专利名称：：含有寡聚核苷酸和无毒lps的用于治疗癌症的组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种抗癌药物，其使用得自LPS的无毒高分子化合物(CIA05)和寡聚脱氧核苦酸(ODN)。
背景技术：
：从二十世纪六十年代起不断进展的治疗癌症的方法主要被分成三组外科手术、放射疗法和化学疗法。在美国，一直上升的癌症死亡率，在过去上升的情况下，直至1973年癌症死亡率突然降低的事实说明了治疗方法的成功。然而，外科手术和免疫治疗有限制，即由于它们限于局部治疗，因此，如果原位癌症在早期阶段被干扰，则它们具有良好的预后。而且，化学治疗在杀死全部癌细胞方面是成功的。在这种情况中，老年人和虚弱的病人可能会失去生命，因为宿主即患者的正常组织，特別是免疫组织也被严重损害。非特异性免疫治疗是最突出的免疫治疗，通过单独使用或者与通过化学治疗联合，非特异性免疫治疗已经被用于治疗几乎全部类型的肿瘤。非特异性免疫治疗所表达的意思是所述免疫治疗与癌症的类型无关。并且，目前已经提出了许多与其内在机制相关的理论，但这些理论还需要被研究。然而，认为非特异性免疫治疗刺激网状内皮组织细胞，特别是淋巴细胞的活动(kinetics),因此在免疫监视方面有发挥作用的方面。棒状细菌实际上在韩国已经被用作临床测试的主导材料，很夂以前，溶链菌(OK-432)就被推荐，并且该材料已经被用于治疗许多患者。上述材料得到大体研究，并已经在日本上市，并且在曰本、韩国和东南亚许多国家可以通过商业渠道获得。在4艮久以前，这些材料家族(family)就已经被用于治疗癌症。早在1968年，BushFehleison等人(德国)发现通过使用这些材料的家族能够停止或减少在患有丹毒的患者中所发展出的癌症。在1891年，美国的外科医生Coley(芝加哥，美国)报道制造了所谓的Coley氏混合毒素，并且其被用于治疗许多癌症患者，所述毒素对显著大量的患者有效。所述Coley氏混合毒素是由从通过培养链球菌所获得链球菌培养基(medium)提取的物质所组成的。通常，哺乳动物和细菌DNA的显著差别之一是显著的CpG抑制和哺乳动物DNA中CpG二核苷酸在胞嘧啶残基处的选择性曱基化。最近，研究人员提出在细菌DNA中存在的CpG基序快速激活多克隆B细胞促进IgM的分泌，细菌CpG基序抑制原癌基因(c-myc)mRNA的表达，提高myn、blc2和bcl-XLmRNA的表达，以保护细胞免于B细胞凋亡，其中，在B细胞的凋亡中，细胞周期会被抗IgM抗体所停止，并且凋亡被启动。在另一个研究中，据报道，CpG基序直接激活B细胞，在短时间内，促进IL-6和IL-12的分泌。根据上述的特征，利用含有CpG序列的合成寡聚核苷酸的治疗哮喘用佐剂和治疗药剂的临床实验已经由CPG公司(美国)开展。然而，在最近的研究中，据报道CpG二核苷酸的胞嘧啶曱基化与抗癌效果无关，还报道细菌DNA的抗癌效果依赖于其结构因素等。然而，据报道，未曱基化的CpG的作用在DNA抗癌药物中不是必要的，因此，需要开发各种方法作为上述方法的备选方案。已经知道LPS是典型的不依赖胸腺的抗原，其通过直接作用于B细胞诱导非特异性的免疫反应能够引起诸如炎症的副作用等。但是，观察到LPS能够利用其毒性杀死癌细胞，并且其亚单位脂质A(LipidA)通过诱导各种转导因子的表达.特异性地显示出抗癌作用。但是，问题是，作为典型内毒素LPS具有强毒性。另外，普通LPS与DNA的结合可以引起严重的症状如败血症。
发明内容从而，设计本发明用于解决现有技术的问题。因此，本发明的目的是提供一种物质，其能够诱导比传统治疗药剂更稳定、有效和特异的免疫应答。为了达到上述目的，本发明提供了一种抗癌药物，其包含寡聚脱氧核苷酸(ODN)和得自细菌LPS的无毒高分子物质。在本发明中，在ODN中是否存在未曱基化CG并不重要，但优选所述无毒化合物具有大约2,000至10,000道尔顿(Da)的分子量。在本发明中，还可以^使用ODN和得自细菌LPS的无毒化合物，如果它们以最低含量进行混合，以显示本发明的效果。特别的，在500:1至1:500重量比例的范围内，它们的效果是以剂量依赖的模式提高的，并且考虑到它们的无毒性、经济效率等，该范围是优选的。同样，优选通过振动将这两种组分进行混合。上述CpG基序的相互作用主要是通过诱导T辅助细胞1型的免疫激活和NK细胞的激活而显现。同样，在本发明中所使用的细菌，优选是大肠杆菌(Esc/zw/c/^co//)或分枝杆菌，更优选是大肠杆菌(^c/^n'c/z/aco//)。在后面的详细描述中将参考附图，对本发明的这些和其它特征以及优选实施方式的优点进^f亍更充分的描述。在附图中图l是电泳图，其显示从大肠杆菌(Esc/zen'c/z/aco//)细胞的外膜分离的脂多糖产物。该电泳图分别显示在5批实验中所分离的脂多糖产物；图2是电泳图，其显示通过碱处理脂质A被降解，并且在所分离的大肠杆菌(&c/2eWc/^co//)脂多糖中脂质A的大小被降低，因此它们的毒性被去除。在该图中，泳道1代表标记物，泳道2表示所分离的脂多糖产物(CIA04),泳道3表示碱处理的无毒脂多糖(CIA05);图3是显示检测在THP-1(急性单核细胞性白血病)中所分泌肿瘤坏死因子-oc(TNF-oc)量的图。对照脂多糖诱导THP-1细胞分泌大量的TNF-cc,而无毒CIA05诱导THP-1细胞分泌非常少量的TNF-cx，这说明脂多糖毒性所引起的炎症反应被显著降低；图4是通过在人血细胞中所表达IL-12的量显示CIA05具有刺激免疫反应的作用的图，而与在寡聚脱氧核苷酸(ODN)中是否存在GC序列无关；图5是通过在人血细胞中所表达IL-12的量显示CIA05提高的DNA抗癌效力与通过CG曱基化的未曱基化CG无关的图。这里，m7909代表胞嘧啶曱基化的ODN7909;图6是显示具有硫代磷酸酯(phosphorothioate)的ODN的免疫性被CIA05提高的图。这里，7909(s)代表来自ODN7卯9的硫代磷酸酯；图7是显示在小鼠模型中通过CIA05的ODN抗癌作用的图表。实施本发明的最佳才莫式下面将参考附图对本发明的优选实施方式进行详细描述。本发明的发明人设计一种得自细菌LPS的无毒高分子材料(CIA05)作为抗癌佐剂，并确认所述寡聚核苷酸能够有效地用作佐剂。具体地，他们发现如果单独使用所述寡聚核苷酸不显示作用，但如果将所述寡聚核苷酸与高分子材料(CIA05)联合使用，则所述寡聚核苷酸显示出上述的作用。DNA与常规的脂多糖结合能够使脂多糖参与多种反应，例如通过在免疫系统的多种位点作为T细胞依赖性抗原发挥作用，因为它们的协同作用能够引起严重的病症如败血症。然而，即使与DNA联合使用，CIA05也不显示特异性的毒性。本发明的发明人从生存于健康人的肠道的大肠杆菌(^yc/^n'c/^co//)筛选了具有非常短的脂多糖糖链的菌抹(大肠杆菌(￡.co//)菌株EG0021),，并于2002年5月2日将大肠杆菌(Eco//)菌抹EG0021保藏到位于361-221弘济洞，西大门区，首尔(361-221Hongje-dong,Seodaemun-gu，Seoul)的韩国微生物培养物中心(KCCM)，其保藏编号为KCCM10374。并且，建立了一种方法用于从大肠杆菌(五.co/O菌抹EG0021中纯化脂多糖。还通过^5威处理从所得到的非常小的LPS中除去脂肪酸，以获得CIA05,其中所述CIA05是非常安全的，并且表现出抗癌效果。合成下列的寡聚脱氧核苷酸(ODN)，这些都是可以从吉诺泰克有限公司(GenotechCo.Ltd)(韩国)商业渠道获得的。ODN1826TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQIDNO:1;20聚体(mer))ODN7909TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQIDNO:2;24聚体)ODN7909mTCmGTCmGTTTTGTCmGTTTTGTCmGTT(胞嘧啶曱基化)ODN7909sTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(硫代磷酸酯)ODN无CG(nonCG)CTGGTCTTTCTGGTTTTTTTCTGG(SEQIDNO:3;24个核普酸)确认通过该方法制备的ODN和CIA05的混合物可能显示进一步增强的效力。将对本发明的非限制性实施方式进行更加详细地描述。参见PCT05-073。实施例1:筛选无毒抹筛选和发现具有非常短脂多糖的大肠杆菌(￡yc/zgn'c/2/flco//)突变抹从生存在健康人的肠道中的大肠杆菌(&c/zeWc/z/aco//)发现了具有非常短的脂多糖糖链的大肠杆菌(五.co//)菌抹EG0021,并且建立了从大肠杆菌co//)菌林EG0021中纯化脂多糖的方法。将从健康男性成年人中获得的大肠杆菌(￡.CO//)单菌落培养在液体培养基中，接着重复5次选择操作以获得50个大肠杆菌(五.co//)菌林。并且，从在平板上选定的50个菌抹取每一个菌落，溶解在4ml的0.9%生理盐水中，接着取lml所得到的溶液转移到埃彭道夫离心管(Eppendorftube)中，并使用2plDNA酶I进行处理，接着在培养箱中37。C下反应1小时。使用DNA酶I进行处理之后，使用50ji1RNA酶(10mg/ml)对裂解液进行处理，接着在培养箱中37。C下反应1小时。接着，向其加入100|ul蛋白酶K(20mg/ml)，接着在37t:下反应过夜。使用根据上述操作获得的每种菌抹的LPS对使用粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)分化的人淋巴细胞系进行处理，并检测所分泌TNF-a的水平，接着选择TNF-ot水平最低的菌抹(表1),通过电泳确认所述脂多糖的分子量。确认减毒菌林自身的属的特征或其形态学特征没有改变，但在分离其脂多糖并在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上进行电泳时(图1),不存在分子量为50,000至100,000道尔顿的脂多糖梯度(ladder),并主要产生了分子量为2,000至10,000道尔顿的脂多糖。从而，将该菌抹命名为EG0021。表1_在健康人的肠道(Bowls)中分离的大肠杆菌(co/z')裂解液中所分泌TNF-a的水平<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例2:CG甲基化为了表征寡聚核苷酸中未曱基化CG的功能，使用Sssl曱基化酶对CG序列的胞嘧啶残基进行选择性曱基化。通过将1单位的CpG曱基化酶(M.SssI;NEBM0226S)与10mgODN7909进行混合，接着在37。c下相互反应12个小时，而进行dna的曱基化。此时，混合160inMS-腺香曱硫氨酸(SAM)作为曱基供体，并共同反应。在完成曱基化之后，接着使用DNA清理试剂盒(CPGDPC60050)和微纯-EZ(Micropure-EZ)(亚米康(Amicon)42529)除去残余的盐和酶。实施例3:从突变的大肠杆菌(E.coil)中纯化CIA02从突变的大肠杆菌(E.coil)纯化脂多糖以DNA分离中相同的方式制备大肠杆菌(E.coil)菌抹。然后将菌抹与2倍体积的乙醇混合，在4，000g下离心以使沉淀(pellet)沉降，接着向所得到的沉淀中加入1.5倍体积的丙酮，彻底混合并在4,000g下离心。将等量的乙醚加入到所得到的沉淀中，彻底混合并在4,000g下离心。将通过离心获得的细胞沉淀覆盖有孔的铝箔，干燥，并对细胞体进行称重，接着以每克干重7.5ml的量加入提取混合物(90%苯酚氯仿石油醚=2:5:8)。将所得到的混合物分入到玻璃离心管中，并在25。C和3，000rpm(1,200g)下离心20分钟以获得上清。所得到的上清保持在无菌操作台(hood)中12小时以使残片沉淀，并分入到玻璃离心管中，在25。C和3,000rpmU,200g)下离心20分钟以获得脂多糖。将所得到的脂多糖溶解在乙醚中，接着将脂多糖溶液转入到Eppendorf离心管中，在无菌操作台中干燥，接着使用化学天平对其干重进行检测，接着向干燥的脂多糖中加入乙醇，存储用于将来使用。从保存在乙醇中的纯化的大肠杆菌(E.coil)脂多糖中完全除去乙醇，接着检测脂多糖中KDO(2-酮-3-脱氧辛酸)的量，并规格化为标准以检测其含量，并根据它们在SDS-PAGE上的分子量进行分离，使用银染法确认它们的分子量(图2)。确认所述脂多糖具有大约3,000至大约10,000道尔顿的分子量，这与一般大肠杆菌脂多糖相比小得多。实施例4:除去从突变大肠杆菌(E.coil)纯化的脂多糖的毒性通过降解脂多糖中的脂质A而除去喜性将纯化的大肠杆菌(￡.co//)脂多糖调节到3mg/ml的浓度，并以1:1(体积)的混合比例将0.2NNaOH与所述脂多糖进行混合，并在60。C下脱酰基140分钟，其中每10分钟进行振动一次。-以起始0.2NNaOH的约1/5量加入1N醋酸，以滴定到pH7.0。画在滴定pH后，通过乙醇将所得到的混合物进行沉淀，以获得无毒脂多糖。-使用KDO法检测无毒脂多糖的浓度，并将所述无毒脂多糖与未处理的脂多糖在SDS-PAGE上进行比较，接着使用银染法确认其分子量。-作为银染的结果，显示脂多糖的脂质A被碱处理所降解，因此比未处理的脂多糖要小(图2)。对从无毒脂多糖除去毒性的确认进行炎症蛋白质的分泌测试和发热原测试，以确认所得LPS的毒性被降低到在选择合成较小LPS的菌株方法中的毒性的至少1/1,000，因此确认通过使用碱处理，其毒性被进一步降低。-炎症蛋白质的分泌检测THP-1(急性单核细胞性白血病)中所分泌的TNF-a的水平。观察到对照脂多糖分泌大量的TNF-oc，而无毒LPS(CIA05)分泌非常少量的TNF-oc，这说明由于毒性的炎症反应被显著緩解(图3)。-发热原测试对3只兔进行预防接种，以如下检测直肠中温度的变化。以每lkg兔0.2Ug/lml的量，将疫苗静脉内注射到兔耳中，接着将每个温度计插入到它们的直肠中，以检测它们温度的异常变化。在该实-险中使用体重至少1.5kg的兔。在该测试中使用的兔需要在在至少3天后被重复使用。使用能够检测精度o.rc温度的温度计来检测它们的体温。使用之前通过在250。C下加热至少30分钟而进行灭菌的注射器和针头。在从它们使用之前16个小时直到实验结束，仅对动物供给水。对动物的固定要尽可能的緩和。对体温的4全测时通过将温度计以60mm至90mm的固定深度插入直肠而进行，并检测确定时间后的温度。使用在注射疫苗之前所;险测的温度作为对照温度。在4企测对照温度后的15分钟内，将预温到大约37。C的样品静脉注射到兔耳中。每3小时对体温进行检测一次，在注射后，至少每l小时检测一次。计算所检测温度与对照体温之间的差异，该差异被称作体温差。最大的体温差被认为是测试动物的》文热反应。在该实验中使用3个动物样本。如果在3只动物中所检测到的温度和是1.3。C或更低，则发热原测试被认为是"阴性"，而如果是2.5。C或更高，则发热原测试被认为是"阳性"。重复该实验3次，该疫苗适合该实验，因为发热原测试;故证明是阴性的。下表2中列出结果。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>实施例5:寡聚脱氧核苷酸(ODN)和得自脂多糖的无毒多糖(CIA05)以及它们的活性ODN和CIA05混合物的效力测试在无菌条件下从健康成年男性取静脉血，并注入到含有抗凝血剂肝素的真空管中。将所得到的全血与RPMI1640培养基(2mML-谷氨酰胺，lmM丙酮酸钠，80jig/ml庆大霉素)以1:1的混合比例进行混合。将20jlUCIA07(50jjgCIA02+1jag或500ngCIA05,100ng)或20ju1HBSS力口入至'Jlml与培养基混合在一起的全血中，接着在37。C下在5。/。c02培养箱中孵育24小时。接着，收集培养物上清，以使用可以商业渠道获得的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒4企测所分泌TNF-ct(R&D系统，DY210)和所分泌IL-12p40(R&D系统，DY1240)的水平。结果在图3至图6中显示。从上述的结果可以看出，发现CIA05显示出免疫刺激作用，而不论是否在所述寡聚脱氧核苷酸(ODN)中存在GC序列。特别地，发现不含未曱基化CG的ODN(无CG(nonCG))如果单独使用的话，会显示出与用作对照的生理盐水相似的免疫刺激效果，但如果与CIA05联合使用(nonCG+CIA05)，则会显示出强免疫刺激效果(图4)。通过ODN中GC序列的胞嗜啶曱基化明确确认了这种协同作用。即，如果单独使用，则在7卯9ODN(7909)GC序列的胞嘧啶残基被甲基化的ODN(m7909)显示出低免疫刺激效果，但如果与CIA05(m7909+CIA05)联合使用，则显示出与7卯9ODN和CIA05混合物(7909+CIA05)情况中几乎同样强的免疫刺激效果。因此，确认，CIA05提高的DNA抗癌效力与未曱基化的CG不相关(图5)。同样，发现含有硫代磷酸酯的ODN也显示出改进的免疫效力。7卯9(s)是7卯9ODN中二酯键被硫代磷酸酯所取代的寡聚脱氧核苦酸(图6)。使用小鼠模型系统对CIA抗癌作用的检测MBT-2细胞系被用于确定ODN+CIA05对治疗患有膀胱癌的C3H/HeJ小鼠(雌性，4周大，19至21g)中膀胱癌的作用。从给予肿瘤细胞系之后当曰，使用ODN+CIA05对C3H/HeJ小鼠进行治疗。每天给予肿瘤细胞系(总共13次)持续l周，接下来的两周每两天给予一次。将肿瘤细胞系给药到C3H/HeJ小鼠的右侧腹(rightflank),并使用皮下注射作为给予途径。通过检测癌损伤的垂直半径并比较实验组的死亡率来确定ODN+CIA05对治疗膀胱癌的作用。下面描述详细的实验。选择C3H/HeJ小鼠，并适应实验环境1周，接着在第0天时间点，将MBT-2膀胱癌细胞系以5Xl()S个细胞/100jil的密度皮下给药到C3H/HeJ小鼠的右侧腹。将CIA07皮下给药到与给药肺瘤细胞相同的位点，并从第1天时间点开始每日进行给药持续1周，接下来的两周每两天给药一次。在第10天至第45天期间，每2天给药CIA07以检测损伤的垂直直径(图7)。如图7所示，发现如果共同使用，CIA05和ODN显示出比它们单独使用时强得多的抗癌作用。特别地，发现如果将CIA05和ODN混合在一起，ODN中存在未甲基化的CG不是重要的。工业实用性本发明的得自细菌的物质(CIA05)可以诱导比传统寡聚脱氧核苷酸单独用作治疗药剂更有效和特异性的抗癌功能。因此，从工业角度来看，本发明的得自大肠杆菌(￡.co//)的抗癌药物是非常有用的。权利要求1.一种用于治疗癌症的组合物，其包含(a)寡聚脱氧核苷酸(ODN)；以及(b)得自细菌LPS的无毒高分子物质。2.根据权利要求要求1所述的用于治疗癌症的组合物，其中，所述寡聚脱氧核苷酸大小为至少20聚体。3.根据权利要求1所述的用于治疗癌症的组合物，其中，所述寡聚脱氧核苷酸含有CG基序。4.根据权利要求1所述的用于治疗癌症的组合物，其中，所述寡聚脱氧核苷酸不含CG基序。5.根据权利要求1或3所述的用于治疗癌症的组合物，其中，所述脱氧核苷酸在胞嘧啶残基处被曱基化。6.根据权利要求1或3所述的用于治疗癌症的组合物，其中，所述脱氧核苷酸在胞嘧啶残基处未被甲基化。7.根据权利要求1-4中任一项所述的用于治疗癌症的组合物，其中，所述脱氧核苦酸包含选自由SEQIDNO:1、SEQIDNO:2和SEQIDNO:3中所描述的核苷酸序列所组成的组中的序列。8.根据权利要求1所述的用于治疗癌症的组合物，其中，所述得自细菌LPS的无毒高分子物质具有2,000至10,000道尔顿(Da)的分子量。9.根据权利要求1所述的用于治疗癌症的组合物，其中，所述寡聚核苷酸与所述得自细菌LPS的无毒高分子物质的重量比在500:l至l:500的范围内。10.根据权利要求1所述的用于治疗癌症的组合物，其中，所述细菌选自由大肠杆菌和分枝杆菌所组成的组中。11.根据权利要求1所述的用于治疗癌症的组合物，其中，所述组分(a)和(b)通过振动得以混合。12.根据权利要求1所述的治疗癌症的组合物，其中，所述组合物免疫刺激T辅助细胞1型。13.根据权利要求1所述的用于治疗癌症的组合物，其中，所述组合物刺激NK细胞活性。全文摘要本发明公开了一种用于治疗癌症的组合物，其包含寡聚脱氧核苷酸和得自LPS的无毒脂多糖作为有效组分。文档编号A61P35/00GK101394857SQ200680053611公开日2009年3月25日申请日期2006年2月1日优先权日2006年2月1日发明者俞元一,安宝暎,李奈暻,赵良济,金斗植申请人:爱吉恩公司;大熊株式会社