专利名称：淋巴细胞肿瘤抗体的增强剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种增强剂，其含有生物反应调节物(BRM)作为活性成分，作为用于淋巴细胞肿瘤治疗的药物，并且含有一种抗体作为活性成分，其能特异结合淋巴细胞肿瘤中表达的蛋白质。
背景技术：
在生物中淋巴细胞主要负责免疫。全部来源于血液中相同干细胞的淋巴细胞通过骨髓或其它器官中多种分化诱导因子或生长因子的作用经受反复分化，然后释放至外周血中。根据分化的不同，大体将淋巴细胞分类为B细胞和T细胞。普遍认为，B细胞具有产生抗体的能力，而T细胞具有呈递抗原的能力，具有细胞毒性，并且具有多种其它能力。当细胞在分化期经历致瘤性转化并开始在骨髓、淋巴组织和外周血中异常生长时，它们变为所谓的淋巴细胞肿瘤。
由于最近新技术的引入，特别是应用单克隆抗体分化细胞表面抗原的技术进展，现在能够鉴定淋巴细胞的起源和/或阶段。当前，同样对于淋巴细胞肿瘤，现在不仅能够确定肿瘤细胞的起源是T细胞还是B细胞，而且能确定成熟度。
根据肿瘤细胞的起源或成熟度，大体将淋巴细胞肿瘤分类为B细胞肿瘤和T细胞肿瘤。B细胞肿瘤根据成熟度分类为急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)、慢性B淋巴细胞白血病(B-CLL)、前B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、滤泡性大脑皮质淋巴瘤、弥漫性淋巴瘤、骨髓瘤，等等。T细胞肿瘤也根据成熟度分类为急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)、慢性T淋巴细胞白血病(T-CLL)、成人T细胞白血病(ATL)、非ATL外周T淋巴瘤(RNTL)，等等(Zukai Rinsho[Gan](临床阐述[癌症])，系列号17，白血病/淋巴瘤，Takashi Sugimura等人，医学观察(MEDICAL VIEW)，1987，B细胞肿瘤，Kiyoshi Kouzuki，Nishimura Shoten，1991)。
尽管医学技术近来有所进展，但在淋巴细胞肿瘤治疗方面仍有待改进。例如，急性淋巴细胞白血病(ALL)的治愈率低于20％。对于淋巴瘤，由于多种药物联合治疗的进展，B淋巴瘤的治愈率相对较高，但晚期的治愈率仍为约50％。另外，T淋巴瘤是更加难以治愈的，其治愈率约为30％，成人T细胞白血病(ATL)低于10％。
另一方面，Goto，T.等人报道了一种通过用人骨髓瘤细胞免疫小鼠获得的单克隆抗体(抗-HM1.24抗体)(血液(Blood)(1994)84，1922-1930)。当对移植有人骨髓瘤细胞的小鼠施用抗-HM1.24抗体时，该抗体以一种特殊方式在肿瘤组织中积累(Masaaki Kosaka等人，Nippon Rinsho(日本临床)(1995)53，627-635)，表明抗-HM1.24抗体能通过放射性同位素标记、导弹疗法(如放射治疗)等用于对肿瘤定位的诊断。
另一方面，癌症患者通常具有降低的免疫功能。由于认为这与致癌作用有关，所以正在进行提高这些功能的尝试。生物反应调节物(BRM)用来以有利于生物的方向将生物的直接和/或间接反应能力导向肿瘤，并在治疗中应用。它们主要增强巨噬细胞、T细胞等的功能，并能恢复免疫能力等。在应用非特异性免疫激活物质进行治疗及研究的时候，研究了多种细胞因子的生物活性，并且大量生产据认为可能有效的细胞因子(Konnniti no Tiryoyaku(《今日治疗性药物》)(1995年版)，YutakaMizushima和Akimasa Miyamoto编，Nankodo K.K.，第17版第3次印刷，1995年6月20日发行)。
发明内容
目前使用的治疗淋巴细胞肿瘤的方法包括多种化学疗法、放射疗法、骨髓移植，等等。然而，上述方法中没有一种是理想的，需要能缓解淋巴细胞肿瘤并延长患者存活时间的新的治疗剂或治疗方法。
因此，本发明的一个目的在于提供一种针对抗淋巴细胞肿瘤的新型增强剂。
为了试图提供这些治疗方法，本发明的发明者检查了抗-HM1.24抗体(Goto，T.等人，血液(1994)84，1922-1930)与生物反应调节物的组合应用，发现该组合应用导致更强的细胞毒性，并且尤其在细胞毒性降低时恢复正常水平的细胞毒性，提示对淋巴细胞肿瘤有可能的抗肿瘤作用，从而完成本发明。
因此，本发明提供一种抗体增强剂用于淋巴细胞肿瘤的治疗，该抗体能特异结合具有如SEQ ID NO5所示氨基酸序列的蛋白质，并具有细胞毒性，该增强剂含有一种生物反应调节物作为活性成分。
本发明也提供一种生物反应调节物增强剂用于淋巴细胞肿瘤的治疗，该增强剂含有一种抗体作为活性成分，该抗体能特异结合具有如SEQ IDNO5所示氨基酸序列的蛋白质，并具有细胞毒性。
本发明也提供上述增强剂，其中淋巴细胞肿瘤是T细胞肿瘤。
本发明也提供上述增强剂，其中淋巴细胞肿瘤是B细胞肿瘤。
本发明也提供上述增强剂，其中B细胞肿瘤是骨髓瘤。
本发明也提供上述增强剂，其中抗体是单克隆抗体。
本发明也提供上述增强剂，其中细胞毒性是ADCC活性。
本发明也提供上述增强剂，其中抗体具有人抗体的恒定区Cγ。
本发明也提供上述增强剂，其中人抗体的恒定区Cγ是Cγ1或Cγ3。
本发明也提供上述增强剂，其中抗体是抗-HM1.24抗体。
本发明也提供上述增强剂，其中抗体是嵌合抗体或人源化抗体。
本发明也提供上述增强剂，其中抗体是嵌合抗-HM1.24抗体。
本发明也提供上述增强剂，其中抗体是人源化抗-HM1.24抗体。
本发明也提供上述增强剂，其中抗体能特异结合可被抗-HM1.24抗体识别的表位。
本发明也提供上述增强剂，其中生物反应调节物是干扰素、OK432、香菇多糖(lenthinan)、西索菲兰、抑胃肽、云芝多糖、N-CWS、左旋咪唑、G-CSF、IL-2、IL-10或IL-15。
本发明也提供上述增强剂，其中抗体具有细胞毒性，在E/T比为50的条件下ADCC活性低于25％。
本发明也提供上述增强剂，其中ADCC活性用Cr(铬)释放试验来测定。
本发明也提供在体内使用的根据上述任意一项的增强剂。
本发明也提供一种用于淋巴细胞肿瘤的治疗剂，该药剂含有一种抗体和一种生物反应调节物，其中抗体能特异结合具有如SEQ ID NO5所示氨基酸序列的蛋白质，并具有细胞毒性。
附图简述
图1是一张图表，显示当使用来源于健康人外周血的细胞作为效应细胞时，人源化抗-HM1.24抗体对RPMI8226细胞显示强细胞毒性。
图2是一张图表，显示当使用来源于骨髓瘤患者外周血的细胞作为效应细胞时，人源化抗-HM1.24抗体对RPMI8226细胞显示细胞毒性。
图3是一张图表，显示当使用来源于用大剂量环磷酰胺治疗的骨髓瘤患者、经受单采血液分离术的细胞作为效应细胞时，人源化抗-HM1.24抗体对RPMI8226细胞显示细胞毒性。
实施本发明的实施方案1.抗体制备1-1.杂交瘤制备产生用于本发明的抗体的杂交瘤基本上能用如下所述的已知方法构建。HM1.24抗原蛋白质或表达HM1.24抗原的细胞可用作致敏性抗原，并按常规免疫方法进行免疫。以常规细胞融合方法使这样获得的免疫细胞与已知的亲本细胞融合，然后用常规筛选方法筛选，筛选出产生单克隆抗体的细胞。
单克隆抗体尤其可以用下列方法获得。例如，对于作为致敏性抗原用于获得抗体的HM1.24抗原表达细胞，能使用一种人多发性骨髓瘤细胞系KPMM2(日本未经审查的专利申请公开文本(Kokai)号7(1995)-236475)或KPC-32(Goto T.等人，日本临床血液学杂志(Jpn.J.Clin.Hematol.)(1991)32，1400)。此外，对于致敏性抗原，可以使用具有SEQID NO1所示氨基酸序列的蛋白质或含有能被抗-HM1.24抗体识别的表位的肽或多肽。
在此处使用时，将编码具有SEQ ID NO5所示氨基酸序列的蛋白质的cDNA插入pUC19载体的XbaI酶切位点中，由此制备质粒pRS38-pUC19。含有该质粒的大肠杆菌已于1993年10月5日由国立生物科学和人体技术研究所，工业科学与技术机构，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，日本，按布达佩斯条约的规定进行国际保藏，为大肠杆菌DH5α(pRS38-pUC19)，保藏号为FERM BP-4434(参见日本未经审查的专利申请公开文本(Kokai)号7(1995)-196694)。能用该质粒pRS38-pUC19所含的cDNA片段通过基因工程技术制备含有能被抗-HM1.24抗体识别的表位的肽或多肽。
优选地，出于对与细胞融合中所用亲本细胞的相容性的考虑，选择用致敏性抗原免疫的哺乳动物。它们通常包括但不限于啮齿类动物如小鼠、大鼠、仓鼠等。
用致敏性抗原对动物的免疫采用公知的方法进行。例如，一种普通方法包括对哺乳动物腹膜内或皮下施用致敏性抗原。
具体而言，如所希望的将一种用适量磷酸缓冲盐溶液(PBS)或生理盐水等稀释或悬浮的致敏性抗原与适量弗氏完全佐剂混合。乳化后，优选地每4-21天对哺乳动物施用数次。或者，在致敏性抗原免疫时可以使用合适的载体。
免疫并确定血清中目标抗体水平提高后，自哺乳动物中采取免疫细胞，进行细胞融合。优选的免疫细胞尤其包括脾细胞。
作为其它亲本细胞，可与上述免疫细胞进行细胞融合的哺乳动物骨髓瘤细胞优选地包括多种已知的细胞系，如P3X63Ag8.653(免疫学杂志(J.Immunol.)(1979)1231548-1550)、P3X63Ag8U.1(微生物学与免疫学当代论题(Current Topics in Microbiology and Immunology)(1978)811-7)、NS-1(Kohler，G.和Milstein，C.，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)(1976)6511-519)、MPC-11(Margulies，D.H.等人，细胞(Cell)(1976)8405-415)、SP2/0(Shulman，M.等人，自然(Nature)(1978)276269-270)、FO(de St.Groth，S.F.等人，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)(1980)351-21)、S194(Trowbridge，I.S.，实验医学杂志(J.Exp.Med.)(1978)148313-323)、R210(Galfre，G.等人，自然(1979)277131-133)，等等。
上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合基本上可以按照如Milstein等人(Kohler，G.和Milstein，C.，酶学方法(Methods Enzymol.)(1981)733-46)所述等已知方法进行。
更具体而言，例如在细胞融合促进剂的存在下在常规营养肉汤中进行上述细胞融合。例如可以使用聚乙二醇(PFG)、仙台病毒(HVJ)等作为细胞融合促进剂，另外，也可如所希望的加入二甲基亚砜等佐剂，提高融合效率。
所使用的免疫细胞与骨髓瘤细胞的优选比例为，例如，免疫细胞比骨髓瘤细胞多1-10倍。可用于上述细胞融合的培养基的实例包括适合于上述骨髓瘤细胞系生长的RPMI1640培养基和MEM培养基，和用于此类细胞培养的常规培养基，此外，也可加入血清添加物如胎牛血清(FCS)。
细胞融合时，将预定量的上述免疫细胞与骨髓瘤细胞在上述培养液中充分混合，以30-60％(w/v)的浓度向其中加入预先加热至大约37℃的PEG溶液，如平均分子量约为1000-6000的PEG溶液，混合后获得需要的融合细胞(杂交瘤)。然后通过重复连续的适当培养液加入及离心弃去上清液步骤，能除去杂交瘤生长所不需要的细胞融合剂等。
通过在常规选择性培养基如HAT培养基(一种含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷的培养液)中培养来筛选所述杂交瘤。在该HAT培养基中的培养通常持续一段时间，这段时间足以实现除目标杂交瘤之外的细胞(非融合细胞)的杀伤，一般为几天到几周。进行常规有限稀释法，其中筛选并单克隆地克隆产生目标抗体的杂交瘤。
除了通过用一种抗原免疫除人之外的动物而获得上述杂交瘤之外，也能用HM1.24抗原或表达HM1.24抗原的细胞体外致敏人淋巴细胞，使产生的致敏淋巴细胞与骨髓瘤细胞(如U266)融合，获得具有结合HM1.24抗原或HM1.24抗原表达细胞活性的目标人抗体(参见日本审查后专利公开文本(Kokoku)号1(1989)-59878)。此外，能按上述方法，用该抗原即HM1.24抗原或HM1.24抗原表达细胞免疫含有全部人抗体基因所有组成成分的转基因动物，获得希望的人源化抗体(参见国际专利申请WO 93-12227、WO 92-03918、WO 94-02602、WO 94-25585、WO96-34096和WO 96-33735)。
这样构建的产生单克隆抗体的杂交瘤能在常规培养液中传代培养，或者能在液氮中贮存较长一段时间。
为了从该杂交瘤中获得单克隆抗体，能述及一种用常规方法培养该杂交瘤并以上清液形式获得抗体的方法，或者向与该杂交瘤相容的哺乳动物施用并在其中生长该杂交瘤，以腹水形式获得抗体的一种方法。前述方法适用于获得高纯度的抗体，而后者适用于抗体的大规模生产。
尤其能用Goto，T.等人(血液(1994)841922-1930)的方法构建产生抗-HM1.24抗体的杂交瘤。能用这样一种方法实施其中向BALB/c小鼠(日本CLEA生产)腹膜内注射产生抗-HM1.24抗体的杂交瘤，获得腹水，从中纯化抗-HM1.24抗体，该杂交瘤于1995年9月14日按布达佩斯条约的规定由国立生命科学和人体技术研究所，工业科学与技术机构，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki prof.，日本，国际保藏号FERM BP-5233，或者用这样一种方法在合适的培养基如含10％胎牛血清的RPMI1640培养基和5％BM-调和的H1(BoehringetMannheim生产)、杂交瘤SFM培养基(GIBCO-BRL生产)、PFHM-II培养基(GIBCO-BRL生产)等培养基中培养所述杂交瘤，从上清液中纯化抗-HM1.24抗体。
1-2.重组抗体在本发明中能用一种经重组基因技术产生的重组抗体作为单克隆抗体，其中从杂交瘤中克隆一种抗体基因，整合至合适的载体中，然后将其引入宿主中(参见，例如，Carl，A.K.，Borrebaeck和James，W.Larrick，《治疗性单克隆抗体》(THERAPEUTIC MONOCLONALANTIBODIES)，英国MACMILLAN PUBLISHERS LTD.出版，1990)。
具体地，从产生抗体的杂交瘤中分离编码希望抗体可变(V)区的mRNA。例如，通过用公知的方法如胍超速离心法(Chirgwin，J.M.等人，生物化学(Biochemistry)(1979)18，5294-5299)或AGPC法(Chomczynski，P.等人，分析生物化学(Analytical Biochemistty)(1987)162，156-159)制备总RNA进行mRMA的分离，然后利用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia生产)等从总RNA中纯化mRNA。此外，能用Quick Prep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia生产)直接制备mRNA。
使用逆转录酶可由这样获得的mRNA合成抗体V区的cDNA。cDNA可以用AMV逆转录酶第一链cDNA合成试剂盒等合成。此外，对于cDNA的合成和扩增，可以使用利用聚合酶链反应(PCR)的5’-Ampli FINDERRACE试剂盒(Clontech生产)及5’-RACE法(Frohman，M.A.等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)(1988)85，8998-9002；Belyavsky，A.等人，核酸研究(Nucleic Acids Res.)(1989)17，2919-2932)。从获得的PCR产物中纯化目标DNA片段，与载体DNA连接。此外，由此构建重组载体，然后将其引入大肠杆菌等，从中挑选菌落制备目标重组载体。目标DNA的碱基序列可以经公知的方法如双脱氧法证实。
一旦获得编码目标抗体V区的DNA，即可与编码目标抗体恒定区(C区)的DNA连接，然后将其整合入表达载体中。此外，也可将编码抗体V区的DNA整合至已经含有编码抗体C区的DNA的表达载体中。
为了产生用于本发明的抗体，如下所述将抗体基因整合至表达载体中，使之在表达调节区如增强子和/或启动子的控制下表达。随后，可以将该表达载体转化入宿主细胞，于是在其中能表达该抗体。
1-3.改变的抗体根据本发明，为了降低对人的异源抗原性，能使用人工改变的重组抗体如嵌合抗体和人源化抗体。这些改变的抗体能用公知的方法产生。
嵌合抗体能如此获得将这样获得的编码抗体V区的DNA与编码人抗体C区的DNA连接，然后将其整合到表达载体中，并引入宿主中用于抗体在其中的产生(参见欧洲专利申请EP 125023，和国际专利申请WO96-02576)。利用该已知方法，能获得可用于本发明的嵌合抗体。
例如，携带含有嵌合抗-HM1.24抗体L链V区或H链的质粒的大肠杆菌已经于1996年8月29日由国立生命科学和人体技术研究所，工业科学与技术机构，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，日本，按布达佩斯条约的规定进行国际保藏分别，为大肠杆菌DH5α(pUC19-1.24L-gκ)和大肠杆菌DH5α(pUC19-1.24L-gγ1)，保藏号为FERMBP-5646和FERM BP-5644(参见国际专利申请WO 98-14580)。
人源化抗体，也称为重构人抗体，其制备方法是将除人之外哺乳动物的抗体如小鼠抗体的互补性决定区(CDR)移植到人抗体的CDR中。制备这些抗体的普通重组DNA技术也是公知的(参见欧洲专利申请EP125023和国际专利申请WO 96-02576)。
尤其，由片段在末端互相重叠的几种分开的寡核苷酸合成用于连接小鼠抗体CDR与人抗体构架区(FR)的DNA序列。然后将寡核苷酸合成为一个整合的DNA。这样获得的DNA与编码人抗体C区的DNA连接，然后将其整合到表达载体中，将其引入宿主中用于抗体生产(参见欧洲专利申请EP 239400和国际专利申请WO 96-02576)。
对于通过CDR连接的人抗体的FR，选择能形成有利地抗原结合位点的互补性决定区。需要时，可以替换抗体可变区的构架区中的氨基酸，使得重构的人抗体的互补性决定区可以形成合适的抗原结合位点(Sato，K.等人，癌症研究(Cancer Res.)(1993)53，851-856)。
例如，携带含有人源化抗-HM1.24抗体L链a型和H链r型的质粒的大肠杆菌已经于1996年8月29日由国立生命科学和人体技术研究所，工业科学与技术机构，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，日本，按布达佩斯条约的规定进行国际保藏，分别为大肠杆菌DH5α(pUC19-RVLa-AHM-gκ)和大肠杆菌DH5α(pUC19-RVHr-AHM-gγ1)，保藏号分别为FERM BP-5645和FERM BP-5643(国际专利申请WO 98-14580)。此外，携带含有H链s型的质粒的大肠杆菌已经于1997年9月29日由国立生命科学和人体技术研究所，工业科学与技术机构，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，日本，按布达佩斯条约的规定进行国际保藏，为大肠杆菌DH5α(pUC19-RVHs-AHM-gγ1)，保藏号为FERM BP-6127。
人源化抗-HM1.24抗体L链a型的V区、人源化抗-HM1.24抗体的H链r型和人源化抗-HM1.24抗体的H链s型中每一种的氨基酸序列和核苷酸序列显示于SEQ ID NO2、3和4中。位点-15到-1的氨基酸是信号序列。
对于嵌合抗体或人源化抗体，使用人抗体的C区，对于显示细胞毒性的人抗体的C区，可使用人Cγ，例如Cγ1、Cγ2、Cγ3和Cγ4。其中，含有Cγ1和Cγ3的抗体尤其具有强细胞毒性，即ADCC活性和CDC活性，优选地用于本发明中。
嵌合抗体由来源于除人之外哺乳动物的抗体的可变区和来源于人抗体的C区组成，而人源化抗体由来源于除人之外哺乳动物的抗体的互补性决定区和来源于人抗体的抗体构架区(FR)及C区组成。因此，其中人体中的抗原性降低，使得它们可用作本发明的治疗剂的活性成分。
用于本发明的人源化抗体的一个优选实施方案包括人源化抗-HM1.24抗体(参见国际专利申请WO 98-14580)。
1-4.表达与产生如上所述构建的抗体基因可以用公知的方法表达并获得。对于哺乳动物细胞，可以用一种表达载体实现表达，该表达载体中含有一种常用的有效启动子、待表达的抗体基因和其中poly A信号有效连接于其3’下游的DNA或含有该DNA的载体。启动子/增强子的实例包括人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子。
另外，对于能在本发明中用于抗体表达的启动子/增强子，能使用病毒启动子/增强子，如反转录病毒、多瘤病毒、腺病毒和猿猴病毒40(SV40)，以及来源于哺乳动物细胞的启动子/增强子，如人延伸因子1α(HEF1α)。
例如，当使用SV40启动子/增强子时，按Mulligan等人(自然(1979)277，108)的方法可方便地实现表达，或者，当使用HEF1α启动子/增强子时用Mizushima等人(核酸研究(1990)18，5322)的方法。
对于大肠杆菌，可如下进行表达有效连接常用的有效启动子、抗体分泌的信号序列和待表达的抗体基因，随后进行其表达。至于启动子，例如，能提及lacz启动子和araB启动子。当使用lacz启动子时，可以使用Ward等人(自然(1098)341，544-546；FASEB J.(1992)6，2422-2427)的方法，当使用araB启动子时，可使用Better等人(科学(1988)240，1041-1043)的方法。
至于抗体分泌的信号序列，当在大肠杆菌周质中产生时，能使用pelB信号序列(Lei，S.P.等人，细菌学杂志(J.Bacteriol.)(1987)169，4379)。分离周质中产生的抗体后，在使用前适当地重折叠该抗体的结构(参见，例如，WO 96-30394)。
至于复制起点，能使用来源于SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等的复制起点。此外，对于宿主细胞系统中基因拷贝数的扩增，表达载体可包含选择性标记氨基糖苷转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因，等等。
对于本发明所用抗体的产生，能使用任何产生系统。抗体制品的产生系统包括体外或体内产生系统。对于体外产生系统，能述及使用真核细胞的产生系统和使用原核细胞的产生系统。
当使用真核细胞时，存在使用动物细胞、植物细胞和真菌细胞的产生系统。公知的动物细胞包括(1)哺乳动物细胞，如CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、HeLa细胞和Vero细胞，(2)两栖动物细胞，如Xenopus oocytes，或者(3)昆虫细胞，如sf9、sf21和Tn5。公知的植物细胞包括，例如，来源于烟草(Nicotiana)属的细胞，尤其是来源于经受愈伤组织培养的烟草(Nicotiaha tabacum)的细胞。公知的真菌细胞包括酵母，如酵母(Saccharomyces)属，尤其是酿酒酵母(Saccharomyces cereviceae)，或丝状真菌，如曲霉(Aspergillus)属，尤其是黑曲霉(Aspergillus niger)。
当使用原核细胞时，存在使用细菌细胞的产生系统。公知的细菌细胞包括大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。
将目标抗体的基因经转化引入这些细胞中，并在体外培养转化的细胞，能获得抗体。培养按公知的方法进行。例如，能用DMEM、MEM、RPMI1640和IMDM作为培养液，并可结合使用血清添加物如胎牛血清(FCS)。另外，通过向动物的腹腔等之中植入已经引入抗体基因的细胞，也可在体内产生抗体。
至于其它的体内产生系统，能述及那些使用动物和使用植物的系统。当使用动物时，存在使用哺乳动物和昆虫的产生系统。
对于哺乳动物，能使用山羊、猪、绵羊、小鼠和牛(Vicki Glaser，光谱生物技术应用(SPECTRUM Biotechnology Applications)，1993)。至于昆虫，能使用蚕。
当使用植物时，例如能使用烟草。
将抗体基因引入这些动物或植物中，在这些动物或植物中产生抗体，并回收。例如，将一种抗体基因插入编码在奶中天然产生的蛋白质如山羊β酪蛋白的基因中间，制备融合基因。向山羊胚胎中注射含有已经插入抗体基因的融合基因的DNA片段，并将该胚胎引入雌性山羊中。从接受该胚胎的山羊所产的转基因山羊或其子代产生的奶中获得目标抗体。为了提高转基因山羊产生的含有目标抗体的奶量，可以适当地对转基因山羊施用激素(Ebert，K.M.等人，生物/技术(Bio/Technology)(1994)12，699-702)。
当使用蚕时，使蚕感染已经插入目标抗体基因的杆状病毒，从蚕的体液中能获得目标抗体(Susumu，M.等人，自然(1985)315，592-594)。此外，当使用烟草时，将目标抗体基因插入一种植物表达载体如pMON530中，然后将该载体引入细菌如根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)中。然后用该细菌感染烟草如烟草，从烟草叶中获得目标抗体(Julian，K.-C.Ma等人，欧洲免疫学杂志(1994)24，131-138)。
当如上所述在体外或体内产生系统中产生抗体时，可分别将编码抗体重链(H链)或轻链(L链)的DNA整合至表达载体中，同时转化宿主，或者可将编码H链或L链的DNA整合至一种单表达载体中，用其转化宿主(参见国际专利申请WO 94-11523)。
如上所述产生的抗体能结合多种分子如聚乙二醇(PEG)用作修饰抗体。此处所用的“抗体”包括这些修饰抗体。为了获得这些修饰抗体，可以化学修饰获得的抗体。这些方法已经在本技术领域中建立。
2.抗体的分离与纯化2-1.抗体的分离与纯化能从细胞内或细胞外或宿主中分离如上所述产生及表达的抗体，然后可将其纯化为均质。用于本发明的抗体的分离和纯化可通过亲和层析完成。对于用于此的亲和层析柱，能提及A蛋白柱和G蛋白柱。使用A蛋白柱的柱子的实例是Hyper D、POROS、Sepharose F.F.等。
此外，能不加任何限制地使用常规用于蛋白质的分离及纯化方法。本发明所用抗体的分离及纯化可以通过适当地结合除上述亲和层析之外的层析、过滤、超滤、盐析、透析等来完成。例如，层析包括离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤等等。
2-2.抗体浓度的测定通过吸光度测定或通过ELISA等能测定在上述2-1中获得的抗体的浓度。因此，当使用吸光度测定时，用PBS(-)适当稀释用于本发明的抗体或含有该抗体的样品，然后在280nm测定吸光度，随后用1mg/ml时1.35OD的吸收系数计算。当使用ELISA方法时，如下进行测定。向96孔板(Nunc生产)中加入100μl用0.1M碳酸氢盐缓冲液pH9.6稀释为1μg/ml的山羊抗人IgG(BIO SOURSE生产)，4℃温育过夜来固定抗体。封闭后，加入100μl每种适当稀释的本发明的抗体，或含有该抗体的样品，或100μl已知浓度的人IgG作为标准，在室温下温育1小时。洗涤后，加入100μl 5000倍稀释的碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体(BIOSOURSE生产)，在室温下温育1小时。洗涤后，加入底物溶液温育，随后用3550型微量培养板酶标仪(Bio-Rad生产)测定405nm的吸光度，计算目标抗体的浓度。
3.FCM分析可以通过流式细胞仪(FCM)分析检测本发明的抗体与淋巴细胞的反应性。至于细胞，能使用建立的细胞系或新分离的细胞。至于建立的细胞系，可使用T细胞系，如RPMI8402(ATCC CRL-1995)、急性成淋巴细胞白血病衍生的CCRF-CEM(ATCC CCL 119)、急性淋巴性白血病衍生的HPB-ALL(FCCH1018)、T淋巴瘤衍生的HPB-MLT(FCCH1019)、急性淋巴性白血病衍生的JM(FCCH1023)、急性成淋巴细胞白血病衍生的MOLT-4(ATCC CRL 1582)、急性淋巴性白血病衍生的Jurkat(FCCH1024)、急性成淋巴细胞白血病衍生的CCRF-HSB-2(ATCC CCL 120.1)、成人T细胞白血病衍生的MT-1(FCCH1043)和Lennert淋巴瘤衍生的KT-3(Shimizu，S.等人，血液(1988)71，196-203)，也可使用B细胞系，如EB病毒转化的细胞CESS(ATCC TIB190)、EB病毒阳性B细胞SKW 6.4(ATCC TIB 215)、B淋巴瘤衍生的MC116(ATCC CRL 1649)、急性成淋巴细胞白血病衍生的CCRF-SB(ATCC CCL 120)、急性骨髓性白血病患者衍生的B细胞RPMI 6410(RCCH6047)、伯基特淋巴瘤衍生的Daudi(ATCC CCL 213)、伯基特淋巴瘤衍生的EB-3(ATCC CCL 85)、伯基特淋巴瘤衍生的Jijoye(ATCCCCL 87)和伯基特淋巴瘤衍生的Raji(ATCC CCL 86)，此外也可使用非T非B细胞系，如急性骨髓性白血病衍生的HL-60(ATCC CCL 240)、急性单核细胞白血病衍生的THP-1(ATCC TIB 202)、组织细胞淋巴瘤衍生的U-937(ATCC CRL 1593)、慢性骨髓性白血病衍生的K-562(ATCCCCL 243)、骨髓瘤衍生的RPMI8226(ATCC CCL 155)、骨髓瘤衍生的U266B1(ATCC TIB 196)、骨髓瘤衍生的KPMM2、骨髓瘤衍生的KPC-32和浆细胞瘤衍生的ARH-77(ATCC CRL 1621)。
用PBS(-)洗涤上述细胞后，向其中加入100μl用EACS缓冲液(含有2％胎牛血清和0.05％叠氮钠的PBS(-))稀释为25μg/ml的抗体或对照抗体，然后在冰上温育30分钟。用FACS缓冲液洗涤后，加入100μl25μg/ml FITC标记的山羊抗小鼠抗体(GAM，Becton Dickinson生产)，然后在冰上温育30分钟。用FACS缓冲液洗涤后，将细胞悬浮于600μl的1ml FACS缓冲液中，用FACScan(Becton Dickinson生产)测定每种细胞的荧光强度。
4.细胞毒性4-1.ADCC活性的测定本发明所用的抗体是具有如ADCC活性作为细胞毒性的抗体。
根据本发明，能用下列方法测定对淋巴肿瘤的ADCC活性。首先，用重力离心法从人外周血或骨髓中分离单核的细胞作为效应细胞。
至于靶细胞(靶细胞T)，用51Cr标记RPMI8226(ATCC CCL-155)、CCRF-CEM(ATCC CCL 119)、(ATCC CCL 120.1)、HPB-MLT(FCCH1019)、EB-3(ATCC CCL-85)、MC116(ATCC CRL 1649)、CCRF-SB(ATCC CCL 120)、K-562(ATCC CCL 243)等，制备为靶细胞。随后，向标记的靶细胞中加入准备测定ADCC活性的抗体并温育。然后加入与靶细胞有适当比例的效应细胞，并温育。
温育后，除去上清液，用γ计数器测定放射性，可用1％NP-40进行最大游离放射性的测定。细胞毒性(％)能计算为(A-C)/(B-C)×100，其中A是在抗体存在下释放的放射性(cpm)，B是NP-40释放的放射性(cpm)，C是不含抗体的培养基独自释放的放射性(cpm)。
4-2.细胞毒性的增强为了显示细胞毒性如ADCC活性，优选地使用Cγ(尤其是Cγ1和Cγ3)作为人抗体的恒定区(C区)。此外，通过在抗体C区加入、改变或修饰部分氨基酸能诱导更强的ADCC活性或CDC活性。
通过以举例方式，能述及通过氨基酸置换对IgG的IgM样多聚体的构建(Smith，R.I.F.和Morrison，S.L.，生物/技术(1994)12，683-688)、通过氨基酸添加对IgG的IgM样多聚体的构建(Smith，R.I.F.等人，免疫学杂志(1995)154，2226-2236)、串联连接的编码L链基因的表达(Shuford，W.等人，科学(1991)252，724-727)、通过氨基酸置换对IgG的二聚化(Carton，P.C.等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)(1992)176，1191-1195，Shopes，B.，免疫学杂志(1992)148，2918-2922)、通过化学修饰对IgG的二聚化(Wolff，E.A.等人，癌症研究(1993)53，2560-2565)、通过改变抗体铰链区中的氨基酸使效应功能的引入(Norderhaug，L.等人，欧洲免疫学杂志(1991)21，2379-2384)，等等。其实现方法可通过使用引物的寡聚体位点特异诱变、使用限制酶酶切位点使碱基序列的添加，以及能产生共价键的化学调节物的应用。
5.治疗对象本发明提供一种抗体增强剂用于淋巴细胞肿瘤的治疗，该抗体能特异结合具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的蛋白质，并且具有细胞毒性，该增强剂含有一种生物反应调节物作为活性成分。尽管治疗对象是患有常见淋巴肿瘤的人类患者，但如下列实施例所述，显然本发明也能用于具有降低的免疫功能的人类患者。此处使用的“降低的免疫功能”意思是细胞毒性如ADCC降低。
尤其，当在E/T比为50的条件下只发现ADCC活性低于25％的细胞毒性时，这是特别有利的。当通过施用抗癌剂等降低免疫功能时，发现ADCC活性低于25％。当测定上述ADCC活性时，培养时间(温育时间)优选地为4小时。作为一种测定ADCC活性的方法，Cr(铬)释放试验或台盼蓝染色法是优选的。
6.生物反应调节物本发明中作为活性成分含有的生物反应调节物(BRM)是一种具有激活免疫性活性的物质。可用任何化合物作为生物反应调节物，只要它能达到本发明的作用。生物反应调节物的优选的实例包括干扰素、OK432、香菇多糖、西索菲兰、抑胃肽、云芝多糖、N-CWS、左旋咪唑、G-CSF、IL-2、IL-10、IL-12或IL-15(Konnnitino Tiryoyaku(《今日治疗性药物》)(1995年版)，Yutaka Mizushima和Akimasa Miyamoto编，Nankodo K.K.，第17版第3次印刷，1995年6月20日发行；细胞因子94-Kisokara Saishin Johomade(《细胞因子94-从基础到最新信息》)，Shinpei Kasakura编，Nihon Igakukan K.K.，第1版，1994年7月14日；Zusetsu Rinsho[Gan](临床阐述[癌症])，系列号19，(癌症临床进展)，Gan to Menneki(《癌症与免疫》)(新版)医学观察K.K.，第二版(新版)，1993年8月31日发行)。其中，IL-2是特别优选的。
这些生物反应调节物是在细胞毒性反应中作用于效应细胞，从而激活效应细胞细胞毒性的物质。这些生物反应调节物可以用公知的方法制备，并且可商业获得。
7.施用途径与药物制备本发明的增强剂可以通过肠胃外途径全身或局部施用，例如静脉注射(如点滴)、肌肉注射、腹膜内注射和皮下注射。根据患者的年龄和病情能适当地选择施用方法。有效剂量选择为每次施用每千克体重0.01mg-100mg。此外，也可选择每名患者1-100mg优选地5-50mg的剂量。对于生物反应调节物，剂量选择为每次施用1单位-1,000,000单位。
根据本发明，可以在向治疗对象如肿瘤病人施用抗体之前或之后，施用能增强该抗体作用的生物反应调节物，只要它能增强抗体的作用即可其中该抗体能特异结合具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的蛋白质，并具有细胞毒性。或者，它能与所述抗体同时施用。
根据本发明，所述抗体和生物反应调节物不仅可以对肿瘤病人施用，而且可用于离体治疗。于是，从患者外周血提取效应细胞并用生物反应调节物激活其免疫功能后，使效应细胞返回患者。可以在使效应细胞返回患者之前或之后或同时施用抗体。本发明也可用于PBSCT(外周血干细胞的移植)的血浆分离置换。在PBSCT中，当返回提取的干细胞时可施用所述抗体和生物反应调节物。
本发明包括如上所述的实施方案，只要所述抗体与生物反应调节物的联合应用能增强其作用。
本发明的增强剂可以含有药学可接受的载体或添加剂，这取决于施用途径。这些载体或添加剂的实例包括水、药学可接受的有机溶剂、胶原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯多聚体、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯树胶、酪蛋白、明胶、琼脂、双甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、药学可接受的表面活性剂等等。所用的添加剂可选择为但不限于上述物质或其组合，这取决于剂型。
本发明治疗的目标疾病是淋巴细胞肿瘤，其中用于本发明的抗体在靶肿瘤细胞上与抗原结合。具体而言，多发性骨髓瘤、急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)、慢性B淋巴细胞白血病(B-CLL)、前B淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、滤泡性大脑皮质淋巴瘤、弥漫性淋巴瘤、急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)、慢性T淋巴细胞白血病(T-CLL)、成人T细胞白血病(ATL)、非ATL外周T淋巴瘤(PNTL)，等等。本发明的增强剂可用作这些淋巴细胞肿瘤的治疗的增强剂。
实施例现在将参照下列实施例在下文中更详细地阐述本发明。然而应当指出，本发明不以任何方式受这些实施例的限制。
实施例ADCC活性的测定ADCC(抗体依赖细胞的细胞毒性)活性按照《免疫学常用方案》第7章，“人类的免疫研究”，编者Johan E，Coligan等人，John Wiley & Sons，Inc.，1993所述的方法测定。
1.效应细胞的制备用密度离心法从健康人和多发性骨髓瘤患者的外周血或骨髓中分离单核细胞。然后，向健康人和多发性骨髓瘤患者的外周血和骨髓中加入等量的PBS(-)，它在Ficoll(Pharmacia生产)-Conrey(DaiichiPharmaceutical Co.Ltd.生产)(比重1.077)上分层，以400g离心30分钟。收集单核细胞层后，用补充了10％胎牛血清(Witaker生产)的RPMI1640(Sigma生产)洗两次，向细胞中加入或不加入(只有培养基)500U/mlIL-2(Genzyme生产)、20ng/ml IL-10(Genzyme生产)、20ng/ml IL-12(R&D生产)、20ng/ml IL-15(Genzyme生产)或5000U/ml M-CSF(GreeCross K.K.生产)，培养3天。用相同培养基洗涤每种培养物两次后，用相同培养液制备细胞密度为5×106/ml的细胞。
2.靶细胞的制备放射性标记人骨髓瘤细胞系RPMI 8226(ATCC CCL 155)，方法是在补充有10％胎牛血清(Witaker生产)的RPMI 1640(Sigma生产)中与0.1mCi51Cr-铬酸钠一起37℃温育60分钟。放射性标记后，用Hanks平衡盐溶液(HBSS)洗细胞三次，并调节为2×105/ml的浓度。
3.ADCC测定向96孔U底平板(Corning生产)中加入50μl 2×105个靶细胞/ml、1μg/ml亲和纯化的人源化抗-HM1.24抗体或对照人IgG(Serotec生产)，在4℃下反应15分钟。
然后，加入100μl 5×105个效应细胞/ml，在CO2培养箱中培养4小时，其中效应细胞(E)与靶细胞(T)的比值(E∶T)设定为50∶1。
取出100μl上清液，用γ计数器(ARC361，Aloka生产)测定释放到培养上清液中的放射性。对于最大放射性的测定，使用1％的NP-40(BRL生产)。根据(A-C)/(B-C)×100计算细胞毒性(％)，其中A是在抗体存在下释放的放射性(cpm)，B是NP-40释放的放射性(cpm)，C是不含抗体的培养液单独释放的放射性(cpm)。
结果，当用来源于健康人外周血的细胞作为效应细胞时，人源化抗-HM1.24抗体对RPMI8226细胞显示强细胞毒性，而对照IgG几乎不显示细胞毒性(图1)。当用来源于免疫功能降低的多发性骨髓瘤患者的细胞作为效应细胞时，人源化抗-HM1.24抗体对RPMI8226细胞显示细胞毒性，而对照IgG几乎不显示细胞毒性(图2)。
然而，该活性弱于上述健康人中的活性(低于25％)。当加入IL-2、IL-10、IL-12或IL-15时，人源化抗-HM1.24抗体的细胞毒性增强。尤其对于IL-2，活性增强至几乎与健康人相等的水平(图2)。
此外，当来源于用大剂量环磷酰胺治疗的骨髓瘤患者、经受血浆分离置换的细胞作为效应细胞时，人源化抗-HM1.24抗体对RPMI8226细胞显示细胞毒性，而对照IgG几乎不显示细胞毒性(图3)。然而，该活性弱于上述健康人中的活性(低于25％)。当加入IL-2、IL-10或IL-12时，人源化抗-HM1.24抗体的细胞毒性增强(图3)。
这表明人源化抗-HM1.24抗体对肿瘤细胞(它们是来源于免疫功能降低的患者的效应细胞)的细胞毒性增强弱于来源于正常人或免疫功能未降低的患者的效应细胞。通过加入BRM如IL-2，能增强效应细胞的细胞毒性，甚至达到健康人的水平。
因此，当对免疫功能降低的患者体内或离体施用人源化抗-HM1.24抗体时，BRM的联合应用预计将进一步增强抗肿瘤作用。同样，当对患者(其经历了将在外周血干细胞移植时经受血浆分离置换的细胞返回该患者)体内或离体地施用人源化抗-HM1.24抗体时，BRM的联合应用预计将进一步增强抗肿瘤作用。
参考实施例1.产生小鼠抗-HM1.24单克隆抗体的杂交瘤的制备按照Goto，T.等人，血液(1994)84，1992-1930的方法，制备产生小鼠抗-HM1.24单克隆抗体的杂交瘤。
每6周向BALB/c小鼠(Charles River生产)的腹腔中注射两次来源于人多发性骨髓瘤患者骨髓的浆细胞系KPC-32(1×107个细胞)(Goto，T.等人，日本临床血液学杂志(1991)32，1400)。
杀死动物之前三天，向小鼠脾脏注射1.5×106个KPC-32，以进一步提高小鼠的抗体产生能力(Goto，T.等人，Tokushima实验医学杂志(1990)37，89)。杀死动物后，取出脾脏，并按照Groth，de St.和Schreidegger(癌症研究(1981)41，3465)的方法将取出的器官与骨髓瘤细胞SP2/0进行细胞融合。
通过应用KPC-32的细胞ELISA(Posner，M.R.等人，免疫学方法杂志(1982)48，23)，筛选杂交瘤培养上清液中的抗体。将5×104个KPC-32悬浮于50ml PBS中，然后等分至96孔培养板中(U底，Corning，Iwaki生产)，在37℃下风干过夜。用含有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS封闭后，加入杂交瘤的培养上清液，在4℃下温育2小时。然后，与过氧化物酶标记的抗小鼠IgG山羊抗体(Zymed生产)在4℃下反应1小时。洗涤后，在室温下与邻苯二胺底物溶液(Sumitomo Bakelite生产)反应30分钟。
加入2N硫酸终止反应，用ELISA酶标仪(Bio-Rad生产)测定492nm的吸光度。为了除去产生抗人免疫球蛋白抗体的杂交瘤，预先向人血清吸附阳性杂交瘤的培养上清液，并用ELISA筛选与其它细胞系的反应性。挑选出阳性杂交瘤，用流式细胞术研究其与多种细胞的反应性。将最后选出的杂交瘤集落克隆两次，注射到降植烷处理的BALB/c小鼠的腹腔中，从中获得腹水。
用硫酸铵沉淀法和A蛋白亲和层析试剂盒(Ampure PA，Amersham生产)由小鼠的腹水纯化单克隆抗体。用Quick Tag FITC结合试剂盒(Boehringer Mannheim生产)以FITC标记纯化的抗体。
结果，由30个杂交瘤集落产生的单克隆抗体与KPC-32和RPMI8226反应。克隆后，研究这些杂交瘤的培养上清液与其它细胞系或外周血单核细胞的反应性。
其中，3个克隆是可与浆细胞特异反应的单克隆抗体。这3个克隆中，筛选出对于流式细胞分析最有用、并且对RPMI 8226具有CDC活性的杂交瘤克隆，命名为HM1.24。通过ELISA用亚类特异的抗小鼠兔抗体(Zymed生产)测定该杂交瘤产生的单克隆抗体的亚类。抗-HM1.24抗体有IgG2aκ亚类。产生抗-HM1.24抗体的杂交瘤HM1.24于1995年9月14日由国立生命科学和人体技术研究所，工业科学与技术机构，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba市，Ibaraki pref.，日本，按布达佩斯条约的规定进行国际保藏，保藏号为FERM BP-5233。
参考实施例2.人源化抗-HM1.24抗体的制备人源化抗-HM1.24抗体是按照国际专利申请WO 98-14580所述的方法获得的。
用常规方法从参考实施例1中制备的杂交瘤HM1.24中制备总RNA。由此合成编码小鼠抗体V区的cDNA，经聚合酶链反应(PCR)法和5’-RACE法扩增。获得含有编码小鼠V区的基因的DNA片段，与每种质粒pUC克隆载体相连接，然后将其引入感受态大肠杆菌细胞中，获得大肠杆菌转化子。从转化子中获得上述质粒。用常规方法测定质粒中cDNA编码区的碱基序列，并确定每一V区的互补决定区(CDR)。
为了构建表达嵌合抗-HM1.24抗体的载体，将编码小鼠抗-HM1.24抗体每一L链和H链V区的cDNA插入HEF载体中。此外，为了构建人源化抗-HM1.24抗体，通过CDR移植法将小鼠抗-HM1.24抗体V区CDR移植到人抗体中。用人抗体REI的L链作为人抗体的L链，对于构架区(FR)1-3，用人抗体HG3的FR1-3作为人抗体的H链，人抗体JH6的FR4用于FR4。替换H链V区FR中的氨基酸，使得CDR移植的抗体能够形成合适的抗原结合位点。
为了在哺乳动物细胞中表达这样构建的人源化抗-HM1.24抗体L链和H链的基因，将每种基因分开引入HEF载体中，分别构建表达人源化抗-HM1.24抗体L链或H链的载体。
通过向CHO细胞中同时引入这两种表达载体，建立产生人源化抗-HM1.24抗体的细胞系。通过细胞ELISA，研究经培养人羊膜细胞系WISH获得的人源化抗-HM1.24抗体对该细胞系的抗原结合活性和结合抑制活性。结果表明，人源化抗-HM1.24抗体具有与嵌合抗体相等的抗原结合活性，至于使用生物素化小鼠抗-HM1.24抗体研究的结合抑制活性，它具有与嵌合抗体或小鼠抗体相等的活性。
顺便提到，携带含有嵌合抗-HM1.24抗体L链或H链的质粒的大肠杆菌已经于1996年8月29日由国立生命科学和人体技术研究所，工业科学与技术机构，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，日本，按布达佩斯条约的规定进行国际保藏，分别为大肠杆菌DH5α(pUC19-1.24L-gκ)和大肠杆菌DH5α(pUC19-1.24H-gγ1)，保藏号分别为FERMBP-5646和FERM BP-5644。
此外，携带含有人源化抗-HM1.24抗体L链a型和H链r型的质粒的大肠杆菌已经于1996年8月29日由国立生命科学和人体技术研究所，工业科学与技术机构，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，日本，按布达佩斯条约的规定进行国际保藏，分别为大肠杆菌DH5α(pUC19-RVLa-AHM-gκ)和大肠杆菌DH5α(pUC19-RVHr-AHM-gγ1)，保藏号分别为FERM BP-5645和FERM BP-5643。此外，携带含有人源化抗-HM1.24抗体H链s型的质粒的大肠杆菌已经于1997年9月29日由国立生命科学和人体技术研究所，工业科学与技术机构，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki pref.，日本，按布达佩斯条约的规定进行国际保藏为大肠杆菌DH5α(pUC19-RVHs-AHM-gγ1)，保藏号为FERM BP-6127。
参考实施例3.编码HM1.24抗原蛋白质的cDNA的克隆1.cDNA文库的构建1)总RNA的制备如下所述克隆可被小鼠抗-HM1.24抗体特异识别的编码HM1.24抗原蛋白质的cDNA。
按照Chirgwin等人(生物化学18，5294(1979))的方法从人多发性骨髓瘤细胞系KPMM2中制备总RNA。然后，在20ml 4M硫氰酸胍(Nacalai Tesque Inc.生产)中充分匀浆化2.2×108个KPMM2。
在离心管中将匀浆物层加于5.3M氯化铯溶液上，然后于20℃在Beckman SW40转头中以31,000转每分离心24小时，沉淀RNA。用70％乙醇洗涤沉淀，然后溶解于300μl含1mM EDTA和0.5％SDS的10mMTris-HCl(pH7.4)中。加入链霉蛋白酶(Boehringer生产)至浓度为0.5mg/ml，然后在37℃下温育30分钟。用酚和氯仿抽提该混合物，用乙醇沉淀RNA。然后将RNA沉淀溶解于200μl含1mM EDTA的10mMTris-HCl(pH7.4)中。
2)poly(A)+RNA的制备使用Fast Track 2.0mRNA分离试剂盒(Invitrogen生产)，按照该试剂盒所附的方案，以如上所述制备的500μg总DNA作为原料，纯化poly(A)+RNA。
3)cDNA文库的构建使用cDNA合成试剂盒TimeSaver cDNA合成试剂盒(Pharmacia生产)，按照该试剂盒所附的方案，以10μg上述poly(A)+RNA作为原料，合成双链cDNA，然后进一步按照该试剂盒所附的方案，用DirectionalCloning Toolbox(Pharmacia生产)将其与该试剂盒提供的EcoRI接头连接。按照试剂盒所附方案进行EcoRI接头的kination和限制酶NotI处理。此外，用1.5％低熔点琼脂糖凝胶(Sigma生产)分离并纯化大小约为500bp或更大的添加接头的双链cDNA，获得大约40μl添加接头的双链cDNA。
用预先以限制酶EcoRI和NotI及碱性磷酸酶(Takara Shuzo生产)处理的pCOS1载体和T4DNA连接酶(GIBCO-BRL生产)连接这样构建的添加接头的双链cDNA，以构建cDNA文库。使构建的cDNA文库转导大肠杆菌DH5α株(GIBCO-BRL生产)，随后估计大约2.5×106总大小的独立克隆。质粒pCOS1的构建方法是，用EcoRI和SmaI消化表达载体HEF-PMh-gγ1(参见国际专利申请WO 92-19759)，删除所含的DNA，并且将其与EcoRI-NotI-BamHI接头(Takara Shuzo生产)连接。
2.通过直接表达法的克隆1)对COS-7细胞的转染在含有50μg/ml氨苄青霉素的2-YT培养基(《分子克隆实验室手册》，Sambrook等人，冷泉港实验室出版社(1989))中培养大约5×105个上述转导的大肠杆菌克隆，扩增cDNA，进行碱裂解法(《分子克隆实验室手册》，Sambrook等人，冷泉港实验室出版社(1989))从大肠杆菌中回收质粒DNA。使用基因脉冲发生装置(Bio-Rad生产)通过电穿孔法使这样获得的质粒DNA转染COS-7细胞。
然后，将10μg纯化的质粒DNA加入0.8ml COS-7细胞溶液中，其中细胞已经以1×107细胞/ml悬浮于PBS中，并且对该混合物施以1500V和25μFD电容的脉冲。在室温下恢复10分钟后，将电穿孔的细胞在含有10％胎牛血清(GIBCO-BRL生产的)DMEM培养基(GIBCO-BRL生产)中在37℃和5％CO2条件下培养3天。
2)淘选皿的制备按B.Seed等人(美国国家科学院院报，84，3365-3369(1987))的方法制备包被有小鼠抗-HM1.24抗体的淘选皿。然后，向50mM Tris-HCl(pH9.5)中加入小鼠抗-HM1.24抗体至浓度为10μg/ml。向直径60mm的细胞培养皿中加入3毫升这样制备的抗体溶液，在室温下温育2小时。用0.15M NaCl溶液洗涤三次后，向培养皿中加入含有5％胎牛血清、1mMEDTA和0.02％NaN3的PBS。封闭后，用于进行下列克隆。
3)cDNA文库的克隆用含有5mM EDTA的PBS裂解如上所述转染的COS-7细胞。以含有5％胎牛血清的PBS洗涤细胞一次后，将其悬浮于含5％胎牛血清和0.02％NaN3的PBS中，至浓度约为1×106细胞/ml。将悬液加入如上所述制备的淘选皿中，在室温下温育2小时。以含有5％胎牛血清和0.02％NaN3的PBS轻洗三次后，用含有0.6％SDS和10mM EDTA的溶液从与淘选皿结合的细胞中回收质粒DNA。
使回收的质粒DNA转导大肠杆菌DH5α。如上所述扩增后，用碱裂解法回收质粒DNA。通过电穿孔法使回收的质粒DNA转染COS-7细胞，从如上所述结合的细胞中回收质粒DNA。重复一次类似步骤，用限制酶EcoRI和NotI消化回收的质粒DNA，从而确定大小约为0.9kbp的插入片段的浓度。此外，将一部分回收质粒DNA已被转导的大肠杆菌细胞接种到含有50μg/ml氨苄青霉素的2-YT琼脂平板上。过夜培养后，从单菌落中回收质粒DNA。用限制酶EcoRI和NotI消化，获得克隆p3.19，其中插入片段的大小约为0.9kbp。
用PRISM染料终止循环测序试剂盒(Perkin Elmer生产)，按照试剂盒所附方案对该克隆反应，用ABI 373A DNA测序仪(Perkin Elmer制造)测定其碱基序列。该碱基序列及相应的氨基酸序列示于SEQ IDNO1中。
工业实用性通过联合使用抗-HM1.24抗体和生物反应调节物，尤其ADCC活性降低的效应细胞的细胞活性得到提高。这表明抗-HM1.24抗体与生物反应调节物的联合应用导致对淋巴细胞肿瘤的抗肿瘤作用的增强。
参考按专利合作条约细则13-2保藏的微生物，以及保藏单位的名称。
保藏单位名称国立生命科学和人体技术研究所，工业科学与技术机构地址1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，日本生物(1)名称大肠杆菌DH5α(pRS38-pUC19)保藏号FERM BP-4434保藏日期1993年10月5日生物(2)名称小鼠-小鼠杂交瘤HM1.24保藏号FERM BP-5233保藏日期1995年4月27日生物(3)名称大肠杆菌DH5α(pUC19-RVHr-AHM-gγ1)保藏号FERM BP-5643保藏日期1996年8月29日生物(4)名称大肠杆菌DH5α(pUC19-1.24H-gγ1)保藏号FERM BP-5644保藏日期1996年8月29日生物(5)
名称大肠杆菌DH5α(pUC19-RVLa-AHN-gκ)保藏号FERM BP-5645保藏日期1996年8月29日生物(6)名称大肠杆菌DH5α(pUC19-1.24L-gκ)保藏号FERM BP-5646保藏日期1996年8月29日生物(7)名称大肠杆菌DH5α(pUC19-RVHs-AHM-gγ1)保藏号FERM BP-6127保藏日期1997年9月29日序列表SEQ ID NO1序列长度1013序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型cDNA序列GAATTCGGCA CGAGGGATCT GG ATG GCA TCT ACT TCG TAT GAC TAT TGC 49Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys1 5AGA GTG CCC ATG GAA GAC GGG GAT AAG CGC TGT AAG CTT CTG CTG GGG97Arg Val Pro Met Glu Asp Gly Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly10 15 20 25ATA GGA ATT CTG GTG CTC CTG ATC ATC GTG ATT CTG GGG GTG CCC TTG145Ile Gly Ile Leu Val Leu Leu Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu30 35 40ATT ATC TTC ACC ATC AAG GCC AAC AGC GAG GCC TGC CGG GAC GGC CTT193Ile Ile Phe Thr Ile Lys Ala Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu45 50 55CGG GCA GTG ATG GAG TGT CGC AAT GTC ACC CAT CTC CTG CAA CAA GAG241Arg Ala Val Met Glu Cys Arg Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu60 65 70CTG ACC GAG GCC CAG AAG GGC TTT CAG GAT GTG GAG GCC CAG GCC GCC289Leu Thr Glu Ala Gln Lys Gly Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala75 80 85ACC TGC AAC CAC ACT GTG ATG GCC CTA ATG GCT TCC CTG GAT GCA GAG337Thr Cys Asn His Thr Val Met Ala Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Glu90 95 100 105AAG GCC CAA GGA CAA AAG AAA GTG GAG GAG CTT GAG GGA GAG ATC ACT385Lys Ala Gln Gly Gln Lys Lys Val Glu Glu Leu Glu Gly Glu Ile Thr110 115 120
ACA TTA AAC CAT AAG CTT CAG GAC GCG TCT GCA GAG GTG GAG CGA CTG433Thr Leu Asn His Lys Leu Gln Asp Ala Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu125 130 135AGA AGA GAA AAC CAG GTC TTA AGC GTG AGA ATC GCG GAC AAG AAG TAC481Arg Arg Glu Asn Gln Val Leu Ser Val Arg Ile Ala Asp Lys Lys Tyr140 145 150TAC CCC AGC TCC CAG GAC TCC AGC TCC GCT GCG GCG CCC CAG CTG CTG529Tyr Pro Ser Ser Gln Asp Ser Ser Ser Ala Ala Ala Pro Gln Leu Leu155 160 165ATT GTG CTG CTG GGC CTC AGC GCT CTG CTG CAG TGA GATCCCAGGA 575Ile Val Leu Leu Gly Leu Ser Ala Leu Leu Gln170 175 180AGCTGGCACA TCTTGGAAGG TCCGTCCTGC TCGGCTTTTC GCTTGAACAT TCCCTTGATC 635TCATCAGTTC TGAGCGGGTC ATGGGGCAAC ACGGTTAGCG GGGAGAGCAC GGGGTAGCCG 695GAGAAGGGCC TCTGGAGCAG GTCTGGAGGG GCCATGGGGC AGTCCTGGGT GTGGGGACAC 755AGTCGGGTTG ACCCAGGGCT GTCTCCCTCC AGAGCCTCCC TCCGGACAAT GAGTCCCCCC 815TCTTGTCTCC CACCCTGAGA TTGGGCATGG GGTGCGGTGT GGGGGGCATG TGCTGCCTGT 875TGTTATGGGT TTTTTTTGCG GGGGGGGTTG CTTTTTTCTG GGGTCTTTGA GCTCCAAAAA 935AATAAACACT TCCTTTGAGG GAGAGCACAC CTTAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 995AAAATTCGGG CGGCCGCC 1013SEQ ID NO2序列长度379序列类型核酸拓扑结构线性分子类型cDNA序列ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TCC TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT48Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly-15 -10 -5GTC CAC TCC GAC ATC CAG ATG ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG AGC GCC96Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala-1 1 5 10AGC GTG GGT GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGT AAG GCT AGT CAG GAT GTG144Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val15 20 25
AAT ACT GCT GTA GCC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA AAG GCT CCA AAG192Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys30 35 40 45CTG CTG ATC TAC TCG GCA TCC AAC CGG TAC ACT GGT GTG CCA AGC AGA240Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg50 55 60TTC AGC GGT AGC GGT AGC GGT ACC GAC TTC ACC TTC ACC ATC AGC AGC288Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser65 70 75CTC CAG CCA GAG GAC ATC GCT ACC TAC TAC TGC CAG CAA CAT TAT AGT336Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser80 85 90ACT CCA TTC ACG TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA C 379Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys95 100 105SEQ ID NO3序列长度418序列类型核酸拓扑结构线性分子类型cDNA序列ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT48Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly-15 -10 -5GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG96Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys-1 1 5 10
CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC144Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe15 20 25ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT192Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT240Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser50 55 60CAG AAG TTC AAG GGC AGA GTC ACC ATG ACC GCA GAC AAG TCC ACG AGC288Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser65 70 75ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val80 85 90TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr95 100 105TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110 115 120SEQ ID NO4序列长度418序列类型核酸拓扑结构线性分子类型cDNA序列ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly-15 -10 -5GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys-1 1 5 10
CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC144Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe15 20 25ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT192Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT240Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser50 55 60CAG AAG TTC AAG GGC AGA GTC ACC ATC ACC GCA GAC AAG TCC ACG AGC288Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser65 70 75ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val80 85 90TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr95 100 105TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110 115 120
权利要求
1.选自干扰素、OK432、香菇多糖、西索菲兰、抑胃肽、云芝多糖、N-CWS、左旋咪唑、G-CSF、IL-2、IL-10、IL-12或IL-15的生物反应调节物用于治疗淋巴细胞肿瘤的用途，其中所述生物反应调节物增强能特异结合具有如SEQ ID NO5所示氨基酸序列的蛋白质的抗体之细胞毒性，其中所述抗体用于治疗淋巴细胞肿瘤。
2.根据权利要求1的用途，其中淋巴细胞肿瘤是T细胞肿瘤。
3.根据权利要求1的用途，其中淋巴细胞肿瘤是B细胞肿瘤。
4.根据权利要求4的用途，其中B细胞肿瘤是骨髓瘤。
5.根据权利要求1的用途，其中抗体是单克隆抗体。
6.根据权利要求1的用途，其中细胞毒性是ADCC活性。
7.根据权利要求5的用途，其中抗体具有人抗体的恒定区Cγ。
8.根据权利要求7的用途，其中人抗体的恒定区Cγ是Cγ1或Cγ3。
9.根据权利要求5的用途，其中抗体是抗-HM1.24抗体。
10.根据权利要求5的用途，其中抗体是嵌合抗体或人源化抗体。
11.根据权利要求9的用途，其中抗体是嵌合抗-HM1.24抗体。
12.根据权利要求9的用途，其中抗体是人源化抗-HM1.24抗体。
13.根据权利要求1的用途，其中该抗体能特异结合可被抗-HM1.24抗体识别的表位。
14.根据权利要求1的用途，其中该抗体具有细胞毒性，在E/T比为50的条件下ADCC活性低于25％。
15.一种用于淋巴细胞肿瘤的治疗剂，该药剂含有一种抗体和一种生物反应调节物，该抗体能特异结合具有如SEQ ID NO5所示氨基酸序列的蛋白质，并具有细胞毒性，所述生物反应调节物选自干扰素、OK432、香菇多糖、西索菲兰、抑胃肽、云芝多糖、N-CWS、左旋咪唑、G-CSF、IL-2、IL-10、IL-12或IL-15。
全文摘要
一种用于淋巴细胞肿瘤治疗的抗体增强剂，该抗体特异性结合具有如SEQ ID NO1所示氨基酸序列的蛋白质，并具有细胞毒性，该增强剂含有一种生物反应调节物作为活性成分。
文档编号A61P35/00GK101073667SQ20071008770
公开日2007年11月21日 申请日期1998年10月14日 优先权日1997年10月14日
发明者小阪昌明, 小石原保夫 申请人:中外制药株式会社