基于使用纤连蛋白eda结构域的试剂和方法

专利名称：基于使用纤连蛋白eda结构域的试剂和方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质栽体，其用于分子转运到表达TLR4受体(Toll 样受体4)的细胞，所迷蛋白质栽体的制备和它的应用，尤其涉及药物 组合物，尤其免疫治疗组合物的制备和用途，用于治疗和预防传染病和 肿瘤疾病。
背景技术：
病原体和癌症仍然是全世界死亡的主要原因。开发用于预防当前还 不存在其疫苗的疾病如AIDS或者疟疾的疫苗，或者治疗慢性感染或癌 症，以及提高现有疫苗的功效和安全性仍然是优先的。在大多数情况下， 此类疫苗的开发需要能够特异刺激CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的策略。通过与MHC I类分子结合的短肽被呈递给T细胞受体(TCRs)而激 活CTL。这些肽-MHC I类复合体存在于抗原呈递细胞(APC)的表面， 所述APC也能够提供最佳的CTL活化所需的共刺激信号。树突细胞(DC)是最有效的APC，其具有与幼稚T淋巴细胞相互 作用并起始初次免疫反应的独特能力，从而激活辅助CD4+和细胞毒性 CD8+ T淋巴纟田胞。Guermo叩rez等人("Antigen presentation and T cell stimulation by DC". /J "w.尺ev. /www o/. 2002， 20:62l-627)综迷了 DC的 抗原呈递和T细胞刺激，将该文献包括在本文中作为参考。不存在正在进行的炎症和免疫应答时，树突细胞通过血液、外周组 织、淋巴和次级淋巴器官巡逻。在外周组织中，树突细胞吸收自身和非 自身抗原。然后被内化的抗原被加工成蛋白水解肽，并且这些肽被装栽 到I和II类MHC分子上(分别对于CD8+或CD4+T淋巴细胞活化)。 该抗原摄入、降解和装栽的过程称作抗原呈递。然而，不存在刺激时， 外周树突细胞相当低效地呈递抗原。来自病原体的外源信号或者内源信 号诱导树突细胞进入发育程序，称作成熟，其将树突细胞转化成APC 和T淋巴细胞活化剂。细菌和病毒产物，以及炎性细胞因子和其他自身 分子通过与固有的树突细胞表面受体直接相互作用诱导树突细胞成熟。T淋巴细胞，通过CD40依赖性和非依赖性的途径，和内皮细胞通过直 接的细胞-细胞接触有助于树突细胞的最终成熟和细胞因子分泌。遇到 危险信号后不久，抗原摄入的效率、细胞内运输和降解和MHC分子的 细胞内运输受到修饰。肽装栽以及半泉期和向MHC分子的细胞表面的 递送增加。T细胞共剌激分子的表面表达也增加。从而，树突细胞变成 最有效的APC，且是唯一能够激活幼稚T淋巴细胞和起始适应性免疫应 答的细胞。与它们的抗原呈递能力的修饰相伴随的是，成熟还诱导树突 细胞大规模迁移出外周组织。趋化因子受体以及粘附分子的修饰以及细树突细胞成熟的诱导树突细胞应答两种类型的信号病原体的直接识别(通过特定模式 识别受体)和感染的间接感知(通过炎性细胞因子、内部细胞化合物和 正在进行中的特异免疫应答)。应答这些信号，树突细胞被激活并且进 入成熟程序，其将树突细胞转化成有效的T细胞刺激物。已经报道至少 5种类型的表面受体触发树突细胞成熟(i)Toll样受体(TLR) , (ii) 细胞因子受体，(iii) TNF-受体(TNF-R)家族分子，(iv)FcR,和(v) 细胞死亡的传感物。 一些最有效的成熟刺激由TLR(TLRl-9)与它们各自 的配体相互作用介导。Kaisho和Akira综迷了关于Toll样受体的知识 ("Toll-like receptors as adjuvant receptors". 5,'oc/zz>mca " S,o/ / 少wc"爿"a， 2002， 1589: 1-13)。 TLR在巨噬细胞和树突细胞以及其他细胞如B'淋巴 细胞上表达。也已经鉴定了几种TLR的配体。这些配体大多数来自病原 体，但是在宿主中没有发现，从而提示TLR对于感知侵入的微生物是关 键的。TLR的配体识别通过诱导促炎细胞因子的产生和共刺激分子的上 调引起先天免疫的快速活化。激活的先天免疫随后导致有效的适应性免 疫。关于TLR4，特异识别的分子模式是LPS(革兰氏阴性细菌)、脂磷壁 酸质(革兰氏阳性细菌)、紫杉醇、F蛋白(呼吸道合胞病毒)、热激蛋 白60和纤连蛋白EDA结构域。因此，能够诱导最佳的T细胞应答的候选疫苗必须满足几种条件。 首先，它必须靶定APC以将抗原来源的T细胞表位递送到MHC I和/ 或II类分子。从而，靶定DC可以代表设计用于疫苗开发的新递送系统 中的主要目标。此外，栽体必须递送合适的信号到DC以诱导它们的活化。无成熟信号的抗原向DC递送可以诱导T辅助细胞和细胞毒性细胞 的耐受而不是活化。此外，它的效率必须不受预先存在的针对栽体自身 的免疫的影响。将抗原肽递送到MHC I和/或II类分子的第一种方法是基于合成肽 疫苗，其含有所选的表位，所述表位能够直接结合到APC表面上的这 些分子。在一些情况下，这些肽已经导致鼠模型中的肿瘤保护或者病毒 清除，而在其他情况中，它们已经导致耐受诱导。用不同类型的肽进行 的人试验引起对癌症的适度的临床反应。多种不同的策略当前处于开发中。基本上，可以将它们分成两类。 第一类是基于抗原的APC合成或者它被主动递送到这些细胞的细胞质 和利用"经典的"MHC I抗原加工途径。第二类利用APC的交叉呈递能力 并且基于游离的或者细胞结合的外源抗原。已经依靠细菌毒素进行了抗 原向APC的细胞质的递送(Mor6n等人，"New tools for antigen delivery to the MHC class I pathway".丽ms /" /画画/ogy, 2004; 25: 92-97)。作 为实例，EPU88446A1涉及基于百日咳博德特氏菌(SoWe"〃a pertussis ) 腺苷酸环化酶毒素的蛋白质栽体，用于分子递送到CDllb表达细胞。本发明涉及纤连蛋白额外结构域A(EDA)——TLR4的可能的天然 配体——作为抗原递送到TLR4表达细胞的理论手段，其可以诱导APC 的合适的选择和成熟，并最终导致有效的特异的CTL应答。纤连蛋白分 子是信号基因的产物，并且所得蛋白质可以以多种形式存在，所述多种 形式由信号前-mRNA的可变剪接引起(Pankov R和Kenneth MY, "Fibronectin at a glance". Jow"a/ o/Ce〃 Sde"ce, 2002; 1 15:3861-3863)。 在1U型重复的中心组内发生主要类型的剪接。外显子使用或者跳跃导 致包括或者排除两种III型重复之一额外结构域B(也称作EDB,EIIIB 或EDII),和额外结构域A (也称作EDA， EIIIA或EDI)。应答组织损伤 产生细胞纤连蛋白，其含有可变剪接的EDA和EDB。在其他生物学功 能中，已经表明EDA诱导蛋白聚糖释放，和金属蛋白酶(MMP 1、 3和 9)和促炎细胞因子的表达(综述见Saito S等人，"The Fibronectin Extradomain A activates matrix metalloproteinase gene expression by an interleukin-1-dependent mechanism", J. 肠/. CTz昆 1999; 161:3071-3076)。也已经描迷EDA能够活化TLR4，从而诱导LPS样应答(Okanuim Y等人,"The extra domain A of fibronectin activates Toll-like receptor 4",J. 5/o/. CT ew. 2001; 276:10229-10233)。
如以前指出的，用于加强对抗原的免疫应答的策略的开发打开了开 发用于治疗癌症或传染病的疫苗之门。具体地，在丙型肝炎病毒感染中， 已经描迷免疫应答在感染的清除中起基本的作用，因此免疫加强 (immunostrengthening )策略的使用組成了治疗和预防该感染的备选方 案。
丙型肝炎病毒(HCV)是单链RNA病毒，其属于黄病毒科(Flaviviridae) (Miller RH.和Purcell RH. 1990. PNAS. 87:2057)。已经认识到该病毒是 慢性肝炎和肝疾病的主要病原体之一并且估计它在全世界影响1亿7千 万人(世界卫生组织(World-Health-Organization). Hepatitis C. Wkly Epidemiol Rec 1997; 72:65)。 HCV感染的一个主要特征是它高度倾向于 慢性(70%的感染)和发展肝硬化(20% ),具有发展肝癌的高风险 (Dienstag等人，Gastroenterology 1983; 85:439)。用IFN-a治疗是HCV 感染的最常见疗法，但是它仅仅在20-30%的所治疗的患者中有效 (Camps等人，J Hepatol 1993; 17:390)。 IFN-a和病毒唑的组合改善了这 些结果(30-40%的患者以持续方式清除了该病毒)，但是仍然有高百分 比的患者抗治疗(Poynard等人，Lancet 1998; 352:1426)。从而，开发用 于治疗慢性丙型肝炎的新的治疗策略是尤其重要的。
HCV基因组是9.6kb，它在大的可读框側翼的5，和3，端含有高度保 守的非编码区，所迷可读框编码3种结构蛋白(核心、E1和E2)和至 少6种非结构蛋白(NS2、 NS3、 NS4a、 NS5a和NS5b) (Major, ME和 Feinstone SM. (1997) Hepatology 25， 1527)。
HCV的急性感染后或者用IFN-a治疗后的病毒清除与存在对病毒蛋 白质的强烈的细胞CD4和CD8免疫应答有关。具体地，对HCV非结构 NS3蛋白质的CD4应答与急性感染后的病毒清除有关，而该T细胞应 答的不存在涉及病毒持久性和慢性感染的确立(Diepolder等人，Lancet 1995; 346:1006, Pape等人J Viral Hepat 1999; 6 S叩pl 1:26-40)。而且, 许多研究已经鉴定了 HCV感染的患者中NS3蛋白质内的多种细胞毒性 表位。这些数据表明NS3蛋白质可以是诱导抗HCV细胞应答的好的靶。
发明详迷
一方面，本发明涉及包含对应于-纤连蛋白EDA结构域(EDA),或
-所迷EDA结构域的能够结合TLR4的片段，或者
-所迷EDA结构域或者片段的变体，其能够结合TLR4并且与任何EDA
结构域天然形式或者片段有70 %以上的同源性，
^:本发明中，该试剂包括纤连蛋白的EDA结构域和需要对其产生 免疫应答的抗原，这些组分作为单独的实体或者共价结合存在。
在本发明的具体实现中，所述c)项中引用的能够结合TLR4的EDA 结构域或者片段的变体的特征是它的氨基酸序列通过a)和b)项中定义 的多肽中一个或多个氨基酸的替代、添加或者缺失得到。
在本发明的优选的实现中，所述c)项的能够结合的片段的特征是它 与EDA结构域的任何天然形式或者其对应的片段具有超过85%程度的 同源性，并且在更优选的实现中，它与所述纤连蛋白EDA结构域的天 然形式或其对应的片段有超过95 %程度的同源性。
根据本发明，在具体实现中，纤连蛋白EDA结构域的氨基酸序列 是能够结合TLR4的任何天然形式的EDA的氨基酸序列。该EDA结构 域可以选自任何动物物种，尤其哺乳动物，即，啮齿类动物(小鼠、大 鼠等等)或者灵长类动物(尤其人)中的天然形式的结构域。
在另一具体实现中，免疫刺激剂包含EDA结构域的部分氨基酸序 列，其特征是它能够结合TLR4。
在本发明的再一个具体实现中，EDA结构域是任一所述EDA结构 域天然形式或者片段的经修饰的变体，并且特征也是它保留结合TLR4 的性质。在具体实施方案中，这种变体EDA结构域与任一EDA结构域 天然形式有70%以上的同源性。通过首先将纤连蛋白EDA结构域天然 形式或者其片段的序列与其他候选多肽序列相比较，可以选择合适的经 修饰变体。可以使用任何比对算法(即，FASTA, Lip歸n DJ, Pearson WR. Rapid and sensitive protein similarity searches, Science. 1985 Mar 22;227(4693):1435-41)或者计算机软件(即，来自Ubvelocity Inc.的 Jellifish或者来自NCBI的Blast软件)进行同源性分析。然后，对具有 70%以上同源性的候选多肽序列测试它们的TLR4结合能力。通过任何 常规的结合测定，例如，通过使用如John Wiley & Sons (编者John E, Coligan, Ada M Kruisbeek， David H. Margulies， Ethan M. Shevach，Warren Strober)(定期更新.更新直到2005年5月1日)出版的The
Current Protocols in Immunology和The current protocols in Protein
Science中描述的流式细胞术，评估TLR4结合性质。
在本发明的一个实施方案中，EDA结构域包含选自下面的序列 a )小鼠EDA结构域的全部氨基酸序列(Entrez Protein: NM—010233,
氨基酸1721到1810; SEQ. ID. NO: 2，氨基酸2-91);
b )人EDA结构域的全部氨基酸序列(Entrez Protein NM—002026,氨
基酸1631到1716; SEQ. ID. NO: 4);和
c)序歹寸a)和b)的能够结合表达TLR4的细胞的片段。 在另一具体实现中，所述EDA结构域包含选自下面的序列
a) SEQ. ID. NO:6的氨基酸2-57，其对应于小鼠纤连蛋白EDA结 构域的可变剪接形式；
b) SEQ. ID, NO: 8，其是人EDA结构域的可变剪接形式；和
c) 序列a)和b)的能够结合表达TLR4的细胞的片段。 在一些实施方案中，免疫刺激剂可以还包括一种或多种目的分子。
当存在于免疫刺激剂中时，目的分子可以以与所迷试刑的其他成分组合 有效产生针对所述分子的免疫应答的量施用。
在优选实现中，EDA结构域(或者其片段或变体)和目的分子在相 同的杂种分子或者蛋白质栽体中连接在一起。
在另一方面，本发明涉及如上述的蛋白质栽体，其中所述目的分子 选自多肽、脂肽、寡糖、多糖、核酸、脂质和化学药品。
在蛋白质栽体的具体实现中，所述目的分子是抗原或者表位。在本 发明的一个实施方案中，偶联到栽体的抗原是病毒抗原、细菌抗原、真 菌抗原或者寄生物抗原。在具体实现中，所述病毒抗原是来自丙型肝炎 病毒的病毒抗原，且在优选实现中，所述丙型肝炎病毒抗原是NSS蛋白 或者其抗原片段。NS3蛋白指丙型肝炎病毒非结构NS3蛋白，其是67kDa 蛋白质，包括两个结构域包含从N末端起189个氨基酸的丝氨酸蛋白 酶，和包含从C末端起442个氨基酸的解旋酶-核苷三磷酸酯酶。在本 发明的蛋白质栽体中包括的NS3蛋白质序列可以对应于人丙型肝炎病 毒的任何毒林或者分离物。
在另一实施方案中，所述抗原是肿瘤抗原或者肿瘤抗原决定簇。如 本文所用的，"表位"指结合MHC I类或者II类分子并且可以分别被CD8+或CD4+ T细胞的T细胞受体分子识别并且诱导免疫应答的肽序列。
在具体实现中，所迷目的分子是来自卵清蛋白的抗原性细胞毒性T 决定簇(OVA 257-264)或SIINFEKL(SEQ. ID. NO: 2,氨基酸95-102,其 侧翼是表位C-末端和N-末端的3个额外氨基酸，QLE-SIINFEKL-TEW)。
所述抗原可以是能够产生Th免疫应答、CD8+T淋巴细胞应答、NK 细胞应答、Y/ST淋巴细胞应答或者抗体应答的任何材料。合适的抗原包 括，但不局限于肽、多肽、脂质、糖脂、多糖、糖类、多核苷酸、朊病 毒、细菌、病毒或者活的或者灭活的真菌；和来自细菌、病毒、真菌、 原生动物、肿瘤或者微生物、毒素或者类毒素的抗原。
在蛋白质栽体的另一具体实现中，所述目的分子是变应原。
这样，EDA结构域还作为抗原递送到表达TLR4的细胞的栽体起作用。
在本发明的另一尤其重要的实现中，所述目的分子是化学或者遗传 偶联到蛋白质栽体的化学药品或者药物。这样，所述蛋白质栽体可用于 靶定表达TLR4的细胞的特定药物。
在具体实现中，所述蛋白质栽体的特征还在于它还包含标记序列， 如N-末端组氨酸尾。当依靠基因工程方法生产蛋白质栽体时，这将简化 純化方法。作为实例，序列SEQ. ID. NO: 2和SEQ. ID. NO: 6代表本发 明的蛋白质载体的特定实现。在本发明具体的非限制性实现中，蛋白质 栽体包含序列SEQIDNO: 10，其包含NS3蛋白质的片段。
掺入蛋白质栽体中的EDA结枸域的特征是它结合TLR4并且进一 步促进目的分子运输到表达TLR4的细胞的胞质溶胶中。
的用途。在具体实现中，、表达T ;4的细胞是任何类型的抗原呈递细胞 (APC)。在优选实施方案中，此类APC是树突细胞。
在本发明的具体实现中，蛋白质载体的特征是它促进目的抗原或表 位的运输，从而进一步促成加工和装栽到MHC分子上用于抗原呈递到 T淋巴细胞。
在另一实现中，蛋白质栽体的特征是它能够刺激被靶定的APC的 成熟，从而增加MHC分子和共刺激信号的表达。在尤其有利的实施方 案中，蛋白质栽体的特征是它能够同时诱导抗原呈递和促进APC成熟，从而诱导有效的抗原特异性免疫应答。在更优选的实施方案中，该抗原
特异性免疫应答是CTL应答。
通过重组DNA技术可以得到本发明的蛋白质栽体。从而，在另一 方面，本发明涉及经修饰的核酸，其编码本发明的蛋白质栽体。该核酸 可以从所述蛋白质栽体的氨基酸序列容易地推导。
该经修饰的核酸可以包含在DNA构建体中。从而，本发明提供了 DNA构建体，其包含编码本发明的蛋白质栽体的核酸。该DNA构建体 可以整合可操作地连接编码本发明的蛋白质栽体的核酸的控制序列。 "可操作地连接"当指核酸时，指将所述核酸置于与另一核酸序列功能关 系中。"控制序列"是特定宿主细胞识别的表达信号，其调节具体编码序 列的功能，如转录和翻译(控制序列的实例是启动子、增强子、转录终 止子、核糖体结合位点、蛋白质分泌或者其他亚细胞定位的信号肽)。 通过在方便的限制位点上连接实现所需序列的连接。如果此类位点不存 在，那么根据常规方法使用合成的寡核苷酸衔接头或者接头。这方面的 优点通过如下事实代表该DNA构建体还包含编码基序或者表型的标 记或者基因，所述基序或者表型允许选择依靠DNA构建体转化的宿主 细胞。本发明提供的经修饰的核酸和DNA构建体可以依靠许多实验室 手册中概述的公知的常规方法得到(例如，"Molecular Cloning: a Laboratory manual." Joseph Sambrook, David W. Russel Eds. 2001， 3rd ed. Cold Spring Harbor, New York)。
在具体实现中，本发明提供的经修饰的核酸或者DNA构建体包含 SEQ. ID, NO: 1 、 SEQ ID. NO: 5、 SEQ ID NO: 9 (EDA-NS3)或SEQ ID NO: 11 (EDA-OVA)。
可以将本发明提供的经修饰的核酸或者DNA构建体插入合适的栽 体中。从而，在另一方面，本发明涉及栽体，如表达栽体，其包含所提 到的经修饰的核酸或者DNA构建体。栽体的选择将取决于该栽体将插 入的宿主细胞。例如，核酸插入的栽体可以是质粒或者病毒，其当插入 到细胞中时，可以整合或不整合到细胞基因组中。可以通过常规方法得 到载体(Sambrook等人，2001,如上引用)。
在另一方面，本发明涉及宿主细胞，如转化的宿主细胞，其包含本 发明提供的经修饰的核酸或者DNA构建体。根据本发明，表达宿主细 胞是原核生物，即大肠杆菌(Ew/^n'c/H" co//),或者真核宿主，即酵母(例如，啤酒糖酵母(S"C(^"raW少CM ce"v/i7'"g )、 巴斯德毕赤氏酵 母(尸/c/na尸"Won's ))、昆虫细胞或者哺乳动物细胞。
在本发明的另一具体实现中，包含编码本发明的蛋白质栽体的经修 饰的核酸或者DNA构建体的表达栽体意在用于体内基因转移或者疗法。 在更具体实施方案中，所述表达栽体是病毒栽体。为此目的的合适的病 毒栽体包括腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒、慢病毒、曱病毒、疱 疹病毒、冠状病毒衍生的栽体，等等。
在另一方面，本发明涉及产生本发明的蛋白质栽体的方法，其包括 在允许表达所述蛋白质栽体的条件下培养含有本发明的经修饰的核酸 或者DNA构建体的宿主细胞。最优化宿主细胞的培养的条件将取决于 使用的宿主细胞的类型。如果需要，那么用于产生本发明的蛋白质栽体 的方法包括分离和纯化所述栽体。
备选地，通过其他常规方法可以得到本发明的蛋白质栽体。此类方 法包括，例如，固相化学合成、用高效液相层析(HPLC)纯化，和如 果优选，通过常规技术分析，如测序或者质语分析法、氨基酸分析、磁 共振技术，等等。
在另一实现中，可以如下得到本发明的蛋白质栽体将具有对应于 纤连蛋白EDA结构域(EDA),或者所述EDA结构域的能够结合TLR4 的片段，或者所述EDA结构域的变体的氨基酸序列的多肽与目的分子 (例如，多肽、脂肽、寡糖、多糖、核酸、脂质或者其他化学药品)共 价连接。这可以使用实验室手册中概迷的常规方法进行，所述实验室手 册诸如John Wiley & Sons出版的〃The current protocols in protein chemistry〃(定期更新。更新直到2005年5月1日)或者"Immobilized affinity ligand Techniques", GT Hermanson, AK Mallia和PK Smith, Academic Press, Inc. San Diego, CA， 1992。
随后，根据本发明，所迷蛋白质载体、或者编码其的经修饰的核酸 和DNA构建体，或者整合所迷核酸或者DNA构建体的表达栽体和表达 宿主细胞可以用于制备药物组合物。
在另一实施方案中，本发明涉及如前迷的具有对应于纤连蛋白EDA 结构域(EDA)或者其片段或变体的氨基酸序列的多肽在制备免疫刺激 剂中的用途，其特征是所述免疫刺激剂是药物组合物。
在某些实施方案中，本发明的药物组合物可以用于刺激抗原呈递细胞的成熟，或者诱导对目的分子特异的有效免疫应答。在具体实施方案 中，所述药物组合物可以用于诱导所迷免疫刺激组合物所施用的受试者
中的Thl免疫应答。如本文所用的，"诱导Thl免疫应答"可以包括其中 免疫刺激组合物诱导混合的Thl/Th2应答的情况。然而，在其他情况中， 免疫刺激组合物可以诱导Thl免疫应答，并且有很小的或者基本上不诱 导Th2免疫应答。在具体实现中，所述药物组合物可以用于诱导CTL应答。
在一些实施方案中，免疫刺激组合物可以用作免疫刺激佐剂，例如， 与一种或多种抗原组合，具有或没有额外的佐剂。从而，在一些情况中， 所述免疫刺激组合物可以形成疫苗。在其他情况中，所述免疫刺激组合 物可以用作佐剂，其可以连同疫苗使用。
包括所述包含纤连蛋白EDA结构域(或者其片段或变体)的多肽 的免疫刺激组合物可以增强经活化的CD8+ T淋巴细胞的扩充，产生记 忆CD8+丁细胞，或者两者。从而，本发明的免疫刺激组合物可以在接 受该免疫刺激组合物的受试者中增强抗原特异性细胞介导的免疫。
在具体实现中，包含纤连蛋白EDA结构域(或者其片段或变体) 的免疫刺激组合物用于治疗和预防传染病、肿瘤疾病或者变应性疾病。 在本发明的具体实施方案中，所述组合物用于治疗和预防丙型肝炎。
包含纤连蛋白EDA结构域(或者其片段或变体)的免疫刺激组合 物可以额外含有栽体、赋形剂和其他已知的药学上可接受的成分。
方法(例如，经口、皮下、经鼻、局部)施用于动物，例如，哺乳动物 (人或者非人)、家禽等等。
本发明还提供了治疗和/或预防方法，其包括对受试者施用包含纤连 蛋白EDA结构域(或者其片段或变体)的免疫刺激组合物。
合适的施用途径包括经皮或者跨粘膜吸收、注射(例如，皮下、腹 膜内、肌内、静脉内，等等)、摄食、吸入，等等。
在另一方面，本发明涉及药物組合物，其包括至少一种可接受的药 物栽体和有效量的处于至少一种表达形式或实施方案中的蛋白质栽体
a) 多肽形式的蛋白质载体；
b) 编码所述蛋白质栽体的经修饰的核酸；
c) 包含所迷经修饰的核酸的表达栽体；或者d)也包含所迷经修饰的核酸的表达宿主细胞。
在另一具体实现中，所迷药物组合物的特征是它包含有效量的树突 细胞，其中所述树突细胞已经在体外与处于至少一种表达形式或实施方 案中的蛋白质栽体温育。在更具体的实施方案中，所迷药物组合物是疫 苗或者免疫治疗组合物。
而且，在本发明提供了蛋白质栽体的一些额外用途。在本发明的一 个实施方案中，处于其任一表达形式的蛋白质栽体用于制备药物组合 物，该药物组合物在体外或体内有效诱导树突细胞成熟。
在另一实施方案中，所述蛋白质栽体用于制备药物组合物，所述药 物组合物用于诱导特异针对偶联到所述蛋白质栽体的目的分子(抗原或 表位)的特异免疫应答。该免疫应答是体液免疫应答(针对目的分子的 抗体产生)、丁辅助细胞应答，或者细胞毒性T细胞应答。在优选实施 方案中，所述免疫应答是CTL应答。
在更具体的实现中，本发明涉及所迷蛋白质栽体在制备用于治疗和 预防传染病的药物组合物中的用途。所述传染病可以是细菌、病毒、真 菌或者寄生物的传染病。
在另一具体实现中，本发明涉及所述蛋白质栽体在制备用于治疗和 预防肿瘤疾病的药物组合物中的用途。
在再一个具体实现中，本发明涉及所迷蛋白质栽体在制备用于治疗
和预防变应性疾病的药物组合物中的用途。许多变应性疾病涉及Th2免 疫应答的活化。从而，通过使用携带特定变应原的蛋白质栽体使从Th2 背离或者转换为Thl应答可能对变应性疾病具有保护性或者治疗效果。 根据本发明的具体实施方案，所提出的药物组合物用于施用于动物 或者人宿主。可以使用任一合适的施用途径。在具体实现中，通过肠胃 外途径(即，静脉内、皮下、肌内)、经皮途径或者粘膜途径施用所迷 药物組合物。
附图简述


图1.所产生和纯化的EDA和EDA-SIINFEKL蛋白质的SDS-PAGE 分析。将一等分试样的EDA和EDA-SIINFEKL蛋白质装栽到15%聚丙 烯酰胺凝胶上并进行电泳。分子量标记(MWM)以KDa表示。观察到 对应于EDA和EDA-SIINFEKL蛋白质的推定分子量(13-14 KDa)的带。图2.蛋白质栽体EDA-SIINFEKL与TLR4的结合。2A.直接结合 测定。将HEK293-LacZ细胞(HEK293-LacZ)和HEK293-TLR4/MD2/CD14 (HEK293-TLR4)细胞用1pM EDA画SIINFEKL脉沖,用低聚甲醛固定，用 抗-His和抗-EDA抗体标记，并用抗小鼠IgG-FITC显色且通过流式细 胞术分析。2B. EDA抑制抗-TLR4抗体与TLR4表达性细胞结合的能力。 将HEK-TLR4细胞在500 nM EDA-SIINFEKL蛋白质存在或不存在下在 4。C温育2小时。洗涤细胞并与抗TLR4抗体温育，用FITC染色并通过 流式细胞术分析。2C.依靠使用不同浓度的EDA-SIINFEKL蛋白质对抗 TLR4抗体与TLR4表达性细胞结合的抑制百分比。2D,细胞粘附测定。 将用氖标记的timidine染色的HEK-hTLR4或HEK-LacZ细胞分散在以 前用EDA蛋白质包被的96孔微量培养板的孔中并在37。C下温育2小 时。除去非贴壁的细胞，而收获贴壁的细胞并在Topcount闪烁计数器中 测量掺入的放射性。借助标准曲线计算每孔贴壁细胞数。
图3. EDA-SIINFEKL激活TLR4信号传导途径。比色法测量用该 报道基因转染的HEK293/TLR4-MD2-CD14或HEK293/LacZ表达细胞的 培养上清液中人分泌的胚胎碱性磷酸酶基因，所迷报道基因的表达受到 NF-kb-诱导型ELAM-1启动子控制。转染后24小时，在不同浓度的LPS、 100 nM EDA-SIINFEKL蛋白(EDA)或事先用蛋白酶K消化的100 nM EDA-SIINFEKL蛋白质存在或不存在下温育细胞。条表示NF-kB倍数诱 导(用来自HEK293/TLR4-MD2-CD14的上清液得到的OD除以用来自 HEK293/LacZ的上清液得到的OD )。
图4. EDA-SIINFEKL诱导体外DC的促炎细胞因子分泌。将骨髄来 源的DC在LPS (1 pg/ml)、 EDA-SIINFEKL (500 nM)、蛋白酶K消化的 EDA-SIINFEKL (500 nM)或者盐水溶液存在下培养。24小时后，通过 ELISA测量培养上清液中IL-12 (A)和TNF-a(B)的存在。
图5. EDA-SIINFEKL诱导体内CDlleDC成熟。树突细胞的成熟是 T细胞应答的最佳刺激所必需的。当发生成熟时，APC增加表面分子如 I类(我们的模型中H2K"和II类MHC (我们的模型中IAb) 、 CD40、 CD80和CD86分子的表达。因此，我们分析EDA-SIINFEKL是否将在 体内诱导CDllc表达性细胞的成熟。将C57BL/6 wt小鼠用25 EDA-SIINFEKL、用蛋白酶K消化的25 EDA-SIINFEKL、 25 LPS 或者仅仅PBS静脉内(i.v.)免疫。同样，将C57BL/6 TLR4 KO小鼠用25EDA-SIINFEKL或者仅仅用PBS免疫。15小时后，处死小鼠并通过 autoMACS纯化CD1 lc细胞。将细胞标记并通过流式细胞术分析H-2Kb、 I-Ab、 CD40、 CD80和CD86分子的表达。
图6: EDA-SIINFEKL被树突细胞有效呈递到对SIINFEKL表位特异 的T细胞。我们表征了 EDA-SIINFEKL被APC捕获以将经加工的CTL 表位SHNFEKL呈递给来自0T-1转基因小鼠的对该表位特异的T细胞 的能力。(A)来自0T-1转基因小鼠的非贴壁细胞的IFN-y产生。在仅 仅培养基、不同浓度的合成SIINFEKL肽、SIINFEKL和EDA、 EDA-SIINFEKL (融合蛋白)或者仅仅EDA的存在下培养骨髄来源的 DC。 24小时后，收获DC并用作105非贴壁0T-1细胞存在下的APC。 再过24小时后，回收上清液并测量分泌的1FN-y。(B) TLR4分子依赖性。 在来自C57BL/6 wt小鼠的脾细胞存在下或者与TLR4分子(l()S细胞/孔) 敲除小鼠的脾细胞一起和EDA-SIINFEKL蛋白质(IOO nM)温育B3Z杂交 瘤细胞(105细胞/孔)。(C)将来自C57BL76wt小鼠脾的细胞与B3Z杂 交瘤细胞和EDA-SIINFEKL蛋白质在存在或不存在抗TLR4抗体下共培 养。(B和C)通过基于使用CTLL细胞系的生物测定测量分泌到培养 上清液的IL-2的量。(D)氯喹、莫能菌素(monensine)、布雷菲德菌素 (brefeldine)或者环己酰亚胺对融合蛋白EDA-SIINFEKL的抗原呈递的作 用。在不存在或存在30mM氯喹、布雷菲德菌素、莫能菌素或4pg/ml 环己酰亚胺下，温育骨髓来源的树突细胞1小时，然后加入 EDA-SIINFEKL或合成肽SIINFEKL(白色条)。培养10小时后，将所述 DC在戊二醛中固定，并用作与非贴壁0T-1小鼠细胞(105个细胞/孔)的 共培养物中的抗原呈递细胞(APC) (104个细胞/孔)。24小时后，通过商 业ELISA测量分泌的IFN-y的量。
为了研究APC上的TLR4表达是否可以促成呈递过程，我们在来自 C57BL/6 wt小鼠或者来自TLR4 KO小鼠的脾细胞和不同浓度的 EDA-SIINFEKL (nM)存在下培养B3Z杂交瘤细胞(对SIINFEKL表位特 异)。通过基于CTLL的生物测定测量释放到培养上清液中的IL-2的量 (图6E)。
图7.用EDA-SIINFEKL免疫小鼠诱导对SIINFEKL表位特异的细胞 应答。前面的结果证明EDA-SIINFEKL重组蛋白质是生物活性的并且特 异性活化APC。在体内特异的T细胞免疫应答的诱导对于疫苗的开发是关键的。从而，我们测试了用EDA-SIINFEKL融合蛋白免疫的小鼠是否 发展了针对该表位的特异细胞应答。(A)产生IFN-y的细胞的诱导。在 第0和10天，将C57BL/6小鼠用1.5nmolEDA-SIINFEKL或用1.5画l SIINFEKL肽免疫。在第20天，在SIINFEKL存在或不存在下将脾细胞 温育48小时，并通过ELISA测量分泌的IFN-y的量。(B) SIINFEKL-特 异性CTL应答分析的诱导。在SIINFEKL肽存在下5天期间再次刺激来 自用EDA-SIINFEKL或用SIINFEKL免疫的小鼠的脾细胞。该温育后， 在SIINFEKL肽不存在或存在下，通过常规铬51释放测定测量针对EL-4 靶细胞的CTL活性。数据表示来自 一式三份样品的净特异裂解值的平均 百分比(用SIINFEKL脉沖的靶细胞的％裂解减去非脉沖的靶细胞的％ 裂解)》
图8. EDA-SIINFEKL保护免于EG7 OVA表达性细胞的肿瘤攻击。 为了研究EDA-SIINFEKL融合蛋白保护小鼠抗EG70VA肿瘤细胞注射 的能力，在第0和IO天用3nmolEDA-SIINFEKL、 SIINFEKL或者用盐 水溶液皮下(s.c.)免疫小鼠。第二次免疫后20天，用105个EG70VA 细胞皮下攻击小鼠。用卡尺监控肿瘤生长并使用式V = (Lx w2)/2以立方 毫米表达，其中L为长度，w为宽度。当肿瘤大小达到大于8 cn^的体 积时处死小鼠。
图9, EDA作为用OVA蛋白免疫后诱导细胞毒性应答中的佐剂。存 在这样的可能性如果EDA能够在体内促进树突细胞成熟，那么它可 以作为用含有细胞毒性表位的蛋白质免疫后的佐剂，但是不能自身激活 细胞毒性应答。为了测试该可能性，我们用50 pg EDA与500 pg OVA 蛋白质(A)免疫一组小鼠，并用500 pgOVA(B)免疫另一组小鼠，不使用 任何其他类型的佐剂。免疫后一周，处死小鼠并在SIINFEKL合成肽存 在下培养脾细胞。培养5天后，在常规Cr"释放测定中，测量对用 SIINFEKL肽脉沖的EL-4靶细胞的细胞毒性应答。
图10. EDA可以作为更大抗原的栽体。在以前的实验中，已经证明
CTL应答的 秀导。在以后的步骤中，我们想研究EDA是否能够转运更 大的抗原和促进诱导针对所述抗原的细胞应答。为此目的，我们构建了 融合蛋白EDA-OVA并在体外和体内进行下面的实验。(A)重组 EDA-OVA蛋白的SDS-PAGE分析。在大肠杆菌中表达重组蛋白EDA-OVA,通过亲和层析純化，脱盐，解毒，浓缩并通过SDS-PAGE 分析。观察到约55kDa的带，其对应于所述蛋白质的推定的分子量。(B) 抗原呈递实验。在OVA、EDA-OVA (融合蛋白)EDA加OVA或仅仅EDA 存在下或不存在下培养骨髓来源的DC。 24小时后，在来自OT-l小鼠 的105非贴壁细胞存在下，将DC用作抗原呈递细胞。通过商业ELISA 定量在DC存在下，来自OT-l小鼠的非贴壁细胞的IFN-y产量。(C) EDA-OVA蛋白在体内诱导OVA特异的CTL。将C57BL/6小鼠用nmol EDA-OVA或用lnmolOVA免疫。免疫后7天，在SIINFEKL肽存在下 5天期间在体外再次刺激来自经免疫的小鼠的脾细胞。之后，在常规Cr51 释放测定中测量针对不存在或存在SIINFEKL时温育的EL-4细胞的特异 CTL活性。数据代表来自一式三份样品的净特异裂解值的平均百分比
(用SIINFEKL脉沖的靶细胞的％裂解减去非脉冲的耙细胞的％裂解)。 图11. EDA-NS3蛋白质产生针对NS3丙型肝炎病毒蛋白质的特异 性CTL应答。已经观察到EDA蛋白质可以作为大抗原的栽体后，分析 了 EDA诱导对丙型肝炎病毒NS3蛋白质(来自NS3蛋白质的蛋白酶区 的氨基酸1 - 196)的抗病毒应答的能力，作为针对所述病毒感染的接种 策略。(A)重组EDA-NS3 (l-196)蛋白质的SDS-PAGE分析。构建了重 组融合蛋白EDA-NS3并在大肠杆菌中表达，并通过SDS-PAGE分析。 (B) EDA-OVA蛋白质在体内诱导OVA特异性CTL。用溶解在盐水溶液 中的100 pg/小鼠EDA-NS3蛋白质通过静脉内途径免疫HHD小鼠
(HLA-A2.1蛋白质转基因的) 免疫后一周，用NS3 1073肽(其含有 来自NS3蛋白质的免疫显性细胞毒性T决定簇用于HLA-A2限制)体外 再次刺激脾细胞。培养5天后，使用常规Cr"释放测定，测量针对与肽 1073(V)(SEQIDNO:20, CVNGVCWTV),或与所述肽的1073(L)变体 (SEQ ID NO: 21, CLNGVCWTV)或者不存在所述肽时温育的T2靶细胞 的细胞毒性活性。(C)EDA-NS3蛋白质诱导针对来自NS3蛋白质的不同 表位的多表位应答。在肽1038-1046、 NS3 1073-1081或NS3 1169-1177
(其含有NS3蛋白质的片段1 - 196内的用于HLA-A2限制的三个细胞 毒性决定簇)的存在下或用重组NS3蛋白质(Mikrogen)体外再次刺激从 用EDA-NS3免疫的小鼠得到的脾细胞48小时。通过商业ELISA测量分 泌到上清液中的IFN-y的量。(D) EDA-NS3蛋白质诱导持久细胞毒性应 答。用溶于盐水溶液中的100ing/小鼠的EDA-NS3蛋白质通过静脉内途径免疫HHD小鼠。免疫后60天，处死小鼠并用常规的铬51释放测定， 用在不存在或存在NS3 1073肽温育的T2靶细胞测量对肽NS3 1073特 异的CTL的存在。(E)与EDA-NS3温育的DC免疫C57BL/6小鼠保护小 鼠，于受表达丙型肝炎病毒蛋白质的重组痘苗病毒vHCV(l-3011)的感 染。将小鼠用以前与EDA-NS3蛋白质温育的1(^个DC免疫，并在7天 后，它们接受通过腹膜内途径的5xl()6个痘苗病毒vHCV(l-3011)攻击。 感染后三天，处死小鼠并依靠BSC-1细胞感染测定，定量病毒负荷/mg 卵巢组织。
实施例
实施例.来自纤连蛋白的额外结构域A与TLR4相互作用并激活TLR4 信号传导途径
1.1材料和方法
1丄1 EDA和EDA-SIINFEKL蛋白质栽体重组蛋白的表达 重组蛋白质栽体的制备
使用特异引物和来自用伴刀豆球蛋白A处理以诱导肝损害的小鼠 得到的RNA，通过RT-PCR扩增纤连蛋白额外结构域(EDA) [Lasarte 等人，Hepatology. 2003; 37(2):461-70.]。将肝組织切片匀浆并在Ultraspec (Biotecx， Houston, TX, USA)中使用Ultraturrax Driver T.25 (J汰nke & Kimkel， Ika-Labortechnik,德国)裂解。根椐Chomczynski和Sacchi的方
/9S7; M2.' /56-/59)分离RNA。在补加了 5mM 二硫苏糖醇(DDT), 0.5mM 脱氧核苷三磷酸(Boehringer Mannheim, Mannheim,德国)，25U核糖核 酸酶抑制剂(Promega Corporation, Madison, WI, USA)和200ng随机六聚 体(Boehringer Mannheim)的20 ^L体积的5xRT緩沖液(250mM Tris-HCl Ph 8.3, 375mM KCl, 15mM MgCl2)中用200U的M-MuLV反转录酶 (Gibco-BRL)反转录RNA (37°C, 60分钟)。加热(95。C， 1分钟)并在冰 上快速冷却后，0.3 cDNA库用于在含有0.08mM dNTP，上游和下游 引物(每种40ng)， 1.5mM MgCl2和2U 7b《DNA聚合酶(Promega Corpomtion)的20 pi lOx緩沖液(lOOmM Tns-HCl pH9.3， 500mM KCl, 1%Triton X-100)中进行PCR扩增。上游引物是(SEQ. ID. NO: 13)
(加下划线的碱基加到引物中以导入限制酶Ndel识别的序列，而斜 体序列对应于EDA的开始)
和下游引物是(SEQ. ID. NO: 14)
5'AGCGGCCGCCCATTCAGTCAgTTTTTCAAAGTTGATTATACTCTCAAGCTGrGrG
(加下划线的碱基加到引物中以导入限制酶Notl识别的序列，粗体 序列对应于编码两端侧翼是三个氨基酸的OVA CTL表位(SIINFEKL) QLESHNFEKLTEV的序列，而斜体序列对应于EDA的结束)。
使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen， Carlsbad, CA， USA)在 pCR2.1-TOPO中克隆PCR扩增的片段。将该质粒用NdeI和NotI消化并 将得到的DNA片段亚克隆到Ndel/Notl消化的质粒pET20b (Novagen)， 其使得能够表达在羧基末端携带六个组氨酸残基(6xHis标记)的融合蛋 白。
将所得的表达融合蛋白EDA-SIINFEKL-6xHis的质粒pET20b2-26 转染到BL21(DE3)细胞中用于表达重组蛋白质栽体。经转染的细胞在1/ LB中在37。C下生长直到OD600达到0.5-1。向培养物中加入IPTG至终 浓度0.4 mM并在室温摇动下温育过夜。通过离心收集细胞，将其重悬 浮在0.1M Tris-HCl pH=7，2中，用溶菌酶处理，并使用弗氏压碎器(20.000 pst下两次通过)破碎，通过离心澄清和过滤。使用FPLC平台(AKTA， Pharmacia),通过亲和层析(Histrap, Pharmacia)純化可溶级分中存在的融 合蛋白。将洗脱的蛋白质用Hitr叩脱盐柱(Pharmacia)脱盐，并用Amicon Ultra 4-5000 MWCO离心过滤装置(M""pore CarrighwahUl,爱尔兰)浓 缩。通过使用Endotrap柱(Profos Ag, Regensburg，德国)从内毒素纯化重 组的蛋白质栽体直到内毒素水平低于0.2EU/ng蛋白质(通过LAL测定 评估，Cambrex)。
为了得到 EDA 蛋白质的表达质粒，使用引物 CCATATG>MC4 rCGCCC7VU/1 GCM(SEQ ID NO: 13)和
似于为EDA-S1INFEKL质粒所描迷的克隆策略进行PCR,从而得到质粒 pET20bEDA1.2。向15°/。 SDS-丙烯酰胺凝胶中的每种样品加入20 蛋白质，接着用考马斯蓝染色。观察到对应于推定的分子量(13kDa)的带。
5"Z^隱57/A7^XiL与7X/^ W潜合。^4'勿/《^和輪餘,/;t。 为了测试重组的EDA-SIINFEKL蛋白质是否能够结合TLR-4表达性 细胞，我们使用表达人TLR4-MD2-CD14 293的HEK293 (来自 Invivogen)。我们还使用用LacZ (Invivogen)转染的HEK293细胞作为阴 性对照。将细胞在4。C用1 mM EDA-SIINFEKL脉沖1小时，用PBS洗 涤并用溶于PBS中的4%低聚甲醛固定IO分钟。3次洗涤后，将细胞用 1/100抗-His抗体(Qiagen)和1/200抗-CD16 (FcBlock，来自Becton Dickinson)标记1小时30分钟。三次洗涂后，将细胞与用焚光素标记的 抗小鼠IgG的1/100稀释液温育30分钟并通过流式细胞术分析。
备选地，测量EDA-SIINFEKL蛋白质抑制FITC染色的抗人TLR4 抗体结合HEK-hTLR4细胞的能力。为此，在不同剂量的EDA-SIINFEKL 存在或不存在下，4°C2小时期间温育HEKTLR4细胞。之后，洗涂细胞 并将其与抗-TLR4抗体温育并通过流式细胞术分析。为不同测定浓度 的EDA-S1INFEKL计算抑制百分比。还进行细胞粘附测定。HEK LacZ 或HEK hTLR4细胞以前用氚标记的胸苷染色并分散在事先用EDA蛋白 质包被的96孔板中。在37。C温育2小时后，取出非贴壁细胞而收获贴 壁细胞并用Topcount闪烁计数器测量掺入的放射性。在使用不同浓度的 染色细胞得到的标准曲线帮助下计算每孔贴壁细胞数。
1丄3. 7YJ^《矛传爭途径的戚活
根据生产商的说明书(Invivogen)，用携带人分泌的胚胎碱性磷酸酶 基因(SEAP)的质粒转染HEK293/hTLR4-MD2-CD14或HEK293/LacZ表 达细胞。通过NF-KB-诱导型ELAM-1启动子(pNiFty-SEAP (Invivogen)) 控制SEAP表达。转染后24小时，在不同浓度的LPS、 100 nM EDA-SIINFEKL蛋白或者事先用蛋白酶K消化的100 nM EDA-SIINFEKL 存在下或不存在下温育细胞。24小时后，通过比色测定(Invivogen)测 量培养上清液中报道基因的表达。在图3中，条代表倍数NF-KB诱导因 子(从来自HEK293/TLR4-MD2-CD14的上清液得到的OD除以从来自 HEK293/LacZ的上清液得到的OD)。该测定中EDA制刑中内毒素污染 物的量低于0.0003 ^tg/ml。1.2结果
1.2.1. EDA和EDA-SIINFEKL重组融合蛋白的表达
重组EDA-SIINFEKL蛋白在大肠杆菌中作为6xHis融合蛋白(SEQ. ID. N0:2)表达，通过亲和层析纯化，脱盐，并从内毒素純化，如方法部 分中描迷的。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹使用抗-his抗体分析所得 的蛋白质(图1 )。观察到每种蛋白质对应于推定的分子量(13 kDa)的带。
1.2.2. EDA-SIINFEKL融合蛋白结合TLR4 已经描迷纤连蛋白额外结构域A激活Toll样受体4(Okamura等人,
JBC, 2001; 276:10229-10233)。然而，没有EDA与TLR4的物理结合的 直接证据。我们首先分析了 EDA-SIINFEKL蛋白质是否能够结合表达 TLR4的细胞。将表达人TLR4-MD2-CD14的HEK293或者用LacZ (Invivogen)转染的HEK293细胞用1 |xM EDA-SIINFEKL蛋白脉冲，用抗 -His抗体和荧光素标记的抗-小鼠IgG标记(见方法)并通过流式细 胞术分析。发现表达人TLR4-MD2-CD14的HEK 293的细胞比表达LacZ 的HEK 293细胞呈现出稍高的荧光强度(图2A )。还测量了 EDA-SIINFEKL蛋白质抑制荧光素染色的抗体结合人TLR4的能力。结 果表明事先与500mM EDA-SIINFEKL蛋白温育HEK-hTLR4细胞抑制了 约50 %的所述抗体结合(图2B )。图2C显示了不同刑量的 EDA-SIINFEKL对所迷抗体结合的抑制作用。另一方面，我们测量了 HEK hTLR4和对照HEK LacZ对照细胞在粘附测定中结合事先用EDA 蛋白质包被的塑料孔的能力。表明HEK hTLR4细胞能够特异结合含有 EDA的孔。所有这些实验都表明EDA和EDA-SIINFEKL蛋白质能够结 合TXR4。
1.2.3. EDA-SIINFEKL融合蛋白激活TLR4信号传导途径 TLR4信号传导导致NF-kb运输，NF-kB是一种转录因子，其结合
多种基因的启动子内的共有元件。为了确定重组EDA-SIINFEKL蛋白质 是否能够激活TLR4,我们使用用质粒转染的HEK293/hTLR4-MD2-CD 14 或HEK293/LacZ细胞，所述质粒携带处于NF《B-诱导型ELAM-1启动 子(pNiFty-SEAP (Invivogen))控制下的人分泌的胚胎碱性磷酸酶基因(SEAP)。 我们发现 EDA-SIINFEKL 蛋白质能够仅在 HEK293/hTLR4-MD2-CDM转染的细胞中刺激SEAP的表达，从而达到 7的倍数NF-kB诱导因子，类似于当细胞与0.01 pg LPS温育时发现的倍 数NF-KB诱导因子(图3)。如果将EDA-SIINFEKL蛋白质事先用蛋白 酶K消化，那么该刺激NF-kb核运输的能力被完全消除(图3),从而 提示TLR4的EDA活化不能通过重组蛋白质制刑中潜在的LPS污染来
我们构建了重组质粒pET20b2-26 ,其允许重组融合蛋白 EDA-SIINFEKL 6xHis在大肠杆菌中的表达。6组氨酸的存在促进检测和 纯化融合蛋白。从而，我们能够从大肠杆菌培养物的细胞质级分纯化相 当大量的融合蛋白。对TLR4表达性细胞进行的结合测定提示 EDA-SIINFEKL蛋白能够特异结合TLR4 。此外，我们在这里表明 EDA-SIINFEKL能够激活TLR4信号传导途径。该激活与该蛋白质的潜 在LPS污染无关，因为用蛋白酶K事先消化完全消除了刺激NF-kB核 运输的能力。此外，该测定中EDA制剂中内毒素污染物的量低于0.0003 Hg/mK如通过LAL测定评估的)，其不能够在该体外测定中激活TLR-4 信号传导途径。这些结果提示EDA蛋白质可以用作蛋白质栽体以将抗 原耙向TLR4表达性细胞。已知树突细胞表达toll样受体，且尤其是 TLR4。还已知DC的一些最有效的成熟刺激来自TLR受体与它们各自 配体的相互作用。从而，含有EDA的融合蛋白与某种抗原的相互作用
的快速活化。此外，该融合蛋白向DC表面的靶定可以增加DC对该抗 原的捕获和胞吞并因此增强针对该抗原的免疫应答。
实施例2.含有EDA的融合蛋白在体外和体内诱导树突细胞成熟和允许 细胞毒性T淋巴细胞的诱导
2.1材冲牛和方法
2丄1.骨髓来源的树突细胞产生
树突细胞从骨髓细胞生长而来。用ACK裂解緩沖液裂解红细胞后，
3讨论洗涤细胞并随后通过与抗CD4(GK1; ATCC， Manassas, VA)、 CD8 (53.6.72; ATCC) 、 Ly-6G/Grl (BD-Pharmingen; San Diego CA)和 CD"R/B220 (BD-Pharmingen)的抗体混合物接着与兔补体温育耗尽淋 巴细胞和粒细胞。剩余的细胞以1(^个细胞/ml生长在12孔板中的完全 培养基中，该培养基补加了 20 ng/ml mGM-CSF和20 ng/ml mlL-4 (均来 自Peprotech; London, UK)。每隔一天，将培养基用含有细胞因子的新鲜 培养基更换。在第7天收获非贴壁的树突细胞并在1 pg/ml或15 ng/ml LPS (Sigma), EDA-SIINFEKL (500 nM)或SIINFEKL (10 pM)存在或不存 在下在37'C和5%(302下培养。在一些实验中，向培养物加入多粘菌素 (10 pg/ml)以抑制内毒素污染物的作用。24小时培养后，收获上清液并 通过ELISA (BD-Pharmingen)根据生产商的说明书测量IL-12和TNF-a。
2.1.2用EDA-SIINFEKL免疫后测量CDUc细胞的体内成熟。用蛋白 酶K消化的作用。
通过流式细胞术测量各种表面标记的表达，在体外评估DC的成熟。 用25 pgEDA-SIINFEKL、用蛋白酶消化的25 pg EDA-SIINFEKL、 25 ^ig LPS或者仅用PBS静脉内注射C57BL6小鼠。通过使用琼脂糖蛋白酶 K(Sigma, StLouis)进行用蛋白酶K消化EDA-SIINFEKL。简言之，用在 洗涤緩沖液(20 mM Tds-HCl, pH 7.2, 1 mM EDTA， lmM ClCa2)洗涤的5 mg/ml蛋白酶琼脂糖珠在3(TC消化EDA-SIINFEKL蛋白或者LPS 20分 钟。通过离心除去琼脂糖-蛋白酶K珠。免疫后15小时，处死小鼠并 通过autoMACS純化CDllc细胞。标记细胞并通过流式细胞术分析。
2丄3.用于分析抗原呈递能力的体外研究
我们表征了 EDA-SIINFEKL被APC捕获以将经加工的CTL表位 SIINFEKL呈递到来自OT-l转基因小鼠的T细胞，或呈递到丁杂交瘤 B3Z的能力，所迷T细胞和T杂交瘤B3Z都对该表位特异。在不同浓 度的EDA-SIINFEKL、EDA和SIINFEKL (未共价结合)或SIINFEKL存在 下培养骨髓来源的DC。 24小时培养后，收集上清液并通过ELISA测量 IFN-y产生。备选地，起始培养后12小时，收集DC，用0.05%戊二醛 固定并在不同量的来自OT-l的非贴壁细胞存在下或者在B3Z杂交瘤T 细胞系存在下用作APC。在一些实验中，在氯喹(3pM)、莫能菌素(lplGolgystop, Pharmingen)、布雷菲德菌素(1 pi Golgyplug， Pharmingen)、 环己酰亚胺(4 pg/ml)存在或不存在下温育DC,然后在EDA-SIINFEKL 或SIINFEKL肽存在下温育。在一些情况下，将抗-丁LR4抗体加入到培 养物中。
通过测量IL-2产生进行经处理的APC存在下B3Z细胞的激活。将 B3Z杂交瘤细胞(105个细胞/孔)在完全培养基(补加了 10% FCS, 2 mM谷 氨酰胺，100 U/ml青霉素，100 pg/ml链霉素和5xl(T5M 2-巯基乙醇的 RPMI 1640)中在来自C57BL/6 wt小鼠或者来自TLR4 KO小鼠的脾细胞 (105个细胞/孔)和不同浓度的EDA-SIINFEKL存在下培养8小时。通过 如前述的基于CTLL的生物测定测量释放到培养上清液的IL-2的量。
2丄4.免疫后测量细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和产生IFN-y的细胞的体外 诱导
将C57BL6小鼠用50 pg EDA-SIINFEKL或用SIINFEKL在第0和 第10天静脉内免疫。在第20天时，处死小鼠用于分析针对SIINFEKL 的CTL应答。在完全培养基中，0.1 pg/ml SIINFEKL存在下以5 x 106 个细胞/ml(10ml)培养来自经免疫动物的脾细胞5天。在第5天，收获细 胞用于铬释放测定。通过将不同数目的效应细胞与事先装栽"Cr并且装 栽或没有装栽SIINFEKL的lx 1(^EL-4靶细胞温育4小时，测量裂解活 性。根椐下面的公式计算特异裂解百分比(cpm实验的-cpm自发 的)/(cpm最大值-cpm自发的)x100，其中自发裂解对应于不存在效应 细胞时温育的靶细胞，且通过将靶细胞与5% Triton xlOO温育得到最大 裂解。
为了测量应答SIINFEKL的IFN-y产生，将来自经免疫小鼠的脾细 胞以8xl05个细胞/孔平板铺平板在％-孔板上，所迷孔仅仅具有完全培 养基或者具有30 )iM肽，终体积为0.25 ml。 48小时后取出上清液(50 |til) 并通过ELISA(Pharmingen， San Diego, CA)根据生产商的说明书测量
在另一组实验中，证明了 EDA蛋白质作为蛋白质混合物中佐刑的 能力。在该情况下，将一组C57BL/6小鼠用50 EDA-SIINFEKL在溶 于PBS中的500 pgOVA蛋白质存在下静脉内免疫，而另一组仅用溶于 PBS中的500 OVA蛋白质免疫。 一周后，处死小鼠以确定两組中针对SIINFEKL的CTL应答，如上迷。
2丄5.针对EG70VA肿瘤细胞攻击的保护
在第0和IO天用3 nmol EDA-SIINFEKL或SIINFEKL皮下免疫小 鼠。第二次免疫后20天，用105个EG70VA细胞皮下攻击小鼠。用卡 尺控制肿瘤生长并使用公式V-(Lxw2)/2以mir^表示，其中L是长度； w是宽度。当肿瘤大小达到大于8cr^的体积时处死小鼠。
2.2.结果
2.2丄EDA-SIINFEKL融合蛋白刺激骨髓来源的树突细胞(BMDC)产生 IL-12和TNF-a
我们检查了 EDA-SIINFEKL重组蛋白是否能够刺激BMDC以产生 促炎细胞因子如或TNF-a。从而，将BMDC与SIINFEKL (10 |liM)、 LPS (1 |ng/ml和15 ng/ml)或EDA-SHNFEKL-6xHis (500nM)培养。24小 时后，通过ELISA测量培养上清液中的IL-12或TNF-a。发现 EDA-SIINFEKL能够刺激BMDC产生非常高水平的IL-12或TNF-a (图 4)。当事先用蛋白酶K处理该蛋白质时，免疫刺激能力消失，从而表 明该活性不时由于蛋白质样品中可能痕量的内毒素。
2.2.2. EDA-SIINFEKL诱导表达CDllc的DC的TLR4依赖性体内成熟
树突细胞(DC)是最有效的抗原呈递细胞，具有刺激幼稚T细胞 和针对抗原的次级应答的独特能力。DC能够捕获抗原，将它们加工成 肽并将与MHC I或II类分子结合的所述肽分别呈递给细胞毒性T细胞 (CTL)或者T辅助细胞。不成熟DC可以捕获抗原但是它们必须分化 或者成熟而变得能够剌激幼稚T细胞。从而，树突细胞的成熟是T细胞 应答的最佳刺激所必需的。当发生成熟时，APC增加表面分子如I类和 II类MHC、 CD40、 CD80和CD86分子的表达。因此，我们分析了 EDA-SIINFEKL是否可以诱导表达CD 11 c的细胞在体内成熟。将C57BL6 小鼠用25 EDA-SIINFEKL、用蛋白酶K消化的25 EDA-SIINFEKL、 25 LPS或者仅用PBS在静脉内免疫。15小时后处死小鼠并通过 autoMACS純化CDllc细胞、抗体标记并通过流式细胞术分析。我们发 现用EDA-SIINFEKL免疫能够诱导MHC I类和II类分子，CD40和CD86的表达。当将EDA-SIINFEKL在免疫前用蛋白酶K消化时，该蛋白质的 能力被完全消除(图5)。用蛋白酶K消化LPS对LPS诱导这些成熟标 记表达的能力没有任何抑制作用(未显示)。我们测试了 EDA-SIINFEKL 诱导来自C57BL/6 TLR4 KO小鼠的CDlle细胞成熟的能力并且我们发 现EDA-SIINFEKL不能诱导在C57BL/6 wt小鼠上发现的成熟标记的超 表达(图5)。
2.2.3 EDA-SIINFEKL被树突细胞有效呈递给对SIINFEKL表位特异的T
细胞
我们表征了 EDA-SIINFEKL被APC捕获以将经加工的CTL表位 SIINFEKL呈递给来自0T-1转基因小鼠的对该表位特异的T细胞的能 力。将骨髓来源的DC (105个细胞/孔)在不同浓度的EDA-SIINFEKL、 EDA+SIINFEKL、 EDA或SIINFEKL肽存在下培养。48小时后，加入 105个非贴壁的OT-1细胞。测量OT-1非贴壁细胞的IFN-y生产(图6A)。 如通过IFN-丫生产所证明的，SIINFEKL肽被有效呈递到来自OT-1小鼠 的T细胞。EDA-SIINFEKL也诱导高水平的IFN-y，尽管必须高剂量的 该蛋白质来得到相似水平或者甚至更高的IFN-y,从而清楚地表明EDA 蛋白将该SIINFEKL表位携带到MHCI类分子。向与SIINFEKL肽温育 的DC力o入EDA蛋白质不增加来自OT-1小鼠的T细胞的IFN-y生产。 如所预期的，仅仅与EDA温育的DC不激活来自OT-1小鼠的T细胞。 为了分析DC中的TLR4分子表达是否可以增强EDA-SIINFEKL呈递， 将SIINFEKL特异的B3Z细胞与不同浓度的EDA-SIINFEKL在来自 C57BL/6 wt或TLR4KO小鼠的脾细胞存在下温育。在表达TLR4的抗 原呈递细胞存在下，EDA-SIINFEKL向B3Z细胞的呈递是更有效的(图 6B )。同样，通过加入抗-TLR4抗体完全阻断了 EDA-SIINFEKL向B3Z 细胞的呈递(图6C ),从而提示TLR4涉及EDA-SIINFEKL捕获。之后， 我们研究了不同的药物对EDA-SIINFEKL的加工的作用并且我们发现 该呈递受到莫能菌素、布雷菲德菌素或环己酰亚胺的完全抑制，但是不 被氯喹完全抑制，氯喹是内体和晚期溶酶体中酸化的已知的抑制剂(图 6D)。如所预期的，这些药物不影响SIINFEKL合成肽的呈递。这些数 椐提示大胞饮不介导EDA-SIINFEKL的内化，并且证明EDA-SIINFEKL 通过I类胞质溶M^加工途径加工。2.2.4. EDA-SIINFEKX在体内诱导SIINFEKL特异性CTL 前面的结果证明EDA-SIINFEKL重组蛋白是生物活性的并且特异
活化APC。在体内特异T淋巴细胞免疫应答的诱导对于疫苗的开发是关 键的。从而，我们测试了用EDA-SIINFEKL融合蛋白免疫的小鼠是否产 生了针对用SIINFEKL表位脉沖的靶细胞的特异CTL应答。将C57BL6 小鼠用溶于PBS中的50 pg EDA-SIINFEKL或者SIINFEKL在第0和10 天静脉内免疫。在第20天，处死小鼠用于分析针对SIINFEKL的CTL 应答。发现EDA-SIINFEKL能够诱导针对用SIINFEKL脉沖的EL-4靶细 胞的CTL。另一方面，当仅用SIINFEKL免疫小鼠时没有发现CTL活性 (图7)。由于EDA在体内诱导树突细胞成熟的能力，所以还分析了当 用OVA蛋白质免疫时EDA作为佐剂的能力。在该实验中，我们观察到 免疫混合物中存在EDA具有免疫刺激作用并且能够增强OVA蛋白诱导 的针对SIINFEKX的CTL应答诱导(比较图9的图A和B之间的裂解 活性)。
2.2.5. EDA-SIINFEKL保护小鼠免于表达OVA蛋白质的肿瘤细胞的攻击 为了研究EDA-SIINFEKL融合蛋白保护小鼠抵抗EG70VA肿瘤细
胞注射的能力，将小鼠用3nmo1 EDA-SIINFEKL、 SIINFEKL或用盐水 皮下免疫。第二次免疫后20天，用105个EG70VA细胞皮下攻击小鼠。 我们发现EDA-SIINFEKL免疫保护小鼠免于肿瘤生长。用SIINFEKL或 盐水免疫的所有小鼠都发展了肿瘤，而用EDA-SIINFEKL免疫的小鼠中 40%保持无肿瘤并且剩余的60%经历了肿瘤生长减速(图8)。
2.3.讨论
在当前的研究中，使用重组EDA蛋白质作为表位递送栽体，我们 确立了免疫策略，其在体内起动CTL应答，从而回避了对佐剂的需要。 我们鉴定了有助于含有EDA的融合蛋白作为将抗原递送到表达TLR-4 的细胞和诱导针对抗原的细胞免疫应答的栽体的功效的机理。
首先，我们发现用EDA体外刺激BMDC能够刺激产生促炎细胞因 子，如IL-12和TNF-a。已知这些细胞因子是起始针对抗原的强烈免疫 应答关健的。此外，发现用EDA体内免疫能够诱导DC成熟和增加DC表面上共刺激分子的表达。这些共刺激分子的表达对于有效诱导针对抗
原的免疫应答是极为重要的。发现该作用依赖于TLR4的存在，因为来 自事先用EDA免疫的C57BL/6 TLR4 KO小鼠的体内分离的CD 11 c细胞 与在未免疫的动物中发现的相比对于它的成熟状态不显示出任何改善。
我们发现与EDA-SIINFEKL融合蛋白温育后，APC上TLR4分子的 存在提高了抗原呈递，并且该呈递不受到抑制内溶酶体(endolysosomal) 蛋白酶解的氯喹的影响。这些数据表明EDA-SIINFEKL的内化不受到大 胞饮的介导，并且证明重组EDA-SIINFEKL蛋白被作为胞质溶胶抗原加 工，并且暗示必须将该融合蛋白通过APC质膜递送到胞质溶胶。
并且最重要的是，我们发现用重组融合蛋白EDA-SIINFEKL免疫小 鼠能够在体内诱导特异针对SIINFEKL表位的CTL应答。此外，用 EDA-SIINFEKL免疫能够保护小鼠免于EG70VA肿瘤细胞的攻击。所有 这些数据表明含有EDA的该蛋白质栽体能够(i)将抗原靶向表达TLR4 的细胞，且尤其是专职APC; (ii)将载体化抗原递送到经典的I类抗 原加工途径；(iii)诱导体内和体外树突细胞成熟；和(iv)不存在佐 剂时，起动针对栽体化抗原的体内C丁L,且从而可以用于抗传染物或者 抗癌症的接种策略中。同样，这些含有EDA的融合蛋白可以用于药学 上相关的分子向表达TLR4的细胞的胞质递送。此外，EDA在体内诱导 树突细胞成熟的能力允许它用作含有抗原的制剂中的佐剂，其中人力']希 望产生针对所迷抗原的免疫原性应答，从而打开了在疫苗开发中使用 EDA的可能性的领域。
实施例3. EDA蛋白可以用作栽体以转运具有至少390个氨基酸的抗原 3.1材料和方法
3.1.1 EDA-OVA和EDA-NS3重组蛋白的表达
为了构建EDA-OVA表达质粒，从表达OVA蛋白的EG70VA肿瘤 细胞提取 mRNA 。 逆转录和通过 PCR 用引物 GCGGCCGCA/J 7TOGC7m4 7TOGCGC4 (SEQ ID NO: 16)和 GCGGCCGC4GGGCM/^C4C4 7tT (SEQ ID NO: 17)(加入加下划线的碱 基以引入限制酶Notl识别的序列，而斜体序列属于卵清蛋白的开始和结 束)扩增后，将PCR产物用TOPO TA试剂盒(Invitrogen)克隆在pCR2.1-TOPO中，用Notl消化并用事先用Notl消化的质粒pET20EDA 1.2 (其表达EDA蛋白质)中亚克隆。通过测序验证构建的正确方向。 诱导用质粒培养物转化的大肠杆菌后，使用FPLC平台(AKTA， Pharmacia) 通过亲和层析(Histrap， Pharmacia)纯化可溶级分中存在的融合蛋白。将 蛋白质用脱盐Hitrap柱(Pharmacia)脱盐，并用滤器装置通过离心Amicon Ultra 4-5000 MWCO (Millipore Carrighwahill，爱尔兰)浓缩。用Endotrap 内毒素柱(Profos Ag, Regensburg，德国)純化重组蛋白质栽体，直到内毒 素水平低于0.2 EU/pg蛋白质(通过LAL测定测量，Cambrex)。对于 EDA-NS3蛋白质构建，按照相似的策略，其中使用引物 A( CGG"COFCAGCCACCATGGCGCCTATCACGGCCTATTC (SEQ ID NO: 18)和 AGCGt CO CTTGCGGTACGGCCGGAGGGGATGAGTT (SEQ ID NO: 19)，其允许NS3蛋白质的氨基末端片段(氨基酸 1026-1221 )的表达。与从大肠杆菌级分的可溶级分提取的EDA-OVA蛋 白质相对照，在EDA-NS3蛋白质的情况下，从事先溶解在8M尿素的 内含体纯化蛋白质。使用Histrap柱进行亲和层析后，进行离子交换层 析(DEAE-琼脂糖)。按照再折叠规程在G25柱中再折叠从该第二次层析 纯化的级分。 一旦再折叠，就对EDA-NS3柱脱盐并使用Endotrap柱 (Profos,德国)纯化内毒素。
通过SDS-PAGE分析这样純化的蛋白质。
3丄2用于评估抗原呈递能力的体外研究
评估了 EDA-OVA被APC捕获并随后将CTL表位加工的SIINFEKL 呈递给来自OT-l转基因小鼠的T淋巴细胞的能力。在不同浓度的 EDA-OVA、 EDA + OVA (非共价结合的)、OVA或EDA存在下培养骨 髓来源的树突细胞(105个细胞/孔)。12小时后加入105细胞/孔的来自 OT-l转基因小鼠的非贴壁细胞。从培养开始24小时，提取上清液用于 通过商业ELISA测定定量分泌的IFN-y。
3丄3免疫后测量体内T细胞毒性淋巴细胞(CTL)诱导和产生IFN-y 的细胞
分别在第0和10天用50 pg EDA-OVA或EDA-NS3静脉内免疫 C57BL6或HHD (对于HLA-A2.1分子转基因的)小鼠。在第20天，处死小鼠以确定针对SIINFEKL或者针对NS3 1073肽的CTL应答。来自 经免疫动物的脾细胞在完全培养基中0.1 pg/ml SIINFEKL或1 pg/ml NS3 1073存在下以5 x 106个细胞/ml (10 ml)培养5天。在第5天，收 获细胞用于铬释放分析。将不同量的效应细胞与事先装栽"Cr、有或者 没有肽的lx104个EL-4靶细胞温育4小时，测量裂解活性。根椐下面 公式计算特异裂解百分比(实验cpm-自发cpm) /(最大cpm -自发 cprn) x 100，其中自发裂解对应于不存在效应细胞时温育的靶细胞，且 通过温育把细胞与5% Triton xlOO得到最大裂解。
为了测量应答不同肽的IFN-y产生，将来自经免疫小鼠的脾细胞分 散在96孔板中，8xl()S个细胞/孔，所述孔仅仅具有完全培养基，或者 具有30幽肽NS3 1038-1046 (SEQ ID NO: 23)、 1073-1081 (SEQ ID NO: 20， CVNGVCWTV)、 1169-U77 (SEQ ID NO: 22)，或具有1 |tig/ml重组 NS3 ,终体积为0.25 ml。 48小时后回收上清液(50 iul)并通过 ELISA(Pharmingen， San Diego， CA)根据生产商的说明书测量IFN卞
3丄4抗表达丙型肝炎病毒多蛋白的vHCV 1-1031痘苗病毒感染的保护 在第1和IO天用1 x 106个以EDA-NS3蛋白脉沖的骨髄来源的树突 细胞免疫C57BL/6。第二次免疫后10天> 用5 x 106 pfu的重组vHCV 1-1031痘苗病毒腹膜内感染小鼠。感染后3天，处死动物并通过基于使 用BSC-1细胞系的噬斑形成单位定量测定定量病毒负荷/mg卵巢组织。
3.2结果
3.2.1 EDA-OVA和EDA-NS3蛋白的表达和純化 如材料和方法部分中指出的，对于EDA-OVA的情况使用可溶级分
从转化的大肠杆菌提取物純化EDA-OVA或EDA-NS3，且对于EDA-NS3 的情况，从内含体纯化。在图10A和11A中，显示了两种蛋白质的 SDS-PAGE结果。得到了对应于55 kDa和32 kDa大小蛋白质的简单带， 其分别对应于这些蛋白质每一种的预期大小。
3.2.2 EDA与OVA蛋白质的结合增强IVA向来自O丁-l转基因小鼠的T 淋巴细胞的抗原呈递
我们分析了 EDA结合OVA蛋白质以增强SIINFEKL表位向对该表位特异的T细胞的抗原呈递的能力。我们观察到在EDA-OVA存在下培 养的骨髓来源的树突细胞刺激非贴壁OT-l小鼠细胞的IFN-y产生比仅 仅等分子量OVA蛋白质诱导的更强(图9B)。我们观察到当与仅仅 OVA蛋白质比较时，在含有EDA蛋白质和OVA蛋白质的共培养物中 的IFN-y产生被增强，从而提示EDA诱导的DC成熟可以增强T细胞活 化。
3.2.3. EDA与OVA蛋白质或者与NS3蛋白质的结合增强体内特异细胞 毒性T淋巴细胞诱导
分析了 EDA-OVA和EDA-NS3分别诱导针对SIINFEKL表位或针对 NS3 1073表位的CTL应答。对于EDA-OVA蛋白质，我们观察到用溶 解在盐水溶液中的该蛋白质免疫能够诱导针对与SIINFEKL肽温育的靶 细胞的细胞毒性应答，仅仅用OVA蛋白质免疫不能诱导(图9C)。以 相同的方式，用EDA-NS3蛋白质免疫HHD小鼠(对于HLA-A2.1转基 因的)诱导针对以前与肽NS3 1073 (V) (SEQ ID NO: 20， CVNGNCWTV) 或与该肽的变体1073 (L) (SEQ ID NO: 21, CLNGVCWTV)温育的靶细胞 的有效细胞毒性应答图11B。我们还观察到用EDA-NS3蛋白免疫HHD 小鼠诱导对肽NS3 1038 (SEQ ID NO: 23)、 1073 (SEQ ID NO: 20， CVNGVCWTV)和1169 (SEQ ID NO: 22)特异的产生IFN-y的细胞的活 化(图UC)。此外，用EDA-NS3蛋白免疫小鼠诱导了特异针对NS3 1073 肽的持久细胞毒性细胞应答。实际上，当用EDA-NS3蛋白免疫的小鼠 在免疫后60天被处死时，我们检测到对该肽特异的CTL的存在(图 11D)。
3.2,4用与EDA陽NS3蛋白质温育的树突细胞免疫C57BL/6小鼠保护小 鼠抵抗表达丙型肝炎病毒蛋白的痘苗病毒的感染
我们想研究用与EDA-NS3蛋白体外温育的树突细胞免疫是否能够 诱导能够保护小鼠抵抗表达丙型肝炎病毒蛋白的重组病毒攻击的细胞 应答。为此，我们用与EDA-NS3蛋白温育的骨髓来源的树突细胞或者 以前还没有与任何抗原温育的树突细胞免疫C57/BL6小鼠。第二次免疫 后10天，小鼠用5 x 106 pfu重组vHCV 1-3011痘苗病毒(Dr Rice, Washington University School of Medicine, St Louis， MO友情赠送，并且由Grakoui A,等人，J Virol, 1993; 67:1385描迷)感染。3天后,测量两 组小鼠中的病毒负荷。在该实验中，我们观察到用与EDA-NS3蛋白温 育的DC免疫能够保护6%的小鼠抵抗重组痘苗病毒的感染。
3.3.讨论
如已经在前面的结果中显示的，EDA蛋白质可以用作有用的栽体以 将来自OVA蛋白质的SIINFEKL表位靶向表达TLR4分子的细胞并增强 它们的免疫原性。为了评估EDA增加较大蛋白质的免疫原性的能力， 我们构建了含有完整OVA (397个氨基酸)的EDA-OVA融合重组蛋白和 含有具有来自丙型肝炎病毒的NS3蛋白质的蛋白酶活性的片段的 EDA-NS3蛋白。
这些结果证明EDA蛋白质可以作为靶定较大抗原的非常有效的栽 体。从而，我们发现在抗原呈递測定中，OVA与EDA的结合增强抗原 呈递细胞的抗原捕获，从而增加特异性T细胞活化。而且，我们观察到 用这些融合蛋白(EDA-OVA和EDA-NS3)免疫允许诱导抗这些抗原的特 异细胞毒性应答。这些诱导的应答是持久的。最后，我们观察到施用 EDA-NS3蛋白与树突细胞允许诱导保护性细胞应答，其抵抗表达丙型肝 炎病毒蛋白的痘苗病毒的感染。
这些数据表明EDA蛋白质可以是诱导针对目的抗原的细胞应答的 非常足够的蛋白质栽体。基于EDA蛋白质的融合蛋白的构建是针对肿 瘤疾病或者传染物引起的疾病的接种规程中的合适策略。
权利要求
1.包含选自-纤连蛋白EDA结构域(EDA)，或-所述EDA结构域的能够结合TLR4的片段，或-所述EDA结构域或者片段的变体，其能够结合TLR4并且与任何EDA结构域天然形式或者片段有70％以上的同源性，的氨基酸序列的多肽在生产针对抗原的的细胞免疫应答刺激剂中的用途。
2. 权利要求l的多肽的用途，其特征是所迷对应于EDA结构域的 片段包含选自如下的序列a) SEQ. ID. NO: 2的氨基酸2 - 91;b) SEQ, ID. NO: 4;和c) 序列a)和b)的能够结合TLR4表达性细胞的片段。
3. 权利要求1的多肽的用途，其特征是所迷对应于EDA结构域的 片段包含选自如下的序列a ) SEQ. ID. NO: 6的氨基酸2-57; b ) SEQ. ID. NO: 8;和c)序列a)和b)的能够结合TLR4表达性细胞的片段。
4. 根据权利要求1到3任一项的多肽的用途，其特征是所迷免疫刺 激剂还包含一种或多种目的分子。
5. 根据权利要求1到4任一项的多肽的用途，其特征是所述免疫刺 激剂是蛋白质栽体，其中所迷多肽连接到所述目的分子。
6. 蛋白质栽体，其特征是它包含多肽，所迷多肽的氨基酸序列选自a) 纤连蛋白EDA结构域(EDA),b) 所述EDA结构域的能够结合TLR4的片段，或c) 所迷EDA结构域或者片段的变体，其能够结合TLR4并且与所 述EDA结构域的任何天然形式或者片段有70 %以上的同源性； 所述多肽结合到选自多肽、脂肽、寡糖、多糖、核酸、脂质和化学药 品的目的分子。
7. 根据权利要求6的蛋白质栽体，其特征是所述目的分子选自抗原和表位。
8. 根椐权利要求6或7任一项的蛋白质栽体，其特征是所述目的分 子选自病毒抗原、细菌抗原和寄生物抗原。
9. 根据权利要求6到8任一项的蛋白质栽体，其特征是所述目的分 子是丙型肝炎病毒的病毒抗原。
10. 根据权利要求9的蛋白质栽体，其特征是所迷丙型肝炎病毒抗 原是NS3蛋白或所述蛋白质的抗原片段。
11. 根据权利要求10的蛋白质栽体，其特征是所述氨基酸序列是 SEQ ID NO: 10。
12. 根据权利要求6或7任一项的蛋白质栽体，其特征是所迷目的 分子选自肿瘤抗原和肿瘤抗原决定簇。
13. 根椐权利要求12的蛋白质栽体，其特征是所迷目的分子是来自 卯清蛋白的抗原性细胞毒性T决定簇(OVA 257-264)或SIINFEKL。
14. 根据权利要求13的蛋白质栽体，其特征是它包含选自SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 6的氨基酸序列。
15. 根据权利要求6的蛋白质栽体，其特征是所述目的分子是变应原。
16. 根椐权利要求6的蛋白质栽体，其特征是所迷目的分子是化学 或者遗传偶联到EDA结构域的药物。
17. 权利要求6到16中定义的蛋白质栽体将所述目的分子特异靶定 和运输到TLR4表达性细胞的胞质溶胶中的用途。
18. 权利要求17的蛋白质栽体的用途，其特征是所述TLR4表达性 细胞是抗原呈递细胞。
19. 权利要求18的蛋白质栽体的用途，其特征是所述抗原呈递细胞 是树突细胞。
20. 经修饰的核酸，其特征是它编码权利要求6到16任一项定义的 蛋白质栽体。
21. 根据权利要求20的经修饰的核酸，其特征是它还包含调节所述 蛋白质栽体表达的可操作地连接的控制序列。
22. 根据权利要求20或21的经修饰的核酸，其特征是它包含SEQ. ID. N。 1或SEQ ID. NO: 5。
23. 根据权利要求20或2的经修饰的核酸，其特征是它包含SEQ. ID. NO. 9。
24. 用于权利要求6- 16任一项中定义的蛋白质栽体的基因表达的表达栽体，其特征是所述表达栽体包含权利要求20到23任一项中定义的经^修饰的核酸。
25. 权利要求24的表达栽体，其特征是所述栽体是病毒栽体。
26. 表达宿主细胞，其特征是它包含权利要求20到23任一项中定 义的经修饰的核酸，或者权利要求24或25定义的表达栽体。
27. 根椐权利要求26的表达宿主细胞，其特征是所述宿主表达细胞 是大肠杆菌。
28. 产生权利要求6到6任一项中定义的蛋白质载体的方法，其特中定义的宿主表达细胞并回收所述蛋白质栽体。。 ' ,
29. 权利要求20到23任一项定义的经修饰的核酸、权利要求24或 25的定义的表达栽体或者权利要求26或27定义的宿主细胞在制备药物 組合物中的用途。
30. 权利要求1到5任一项的多肽的用途，其特征是所述细胞免疫 应答刺激剂是药物组合物。
31. 权利要求30的多肽的用途，其特征是所述药物組合物刺激抗原 呈递细胞的成熟。
32. 权利要求30或31的多肽的用途，其特征是所迷药物组合物诱 导针对目的分子的有效免疫应答。
33. 权利要求32的多肽的用途，其特征是所述免疫应答是CTL应答。
34. 权利要求30到33任一项的多肽的用途，其特征是所迷药物組 合物用于治疗和预防传染病。
35. 权利要求34的多肽的用途，其特征是所述药物組合物用于治疗 和预防丙型肝炎。
36. 权利要求34的多肽的用途，其特征是所述药物组合物用于治疗 和预防肿瘤疾病。
37. 权利要求30到33任一项的多肽的用途，其特征是所述药物组 合物用于治疗和预防变应性疾病。
38. 药物组合物，其特征是它包含至少一种可接受的药物栽体和至 少一种下面的组分i) 权利要求6到16任一项中定义的蛋白质载体；ii) 权利要求20到23任一项定义的经修饰的核酸；iii )权利要求24或25中定义的包含所迷经修饰的核酸的表达栽体；或iv)权利要求26或27中定义的也包含所迷经修饰的核酸的表达宿 主细胞。
39. 药物组合物，其特征是它包含一定量的树突细胞，其中所迷树 突细胞已经在体外与至少一种下面的组分温育i) 权利要求6到16任一项中定义的蛋白质栽体；ii) 权利要求20到23任一项定义的核酸；或iii) 权利要求24或25中定义的包含所述经修饰的核酸的表达载体。
40. 根据权利要求38或39的药物组合物，其特征是所述组合物是 疫苗或者免疫治疗组合物。
全文摘要
本发明涉及多肽在产生免疫刺激剂中的用途，所述多肽包含对应于纤连蛋白的EDA结构域的序列，EDA结构域的可以结合TLR4的片段，或者所述EDA结构域或者片段的变体，其可以结合TLR4并且与EDA结构域的任何形式或者天然片段有70％以上的同源性。本发明还涉及所述试剂的生产方法和应用。
文档编号A61K38/39GK101287487SQ200680029324
公开日2008年10月15日 申请日期2006年6月13日 优先权日2005年6月13日
发明者C·莱勒克, J·J·拉萨特萨加斯蒂贝尔扎, J·普里托瓦尔图纳, M·格雷茨阿亚拉 申请人:西马生物医学计划公司