专利名称：：B7-h4在肺癌细胞中的表达与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种B7-H4在肺癌细胞中的表达方法与应用，属于生物医学
技术领域：
。技术背景随着全世界工业化进程的加快，大气环境的恶化，以及吸烟人群的不断增加，20世纪70年代以后肺癌发病率和死亡率在全世界范围内均不断增长，其中非小细胞肺癌占75%，至90年代肺癌己成为人类肿瘤致死的第一杀手。然而，在肺癌发病率不断增长的同时，肺癌治疗效果并未取得突破性进展，肺癌总的治愈率仍低于15%，最主要原因之一是，至今对于晚期肺癌尚无有效的治疗手段。从免疫学角度对其进行研究和治疗是一条很有希望的途径。现认为肿瘤细胞上缺少CDs。和CDM的表达是免疫逃逸的主要原因。然而，负性共刺激分子通过两种方法来诱导T细胞无力一是诱导抑制性因子表达在效应性免疫细胞上，二是诱导抑制性因子受体表达在肿瘤细胞上。CDm和PD-1是众所周知的抑制性因子，阻断抑制性因子的表达是治疗肿瘤的新途径。抗CD,52抗体已成功应用于黑色素瘤和卵巢癌的治疗中，现也注意到PD-L1在许多癌中表达丰富，因此，负性共刺激分子对于调控免疫反应是非常重要的。B7-H3和B7-H4(B7x，B7Sl)是最近发现的B7家族成员，B7-H4的体外试验发现，细胞相关的、非可容性的B7-H4能够抑制T细胞增殖、细胞因子分泌和CTL的诱导，其机制是通过抑制细胞周期中的G。/Gi相和细胞分裂。可容性的B7-H4可以抑制CD8+T细胞的增殖和成熟及CTL的活性，认为B7-H4在相对早期阶段抑制T细胞反应。Prasad等认为B7-H4介导的T细胞抑制能够被抗-B7-H4的封闭抗体逆转，引起更强的增殖和IL-2的产生(2)。在体内，注入抗B7-H4抗体可使自身免疫性脑脊髓膜炎加重，这些结果显示了B7-H4在T细胞反应负性调节中的重要地位。但B7-H4在肿瘤细胞中的表达报道很少。
发明内容针对B7-H4在抑制肿瘤细胞中研究的不足，本发明提供了B7-H4在肺癌细胞中的表达与应用。本发明B7-H4在肺癌细胞中的表达方法,步骤如下一、细胞株及其培养人的肺腺癌细胞株A549、H簡、H23、Wark;人的肺鳞癌细胞株U1752;肺癌大细胞株U1810。培养液为RPMI1640+10%FCS。二、表达方法1、肺癌组织常规石蜡包埋、切片；2、H.E染色及观察;3、免疫组化检测B7-H4和CD45的表达；采用连续切片，切片分实验组和空白对照组。免疫组染色采用生物素一H菌卵白素一过氧化物酶方法(VectastinABC试剂:VECTOR实验室，INC，.EA.CLSA)。福尔马林固定手术标本，石蜡包埋，切片厚度4um，二甲苯脱蜡，阶梯酒精内水化，900w微波加热2'，进行抗原修复，0.3%的HA30min阻断内源性抗原，10%正常的血清孵育阻断背景非特异性染色。加入一抗鼠抗B7-H4(1:1000稀释)(NordiBiositeAB)过夜、CD45抗体(1:100稀释)(Pharmingen，SamDiego.CA,USA)室温2小时、生物素包被的马抗鼠抗体孵育30分，卵白素连接的过氧化物酶孵育30分种，DAB孵育，苏木素复染。4、RT-PCR检测肺癌细胞株A549、H1299、H23、Wark、U1752和U1810中B7-H4的表达(1)B7-H4引物上游引物序列5'GCAGATCCTCTTCTGGAGCA3，下游引物序列5，TTAGCATCAGGTAAGGGCTGA3，(2)内参照GADPH引物上游引物序列5，AGTACGCTGCAGGGCCTCACTCCTT3，下游引物序列5，AAGAGCCAGTCTCTGGCCCCAGCCA3，(3)逆转录反应细胞总RNAdNTP混合物(lOMtn)RnasinRibonucleaseInhibitor下游引物MgCl2(25Mm)10XbufferAMVReverseTranscriptaseDEPC水总反应体积20uL短暂离心混匀，37'C反应30min，95'C放置lOmin灭活M-MLV逆转录酶，冰浴5min，短暂离心使管壁的水份沉于管底。(4)PCR反应体系4.0uL(lug)2.OiiL0.L1.0yL4.OtiL2.OtiL5.5yL前面反应所得混合液4.OyLdNTP混合物(10mM)0.4nL上游引物1.OyLMgCI2(25mM)0.8nL10Xbuffer1.6pLTaqDNA聚合酶0.5nLDEPC11.7uL总反应体积20将以上反应体系各组分依次加入后混匀，短暂离心。于下列条件下进行PCR扩增94。C20s，56°C20s,72。C60s，72。C10min，进行35个循环。(5)电泳2%凝胶进行电泳；结果观察在紫外检测仪下与Marker比较，观察结果。5、人B7-H4的一个剪接形式的克隆和测序RT-PCR扩增的片断用2%的GTG琼脂糖凝胶分离和获取。然后把这一片断亚克隆到TA克隆载体中。用ABI-PRISMTerminator循环反应试剂盒进行测序。6、流式细胞仪分析肺癌细胞株A549、H1299、H23、Wark、U1752和U1810表面B7-H4的表达用PE标记的抗鼠抗体4'C孵育30分。通过单抗确定非特异性染色。我们应用PE标记的抗B7-H4抗体和独特型对照来确定B7-H4的表达。7、统计分析通过Fisher精确检验来分析B7-H4的表达与临床病理变量之间的关系；用不配对T检验来分析B7-H4与TIL之间的关系。本发明所述的B7-H4的表达方法可用于治疗外周非淋巴组织的癌变中。三、结果通过Fisher精确检验来分析B7-H4的表达与临床病理变量之间的关系；用不配对T检验来分析B7-H4与TIL之间的关系1.人肺癌细胞株中B7-H4mRNA的表达B7-H4转录产物仅在A549细胞株中表达，其它细胞株不表达。2.人肺癌细胞株膜表面B7-H4蛋白的表达水平通过FACS分析发现，所有的细胞株膜表面均检测不到B7-H4蛋白的表达。3.发现一个新的B7-H4mRM的剪接形式通过RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳发现，细胞株A549的B7-H4有两条带，其中一条501bp的短带在正常外周血和单核细胞源性树突状细胞中没有出现。将其克隆并测序。基因库提供其序列数据，其存取码为BankU729346。根据人B7-H4(CCDS:894.1)，501bp的短带是由B7-H4mRNA的一个剪接形式所产生的，它缺乏编码IgC结构域的CDS3，命名为dv-B7-H4，见图1。4.B7-H4在人NSCLC标本中的表达在多数标本中，B7-H4在肿瘤细胞上的表达形式是弥漫性的。表达在细胞膜或胞浆内或两者。病灶中浸润性淋巴细胞不表达B7-H4，见图2。70例标本中，B7-H4阳性42.9%(30/70)。B7-H4表达强度的分布。5.NSCLC标本中B7-H4的表达与TILs的相关性B7-H4阳性标本的TILs为23.9±13.36，明显低于B7-H4阴性标本中的TILs(33.17±16.29，p=0.0174)。6.B7-H3和B7-H4的表达与临床参数的相关性表1显示了B7-H4的表达强度与临床病理因素之间的关系。腺癌中B7-H4阳性占50%(16/32)，而鳞癌占36.8%(14/38)，统计学上无显着性差异(P>0.05)。没发现其它因素(年龄、性别、吸烟史或分化程度)与B7-H3或B7-H4的表达有关。在有淋巴结转移的56例标本中，23例高表达B7-H4。在14例未发生淋巴结转移的病人中，仅1例高表达B7-H4。B7-H4的表达与淋巴结转移高度有关(p=0.023)。见图3。表1、肿瘤细胞B7-H4的表达与临床病理参数的相关性<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>图l.是B7-H4mRNA的一个剪接形式，顺序数据己注册于GenBank,no.bankit729346。图2.是原发性非小细胞肺癌标本中免疫组织化学染色(X200):A:B7-H4阳性表达(+++);B:B7-H4阳性表达(+);P=0.0174。图3.是B7-H4表达强度与淋巴结转移的关系。具体实施方式实施例B7-H4在肺癌细胞中的表达方法，步骤如下一、细胞株及其培养人的肺腺癌细胞株A549、H1299、H23、Wark;人的肺鳞癌细胞株U1752;肺癌大细胞株U1810。培养液为RPMI1640+10%FCS。二、表达方法1、肺癌组织常规石蜡包埋、切片；2、H.E染色及观察;3、免疫组化检测B7-H4和CD45的表达；(l)采用连续切片，切片分实验组和空白对照组。免疫组染色釆用生物素一链菌卵白素一过氧化物酶方法(VectastinABC试剂:VECTOR实验室，INC，EA.CLSA)。福尔马林固定手术标本，石蜡包埋，切片厚度4um，二甲苯脱蜡，阶梯酒精内水化，900w微波加热2'，进行抗原修复，0.3%的HA30min阻断内源性抗原，10%正常的血清孵育阻断背景非特异性染色。加入一抗鼠抗B7-H4(1:1000稀释)(NordiBiositeAB)过夜、CD45抗体(1:100稀释)(Pharmingen，SamDiego.CA,USA)室温2小时、生物素包被的马抗鼠抗体孵育30分，卵白素连接的过氧化物酶孵育30分种，DAB孵育，苏木素复染。4、RT-PCR检测肺癌细胞株A549、H1299、H23、Wark、U1752和U1810中B7-H4的表达(1)B7-H4引物上游引物序列5，GCAGATCCTCTTCTGGAGCA3'下游引物序列5'TTAGCATCAGGTAAGGGCTGA3，(2)内参照GADPH引物上游引物序列5，AGTACGCTGCAGGGCCTCACTCCTT3，下游引物序列5'AAGAGCCAGTCTCTGGCCCCAGCCA3'(3)逆转录反应细胞总RNA4.OnL(lng)dNTP混合物(10Mm)2.OyLRnasinRibonucleaseInhibitor0.5iiL下游引物1.OiiLMgCl2(25Mm)4.OnL10Xbuffer2.0yLAMVReverseTranscriptasel.OuLDEPC水5.5uL总反应体积20PL短暂离心混匀，37。C反应30min，95。C放置lOmin灭活M-MLV逆转录酶，冰浴5min，短暂离心使管壁的水份沉于管底。(4)PCR反应体系前面反应所得混合液4.0uLdNTP混合物(10mM)0.4yL上游引物l.OuLMgCI2(25mM)10Xbuffer0.8uL1.6yL0.L11.7uL20yLT叫DNA聚合酶DEPC总反应体积将以上反应体系各组分依次加入后混匀，短暂离心。于下列条件下进行PCR扩增94。C20s'56°C20s，72。C60s,72。C10min，进行35个循环。(5)电泳2%凝胶进行电泳；结果观察在紫外检测仪下与Marker比较，观察结果5、人B7-H4的一个剪接形式的克隆和测序RT-PCR扩增的片断用2X的GTG琼脂糖凝胶分离和获取。然后把这一片断亚克隆到TA克隆载体中。用ABI-PRISMTerminator循环反应试剂盒进行测序。6、流式细胞仪分析肺癌细胞株A549、H1299、H23、Wark、U1752和U1810表面B7-H4的表达。用PE标记的抗鼠抗体4。C孵育30分。通过单抗确定非特异性染色。我们应用PE标记的抗B7-H4抗体和独特型对照来确定B7-H4的表达。权利要求1.一种B7-H4在肺癌细胞中的表达方法，其特征在于，步骤如下(1)细胞株及其培养人的肺腺癌细胞株A549、H1299、H23、Wark；人的肺鳞癌细胞株U1752；肺癌大细胞株U1810，培养液为RPMI1640+10％FCS；(2)表达方法①、肺癌组织常规石蜡包埋、切片；②、H.E染色及观察；③、免疫组化检测B7-H4和CD45的表达采用连续切片，切片分实验组和空白对照组，免疫组染色采用生物素-链菌卵白素-过氧化物酶方法，福尔马林固定手术标本，石蜡包埋，切片厚度4um，二甲苯脱蜡，阶梯酒精内水化，900w微波加热2min，进行抗原修复，0.3％的H2O230min阻断内源性抗原，10％正常的血清孵育阻断背景非特异性染色，加入一抗鼠抗B7-H4过夜、CD45抗体室温1～3小时、生物素包被的马抗鼠抗体孵育30分，卵白素连接的过氧化物酶孵育30分种，DAB孵育，苏木素复染；④、RT-PCR检测肺癌细胞株A549、H1299、H23、Wark、U1752和U1810中B7-H4的表达；⑤、人B7-H4的一个剪接形式的克隆和测序；⑥、流式细胞仪分析肺癌细胞株A549、H1299、H23、Wark、U1752和U1810表面B7-H4的表达；⑦、统计分析。2、如权利要求1所述的B7-H4在肺癌细胞中的表达方法，其特征在于，步骤(2)中RT-PCR的B7-H4引物为上游引物序列5'GCAGATCCTCTTCTGGAGCA3'下游引物序列5'TTAGCATCAGGTAAGGGCTGA3，RT-PCR的内参照GADPH引物为上游引物序列5'AGTACGCTGCAGGGCCTCACTCCTT3，下游引物序列5，AAGAGCCAGTCTCTGGCCCCAGCCA3，》3、一种如权利要求1所述的B7-H4在肺癌细胞中的表达方法的应用，其特征在于，可应用于外周非淋巴组织的癌变治疗药物中。全文摘要一种B7-H4在肺癌细胞中的表达与应用，属于生物
技术领域：
。本发明通过RT-PCR和FACS流式细胞仪等方法对B7-H4在人的肺腺癌细胞株(A549、H1299、H23、Wark)、人的肺鳞癌细胞株(U1752)、人的肺癌大细胞株(U1810)中的mRNA和蛋白表达进行了分析；RT-PCR扩增的片断用2％的GTG琼脂糖凝胶分离和获取，将其克隆和测序；通过免疫组化来检测NSCLC病人肺癌组织中B7-H4的表达水平，分析它们的表达与临床参数之间的关系。本发明所述的B7-H4在肺癌细胞中的表达方法可应用于外周非淋巴组织的癌变治疗药物中。文档编号A61P35/00GK101270354SQ20071001368公开日2008年9月24日申请日期2007年3月19日优先权日2007年3月19日发明者孙玉萍申请人:孙玉萍