大鼠 (第1组)显著高。肌酸酐(图3A的黑圆圏)或葡萄糖(图3B)的透过性增加 与肾衰竭的程度之间可见显著相关。这些数椐与Kombet等人最近的慢 性尿毒症本身使腹膜变化并且使EPSA增大的观察结果一致[Korbet SM， 等人、Am J Kidney Dis 22:588-591， 1993]。在PD中，腹膜的透过性逐渐变化。使用通常的以葡萄糖为基础的 透析液进行6周的PD,则来自血浆的小分子溶质的转运速度(图2A和B 的第3组)以及来自透析液的葡萄糖的吸收速度(图2C)显箸增加。尿毒症和PD处理导致的腹膜功能的变化至少部分性地成为来自尿 毒症性循环和PD液两者的腹膜羰基应激的原因。因此，对于尿毒症使 用吡。多胺(作为AGE和羰基应激的强力抑制药物在临床中应用)在腹腔 内进行PD。通过吡。多胺(5 mg/ml)进行6周的处理，来自血浆的小分子溶质的转运速度(图2A和B的第4组)以及来自透析液的葡萄糖的吸收 速度(图2C)显著降低。如图3A和B (白色三角)所示，吡哆胺使小分子 溶质(肌酸酐和葡萄糖)的透过性增加和肾衰竭程度之间的回归直线的斜 率急剧减小。吡喷胺的处理使尿毒症对膜透过性的影响几乎完全消失。
(2) 组织学分析
已知EPSA的增大与血管生成亢进密切相关。因此，测定血管性血 友病因子染色后腹膜组织中的血管数量(图4A)。尿毒症本身使血管数量 增力al.87倍，PD处理使该值又增大了 5.83倍。该血管生成的亢进由于 吡。多胺的处理而显著改善至2.68倍。肌酸酐(图4B)或葡萄糖(图4C)的 透过性增加与血管数量之间可见显著相关性。该结果意味着腹膜功能低 下时EPSA的增大与尿毒症和PD处理相关。
(3) 分子生物学分析
对与腹膜的功能和结构变化相关的分子情况进行研究。通过肠系膜 组织的HPLC测定对AGE和羰基应激的周知的代用标志戊糖素的含量 进行测定。戊糖素含量根椐尿毒症而增加(图5A的第2组)，组织中戊糖 素含量与肾衰竭的程度之间存在相关关系(图5B的黑色圆圏)。PD处理 中，促进了戊糖素的形成(图5A的第3组)，PD使戊糖素含量与肾衰竭 之间的回归直线的斜率增大(图5B的白色方框)。与此相对，吡。多胺的介 入使组织中戊糖素含量显著降低(图5A的第4组)，回归直线的斜率减小 (图5B的白色三角)。组织中的戊糖素含量与肌酸酐透过性(图6A)和血 管数量(图6B)的增加之间可见显著相关。
接着，为了明确诱导血管生成的细胞因子的作用，通过半定量PCR 对腹膜组织中的VEGF和FGF-2的基因表达进行分析。尿毒症大鼠中的 VEGF (图7B)和FGF-2 (图7C)的表达比对照大鼠高，由于PD处理而显 著增加。而吡。多胺使VEGF和FGF-2两者的表达降低至与未进行PD的 尿毒症大鼠同样的水平。
腹膜的分子生物学变化可进 一 步通过对肠系膜组织切片中的 VEGF、 FGF-2、 vWF、 AGE、 TGF-卩1的免疫组织化学进行了解(图8)。 即，在对照大鼠的肠系膜血管内皮中，无法感观检测出VEGF、 FGF-2、 vWF、 AGE、 TGF-pi的染色，这些生物学标志在尿毒症大鼠腹膜中微量 存在，而在进行了 PD处理的尿毒症大鼠中显著存在。另一方面，进行 了吡。多胺处理的大鼠的肠系膜毛细血管中，只检测出了微量的染色。产业实用性
本发明中作为有效成分使用的吡哆胺等吡哆素类是副作用小的安
全物质。根据本发明，可以提供可以有效抑制长期腹膜透析(PD)患者等 中的腹膜功能低下的安全的腹膜保护剂。
附图简述
图1是表示动物实验的方案说明。将6周龄的大鼠分成尿毒症模拟 手术组。肾部分摘除5周后进行配置腹腔内导管和皮下接口的外科埋入。 PD持续进行至出生后第21周。
图2表示通过PET进行的腹膜功能分析。在对照大鼠(第l组)、不 进行PD的尿毒症大鼠(第2组)、无吡。多胺但进行PD的尿毒症大鼠(第3 组)、有5 mg/1吡。多胺并进行PD的尿毒症大鼠(第4组)中，对用20 ml 3.85%葡萄糖透析液进行60分钟交换中的Cr(A)和尿素(B)的透析液/血 浆比(D/P)、以及来自透析液的葡萄糖吸收(D/DO)(C)进行研究。a:相对 于第l组pO.Ol。 b:相对于第2组p<0.01。 c:相对于第3组p<0.01 。 d:相对于第4组p<0.01。 e:相对于第3组p<0.05。 f:相对于第4组 p<0.05。
图3表示肌酸酐(A)或葡萄糖(B)的透过性的增加与肾衰竭程度的相 关性。黑色圓圏第1组和第2组(A、y-0.20x+0.26、n-14、r-0.87、pO.01。 B、 y=0.0538x+0.49、 n=14、 r=0.63、 p<0.05)，白色方框第3组(A、 y=0.22x+0.39、 n=7、 r=0.76、 p>0.01。 B、 y=0.1350x+0.45、 n=7、 r=0.93、 p<0.05)，白色三角第4组(A、 y=0.22x+0.63、 n=10、 r=0.24、 p>0.1。 B、 y=0.0015x+0.29、 n=10、 r=0.025、 p>0.1)，由于慢性尿毒症使小分子 溶质的透过性增大。该增大由于使用通常的以葡萄糖为基础的透析液进 行PD而进一步增大。与此相对，吡p多胺处理纠正了尿毒症导致的膜透 过性的降低。
图4是表示对血管性血友病因子的免疫组织化学分析进行的腹膜结 构分析。A:大鼠肠系膜的血管数量。a:相对于第l组pO.Ol。 b:相 对于第2組p〈0.01。 c:相对于第3组p<0.01。 d:相对于第4组p<0.01 。 肌酸酐(B、 y=0.052x+0.434、 n=31 、 r=0.65 、 p〈0.001)或葡萄糖(C、 y=-0.029x+0.43、 n=31、 r=-0.64、 pO.001)的透过性增大与血管数量之间存在显著相关。慢性尿毒症导致血管数增加，该增加由于使用通常的以葡萄糖为基础的透析液进行PD而进一步增大，但通过吡哆胺的处理减少。图5表示通过HPLC测定得到的腹膜的AGE含量。A:大鼠肠系膜 中的戊糖素含量。a:相对于第1组pO.Ol。 b:相对于第4组p<0.05。 c:相对于第3组p0.05。 B:肠系膜的戊糖素含量与肾功能衰竭导致的 肌酸酐透过性的程度之间存在显著的相关。黑色圆圏第1组和第2组 (y=0 024x-0 005 、 n=14 、 r=0.91 、 pO.OOl) 白色方框第3组 (y=0.80x+0.091 、 n-7 、 r=0.82 、 pO.Ol)。白色三角第4组 (y=0.006x+0.0135、 n=10、 r=0.35、 p〉0.1)。慢性尿毒症导致肠系膜的戊 糖素含量增加，由于使用通常的以葡萄糖为基础的透析液进行PD而进 一步增加，但通过给予吡喷胺而降低。图6表示肠系膜戊糖素含量与肌酸酐透过性或血管数量之间的相 关。肠系膜间戊多数素含量与肌酸酐透过性(A、 y=0.066x-0.018、 n=31、 r=0.65、 pO.OOl)或血管数量(B、 y=0.004x-0.001 、 n=31、 r=0.46、 p<0.01) 相关。图7表示诱导血管生成的细胞因子表达的检测。通过半定量性反转 录聚合酶链反应(RT-PCR)对肠系膜的VEGF或FGF2的mRNA表达进行 分析(A)。每次实验均计算VEGF或FGF2的mRNA对于|3-肌动蛋白的 比的平均值。对于VEGF(B)或FGF2(C)表示两次实验的平均值。a:相 对于第1组p<0.05。 b:相对于第2组p<0.05。 c:相对于第3组p<0.05。 d:相对于第4组p<0.05。 e:相对于第1组p<0.01。 f:相对于第2组 p<0.01。 g:相对于第3组p<0.01。 h:相对于第4组p<0.01 。图8表示肠系膜的VEGF、 FGF2、 vWF、 AGE、 TGF卩1的免疫组织 化学检测。对照大鼠的腹膜中，无法视觉上检测出VEGF(A)、 FGF2 (B)、 vWF(C)、 AGE(D)、 TGF-卩1 (D)的染色，尿毒症大鼠中微量存在这些生 物学标志，而进行了 PD处理的尿毒症大鼠中则显著。与此相对，在给 予了吡。多胺的大鼠肠系膜的毛细血管中，仅检测出微量染色。倍率x400。
权利要求
1. 腹膜保护剂，其含有吡哆素类或其盐作为有效成分。
2. 权利要求l的腹膜保护剂，其中，吡哆素类是吡哆胺。
3. 权利要求1或2的腹膜保护剂，该腹膜保护剂应用于治疗和/或 预防腹膜透析患者中的腹膜功能衰竭或超滤衰竭。
全文摘要
本发明的目的在于提供可有效抑制长期腹膜透析(PD)患者等中的腹膜功能低下的新型腹膜保护剂。本发明可提供含有吡哆素类或其盐作为有效成分的腹膜保护剂。
文档编号A61K31/44GK101227904SQ200680027050
公开日2008年7月23日 申请日期2006年5月23日 优先权日2005年5月24日
发明者宫田敏男, 角田隆俊 申请人:学校法人东海大学