专利名称：自组装仿生磷脂聚合物组织细胞膜的制备及应用的制作方法
技术领域：
本发明属高分子材料膜技术领域，特别是涉及一种自组装仿生磷脂聚合物组织细胞膜
的制备和在药物渗透中的应用。
背景技术：
生物利用度是衡量一种药物能否开发成有效的临床药物的重要指标之一。药物的生物
利用度受一系列因素的影响，具有关报道，80%的药物通过肠上皮细胞的非自发扩散渗透 进入血液。有研究表明，吸收性的数据能够用于早期药物开发中的体外活性分析。
近十余年来，国外已普遍采用组织细胞模型作为药物吸收性研究的工具，主要有 Caco-2细胞单层模型、MDCK细胞模型等。
Caco-2细胞模型来源于人的结肠癌细胞，是著名的小肠吸收模型，该模型的研究结果 与体内药物的处置有较好的相关性。Caco-2细胞模型现己被作为小分子药物口服吸收的体 外筛选模型，为发达国家的药物研究机构或开发公司广泛采用。
MDCK细胞模型来源于犬科动物的肾细胞，该细胞可以形成紧密结合的单细胞层。
Caco-2细胞单层模型、MDCK细胞模型在使用时均需要实验室培养，利用传统培养方 法至少需要21天才具有模拟细胞膜的性质，而且不同研究者所建立的细胞模型方法存在 一些差异，不同实验室对同一模型的评价结果也可能不尽相同。另外，还存在储存时间短， 操作麻烦，成本高等缺陷。因而建立一种用于分析药物渗透和吸收性的体外仿生膜模型己 成为世界药物学家关注的前沿。
2002年7月在旧金山召开了第一届人工膜渗透性研究的国际会议，会上介绍了一种新 的人工膜PAMPA模型，但该模型尚存在不足之处，主要在于U)PAMPA价格虽然比Caco-2 细胞模型低，但此模型自动化程度高，对少量样品的试验来说，其成本较大，因而对普通 实验室的少样测试不方便；(2)PAMPA是溶液成膜，会对某些试验测试造成误差；(3)PAMPA 是小分子磷脂制成的双分子膜，不稳定，影响药物检测的结果；(4)目前PAMPA采用卵磷 脂膜以模拟肠的吸收性能，模拟的细胞膜部位尚嫌单一。
本发明制备的自组装仿生磷脂聚合物组织细胞膜的原理是细胞膜结构具有亲水的 头、疏水的尾，膜中磷脂呈液晶结构，这种结构容许离子传递和分子运动；将极性磷酸胆 碱基或其衍生物引入疏水脂肪链上，这种材料在水溶液中或在生理条件下可以自组装成亲
水头、疏水尾的结构；材料自组装以后，将疏水链末端的双键打开，使分子间疏水端縮合，
从而保证了疏水链始终在内部，亲水端始终在表面，这种磷脂聚合物保证了材料在成膜以
后，更好模拟组织细胞膜的结构和性能。
发明内容
本发明的目的是提供一种自组装仿生磷脂聚合物组织细胞膜的制备方法及其在药物吸 收中的用途。该制备方法简单快速、成本低、所得膜储存时间长，可加快新药筛选和开发 的速度。
本发明的一种自组装仿生磷脂聚合物组织细胞膜的制备方法，包括下列步骤-(1)按式(I )的路线合成单体-
<formula>formula see original document page 5</formula>脂肪族二元醇，Et3N溶于干燥的THF中，冷却至0'C，搅拌滴加甲基丙稀酰氯，温度 在0'C，混合物升温至50'C反应2h，过滤，洗涤，层析柱分离得甲基丙稀酸脂肪族二元醇 酯，展开剂为Et0Ac/hexanes 20/80;所得甲基丙稀酸脂肪族二元醇酯，Et3N溶于干燥的 THF中，冷却至-20°C， C0P溶于干燥的THF中，搅拌滴加溶液，温度在-2(TC -30'C， 3h， 过滤，洗涤，干燥得单体中间体无色液体；单体中间体和干燥乙腈，冷却至-20'C，加入
无水Me3N，混合物升温至6(TC反应16h,冷却至-20°C，氮气下过滤沉淀，干燥的乙腈洗 涤，减压干燥得磷脂聚合物单体；
(2)按式(II)的路线制备齐聚物: CH,
n H,C=l
o
<formula>formula see original document page 6</formula>物。
单体在引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)存在下5(TC 70'C反应10-24h，得到齐聚物产
所述的脂肪族二元醇选自1,8-辛二醇，1, IO—癸二醇或1， 12-十二元二醇； 所述合成仿生膜单体的一般具有式(III)的结构
<formula>formula see original document page 6</formula>(III)
其中n二8， 10， 12。
所述的齐聚物是指特征为原料中水份0 0.3 (%)，分子量12000 20000，疏水链 段碳原子的数目8 12，极性磷脂含量0. 5wt % 20wt%，玻璃转化温度(Tg) 48. 3 63. 2 'C，接触角(0A) 70° 120°的齐聚物；
所述的仿生磷脂聚合物组织细胞膜是指含有疏水性脂肪烃端和亲水性磷脂基团齐聚 物，其单体包括含亲水性磷脂极性头部端基和疏水性脂肪烃尾部链段，其齐聚物作为成膜
聚合物的原料；
所述的亲水性磷脂基团选自卵磷脂，脑磷脂； 所述的疏水性脂肪烃选自辛基，癸基或十二烷基，优选不饱和脂肪烃；
所述的仿生磷脂聚合物组织细胞膜是指其分子形态随环境PH值变化，当pH值为2 6.5时，表现为脂质双分子层样结构；pH值为7.3 10.5时，表现为单分子层；pH值〉10.5 时，表现为双分子层微管；
所述的仿生磷脂聚合物细胞膜是指分子形态为单分子层，其厚度〈0.75mra，分子形态 为双分子层，其厚度〉0.75mm;
所述的仿生磷脂聚合物细胞膜是可通过控制聚合物的分子量大小、疏水性脂肪烃端的 长度和磷脂含量，调节合成磷脂聚合物的稳定性和弹性。
在疏水链上引入不同极性磷脂基或其衍生物如卵磷脂、脑磷脂等，可用于制备建立不 同靶目标的模拟细胞膜模型，该模型可以是卵磷脂基仿生膜建立小肠模拟细胞膜模型或脑 磷脂基仿生膜建立脑组织模拟细胞膜模型，与体内实验数据或药物参数比较，可以建立模 拟模型P=VdC/ACodT， P—渗透率，V—接受液体积，A—膜表面积，Co—供体液浓度，dC/dT 一浓度变化速率。
本发明的有益效果-
(1) 合成的磷脂聚合物含有两性端基，使得磷脂聚合物容易自组装形成与生物膜非 常相似的微观非均相结构；
(2) 由于两性端基的存在，磷脂聚合物的分子形态随着周围环境pH值的变化而变化， 因而表现出环境敏感性，可以调节渗透液体的pH值的大小，而模拟不同器官组织的pH值 变化；
(3) 通过控制聚合物的分子量大小、疏水链段的长度和磷脂含量，调节合成磷脂聚 合物的稳定性和弹性，也可根据分子形态随环境pH值变化制备单层膜，或制备双层膜；
(4) 在疏水链上引入不同极性磷脂基或其衍生物如卵磷脂、脑磷脂等，可以建立不 同靶目标的模拟细胞膜模型。
图是聚合物在不同PH值水溶液中的形态，其中，(a)脂质双分子层样结构，pH值在2 6.5; (b)单分子层，pH值在7.3 10.5; (c)双分子层微管，pH值在〉10.5。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限 定的范围。
实施例1
精确称取1, 8-辛二醇28. 76g (0. 197mol), Et3N33. lg (0. 327mol)溶于200mL干燥 的THF中，冷却至0t:，搅拌缓慢滴加甲基丙稀酰氯20.6g (0. 197mol)，保持温度在0。C， 混合物升温至5(TC反应2h,经过滤，洗涤，层析柱分离得无色液体甲基丙稀酸辛二醇酯， 展开剂为EtOAc/hexanes 20/80。精确称取甲基丙稀酸辛二醇酯32. 96g (0. 154mol)， 15. 6g Et3N (0.154 mol)溶于200mL干燥的THF中，冷却至-20。C， 21. 9g (0.154mol) COP溶 于lOOmL干燥的THF中，搅拌缓慢滴加溶液，保持温度在-20 -3(TC3h，经过滤，洗涤， 干燥得2- (2-oxo-l， 3, 2-diox即hospholoyloxy) ethyl raethacrylate无色液体。精确称 取2- (2-oxo-l， 3, 2-diox邻hospholoyloxy) ethyl methacrylate5. 0g禾口 30ml干燥乙腈， 冷却至-20°C，快速向溶液中加入2ml无水Me3N，混合物升温至6(TC反应16h，冷却至-20 °C，氮气下过滤沉淀，干燥的乙腈洗涤，减压干燥得磷脂聚合物单体。称量适当的磷脂聚 合物单体和AIBN溶于甲醇一THF混合液中置入聚合试管中，氮气保护下封闭试管，试管 6(TC振荡反应16h，冷却停止反应，减压收集得到磷脂聚合物。
实施例2
精确称取1， 9-壬二醇31, 52g (0. 197mol)， Et3N33. lg (0. 327mol)溶于200mL干燥 的THF中，冷却至0。C，搅拌缓慢滴加甲基丙稀酰氯20.6g (0. 197m0l)，保持温度在0。C， 混合物升温至5(TC反应2h，经过滤，洗涤，层析柱分离得无色液体甲基丙稀酸辛二醇酯， 展开剂为EtOAc/hexanes 20/80。精确称取甲基丙稀酸辛二醇酯34. 25g (0.154mol)， 15. 6g Et3N (0.154 mol)溶于200mL干燥的THF中，冷却至-20°C， 21. 9g (0.154mol) COP溶 于100mL干燥的THF中，搅拌缓慢滴加溶液，保持温度在-20~-30°C3h，经过滤，洗涤， 干燥得2- (2-oxo-l， 3, 2-dioxaphospholoyloxy) ethyl methacrylate无色液体。精确称 取2- (2-oxo-l， 3， 2 dioxaphospholoyloxy) ethyl methacrylate5. 0g和30ml干燥乙腈， 冷却至-2(TC，快速向溶液中加入2ml无水Me3N，混合物升温至6(TC反应16h,冷却至-20 'C，氮气下过滤沉淀，千燥的乙腈洗涤，减压干燥得磷脂聚合物单体。称量适当的磷脂聚 合物单体和AIBN溶于甲醇一THF混合液中置入聚合试管中，氮气保护下封闭试管，试管 6CTC振荡反应16h，冷却停止反应，减压收集得到磷脂聚合物。
实施例3
将少量的合成的卵磷脂聚合物放置在PAMPA的微孔上，PAMPA由上下两个腔室组成， 上层为供体液(缓冲溶液和药物)，下层为接收液(缓冲溶液)，缓冲溶液由50mM磷酸钠 (p服.0-7.5)， 50mM拧檬酸钠(pH3.0-5. 5)， 50mM硼酸钠(pH8. 0-10.0)组成，30。C培 养2 15小时形成卵磷脂聚合物仿生细胞膜。接收液中溶液的浓度由UV光谱来测量。少 量测试磺胺撒克西啶，诺福克，双氢克尿塞，立痛定，心得安，戊脉安等几种药物渗透率 分别为16.0， 45.0， 16.0， 128.0， 133.0， 148. Onm/s。
权利要求
1.一种自组装仿生磷脂聚合物组织细胞膜的制备方法，包括下列步骤(1)合成单体脂肪族二元醇，Et3N溶于干燥的THF中，冷却至0℃，搅拌滴加甲基丙稀酰氯，温度在0℃，混合物升温至50℃反应2h，过滤，洗涤，层析柱分离得甲基丙稀酸脂肪族二元醇酯，展开剂为EtOAc/hexanes 20/80；所得甲基丙稀酸脂肪族二元醇酯，Et3N溶于干燥的THF中，冷却至-20℃，COP溶于干燥的THF中，搅拌滴加溶液，温度在-20℃～-30℃，3h，过滤，洗涤，干燥得单体中间体无色液体；单体中间体和干燥乙腈，冷却至-20℃，加入无水Me3N，混合物升温至60℃反应16h，冷却至-20℃，氮气下过滤沉淀，干燥的乙腈洗涤，减压干燥得磷脂聚合物单体；(2)制备齐聚物单体在引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)存在下50℃～70℃反应10-24h，得到齐聚物产物。
2. 根据权利要求1所述的自组装仿生磷脂聚合物组织细胞膜的制备方法，其特征在于 所述的脂肪族二元醇是1,8-辛二醇，1， IO—癸二醇或1， 12-十二元二醇。
3. 根据权利要求1所述的自组装仿生磷脂聚合物组织细胞膜的制备方法，其特征在于所述合成仿生膜单体具有式(III)的结构<formula>formula see original document page 2</formula>(m)n二8， 10， 12 ， X基团是H时，磷脂是磷酸(PA)， x基团是GH2CH2W(eH3)3，磷脂 是卵磷脂(PC)。
4. 根据权利要求1所述的自组装仿生磷脂聚合物组织细胞膜的制备方法，其特征在于 所述的齐聚物是指原料中水份0 0.3 (%)，分子量12000 20000,疏水链段碳原子的 数目8 12，极性磷脂含量0.5wt % 20wt%，玻璃转化温度(Tg) 48.3 63.2°C，接触 角(6 J 70。 120°的齐聚物。
5. 根据权利要求1所述的自组装仿生磷脂聚合物组织细胞膜的制备方法，其特征在于<formula>formula see original document page 2</formula> 所述的仿生磷脂聚合物组织细胞膜是指含有疏水性脂肪烃端和亲水性磷脂基团齐聚物，其 单体包括含亲水性磷脂极性头部端基和疏水性脂肪烃尾部链段，其齐聚物作为成膜聚合物 的原料。
6. 根据权利要求1所述的自组装仿生磷脂聚合物组织细胞膜的制备方法，其特征在于所述的仿生磷脂聚合物组织细胞膜，其分子形态随环境pH值变化，当pH值为2 6.5时， 表现为脂质双分子层样结构；pH值为7.3 10.5时，表现为单分子层；pH值M0.5时，表 现为双分子层微管。
7. 根据权利要求1所述的自组装仿生磷脂聚合物组织细胞膜的制备方法，其特征在于 所述的仿生磷脂聚合物细胞膜是指分子形态为单分子层，其厚度〈0.75mm，分子形态为双 分子层，其厚度〉0.75mm。
8. 根据权利要求1所述的自组装仿生磷脂聚合物组织细胞膜的制备方法，其特征在于 所述的仿生磷脂聚合物细胞膜是可通过控制聚合物的分子量大小、疏水性脂肪烃端的长度 和磷脂含量，调节合成磷脂聚合物的稳定性和弹性。
9. 根据权利要求5所述的自组装仿生磷脂聚合物组织细胞膜的制备方法，其特征在于-所述的亲水性磷脂选自卵磷脂，脑磷脂，疏水性脂肪烃选自辛基，癸基或十二烷基。
10. 根据权利要求9所述的自组装仿生磷脂聚合物组织细胞膜的制备方法，其特征在于 疏水性脂肪烃是不饱和脂肪烃。
11. 一种自组装仿生磷脂聚合物组织细胞膜的应用于建立不同靶目标的模拟细胞膜模型。
12. 根据权利要求11所述的一种自组装仿生磷脂聚合物组织细胞膜的应用，其特征在于 所述的仿生磷脂聚合物组织细胞膜是卵磷脂基仿生膜建立小肠模拟细胞膜模型或脑磷脂 基仿生膜建立脑组织模拟细胞膜模型。
全文摘要
本发明涉及一种自组装仿生磷脂聚合物组织细胞膜的制备及应用，制备包括(1)单体制备；(2)齐聚物制备；将亲水性的磷脂基团或其衍生物连接端基含有双键的疏水性脂肪烃上，合成出能自组装形成与生物膜非常相似的微观非均相结构，通过调节渗透液体pH值大小，可模拟不同器官组织的pH值变化，或通过控制聚合物的分子量大小、疏水链段的长度和磷脂含量，调节合成磷脂聚合物的稳定性和弹性，根据需要调节成膜面积的大小和成膜的厚度，根据分子形态随环境pH值变化制备单层膜，或制备双层膜，该方法简单快速，储存时间长，成本低，有助于加快新药筛选和开发的速度。本发明应用于在疏水链上引入不同极性磷脂基或其衍生物如卵磷脂、脑磷脂等，建立不同靶目标的模拟细胞膜模型。
文档编号A61L31/06GK101108260SQ200710041290
公开日2008年1月23日 申请日期2007年5月25日 优先权日2007年5月25日
发明者晖 于, 亓雪莲, 艳 付, 恒 吴, 丽 张, 段友容, 沈新元, 郈 罗, 顾晓华 申请人:东华大学