专利名称：一种RNAi载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及载体及其应用，特别是涉及一种基于SFV病毒复制子载体构建的RNAi载体及其在制备抑制靶基因表达的基因治疗性药物中的应用。
背景技术：
RNA干涉(RNA interference，RNAi)是近年生命科学领域重要的科研成果之一。它是一种转录后水平的基因沉默机制，通过双链RNA(dsRNA)与同源mRNA碱基互补配对，并引导核酸酶迅速降解结合位点的mRNA，从而阻断相应基因的表达，具有高稳定、高效率、高特异和高穿透的特点，故而被广泛运用在沉默特定基因上。比此前抑制基因表达的所有方法都更高效特异和简便易行。基于上述优点，RNAi技术在生物技术和生物医学中具有广阔的应用前景。目前，RNAi在线虫、果蝇以及植物等模式生物中的应用已经取得了较多成果(尤其是功能基因组研究)，在哺乳动物中的研究和应用也取得不少进展，特别是在抗肿瘤和抗病毒领域具有的重大潜在商用价值，已成为研究者及大众热切关注的焦点。
目前，实施RNAi的基本方法，包括以下步骤1、siRNA的设计与筛选；2、siRNA的获得目前，较为常用的制备siRNA的方法如下(汤华主编，RNA干扰原理与应用，科学出版社，2006)(1)化学合成直接通过化学方法合成两条互补的21-23nt单链RNA，然后退火形成双链RNA。这是最早应用和目前仍为多数研究人员所采用的一种方法，简便可靠，周期短，可引入各种有益的化学修饰，但成本较高。
(2)利用质粒或病毒体内转录通过转染含RNA聚合酶III启动子(RNA polymerase III promoter，pol III)或RNA聚合酶II启动子(pol II)及其下游一小段特殊结构的质粒或病毒载体到宿主细胞内，首先转录生成短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)，然后被Dicer酶水解成siRNA发挥基因沉默效应。该方法相对麻烦，但可以发挥持续的抑制作用，利于长期研究。如果以病毒为载体则能进一步提高转染效率。
目前，已有大量质粒载体在医学等研究领域被广泛使用，病毒载体在应用上多用复制缺陷型腺病毒及逆转录病毒。
(3)体外转录及生物合成A、T7 RNA聚合酶转录法体外转录合成两条互补的单链RNA，然后退火形成双链siRNA。适用于筛选多种siRNA，尤其是需要制备多个siRNA而化学合成的成本较高时，但该方法不适用于对特定siRNA进行长期研究。局限性在于其设计、合成、终产物的纯化处理等技术要求严格，不能引入化学修饰，而且并非所有序列均能被很好地转录。
B、PCR合成法以PCR方法为基础合成Pol III启动子-siRNA基因构建体，然后直接转染到细胞内表达。可快速检测siRNA在细胞中的作用，适用于筛选最有效的siRNA/靶序列组合。主要缺点是很难转染到细胞中。
C、重组人Dicer体外合成法用体外转录的方法制备200-1000bp的双链RNA，然后用重组Dicer或RNaseIII在体外消化，得到各种不同的siRNA的混合物。该方法省时、省力，但有序列不确定性，可能导致非特异性的基因沉默。同时，siRNA混合物必须经仔细纯化，且同体外转录法一样，不能引入化学修饰。
3、siRNA的导入体外研究RNA/重组质粒可用脂质体/电转法，重组病毒颗粒可直接转染；体内实验大多直接进行局部注射或静脉注射。但很难评价具体哪种方法能更有效地引起RNAi。
在RNAi技术大规模应用于临床之前，除siRNA自身的特异性外，还有以下问题亟待解决(陈煜，世界华人消化杂志，2006；142123)(1)siRNA导入细胞内的效率低裸RNA或重组质粒转染虽然对细胞系有作用，但对原代细胞的作用还不够令人满意。电穿孔可引起细胞大量死亡(超过50％)，所以RNAi技术要想在实际的临床应用中获得成功，给药的方式还有待于进一步研究。目前，病毒载体在临床应用中是被看好的一条途径。另外，最近德国Vornloher等把siRNA附在一个靶向分子(脂溶性胆固醇)上也成功实现了靶向RNAi。
(2)siRNA的稳定性RNA在体外和胞内均极易降解，如何储存并将siRNA高效特异地送入患者体内的合适位置是个大难题。另外，siRNAs在病人体内如不能迅速进入细胞内，或者与血浆蛋白亲和力低就会较早地被机体清除。稳定性低和转染方式低效，导致直接注射合成的siRNA所需的剂量极高，因此用于临床治疗将非常昂贵，不可行。此外，通过一些化学修饰等优化手段只能相对增加其半衰期。为避免siRNA降解，利用编码siRNA的重组载体在体内复制是一条有效途径，但如何选择和设计最为安全高效的载体成为另一个难题，至今还未能找到一个理想的选择。
(3)RNAi作用的时效性研究表明，哺乳动物RNAi与其它真核生物RNAi之间有一个明显的区别哺乳动物细胞中对于RNAi的长期持续存在缺少放大系统。例如，果蝇中大约35个dsRNA可使1000个拷贝的目标mRNA沉默，并且可产生系统性RNAi甚至持续遗传几个世代，而在人工化学合成siRNA所致哺乳动物细胞中的RNAi平均只存在66h。这其中一个重要原因就是RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNApolymerase，RdRp)的存在。RdRp已在植物、蠕虫和真菌中发现，是沉默信号扩散、扩增和维持的基本条件，可通过以siRNA为引物合成新的dsRNA。然而在哺乳动物细胞中还没有发现RdRp的同源物。目前，一些可能应用于治疗的实验方案都不可避免地面临着RNA作用时间等一些影响其持续作用的问题。对此，使用慢病毒或腺病毒等相关病毒载体获得siRNA稳定表达在部分研究者中被看好，但一方面安全性仍有明显隐患(宿主基因组整合)，另一方面，这些载体体内表达效率均不十分理想，抑制效果一般不如化学合成的siRNA，对某些细胞内表达丰度特别高的基因更难以起到抑制作用。
如前所述，病毒载体可携带目的基因有效穿过细胞膜并在胞内表达siRNA，是目前已知对siRNA转染细胞低效性和siRNA稳定性不佳问题最有效的解决方案。
在病毒载体的选择上，各种病毒载体各有优劣，主要视应用目的综合权衡。目前已在医学等研究领域得到使用的RNAi病毒载体，基本均为传统的复制缺陷型腺病毒载体或逆转录病毒载体(含慢病毒载体)。
甲病毒载体系统(alphavirus Vector System，AV)是90年代末出现的最有前景的新一代载体系统之一。近年来，研究人员对Semliki森林病毒(Semliki forestvirus，SFV)研究得最多也最深入，该病毒为一种单股正链RNA病毒，宿主范围广泛，其5’编码的非结构蛋白具有RdRp特性，病毒感染细胞后可不入核，在胞浆内迅速自身复制并表达非结构蛋白，3-5h内开始大量催化亚基因组26S mRNA的复制和翻译，并持续高表达直至最终所转化细胞凋亡(Strauss and Strauss，Microbiol Rev.1994；58491 Review)。
重组SFV的制备简单而迅速，每个细胞内可产生105RNA和108蛋白，在2天之内就可达到109-1010PFU/mL的高滴度，且不需要进一步的纯化或离心。相比起来，逆转录病毒/慢病毒、腺相关病毒所花的时间和精力都要大得多，而病毒滴度远低于SFV。腺病毒虽转染效率、滴度也不错，在临床实验中取得较好的治疗效果，但机体针对该病毒的免疫反应的问题却较突出。SFV则没有这些缺陷，它可以反复注射而不会引起机体针对病毒自身的免疫反应(陈煜，世界华人消化杂志2006；142123)。LiljestromP等人将早期SFV载体中的结构蛋白基因切除另外构建成辅助载体，并在辅助载体的结构基因中设置了一系列突变，用于人体更为安全(Liljestrom P，J Virol，1991，654107；Suopanki J，J Gen Virol.1998；79309)。欧洲已有研究者用AV载体研制疫苗，获得了令人振奋的早期结果。目前，SFV载体主要用于表达蛋白。但研究表明，在去除3’末端重复序列(3’-UTR)的情况下，其亚基因组RNA仍可复制或转录，却不能再进一步表达为蛋白，这使SFV复制酶用于表达siRNA成为可能(金奇，医学分子病毒学，科学出版社，2001)。况且，RNAi的过程主要在胞浆中进行，SFV可在胞浆中直接复制，而且本来就是RNA病毒，因而用于表达siRNA具有先天的巨大优势，所能形成的RNA产率可使所有现有的RNAi质粒/病毒难望其项背。
现有SFV载体的最大特点是转染、表达效率极高且不引起抗病毒免疫，但表达时间相对较短，这一特性，在机体需要长期表达时就成为缺点，不如慢病毒等。但从免疫学和安全的角度来看，这也是一个优点，因为短时间高强度刺激是符合免疫系统的要求的，不整合入宿主细胞基因组，则致癌的风险性更低；另一方面，RNA复制酶缺乏DNA聚合酶的监督纠错机制，本身也不利于长期表达。
发明内容
本发明的目的是提供一种可高效、特异抑制靶基因表达的RNAi载体。
本发明所提供的RNAi载体，是在SFV载体骨架中含有CMVIE启动子和Sv40 polyA的重组SFV表达载体；所述CMV IE启动子的GenBank号为U57607.1(1-589)，Sv40poly A的GenBank号为AM697713(2404-2644)。
在所述重组SFV载体骨架中，所述CMV IE启动子位于SFV病毒5’末端非翻译区(5’-UTR)的上游。在用CMV IE启动子替代原SP6启动子驱动SFV非结构蛋白转录，并相应地在SFV 3’末端非翻译区(3’-UTR)下游加入Sv40 poly A以确保转录正确终止后，可以在构建重组质粒时直接用DNA操作，减少了须RNA操作的不便。
由于SFV载体原有的多克隆位点(MCS)所包含的酶切位点少且设计欠佳，为方便外源基因的插入及转录，可在所述重组SFV载体骨架中的26S亚基因组启动子下游添加含优化多克隆位点的shRNA表达元件；所述shRNA表达元件自上游至下游依次包含一个RNA聚合酶III(RNA pol III)启动子、多克隆位点和由5-6个(优选为5个)碱基“T”组成的终止信号；所述RNA pol III启动子的选择是广泛的，如人或鼠的U6、H1RNP RNA启动子，也可选择tRNAval或tRNAmet等tRNA启动子，优选为改良的人tRNAmet启动子MTD，其序列参见文献Boden D，Pusch O，Lee F，et al.Nucleic Acids Res.2003； 31(17)5033-8。
所述shRNA表达元件中的多克隆位点所包含的酶切位点可根据实际需要进行选择，以方便目的基因的插入。所述目的基因可为由一个茎环(loop)序列分开的针对沉默靶基因设计的小干扰RNA编码基因的正义链和反义链序列，所述茎环的序列可由使用者根据需要自主选择，如5’-TTCAAGAGA-3’或5’-TCAAGAG-3’等。
为方便进行真核抗性筛选，在所述shRNA表达元件中的多克隆位点和终止信号之间还包含一个真核抗性基因选择复合体；所述真核抗性基因选择复合体自上游至下游依次包含一个SV40早期启动子(GenBank号为X99274，6850-7187)、一个抗生素抗性基因以及一个HSV-TK Poly A(GenBank号为AB242435，3867-3885)。
所述抗生素抗性基因的选择是广泛的，如Neomycin(Neo，Kan/G418耐受)、Zeomycin、Hygromycin(Hygro)抗性基因或GFP/Neo(绿色荧光蛋白报告基因和Kan/G418抗性基因)等，优选为Neomycin抗性基因(GenBank号为AF113968，2277-3080)。
此外，为避免产生过多不必要的蛋白/多肽引起非特异性反应，同时减低SFV毒性，延长宿主细胞shRNA的表达时间，还可去掉原SFV载体骨架中SFV病毒基因的3’末端非翻译区(3’-UTR)的重复序列(repeating seqence)，以使SFV病毒26S亚基因组保持RNA复制/转录功能而基本丧失翻译功能。
用于构建所述RNAi载体的出发载体的选择也是广泛的，可为pSFV-1、pSFV-3、pCMV-Rep或pSCA1等任意的SFV病毒复制子载体。
其中，以pSFV-1为出发载体构建的RNAi载体为pSFV-RNAi Ready。
所述RNAi载体可按照基因工程领域的常规方法构建。
本发明提供了一种RNAi载体。该载体是利用SFV病毒复制子载体构建的一种RNAi体内表达载体。在本发明的RNAi载体中的多克隆位点插入针对靶基因设计的shRNA的编码DNA，再以重组质粒/重组病毒方式转染细胞后，通过宿主细胞核中RNA聚合酶II转录重组体，产生正链RNA并翻译合成病毒的复制酶，随后，就可借助该复制酶的RdRp放大效果，启动亚基因组中shRNA表达元件的复制和转录，大量合成子代shRNA，从而在转染细胞中高效、特异地抑制靶基因的表达，实验结果表明抑制效果可达90％以上，且10d后抑制效果依然存在，超过体外合成siRNA的平均时间66h，时间接近一般质粒载体水平，而抑制效率远远胜出，因此，针对某些细胞内用常规载体抑制效果欠佳的高丰度表达基因本发明的RNAi载体有突出的抑制效果。本发明载体适用于需短期高效沉默目的基因的科学研究或制备研究基因功能的试剂中，特别是可用本发明的RNAi载体制备成抑制靶基因(包括癌基因、转录因子基因和生长因子基因等基因，例如HPV E6、E7，c-myc或VEGF基因等)表达的基因治疗性药物。因此，本发明将在生物医药领域及基因功能的研究中发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为RNAi载体pSFV-RNAi Ready的物理图谱及构建过程示意2为本发明RNAi载体的作用原理示意3为实施例2中的各处理组与空白对照组的部分Western blot鉴定结果及其16E6蛋白表达水平变化的灰度比值柱形图具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见《Molecular CloningA Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物及DNA序列如无特别说明均由上海生工合成。
实施例1、RNAi载体pSFV-RNAi Ready的构建以pSFV-1为出发载体，构建本发明的RNAi载体pSFV-RNAi Ready，具体构建方法包括以下步骤1)用CMVIE启动子+Sv40 poly A体系替换SP6启动子(见图1中的①)。具体方法为合成引物P1(带下划线碱基为Spe I识别位点)5’-caaactagtcaaacatgataagatac-3’、P2(带下划线碱基为Xba I识别位点)5’-ggctctagataccacatttgtagagg-3’、P3(带下划线碱基为Sph I识别位点)5’-gccggcatgctagttattaataggtaa tcaattacggggtc-3’、P45-catccgccatcgttagccagaggatctgacg-3’以及P55’-ctctggctaacgatggcggatgtgtgacatac-3’和P6(带下划线碱基为EcoR V识别位点)5’-cagtgatatccaagatg agtgtgtctttg-3’。首先在SFV3’-UTR下游加入Sv40 poly A以pIRES2-EGFP质粒(Clontech公司)为模板，在引物P1和P2的引导下PCR扩增Sv40 poly A片段，反应结束后，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果经扩增获得了250bp的DNA片段，与预期结果一致。回收并纯化该250bp的Sv40 poly A片段，再插入经Spe I酶切并去磷酸化的载体pSFV-1中，得到含有Sv40 poly A片段的重组pSFV-1载体，命名为pSFV-Sv40 poly A。
然后，以pIRES2-EGFP质粒为模板，在引物P3和P4的引导下PCR扩增CMV IE启动子，反应结束后，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果经扩增获得了621bp的DNA片段(含589bp的CMV IE启动子序列)，与预期结果一致。再以pSFV-1为模板，在引物P5和P6的引导下PCR扩增SFV复制子5’端的前281bp序列。上述PCR反应条件均为先95℃ 5min；然后95℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，共35个循环；再72℃延伸10min。
最后，以回收的621bp和281bp的扩增片段为模板，在引物P1和P4的引导下进行重叠延伸PCR扩增，PCR反应条件为先95℃ 5min；然后95℃ 1min，58℃ 1min，72℃1min，共35个循环；再72℃延伸10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果经扩增获得了902bp的DNA片段，与预期结果一致。回收并纯化该902bp的DNA片段，对其用限制性内切酶Sph I和EcoR V消化后，与经相同酶双酶切的载体pSFV-Sv40 poly A(去掉了SP6启动子)连接，即用CMV IE启动子替换SP6启动子，得到用CMVIE启动子+Sv40 poly A体系替换SP6启动子的重组载体，命名为pSFV-Sv40poly A/CMV IE。
2)在26S亚基因组启动子的下游添加带有经改良多克隆位点的shRNA表达元件(见图1中的②)。shRNA表达元件包括一个tRNA启动子、多克隆位点(自上游至下游依次为限制性内切酶BamH I、BssH II、Cla I、Nsi I、Apa I和Sma I/Xma I识别位点)和由5个碱基“T”组成的终止信号。在步骤1)获得的重组载体中的26S亚基因组启动子下游添加所述shRNA表达元件，具体方法为如下设计合成两条寡核苷酸(L15’-CGCGGATCCGCGCGCATCGATGCATGGGCCCGGGATCCGG-3’和L25’-CCGGATCCCGGGCCCATGCATCGATGCGCGCGGATCCGCG-3’)，将等摩尔的L1和L2两条链混合，于100℃水浴5min后，将其慢慢冷却至室温，使其退火成双链。然后将该双链接头用限制性内切酶BamH I和Sma I双酶切后，与经同样酶双酶切的载体pSFV-Sv40 polyA/CMV IE连接，即在上述重组SFV载体中再引入一个含多种稀有酶切位点的多克隆位点，将该重组载体命名为pSFV-Sv40 poly A/CMV IE/C。
然后，在上述重组载体pSFV-Sv40 poly A/CMV IE/C多克隆位点的BamH I酶切位点处添加tRNA启动子MTD(modified human tRNAmet-derived promoter)，序列参见文献Boden D，Pusch O， Lee F，et al.Nucleic Acids Res.2003；31(17)5033-8。具体添加方法如下合成引物P75’-TGCTGGGCCCATAACCCAGAGGTCGATGGATCGAAACCTGCGCCACTCCTGATGAGCCTCTAGACACTCTCGAGGGCGAT-3’和P85’-ATCGCCCTCGAGAGTGTCTAGAGGCTCATCAGGAGTGGCGCAGGTTTCGATCCATCGACCTCTGGGTTATGGGCCCAGCA-3’，以及P9(带下划线碱基为BamH I识别位点)5’-TGGATCCGGCAGAACAGTCGAGTGGCGCAGCGGAAGCGTGCTGGGCCCATAAC-3’和P10(带下划线碱基为BamH I识别位点)5’-TGGATCCATGATGTTAGGAGATCTAAACAGAACAGTATCGCCCTCGAGAGTGTCTAG-3’。其中，P7和P8互补，P9与P10分别与之搭上15-21bp。将四条引物混合，进行重叠延伸PCR扩增，PCR反应条件为先94℃ 5min；然后94℃ 1min，58℃ 45sec，72℃ 45sec，共35个循环。反应结束后，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果经扩增获得了165bp的DNA片段，与预期结果一致。回收并纯化该165bp的目的片段，将其用限制性内切酶BamH I酶切后，与经相同酶酶切的重组SFV载体pSFV-Sv40 poly A/CMV IE/C连接，得到添加shRNA表达元件的重组SFV载体，命名为pSFV-Sv40/CMV/C/shRNA。
3)在所述shRNA表达元件中的多克隆位点和终止信号之间再添加一个真核抗性基因选择复合体(见图1中的③)。该真核抗性基因选择复合体自上游至下游依次为一个SV40早期启动子(GenBank号X99274，6850-7187)、一个Neomycin抗性基因(GenBank号AF113968，2277-3080)和一个HSV-TK PolyA(GenBank号AB242435，3867-3885)。在步骤2)获得的重组SFV载体骨架中SV40 PolyA和ori之间再添加一个真核抗性基因选择复合体，具体方法如下设计合成引物P9(带下划线碱基为Spe I识别位点)5’-CGGACTAGTTAGTTATTAATAGTAATCA-3’和P10(带下划线碱基为Spe I识别位点)5’-TTACTAGTGATCTGACGGTTCAC-3’，以pIRES2-EGFP质粒为模板，在引物P9和P10的引导下PCR扩增真核抗性基因选择复合体，PCR反应条件为先94℃ 5min；然后94℃1min，56℃ 1min，72℃ 2min，共32个循环。反应结束后，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果经扩增获得了1.4Kb的DNA片段(含SV40早期启动子/增强子、Neomycin抗性基因和HSV-TK Poly A)，与预期结果一致。回收并纯化该1.4Kb的目的片段，将其用限制性内切酶Spe I酶切后，与经相同酶酶切的重组SFV载体pSFV-Sv40/CMV/C/shRNA连接，得到添加有真核抗性基因选择复合体的的重组SFV载体，命名为pSFV-Sv40/CMV/C/shRNA/K。
4)去除SFV载体骨架中的SFV病毒基因3’-UTR终止子与Poly A之间的重复序列(见图1中的④)用限制性内切酶SsP I(购自Takara公司)对步骤3)得到的重组载体进行partial酶切准备多个20μl常规酶切体系(酶切体系及反应条件参见试剂盒说明书)，分别于第1min、3min、10min中止反应，寻找并切胶回收11.5Kb和1.5Kb的DNA片段；合成引物P13(带下划线碱基为SsPI识别位点)5’-gagaatattgggaagaatatgctaaac-3’和P14(带下划线碱基为SsPI识别位点)5’-gaaatattaaaaaccaatttcaattaattaccc-3’，以上述回收的1.5Kb DNA片段为模板，，在引物P13和P14的引导下进行PCR扩增，扩增条件为先95℃预变性5min；然后95℃ 1min，57℃ 1min，72℃ 1.5min，32个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果经扩增获得了1.2Kb的DNA片段(所述重复序列去除)，与预期结果一致。回收并纯化该1.2Kb的DNA片段，将其与前述11.5Kb片段16℃连接过夜(12-16h)，得到本发明的重组SFV载体，命名为pSFV-RNAi Ready，其物理图谱如图1所示。该载体的作用原理示意图如图2所示，将针对靶基因设计的shRNA的编码DNA连接入该载体的多克隆位点，再将重组载体转染细胞后，在CMV启动子调控下于胞核内利用PolII复制出病毒(+)股基因组RNA，病毒RNA自身催化复制出(-)股等长基因组RNA，出核后以此为模板再进行(+)股基因组RNA的大量复制(包括基因组RNA和26S亚基因组RNA)，含全部shRNA表达元件的26S mRNA经Dicer加工后可引起RNAi。此外，在tRNA启动子的作用下，在核内(-)股基因组RNA亦可高效转录出不带3’-polyA的shRNA。
实施例2、利用本发明的RNAi载体抑制HPV16E6基因在人宫颈癌细胞Caski中的表达以HPV16E6基因为例，检测实施例1构建的载体pSFV-RNAi Ready的RNAi效果，具体方法包括以下步骤1、抑制HPV16E6基因表达的小干扰RNA的设计及其编码基因的获得根据HPV16E6基因序列(GenBank号AF536179，83-559)，选取位于HPV16E6基因开放阅读框架(ORTs)序列转录起始位点ATG下游104-124处长度21bp的序列为靶点序列进行设计，得到抑制HPV16E6基因表达的小干扰RNA，序列如下正义链5’-UGUGUGUACUGCAAGCAACUU-3’；反义链5’-GUUGCUUGCAGUACACACAUU-3’。
经Blast比对后排除非特异性同源序列。将该双链RNA序列命名为siRNA-HPV16E6，其反义链与HPV16E6 mRNA转录起始位点下游的106-124位置序列5’-UGUGUGUACUGCAAGCAAC-3’(19bp)互补。
再根据siRNA-HPV16E6作用的靶序列和siRNA设计方案设计能够产生siRNA-HPV16E6的siRNA序列，并添加上BssH II粘端、19N链、茎环序列、反向互补19N链、转录终止区和Cla I粘端，命名为siDNA-HPV16E6，具体序列如下(下划线碱基序列为针对HPV16E6 mRNA的靶序列)siDNA-HPV16E6正义链(序列表中序列1)5’- GTGTGTGTACTGCAAGCAAC GTTGCTTGCAGTACACACATTTTT -3’BssHII粘端 19N链 环序列 反向互补19N链 转录终止区 Cla I粘端siDNA-HPV16E6反义链(序列表中序列2)3’- CACACACATGACGTTCGTTG CAACGAACGTCATGTGTGTAAAAAA -5’人工合成上述siDNA-HPV16E6的正义链和反义链(上海吉凯公司)，并加水分别溶解至1μg/μl。
2、抑制HPV16E6基因表达的重组RNAi载体的构建1)将步骤1合成的siDNA-HPV16E6的正义链和反义链退火成为双链DNA，20μl复性反应体系为正义链1μl，反义链1μl，20×SSC(sigma公司，Cat.S6639)1μl，水17μl。反应条件为95℃加热10min。取出，室温下冷却1h，稀释至浓度为40ng/μl。
2)将步骤1)获得的双链siDNA-HPV16E6用限制性内切酶Sma I和BamH I进行双酶切后与经相同酶双酶切的载体pSFV-RNAi Ready用T4 DNA连接酶进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化细胞涂布于含50mg/L氨苄青霉素的LB抗性平板上进行筛选阳性转化子，挑取长出的单克隆，接种于5mL含50mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，摇菌，提质粒，用限制性内切酶BssH II和Cla I进行双酶切鉴定，对酶切产物进行4％琼脂糖凝胶电泳检测，结果经酶切获得了约60bp的DNA片段，与预期结果相符，再对质粒进行测序，测序结果表明获得了序列及插入位置均正确的含有抑制HPV16E6基因表达的小干扰RNA编码基因的重组RNAi载体，命名为pSFV-RNAi-HPV16E6。
3)以将上述双链siDNA-HPV16E6两端的酶切位点分别更换为Hind III和EcoR I，合成并重组入无关siRNA质粒pSilencer1.0-U6(购自Ambion)相应的多克隆位点处得到的重组质粒为对照，命名为pSilencer-RNAi-HPV16E6。
4)在pSFV-RNAi Ready的多酶切位点中连入一个EGFP基因(GenBank号EF028672，45-758)，以作为对照方便观察质粒转染效率。EGFP基因可从其它质粒如pIRES2-EGFP中经PCR扩增或直接酶切获得。将连接有EGFP基因的重组质粒命名为pSFV-GFP。
3、转染Caski细胞及转染细胞HPV16E6基因表达水平的检测将步骤2经测序鉴定正确的重组载体pSFV-RNAi-HPV16E6用电穿孔法(Amaxa电转仪)转染Caski细胞(武汉大学细胞保藏中心)，另设Caski细胞空白对照组、pSFV-GFP对照组、化学合成siRNA(上海吉玛)处理组、阴性对照siRNA(上海吉玛)组和无关RNAi质粒pSilencer-RNAi-HPV16E6处理组，同样方法转染Caski细胞。具体步骤为Caski细胞用含10％胎牛血清的DMEM完全培养基常规培养至对数生长期，消化、离心收集细胞，选择针对宫颈癌细胞的Nucleofector液转染液100μl(Amaxa电转试剂盒)重悬细胞，加入2μg线性化载体或终浓度为250nmol/L的siRNA，混匀后将细胞、DNA混合物移入移入Amaxa特制电击池，选择宫颈癌细胞转染程序电转3s。电转结束后取出电击池，向电击池中加入0.5mL培养液，冲洗并移入6孔板中培养。每12h荧光显微镜观察pSFV-GFP组转染情况。分别于转染后24、48、72、120h和10d镜下观察并收集各细胞，Western Blot法检测细胞内HPV16E6蛋白的表达，具体步骤为收集细胞到蛋白上样缓冲液中，沸水浴10min，10000rpm离心10min，取上清，经15％的SDS-PAGE分离后，转移至硝酸纤维素膜上，以鼠抗人HPV16E6单抗(Chemicon公司)为一抗，HRP标记的羊抗小鼠IgG(上海华美)为二抗进行免疫酶反应，DAB显色，Gel-Pro Analyzer软件对各处理组与空白对照组的灰度扫描比值分析细胞中16E6蛋白表达水平的变化。
转染后48h的Western Blot鉴定结果如图3所示(Control为对照组)，上述WesternBlot鉴定与荧光显微镜观察计数结果表明，利用Amaxa公司的电转方法，pSFV-RNAiReady载体对Caski细胞转染率可达75.7％，所携shRNA高水平表达，对HPV16E6蛋白表达水平的抑制率达到95.6％(总的抑制率为72.4％)。与化学合成siRNA组与空白对照组比，使用本发明载体RNAi抑制效果峰值无明显降低，且出现早(转染后24h内)，持续时间长(10d抑制效果依然存在)，而化学合成siRNA组(接近100％转染成功)对HPV16E6蛋白的抑制率约为76.5％，转染后48h达到峰值，72h后基本丧失；无关RNAi质粒组总抑制效果仅为约60％，由于其质粒的抑制率远小于pSFV-RNAi Ready，细胞转染率应该更高，提示本发明载体对外源RNA(shRNA)的表达效率大大超过常规的RNAi载体。上述检测结果表明用本发明的RNAi载体可高效、特异地抑制靶基因的表达。
4、产生重组SFV病毒颗粒并感染细胞方法将步骤2经测序鉴定正确的重组载体pSFV-RNAi-HPV16E6及SFV-helper质粒(购自Invitrogene)共同转染BHK-21包装细胞，将转染细胞置于含600μg/L G418和10％胎牛血清的DMEM完全培养基进行筛选，将筛选出的阳性转染细胞进行传代培养，培养48h后取培养液上清离心收集病毒，然后将病毒颗粒加入传代24小时贴壁的Caski细胞培养体系(MOI 10)，常规培养，并分别于24、72、120h和10d收集细胞提总蛋白，用步骤3相同的Western Blot法检测细胞内HPV16E6蛋白的表达水平；另外，取病毒转染后培养48h细胞，PBS清洗，2％多聚甲醛固定10min，作X-gal染色，计数5个高倍镜视野下，核蓝染细胞和未蓝染细胞的比例，分析病毒基因转染细胞的能力。
结果显示MOI为10时，该重组病毒对Caski细胞转染率可提高到96.7％；对HPV16E6蛋白总抑制率在90％以上，且10d后抑制效果依然存在。上述检测结果表明用本发明的RNAi载体可高效、特异地抑制靶基因的表达，且持续时间长。
序列表<160>2<210>1<211>61<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1cgcgcgtgtg tgtactgcaa gcaacttcaa gagagttgct tgcagtacac acatttttta60t61<210>2<211>59<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2gcacacacat gacgttcgtt gaagttctct caacgaacgt catgtgtgta aaaaatagc 59
权利要求
1.一种RNAi载体，是在SFV载体骨架中含有CMV IE启动子和Sv40 poly A的重组SFV表达载体；所述CMV IE启动子的GenBank号为U57607.1(1-589)，Sv40 polyA的GenBank号为AM697713(2404-2644)。
2.根据权利要求1所述的RNAi载体，其特征在于在所述重组SFV载体骨架中，所述CMV IE启动子替换原SP6启动子，且位于SFV病毒基因5’末端非翻译区的上游。
3.根据权利要求1所述的RNAi载体，其特征在于在所述重组SFV载体骨架中的26S亚基因组启动子下游添加shRNA表达元件；所述shRNA表达元件自上游至下游依次包含一个RNA pol III启动子、一个多克隆位点和由5-6个碱基“T”组成的终止信号；所述tRNA启动子为人或鼠的U6 RNA启动子、H1RNP RNA启动子，或tRNAval启动子、tRNAmet启动子。
4.根据权利要求3所述的RNAi载体，其特征在于所述tRNA启动子为RNAmet启动子MTD。
5.根据权利要求3所述的RNAi载体，其特征在于在所述shRNA表达元件中的多克隆位点和终止信号之间还包含一个真核抗性基因选择复合体；所述真核抗性基因选择复合体自上游至下游依次包含一个SV40早期启动子、一个抗生素抗性基因以及一个HSV-TK Poly A；所述SV40早期启动子的GenBank号为X99274(6850-7187)，HSV-TK Poly A的GenBank号为AB242435(3867-3885)。
6.根据权利要求5所述的RNAi载体，其特征在于所述抗生素抗性基因为Neomycin、Zeomycin、Hygromycin或GFP/Neo抗性基因。
7.根据权利要求1所述的RNAi载体，其特征在于将所述重组SFV表达载体骨架中SFV病毒基因的3’末端非翻译区的重复序列去除。
8.根据权利要求1-7任一项所述的RNAi载体，其特征在于用于构建所述RNAi载体的出发载体为pSFV-1、pSFV-3、pCMV-Rep或pSCA1。
9.根据权利要求8所述的RNAi载体，其特征在于以pSFV-1为出发载体构建的RNAi载体为pSFV-RNAi Ready。
10.权利要求1-9任一项所述的RNAi载体在制备抑制靶基因表达的基因治疗性药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种RNAi载体及其应用，其目的是提供一种基于SFV病毒复制子载体的重组SFV表达载体及其在制备抑制靶基因表达的基因治疗性药物中的应用。该RNAi载体是在SFV载体骨架中含有CMV IE启动子和Sv40 poly A的重组SFV表达载体；所述CMV IE启动子的GenBank号为U57607.1(1－589)，Sv40 poly A的GenBank号为AM697713(2404－2644)。本发明载体适用于需短期高效沉默目的基因的科学研究或制备研究基因功能的试剂中，特别是可用本发明的RNAi载体制备成抑制靶基因表达的基因治疗性药物。因此，本发明将在生物医药领域及基因功能的研究中发挥重要作用，应用前景广阔。
文档编号A61K48/00GK101067139SQ20071009914
公开日2007年11月7日 申请日期2007年5月14日 优先权日2007年5月14日
发明者杨峥嵘, 黄来强, 王海峰 申请人:清华大学深圳研究生院