专利名称：：阻止艾滋病毒和性病病原体性传播的消毒剂硝酸镧的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及硝酸镧的新用途，更具体而言是用硝酸镧制备阻止人艾滋病和其它性传播疾病病原体通过生殖道传播的消毒剂。
背景技术：
：性传播疾病是全世界卫生防疫和生殖健康的一大难题。以美国为例，每年的新病例有1200万，1994年预防开支达到170亿美元。在发展中国家(包括中国)，性传播疾病引起的危害和损失也是巨大的。据我国权威部门公布的材料，我国性病的年增长率超过30%，艾滋病和艾滋病毒感染者的增长率，1999年比1998年分别增长105%和250%。在20多种性传播疾病中，危害最大的是艾滋病。到2002年底，全球己死亡艾滋病人3000万人，仅2002年就死亡310万人，有4200万人感染上了艾滋病毒，2002年就有500万新感染者，每天有约一万五千人新感染t.艾滋病毒，其中妇女约占总数的44%。由同性或异性性传播引起的感染者占8090%.虽然已有高效联合疗法(鸡尾酒疗法)可以减少发病率和死亡率，但还不能治愈。所需要的医疗费用更是绝大部分发展中国家的患者无法承受的开支。己有研究表明，其它的性传播疾病会增加艾滋病毒感染的机会，所以针对杀灭其它性传播疾病病原体的杀微生物剂的使用，除了直接减少这些疾病的发生之外，还会间接地阻止艾滋病毒的性传播。因此，目前的主攻方向是研制出高效、价廉和安全的针对艾滋病毒的消毒剂。由此可见，研制出实用的消毒剂是社会十分迫切需要的。中国是稀土矿藏的贮藏大国，也是稀土化合物的生产大国，每年有大量初级稀土化合物出口。国内外有相当数量的科学家从事稀上化合物的应用研究。就发明人目前所知稀土化合物在工业、农业、畜牧业、医药业中有广泛用途。在医药业中'3-磺基异烟酸钕(临床上称为Trombodym)用于抗凝血(倪嘉缵主编.稀土生物无机化学.科学出版社.1995:39-41);2.2%硝酸铈(氯化铈、乙酸铈也可)水合物和1%磺胺嘧啶银制成的水包油型基质的半固体软膏用于治疗烧伤(倪嘉缵主编.稀土生物无机化学.科学出版社.1995:42-47);钛铁试剂钕、钐制成的软膏具有抗炎杀菌作用(倪嘉缵主编.稀土生物无机化学.科学出版社.1995:47-50);磺基水杨酸稀土具有很好的镇痛、镇静和解热作用(王流芳'吴集贵，邓汝温，谷贵文'张训凯'李渭莉，赵秀媛.科学通报，1990,35:1077;英文版，1991,36:117);现在还发现稀土化合物、配合物具有抗癌作用(王夔，韩万书.中国生物无机化学十年进展.高等教育出版社.1997:26-27)及抗艾滋病作用。我们发现硝酸镧对人艾滋病毒的抑制活性(治疗指数TI值)可以达到44004500，作为一种抗艾滋病毒的一种小分子化合物，它具有价格低廉，来源丰富，而且对人体的毒副作用小等特点。技术内容及其它本发明的目的在于用有明确制备方法、检验标准、市场上有售的化学试剂硝酸镧，提供一种用硝酸镧制备阻止人艾滋病和其它性传播疾病病原体通过生殖道传播的新型消毒剂。为了实现本发明的上述目的，本发明提供了下列的技术方案按硝酸镧和赋型剂质量比为l:1001:1000000的比例，制成片剂、乳剂、胶囊或凝胶。下面用实验来说明用硝酸镧阻止人艾滋病毒和其它性传播疾病病原体通过生殖道传播的有益效果。一、硝酸镧体外抗HIV-l病毒活性检测的实验方法用硝酸镧作为测试对象和世界首选抗艾滋病药物AZT作为阳性对照，用MTT方法分别测试它们对50%C8166细胞产生的毒性(即IC5。)；用合胞体形成抑制实验测定它们对H9/HIV-1，感染细胞合胞体的50y。抑制率(EC5。)。然后用IC5。/EC5。得到它们的治疗指数TI值，以确定在上述实验条件下它们对HIV病毒的抑制活性。病毒感染性的滴定HIV-1滴定按Johnson&Byington(1990)所述方法改良进行在96孔培养板上，将HIV-1贮存液作5倍稀释，共8个梯度，每个梯度设6孔，同时设置对照组。每孔加入C8166细胞50ul(2X107孔)，每孔体积为200ul。37°C，5%0)2培养。第三天补加新鲜完全培养基100yl，第七天在倒置显微镜下观察每孔中病毒诱导的细胞致病变效应(Cyt叩athiceffect,CPE)，以每孔是否有合胞体的形成来确定；按Reed&Muench方法计算病毒的TCID5。(500/0Tissuecultureinfectiousdose)，即引起50%培养细胞出现CPE的病毒上清稀释度。MTT方法测定细胞存活与增殖将96细胞孔培养板低速离心后，小心吸去150u1上清，然后每孔加5mg/mlMTT溶液20"1，37°C，5%<:02细胞培养箱中孵育4小时，每孔加lOOu120%SDS-50%DMF，37。C孵育过夜，用Bio-Rad3550ELISA仪测定(测定波长为595咖；参考波长为655nm)。样品对宿主细胞的毒性实验取4X107mlC8166细胞悬液100u1与不同浓度的样品溶液混合，置37°C，5%(1)2培养箱中培养3或5天，然后测定其细胞毒性IC5。(50°/。inhibitionconcentration)。样品对HIV诱导C8166细胞形成合胞体的抑制实验在96孔培养板上，将待测物用培养基进行5倍稀释，共8个梯度，每孔100u1，设2个重复孔，同时设置正常细胞对照。对于HIV感染的细胞，每孔加4X10VmlC8166细胞悬液80u1，然后每孔加20u1HIV-1上清，每孔体积为200n1。在37°C，5%0)2培养箱中培养。感染后第三天观察样品对合胞体形成的影响。在倒置显微镜下，计数HIV-1诱导C8166细胞形成的合胞体数。EC5。(50%effectiveconcentration)为抑制合胞体形成达50%时的样品浓度。计算1，细胞生长抑制率ft)-(l—实验孔0D值Z对照孔0D值)X100(样品的毒性)2，合胞体形成的生长抑制率(%)=(1—实验孔合胞体数/对照孔合胞体数)X100(合胞体方法)3，ICs。为对50%的宿主细胞产毒性的样品的浓度；EQ为具有50%合胞体形成抑制率的样品的浓度。治疗指数(TI值)为ICs。/EC5。的比值。研究中发现，所有测试样品中，水合硝酸镧为抗艾滋病毒活性最优者，水合硝酸铈也有一定的抗艾滋病毒活性。以下将结合附图来详细描述本发明，在附图中图1显示的是阳性对照物AZT在上述实验研究中所得到的结果。图2显示的是抗艾滋病毒活性最优者水合硝酸镧在上述实验研究中第一次实验所得到的结果。图3显示的是抗艾滋病毒活性最优者水合硝酸镧在上述实验研究中第二次平行实验所得到的结果。由图l可见AZT在上述实验中测得的IG。值为3.36ymol/L,ECs。值为0.227mnol/L(即0.000679umol/L),治疗指数TI值为14798.%。结论:AZT具有很高的HIV病毒抑制活性。由图2、3可见:水合硝酸镧在上述实验中测得的IC犯值为2.65umol/L，EU值为0.000569umol/L，治疗指数TI值为4657.29;由图3可见水合硝酸镧在上述实验中测得的ICs。值为3.48umol/L，ECso值为0.000789umol/L，治疗指数TI值为4410.65。两次平行实验的IC5。平均值为3.065umol/L，EG。平均值为0.000679umol/L，治疗指数TI平均值为4533.97。二、硝酸镧对HSV-1的抑制作用和对Vero细胞的毒性作用用PRA法测定硝酸镧对人单纯疱疹病毒(HSV)的抑制作用将Vero细胞悬液加入到24孔板(24X105/well)，37°C，5%0)2培养箱中培养24小时；待细胞单层铺满24孔板后，每孔加200"1病毒上清或培养基，轻摇，使病毒稀释液和细胞单层充分接触，37°C，5%0)2孵育1小时；用RPMI1640培养基对药物作两倍稀释，设置阿昔洛韦作阳性对照；小心吸出培养基，加入PBS洗板；加入未凝的琼脂糖覆盖培养基[A(RPMI1640+2%FCS，12ml，37。C水浴保温)、B(1%现配琼脂糖13ml，60。C水浴保温)混和液]，每孔加lml。加入稀释好的待测样品液，每孔0.5ml，但第6孔(病毒生长孔)和第12孔(细胞生长孔)不加样品液；置37°C，5%0)2培养箱中培养三天。然后用2%甲醛固定细胞10min;加入700u1龙胆紫染液，染色20min;用自来水轻轻洗涤3次，倒置晾干，在倒置显微镜下计数空斑。通过计算得到样品硝酸镧对病毒的抑制率。.空斑减少率(％)=(病毒对照组空斑数一药物处理空斑数)/病毒对照组空斑数X100用MTT法检测硝酸镧对细胞的毒性作用在96孔平底培养板上，将待测化合物用培养基2倍稀释。作7个稀释度，每孔100u1，设两个重复孔。同时设置不含化合物的细胞对照组和空白组及阿昔洛韦阳性对照；离心(1000rpm,100min)，用完全培养基重悬Vero细胞培养液后，每孔加入100u1(4XlOVwell)细胞悬液；置37r，5%0)2培养箱中培养三天。然后将96孔细胞培养板低速离心，弃去150ul培养上清，如人25ulMTT溶液(5mg/ml)，37°C，5%(:02培养箱中孵育4小时，加入20%SDS-50%DMF(pH4.7)，孵育过夜；用酶标仪测定各孔的OD值。通过计算得到样品硝酸镧对细胞的存活率的影响，了解其毒性作用。细胞存活率(％)=实验孔00值/对照孔00值乂100通过实验得到以下结果表1硝酸镧对HSV-1的抑制作用、对Vero细胞的毒性作用和TI值<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>三、用MTT法测定硝酸镧对性传播疾病病菌白色念珠菌的抑制作用取待测样品10mg，用100iil函SO助溶后，滴加900"1沙保氏培养基，充分混合后.使浓度为10mg/ml，过滤除菌，置4X:保存；首先将待测样品在96孔培养板上稀释至合适的浓度，同时设置阴性对照和空白对照，每系列孔(除空白和生长对照孔外)，取100ul加入到下一孔，最终孔弃去lOOlil.用头孢菌素作阳性对照，浓度稀释方法与待测药物相同；用沙保氏培养基把菌悬液浓度从4.5X106cfu/ml调到4.5X105cfu/ml，将稀释好的菌液加入板中，每孔100iil，第9孔不加；接种菌液后，培养板于37'C，5%0)2培养中培养24小时，观察生长情况。待阴性对照孔生长良好后，96孔培养板以1000rpm离心lOmini.吸出150u1培养基，每孔各加5mg/ml的MTT(含lmM甲萘醌)25yl.放入37。C温箱4小时，然后各孔加20%SDS-50%DMF(pH4.7)100u1;培养板37。C放置12小时后，用酶辨仪于波长595nm，参考波长655nm下，测定0D值。通过计算得到样品硝酸镧对细菌的抑制率。抑制率(％)=(1—实验孔0D值/对照孔0D值)X100通过实验得到以下结果-表2硝酸镧对白色念珠菌的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求1、硝酸镧在制备阻止人艾滋病和其它性传播疾病病原体通过生殖道传播的消毒剂中的应用。2、权利要求1所说的硝酸镧在制备阻止人艾滋病和其它性传播疾病病原体通过生殖道传播的消毒剂的制备方法，为按硝酸镧和赋型剂质量比为1:100~1:1000000的比例，制成片剂、乳剂、胶囊或凝胶。3、权利要求1所说的应用硝酸镧制备阻止人艾滋病和其它性传播疾病病原体通过生殖道传播的消毒剂，其在抗HIV-1中的应用。4、权利要求1所说的应用硝酸镧制备阻止人艾滋病和其它性传播疾病病原体通过生殖道传播的消毒剂，其在抗HSV-1中的应用。5、权利要求1所说的应用硝酸镧制备阻止人艾滋病和其它性传播疾病病原体通过生殖道传播的消毒剂，其在抗白色念珠球菌中的应用。全文摘要本发明涉及一种阻止人艾滋病和其它性传播疾病病原体通过生殖道传播的消毒剂，更具体地说，涉及一种用市场上有售的化学试剂硝酸镧来制备阻止人艾滋病和其它性传播疾病病原体通过生殖道传播的消毒剂。本发明针对通过生殖道传播的性传播疾病病原体HIV-1、HSV-1和白色念珠球菌，用我国资源丰富、市场上有售的化学试剂硝酸镧来制备消毒剂，提供一种预防和控制艾滋病及其它性传播疾病有效、低毒、价廉的新型消毒剂。文档编号A61K33/22GK101172114SQ200710065799公开日2008年5月7日申请日期2007年4月11日优先权日2007年4月11日发明者钟文远申请人:钟文远