专利名称：一种RNAi载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及载体及其应用，特别是涉及一种RNAi载体及其在制备抑制靶基因表达的基因治疗性药物中的应用。
背景技术：
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种在小双链RNA(dsRNA)的介导下降解同源基因的现象。长的dsRNA被加工成21-23nt并包含2个nt悬挂结构的短干扰RNA(siRNA)。siRNA可以和RNA诱导的沉默复合体(RNA induced silencing complex，RISC)结合，续而经过一系列反应，最终沉默特定的内源基因。由于RNAi具有特异性强、沉默效率高的特点，故而被广泛运用在沉默特定基因上。近些年来，很多基于RNAi的方法被发明出来，特别是利用RNAi沉默特定的癌基因，以便进行基因功能的研究或肿瘤的基因治疗。
最初直接使用dsRNA进行基因沉默。虽然双链RNA可以达到不错的沉默效果，但由于RNA酶广泛存在于自然界和生物体内，双链RNA会迅速降解，因此无法实现肿瘤的基因治疗的目的。举例来说，在小鼠体内，dsRNA的半衰期大约仅仅只有10秒，所以为了让药物到达靶点，必须采用高压注射的方法，使药物在短时间内迅速流过整个循环系统。由于人的血容量比小鼠大的多，为了将药物运送至靶点所需要的压力更高，超出了人类循环系统所能负担的极限，因而直接使用dsRNA制备基因沉默药物是不可行的。同时，由于dsRNA在体内不能自动合成，所以必须定期给药以便达到长时间的抑制效果，而人工合成dsRNA比较昂贵，因此也将影响直接用dsRNA制备基因治疗药物的前景。
近些年来，为了克服上述困难，基于载体质粒的RNAi技术被发明出来，即将siRNA对应的cDNA插入到载体质粒中，通过转染的方式将重组质粒导入细胞。在特定启动子的帮助下，细胞将cDNA转录成siRNA，此后继续进行正常的RNAi过程。由于DNA比RNA更难被降解，同时质粒在细胞内可以自我复制，从而降低了给药的数量，难度和间隔，并且合成DNA的费用比合成RNA的要低的多，相对于基于dsRNA的药物具有天然优势。载体质粒最重要的成分就是采用的启动子，它直接决定了siRNA的产率，从而决定了沉默效率。目前载体质粒广泛使用的有pSUPER，pSilencer，pSHAG等，使用的启动子一般包含U6，H1。最常用的U6和H1启动子具有结构简单，转录起点明确等优点，但这两种启动子的转录效率在不同的细胞中，甚至同一细胞不同的靶基因中相差很大，甚至在有些细胞中几乎不能实现转录，同时对于siRNA的序列要求也比较严格，从而导致很多情况下靶基因的沉默效果不如人意。
POKEMON，又称为LRF、OCZF或FBI-1，是POK蛋白家族的一个成员，在细胞分化中起重要作用，被称为是癌症基因的总开关，是ARF的特异性抑制子，因此被认为是癌症基因治疗的一个重要靶点。
发明内容
本发明的目的是提供一种可高效、特异抑制靶基因表达的RNAi载体。
本发明所提供的RNAi载体，是在含有多克隆的载体骨架中，含有CMV增强子和tRNAlys启动子的重组载体，所述CMV增强子在载体中位于tRNAlys启动子的上游；所述CMV增强子的GenBank号为AF239249，tRNAlys启动子的GenBank号为140508。
所述载体中还可包含有PBR322复制起点和氨苄青霉素抗性基因等其它核苷酸序列。
以pCMV5为出发载体，构建的含有CMV增强子和tRNAlys启动子的重组载体为pExsiler。
上述含有CMV增强子和tRNAlys启动子的重组载体均可按照基因工程领域的常规方法构建，其中pExsiler的构建方法可包括以下步骤1)以pCMV5质粒载体为模版，在由序列表中序列1和序列2组成的引物对的引导下PCR扩增含有CMV增强子的DNA片段；2)以Hela细胞基因组DNA为模版，在由序列表中序列3和序列4组成的引物对的引导下PCR扩增人源tRNAlys启动子；3)将步骤1)扩增的DNA片段与步骤2)扩增的人源tRNAlys启动子连接，得到RNAi载体pExsiler。
本发明提供了一种RNAi载体。该载体是利用CMV增强子和tRNAlys启动子构建的RNAi载体。实验证明，在本发明的RNAi载体中tRNAlys启动子的下游插入针对靶基因siRNA的编码DNA后，该载体就可以在转染细胞中高效、特异地抑制靶基因的表达，因此，可用本发明的RNAi载体制备成抑制靶基因(包括癌基因、转录因子基因和生长因子基因等基因，例如POKEMON基因等)表达的基因治疗性药物。本发明将生物医药领域及基因功能的研究中发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为载体pCMV5的结构示意2为构建本发明RNAi载体pExsiler及用该载体构建目的基因RNAi载体的流程3为抑制POKEMON基因表达的小干扰RNA编码基因的结构示意4为用pExsiler为出发载体构建的含有靶基因小干扰RNA编码序列的重组RNAi载体的结构示意5A为pExsiler-2T对POKEMON基因表达的抑制效果图5B为pExsiler-2对POKEMON基因表达的抑制效果图5C为tRNAlys-2T对POKEMON基因表达的抑制效果图5D为U6-2T对POKEMON基因表达的抑制效果图5E为pExsiler空载体对POKEMON基因表达的抑制效果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见《Molecular CloningA Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物及DNA序列均由上海Invitrogen公司合成。
实施例1、RNAi载体pExsiler的构建用下述方法构建本发明含有CMV增强子及人源tRNAlys启动子的RNAi载体pExsiler，具体过程包括以下步骤一、CMV增强子的克隆如图1所示，载体pCMV5(GenBank号AF239249)包含pBR322复制起点，氨苄青霉素抗性基团和CMV增强子，因此，用TE将pCMV5质粒稀释到1ng/μl作为模版，在引物MRV15’-GTGGATATCGGGGCGGGGTTATTACGAC-3’(序列表中序列1)(带下划线碱基为限制性内切酶EcoR V识别位点，)和MRV25’-CGACTCTAGAGGATCCCGGGTG-3’(序列表中序列2)(带下划线碱基为限制性内切酶BamH I识别位点，)的引导下PCR扩增CMV增强子(见图1，克隆CMV增强子时，从PCR引物位点2开始，依次通过PBR322复制起点，氨苄青霉素抗性基团，0点，最终到达PCR引物位点1，得到产物)，PCR反应体系为14.5μl ddH2O，5μl MRV1(4μm/μl)，5μl MRV2(4μm/μl)，5μl质粒模版(1ng/μl)，5μl dNTPs(各2.5mM)，10μl 5×Primer STARTM缓冲液(含Mg2+)，5μl DMSO(上海生工)，0.5μl PrimerSTARTM HS DNA Polymerase(2.5U/μl，TAKaRa)；PCR反应条件为98℃10秒，64℃10秒，72℃2分30秒，共28个循环。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得了500bp的DNA片段，与预期结果相符，然后对其进行测序，测序结果表明获得序列正确的CMV增强子(序列两端分别添加限制性内切酶EcoR V和BamH I识别位点)。使用H.Q.&.Q.凝胶回收试剂盒II(安徽优晶生物有限公司)并参照试剂盒说明书回收PCR扩增的目的片段，将回收产物用限制性内切酶EcoR V和BamH I(均购自TaKaRa)进行双酶切，酶切反应体系为60μl PCR产物，EcoRV 0.5μl，BamH I 0.5μl，10×缓冲液K 2.5μl。在37℃下反应3小时后，用H.Q.&.Q.凝胶回收试剂盒II回收经EcoR V利BamH I酶切的CMV增强子片段(命名为CMV(BEv))，最终得到产物60μl，浓度为80ng/μl。
二、人源tRNAlys启动子的克隆1、制备Hela细胞人类基因组DNA将Hela细胞培养于添加有10％FBS(Hyclone)的DMEM培养基(Invitrogen)中，用蛋白酶和苯酚从细胞中分离基因组DNA(具体步骤详见分子克隆实验指南第三版463至470页)，最终用TE稀释至10ng/μl。
2、人源tRNAlys启动子的PCR扩增以Hela细胞基因组DNA为模版，在引物Lys15’-GATGATATCTGGGCCACTAGGGACTGGG-3’(带下划线碱基为限制性内切酶EcoR V识别位点)(序列表中序列3)和Lys25’-GTCGGATCCAAGCTTGAATTCGGGCCCAGTCTGATGCTCTACCGACTG-3’(带下划线碱基为限制性内切酶EcoR V识别位点)(序列表中序列4)的引导下，PCR扩增人源tRNAlys启动子，并在序列两端分别添加限制性内切酶EcoR V和BamH I识别位点，PCR反应体系为5μl Hela细胞基因组DNA(10ng/μl)，5μl Lys1(4μm/μl)，5μl Lys3(4μm/μl)，5μl dNTPs(各2.5mM)，10μl 5×Primer STARTM缓冲液(含Mg2+)，19.5μlddH2O，0.5μl PrimerSTARTMHS DNA Polymerase(2.5U/μl)；PCR反应条件为98℃10秒，60℃10秒，72℃20秒，共35个循环。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果获得了380bp的DNA片段，与预期结果相符，然后对其进行测序，测序结果表明获得序列正确的人源tRNAlys启动子(序列两端分别添加限制性内切酶EcoR V和BamH I识别位点)。使用H.Q.&.Q.凝胶回收试剂盒II并参照试剂盒说明书回收PCR扩增的目的片段，将回收产物用限制性内切酶EcoR V和BamH I(均购自TaKaRa)进行双酶切，酶切反应体系为21.5μl PCR产物(93ng/μl)，EcoR V 0.5μl，BamH I 0.5μl，10×缓冲液K 2.5μl。在37℃下反应3小时后，用H.Q.&.Q.凝胶回收试剂盒II回收经EcoR V和BamH I酶切的人源tRNAlys启动子片段，命名为tRNAlys(BEv)。
三、RNAi载体pExsiler的获得将步骤一经EcoR V和BamH I酶切的CMV增强子片段和步骤二获得的经相同酶双酶切的人源tRNAlys启动子片段连接，连接反应体系及反应条件为2μl CMV(BEv)，3μl tRNAlys(BEv)，ddH2O 11μl，60℃4分钟，冰浴2分钟，再加入2μl 10×T4 ligasebuffer，1μl T4 DNA ligase(TaKaRa)，1μl ATP(50mM)，16℃反应4小时。反应结束后，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，将转化细胞涂布于添加50mg/mL氨苄青霉素的LB抗性平板上在37℃下培养过夜(12-24小时)，挑取长出的单菌落接种于3mL含50mg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中摇菌过夜。培养结束后，取1.5mL菌液，小量提质粒(具体步骤见分子克隆实验指南第三版27页至30页)，用进行初步鉴定，酶切体系为5μl质粒(0.2μg/μl)，1μl 10×缓冲液K，ddH2O3.8μl，EcoRV 0.2μl。对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳后EB染色，未被切成线性的环状质粒即为阳性克隆。这是因为EcoR V和EcoRI的酶切位点均为平末端，进行连接后两个酶切位点均消失；如果是重组质粒，由于不存在酶切位点，则EcoRV不能将其线性化，而非重组质粒存在EcoRV位点，因此可以被EcoRV线性化。取200μl经初步鉴定正确的阳性重组菌的菌液接种入100mL LB液体培养基中继续培养12小时。培养结束后，取1mL菌液送上海Invitrogen公司进行测序，测序结果表明获得了序列正确的含有CMV增强子及人源tRNAlys启动子的RNAi载体，命名为pExsiler，其构建过程见图2中的步骤①-③。
实施例2、检测用本发明载体pExsiler为出发载体构建的含有靶基因小干扰RNA编码序列的重组RNAi载体对靶基因的抑制效果一、用本发明载体pExsiler为出发载体构建含有靶基因小干扰RNA编码序列的重组RNAi载体在使用含有CMV5增强子的pExsiler时，先针对靶基因上一段长度为21-29nt的核苷酸序列设计并合成一对具有反向重复序列的互补脱氧寡核苷酸链作为siRNA的模版，其中将正义序列置于反义序列之前，中间用一段无意义且不形成二级结构的寡核苷酸链隔开，经过退火后插入pExsiler载体中，然后将重组载体(结构示意图见图4)转染细胞，载体上的人源tRNAlys启动子以其下游插入片段为模版，合成具有发夹结构的siRNA，从而导致靶基因沉默。以POKEMON基因为例，检测用本发明RNAi载体pExsiler构建的含有靶基因小干扰RNA编码序列的对靶基因的抑制效果，具体方法包括以下步骤(流程图见图2中的步骤③-⑥)1、抑制POKEMON基因表达的小干扰RNA及其编码基因的获得根据POKEMON基因mRNA(GenBank号GI117647237)序列及http://www.takara-bio.co.jp/sirna/prectl_new.php设计合成2对寡核苷酸(即4条寡核苷酸，F2T和R2T互补，F2和R2T互补)，序列的5’段添加限制性内切酶ApaI识别位点，3’端添加6个“T”作为转录终止信号，最后在转录终止信号后加入可以和Hind III互补的序列，其结构示意图见图3(实际上每段序列中并不存在空格，空格是为了阅读方便而添加的)，具体序列如下(斜体部分碱基序列为针对POKEMON基因mRNA的靶序列)F2T(正义链)5’-CCGGCTTAGACTTCTATGGGTTCAAGAGACCCATAGAAGTCTAAGCCGTTTTTT-3’(带下划线碱基为限制性内切酶ApaI识别位点)R2T(反义链)5’-CCGGGGCCGAATCTGAAGATACCCAAGTTCTCTGGGTATCTTCAGATTCGGCAAAAAATCGA-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Hind III互补序列)；F2(正义链)5’-CCGGCTTAGGACTTCTATGGGTTCAAGAGACCCATAGAAGTCTAAGCCGTTTTTT-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Apa I识别位点)R2(反义链)5’-CCGGGGCCGAATCCTGAAGATACCCAAGTTCTCTGGGTATCTTCAGATTCGGCAAAAAATCGA-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Hind III互补序列)。
F2，R2比F2T，R2T各多了一个碱基，作为实验的阴性对照，以便证明本发明的RNAi载体对于基因沉默具有高度的专一性，同时，每对序列均引入限制性内切酶Apa I和Hind III互补序列，以便同线性化的RNAi载体质粒连接。由上海Invitrogen公司合成上述4条单链寡核苷酸片段，然后按照以下方法将正义链同反义链退火用TE溶解、稀释合成片段，将浓度定位1μm/μl，然后将单链磷酸化，反应体系为30μl H2O，10μl 10×T4PNK buffer，50μl 1μM单链DNA(F2、R2、F2T或R2T)，10μl 50mM ATP，0.2μl T4PNK(TaKaRa)，将反应后的单链DNA按等比例两两对应混合(即F2同R2一组，F2T同R2T一组)，94℃3分钟，80℃20秒，75℃20秒，72℃20秒，65℃20秒，60℃20秒，55℃20秒，50℃20秒，45℃20秒，40℃20秒，35℃20秒，自然冷却到室温，-20℃保存，并将F2和R2的退火产物记为2，将F2T和R2T的退火产物记为2T。
2、含有靶基因小干扰RNA编码序列的重组RNAi载体的获得将质粒载体pExsiler用限制性内切酶Apa I和Hind III进行双酶切使其线性化，然后将步骤1合成的两对双链DNA片段与线性化的质粒载体pExsiler连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，将转化细胞涂布于添加50mg/mL氨苄青霉素的LB抗性平板上在37℃下培养过夜(12-24小时)，挑取长出的单菌落接种于3mL含50mg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中摇菌过夜。培养结束后，取1.5mL菌液，小量提质粒，用进行初步鉴定，酶切体系为5μl质粒(0.2μg/μl)，1μl 10×缓冲液K，ddH2O 3.8μl，Hind III 0.2μl。对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳后EB染色，末被切成线性的环状质粒即为阳性克隆。这是因为Hind III的酶切位点为平末端，连接后酶切位点消失；如果是重组质粒，由于不存在酶切位点，则Hind III不能将其线性化，而非重组质粒存在Hind III位点，因此可以被Hind III线性化。取200μl经初步鉴定正确的阳性重组菌的菌液接种入100mL LB液体培养基中继续培养12小时。培养结束后，取1mL菌液送上海Invitrogen公司进行测序，测序结果表明获得了序列及插入位置正确的携带有双链DNA片段2的重组RNAi载体(命名为pExsiler-2，结构示意图见图4)，以及携带有双链DNA片段2T的重组载体(命名为pExsiler-2T，结构示意图见图4)。同时，将对照载体pBS/U6(该质粒的构建方法请叁考文献Sui G，Soohoo C，Affar el B，Gay F，Shi Y，Forrester WC，Shi Y.A DNA vector-based RNAi technology tosuppress gene expression in mammalian cells.Proc Natl Acad Sci USA.2002Apr 16；99(8)5515-20.)和pEx-tRNAlys(与pExsiler质粒相比，pEx-tRNAlys质粒不含CMV增强子，仅有tRNAlys启动子)也分别用限制性内切酶Apa I和HindIII进行双酶切使其线性化，然后将步骤1合成的双链DNA片段2T与线性化的质粒载体连接，得到序列及插入位置正确的携带有双链DNA片段2T的重组载体，分别命名为U6-2T和tRNAlys-2T。
二、检测用本发明载体pExsiler为出发载体构建的含有靶基因小干扰RNA编码序列的重组RNAi载体对靶基因的抑制效果1、构建携带POKEMON-GFP融合基因的真核表达载体将POKEMON基因的cDNA(GenBank117107)克隆入载体pEGFP-N2(购自BDBiosciences Clontech公司)的多克隆位点处的Hind III和Sma I酶切位点之间，得到携带POKEMON-GFP融合基因的真核表达载体，命名为pPOKEMON-GFP。经测序验证，插入序列及位置完全正确。
2、检测用本发明载体pExsiler为出发载体构建的含有靶基因小干扰RNA编码序列的重组RNAi载体对靶基因的抑制效果以2×105细胞密度在24孔板上铺MCF7细胞，24小时后进行转染，方法为在lipotamine2000(Invitrogen)介导下，将带有绿色荧光标记的真核表达载体pPOKEMON-GFP分别和干扰载体pExsiler-2T，pExsiler-2，tRNAlys-2T，U6-2T和空白载体pExsiler各400ng共转染MCF7细胞。其中POKEMON-GFP是POKEMON和绿色荧光蛋白GFP的融合蛋白，当细胞表达POKEMON时，也同时会表达绿色荧光蛋白GFP。通过荧光显微镜就可以看到荧光，从而观察到POKEMON表达状况。转染结束24小时后在荧光显微镜下观察转染细胞的荧光强度。
结果如图5A-图5E所示(放大倍数40×)，pPOKEMON-GFP质粒和pExsiler共转染细胞(见图5E)可以看见较强的绿色荧光，表明POKEMON基因的表达水平较高，而pPOKEMON-GFP质粒和pExsiler-2T的共转染细胞(见图5A)只能看到很弱的绿色荧光，表明POKEMON基因的表达受到显著抑制。同时，只拥有U6启动子的干扰质粒和pPOKEMON-GFP质粒共转染细胞(见图5D)和只拥有tRNAlys启动子的干扰质粒和pPOKEMON-GFP质粒共转染细胞(见图5C)均发出较高强度的绿色荧光，证明本发明的RNAi干扰质粒具有较强的靶基因抑制效应。此外，pPOKEMON-GFP质粒和pExsiler-2质粒共转染细胞(见图5B)可以看到相对于pPOKEMON-GFP质粒和pExsiler共转染细胞更强的绿色荧光，由于pExsiler-2仅比pExsiler-2T多了一个碱基，这就证明了本发明的RNAi干扰载体还具有高度的专一抑制性。
序列表<160>4<210>1<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
<400>1gtggatatcg gggcggggtt attacgac<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
<400>2cgactctaga ggatcccggg tg<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列
<220>
<230>
<400>3gatgatatct ggccactagg gactggg<210>4<211>48<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
<400>4gtcggatcca agcttgaatt cgggcccagt ctgatgctct accgactg
权利要求
1.一种RNAi载体，是在含有多克隆位点的载体骨架中，含有CMV增强子和tRNAlys启动子的重组载体，所述CMV增强子在载体中位于tRNAlys启动子的上游；所述CMV增强子的GenBank号为2828971，tRNAlys启动子的GenBank号为140508。
2.根据权利要求1所述的RNAi载体，其特征在于用于构建所述含有CMV增强子和tRNAlys启动子的重组载体的出发载体为pCMV5。
3.根据权利要求2所述的RNAi载体，其特征在于所述载体中还包含有PBR322复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
4.根据权利要求3所述的RNAi载体，其特征在于所述含有CMV增强子和tRNAlys启动子的重组载体为pExsiler。
5.一种构建权利要求4所述的RNAi载体的方法，包括以下步骤1)以pCMV5质粒载体为模版，在由序列表中序列1和序列2组成的引物对的引导下PCR扩增含有CMV增强子的DNA片段；2)以Hela细胞基因组DNA为模版，在由序列表中序列3和序列4组成的引物对的引导下PCR扩增人源tRNAlys启动子；3)将步骤1)扩增的DNA片段与步骤2)扩增的人源tRNAlys启动子连接，得到RNAi载体pExsiler。
6.权利要求1或2或3或4所述的RNAi载体在制备抑制靶基因表达的基因治疗性药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述靶基因为癌基因、转录因子基因或生长因子基因。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述靶基因为POKEMON基因。
全文摘要
本发明公开了一种RNAi载体及其应用。该载体是在含有多克隆位点的载体骨架中，含有CMV增强子和tRNA
文档编号A61K48/00GK101058819SQ20071006410
公开日2007年10月24日 申请日期2007年2月28日 优先权日2007年2月28日
发明者蒋宇扬, 谢振华, 马伟伟, 李文鹏 申请人:清华大学深圳研究生院