转录调控物组合物的制作方法

专利名称：转录调控物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及 一 种转录调控物组合物。
背景技术：
雄激素定义为广泛种类的主要控制雄性特征发展及维持
的类固醇激素。其经由雄激素受体(AR)发挥其生理作用，该 雄激素受体为类固醇激素核受体总科中的 一 员。该AR通过结 合雄激素(例如睾固酮)或相关配位体得以活化。经活化之AR 引发信号转导路径，其驱动众多"雄激素响应"靶基因(例如前 列腺特异性抗原(PSA))之转录增加。应注意的是，此路径中 的信号转导步骤尚未完全阐明。
由雄激素活化AR，接着增加雄激素响应靶基因的转录， 会激发众多疾病，例如前列腺癌。因此，治疗前列腺癌通常 包括投与AR拮抗剂。不幸地，由于由癌细胞所表现之AR常变 成雄激素非依赖性，意即组成性活性(例如由于突变)，因此 其效用常为短期的。因此，配位体非依赖性AR即使在AR拮抗 剂存在下仍驱动高水平的支持持久性癌生长的靶基因转录。
因此，需要在AR活化下游的信号转导步骤中调控雄激素 回应耙基因转录的组合物，以及用于其识别及治疗用途的方 法。

发明内容
本发明部分基于意外发现，即IkB激酶亚单位a(IKKa)与 AR相互作用且其活性对于雄激素响应基因转录很关键。
因此，本发明 一 方面涉及通过对受检者投与含有有效剂 量之IKKa活性抑制剂的组合物来治疗雄激素刺激的疾病的 方法。较佳地，在投与该组合物之前，该受检者经诊断患有 该雄激素刺激的疾病。雄激素刺激的疾病为由AR活性所引起 或恶化的任何健康异常病症，例如前列腺癌、良性前列腺肥 大、乳癌、男性秃头症、痤疮丙酸杆菌、多嚢性卵巢症、体
5染色体显性多嚢性肾病或雄性素过多症。组合物可含有来自
虫彭蜞菊(『ede〃a c/n'"e"w、)、 鳢肠(五c/(pfa pro^rafa)或旱莲草 a/6a)的提取物。IKKa活性抑制剂可为叶含螺蜞菊内 酉旨(wedelolactone)、 口十黄酉同(luteolin)、 樹皮酉同(quercetin) 、 ^羊 元荽黄素(apigenin) 、 15-脱氧-厶12'14-前列腺素h或前列腺素 Al 。该方法也包括在对受检者投与上述组合物之前或之后测 定来自该受检者的生物试样中的PSA含量。在投药之前测定 PSA含量适用于诊断受检者患有雄激素刺激的疾病(例如前列 腺癌)。在投药之后所测定的PS A含量为响应上述用于治疗雄 激素刺激的疾病之方法的治疗的可靠指数。
本发明另一方面涉及通过对高风险受检者投与含有有效 剂量的IKKa活性抑制剂来降低该受检者的前列腺癌风险的 方法。
本发明另 一 方面涉及用于识别调控物(意即IKKa调节的 转录活性的抑制剂或刺激剂)的方法。转录活性抑制剂适用于 (例如)治疗诸如前列腺癌等的雄激素刺激的疾病。该方法包 括(l)提供哺乳动物细胞，其表达IKKa及AR,且含有包括可 操作性地连接于编码报导体多肽序列上的雄激素回应促进剂 序列的分离的核酸，从而使得该细胞也表达该报导体多肽， (2)将该细胞与测试组合物接触，且(3)检定表达量(意即mRNA 或蛋白质的表达量)或报导体多肽的活性。若该测试组合物增 加或降低与负控制治疗有关的表达量或编码的报导体多肽的 活性，则认为其为由IKKa调节的转录活性的调控物。经表达 的AR可为组成性活性突变体。若AR为非组成性活性，则该方 法包括将细胞与AR促效剂接触。该方法也可包括判定测试组 合物对IKKa活性的作用以进 一 步表征机制，测试组合物通过 该机制调控由此激酶调节的转录活性。
本发明另 一 方面涉及用于测定非人类哺乳动物测试受检 者中由IKKa调节的转录活性的方法。该方法适用于(例如)判 定活体内候选IKKa抑制剂组合物的功效。该方法包括(1)引入 众多细胞，其表现IKKa及雄激素受体，且含有具有可操作性地连接于编码报导体多肽序列上的雄激素回应促进剂序列的
分离的核酸，从而使得该细胞也表达该报导体多肽；及(2)检 测由该等细胞所表达的报导体多肽的活性。报导体活性(例如 活体内)的检测指示测试受检者中由IKKa调节的转录活性。该 方法也可包括测定来自测试受4企者的生物试样中的IKKa活
性程度。
本发明其它特征或优点将因以下实施方式亦及申请专利 范围而显而易见。 实施方式
下文所描述用于识别特定调控例如雄激素响应靶基因而 发生转录的IKKa调节型转录(IKKaRT)的组合物的方法。下文 也描述通过投与有效剂量的所属组合物来治疗患有雄激素刺 激的疾病或对于雄激素刺激的疾病具高风险的受检者的方 法。
IKKaRT调控物组合物(意即降低或增力。IKKaRT的组合 物)通过雄激素回应报导体检测来识别。
雄激素响应报导体结构通过将雄激素响应促进剂与编码 报导体多肽的核酸融合来产生。雄激素回应促进剂为可由AR 依赖性信号转导路径活化的促进剂。将该雄激素响应报导体 结构引入宿主细胞中以产生雄激素回应报导体细胞，在该雄 激素回应报导体细胞中该雄激素响应促进剂驱动报导体多肽 的表达。为评估在才艮导体细胞中测试组合物调控IKKaRT的能 力，可通过在有或无测试组合物的情况下将所属细胞与雄激 素(例如睾固酮或5a-二氢睾固酮)接触来增加报导体细胞的 IKKa活性。将细胞与雄激素在加上或无测试组合物的情况下 接触后，测定报导体表达或活性。若在测试组合物存在下与 无测试组合物相比，响应雄激素刺激的报导体的表达或活性 增力口或降低，则认为该组合物为IKKaRT调控物。
测试组合物可为(例如)自生物源纯化或合成的天然产生 的组合物、植物提取物、蛋白质、肽或小分子(例如选自组合 合成库的化合物)。合适的雄激素响应报导体细胞可衍生自哺乳动物组织或 细胞抹(例如衍生自人类、猴、小鼠、大鼠或仓鼠)。宿主细
胞内因性或异源性地表现IKKa(例如GenBank第NP—001269 号)及AR(例如GenBank第AAA51729号)。举例而言，得自美国 典型 培养物保藏 中心 (AmericanType Culture Collection)(ATCC⑧^f呆藏号CRL-2505 丁m)的人类PCa 22Rvl细 胞林可用于产生雄激素回应报导体细胞抹。
在报导体测定中，可通过使用表现组成性活性AR的报导 体细胞来避免雄激素刺激，例如Marcelli等人(1995)， 五"docW"o/ogy第136巻，第3期中所述。
用于产生报导体结构、将其引入细胞中且测定多种报导 体多肽活性的方法于(例如)Cwrre"f /Vo/oco" z'" Mo/ecw/ar John Wiley & Sons, N.Y. (2005),分别3.16-3.17及
9.1-9.14中详细说明。
雄激素回应促进剂应包括以下雄激素响应元素中的至少 一种
AGAACAGCAAGTGCT (SEQ ID NO: 1) GGATCAGGGAGTCTC (SEQ ID NO:2) GGAACATATTGTATC (SEQ ID NO:3)
参见 Cleutjens 等人 (1997) , Mo/. 五油cW"o/. ll(9):1256-65。
举例而言，雄激素回应促进剂可为PSA促进剂，其含有 全部三种上文所列的雄激素响应元素，且具有以下序列
AGCTTCTAGTTTTCTTTTCCCGGTGACATCGTGGAAAGCACTAGCATCTC
TAAGCAATGATCTGTGACAATATTCACAGTGTATTGCCATCCAGGGAACT
CAACTGAGCCT丁GATGTCCAGAGATmTGTGTTTTTTTCTGAGACTGAG
TCTCGCTCTGTGCCCAGGCTGGAGTGCAGTGGTGCAACCTTGGCTCACTG
CAAGCTCCGCCTCCTGGGTTCACGCCATTCTCCTGCCTCAGCCTCCTGAG
丁AGCTGGGACTACAGGCACCCGCCACCACGCCTGGCTAATTTTTTTGTATttttagtagagatggggtttcactgtgttagccaggatggtctcagtctcctgacctcgtgatctgcccaccttggcctcccaaagtgctgggattacaggcgtgagccactgcgcctggccgatatccagagattttttggggggctccatcacacagacatgttgactgtcttcatggttgacttttagtatccagcccctctagaaatctagctgatatagtgtggctcaaaaccttcagcacaaatcacaccgttagactatctggtgtggcccaaaccttcaggtgaacaaaggcactctaaactggcaggatattccaaagcattagagatgacctcttgcaaagaaaaagaaatggaaaagaaaaagaaagaaaggaaaaaaaaaaaaaaaXagagatgacctc丁caggctctgaggggaaacgcctgaggtctttgagcaaggtcagtcctctgttgcacagtctccctcacagggtcattgtgacgatcaaatg丁ggtcacg丁gtatgaggcaccagcacatgcctggctctggggagtgccgtgtaagtgtatgcttgcactgctgaatggctgggatgtgtcagggattatcttcagcacttacagatgctcatc丁catcctcacagcatcactatgggatgggtattactggcctcatttgatggagaaactggctgtggctcagaaaggggggaccactagaccagggacactctggatgctggggactccagagaccatgaccactcaccaactgcagagaaattaattgtggcctgatgtccctgtcctggagagggtggaggtggaccttcactaacctcctaccttgaccctctctntagggctctttctgacctccaccatgatactaggaccccattgtattctgtaccctcttgactctatgacccccactgcccactgcatccagctgggtcccc丁cctatctctattcccagctggccagtgcagtctcagtgcccacctgtttgtcagtaactctgaaggggctgacattttactgacttgcaaacaaataagctaactttccagagttttgtgaatgctggcagagtccatgagactcctgagtcagaggcaaaggcttttactgctcacagcttagcagacagcatgaggttcatgttcacattagtacaccttgccccccccaaatcttgtagggtgaccagagcagtc丁aggtggatgctgtgcacacggggtttgtgccactggtgagaaacctgagattaggaatcctcaatcttatactgggacaacttgcaaacctgctcagcctttgtctctgatgaagatattatcttcatgatcttggattgaaaacagacctactctggaggaacatattgta丁cgattgtccttgacagtaaacaaatctgttgtaagagacattatctttattatctaggacagtaagcaagcctggatctgagagagatatcatcttgcaagga丁gcctgc7ttacaaacatccttgaaacaacaatccagaaaaaaaaaggtgttgctgtctttgctcagaagacacacagatacgtgacagaaccatggagaattgcctcccaacactgttcagccagagccttccacccttgtctgcaggacagtctcaacgttccaccattaaatacttcttctgtcacatcctgcttatttatgcctaaccaaggttctaggtcccgatcgactgtgtctggcagcactccactgccaaacccagaataaggcagcgctcaggatcccgaaggggcatggctggggatcagaacttctgggtttgagtgaggagtgggtccaccctcttgaatttcaaaggaggaagaggctggatgtgaaggaactgggggagggaaagtgtcagttccgaactcttaggtcaatgagggaggagactggtaaggtcccagctcccgaggtactgatgtgggaatggcctaagaatctcatatcctcaggaagaaggtgctggaatcctgaggggtagagttctggg丁atatttgtggcttaaggctctttggcccctgaagggcagaggctggaaccattaggtccagggtttggggtga丁agtaatgggatctcttgattcctcaagagtc丁gaggatcgagggttgcccattcttccatcttgccacctaatccttactccacttgagggtatcaccagcccttctagctccatgaaggtgcccctgggcaagcacaatctgagcatgaaagatgccccagaggccttgggtgtcatccactcatcatccagcatccacactctgagggtgtggccagcaccatgacgtcatgttgctgtgacta丁ccctgcagcgtgcctctccagccacctgccaaccgtagagctgccgacatcctcctctggtgggagtggcctgcatggtgccaggctgaggcctagtgtcagacagggagcctggaatcatagggatccaggactcaaaagtgctagagaatggccatatgtcaccatccatgaaatctcaagggcttctgggtggAGGGCACAGGGACCTGAACTTATGGGTnrCCCCAAGTCTATTGCTCTCC
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GTTGGGTTAGAGATGGGGTAAAATTGTGCTTCGGATGAGTTTGGGATTGA
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TCTCACTGGAGTGGAGACAAACTTCCTTTCCAGGATCAATCCGGGGAAGC
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GTGGTGCAGGGATCAGGGAGTCTCACAATCTCCTGAGTGCTGGTGTCTTAGGGCACACTGGGTCTTGGAGTGCAAAGGATCTAGGCACGTGAGGCTTTGTATGAAGAATCGGGGATCGTACCCACCCCCTGTTTCTGTTTCATCCTGGGCGTGTCTCCTCTGCCTTTGTCCCCTAGATGAAGTCTCCATGAGCTACAGGGCCTGGTGCATCCAGGGTGATCTAGTAATTGCAGAACAGCAAGTGCTAGCTCTCCCTCCCCTTCCACAGCTCTGGGTGTGGGAGGGGGTTGTCCAGCCTCCAGCAGCATGGGGAGGGCCTTGGTCAGCCTCTGGGTGCCAGCAGGGCAGGGGCGGAGTCCTGGGGAATGAAGGTTTTATAGGGCTCCTGGGGGAGGCTCCCCAGCCCCAAGCTT (SEQ ID NO:4)本领域熟练技术人员将认为其它在结构上及功能上等效 的促进剂可用于刚才所述之促进剂才艮导体才企测中，例如与 SEQ ID NO:4具有至少75%同 一性(即，介于75%与100%之间 的任何同 一性百分数)的促进剂。该等促进剂应包括雄激素响 应元件的至少 一 个复本，例如SEQ ID NOs: 1 -3中的任 一 种。等效促进剂的实例包括那些删去或添加高达40种核苷酸 且保持至少70%的SEQ ID NO:4的促进剂活性的等效促进剂。 该等促进剂的用途亦在本发明范畴内。促进剂活性可通过量测报导体多肽的特性(例如酶促活 性或荧光性)、报导体多肽表达(例如根据ELIS A检定)或报导 体mRNA表达(例如根据荧光杂交技术)来定量。在暴露于AR 促效剂(例如睾固酮或5a-二氢睾固酮)及测试组合物的第 一 组 与暴露于单独的AR促效剂的第二组之间比较PSA促进剂活 性。若相对于该第二组，该第 一 组中报导体活性或表达增加 或降低，则认为该测试组合物为IKKaRT调控物。合适的报导体多肽包括(例如)萤火虫荧光素酶、水母荧光 素酶(7 e"z7/a luciferase)、荧光蛋白质(例如强化型绿色荧光蛋 白质)、P-半乳糖苷酶、P-内醯胺酶、碱性磷酸酶及辣根过氧 化物酶。举例而言，荧光素酶活性可通过提供适当发光受质(例如 用于安火虫荧光素酶之萤火虫发光素或用于水母荧光素酶的 腔肠素(coelenterazine))来检测。在适当受质存在下荧光素酶 活性可由例如冷光光度测定法(luminometry)等众多标准#支术来定量。可使报导体活性量测标准化成细胞溶解产物中的蛋白质 浓度。蛋白质浓度可由(例如)使用市售试剂的库马斯(Coomassie)检测来测定。或者，第二报导体结构(意即"标准 化报导体结构")可用于标准化报导体活性量测。由标准化报 导体结构编码的标准化报导体多肽通常具有不同于上述雄激 素响应报导体多肽的活性。此外，标准化报导体结构通常包 括弱组成性促进剂，例如驱动报导体多肽表达的疱渗性胸香 激酶促进剂。该标准化报导体结构可与包括第 一 报导体结构 的相同核酸分离或为该核酸的 一 部分(例如作为质体的 一 部 分)。促进剂活性可通过测出雄激素回应报导体多肽活性与标 准化报导体多肽活性的比率来定量。举例而言，在双荧光素 酶报导体检测中，萤火虫荧光素酶可用作指示雄激素响应促 进剂活性的报导体多肽且水母荧光素酶可用作标准化报导体 多肽。包括高产量方法的双荧光素酶检测法的详细说明揭示 于美国专利第5，744，320号中。
报导体表现或活性可在无细胞检定(例如细胞溶解产物) 中或在活细胞中检定，这根据被选择用于检测的报导体多肽 或报导体酶受质而定。无细胞检测可在任何合适容器(例如微 量滴定盘、试管、比色管及微量离心管)中进行。活细胞检定 可在任何适合于哺乳动物细胞培养的容器(例如微量细胞培 养盘、多孔盘、细胞培养皿及细胞培养并瓦)中进行。多孔细胞 培养盘可适用于该盘的孔中的细胞或细月包溶解产物的直接冷 光光度测定法或荧光光度测定法(fluorimetry)。荧光素酶活性 可在活细胞中通过将合适的荧光素酶受质直接添加至细胞培 养基中的培养细胞中(意即无溶解步骤)且量测直接来自完整 细胞的光发射来量测。可将VivirenTM受质(Promega, WI)或其 它合适细胞可渗透性荧光素酶受质直接添加至细胞中以量测 焚光素酶活性。
荧光多肽(例如EGFP)可在活细胞中由此项技术中已知的 众多检测方法(例如荧光光度测定法或荧光显微法)来检测及 定量。在活细胞中使用焚光多肽的报导体检定筛检的详细说 明(包括高产量方法)可于(例如)美国专利第6，875,578号中发 现。报导体mRNA及蛋白质表现量可由众多习知方法测定。举 例而言，来自经处理及未经处理的细胞的报导体mRNA表现可 由标准RNA墨点分析法监测或可由PCR , 尤其为定量 PCR(qPCR)或此项:忮术中已知的类似4支术来辅助(参见，例如 Cwrrew iVo/oco/s Mo/ecw/ar 5/o/og_y, John Wiley & Sons, N.Y. (2005), 1 5.5-15.7)。免疫才企定亦可用于侦测或监测报导 体多肽含量。对于众多报导体多肽(例如EGFP、荧光素酶或--半乳糖苷酶)而言，特异性多抹或单抹抗体为市售的且可用于 任何标准免疫检定格式中。适用于量测报导体多肽含量的测 定法包括竟争性及非竟争性测定法、放射免疫测定法、生物 发光及化学发光测定法、荧光测定法、夹心测定法、点渍墨 法、酶联测定法(包括ELISA)、微量滴定盘及经抗体涂覆的条 带或用于快速监测血液的量杆。对于每 一 种方法而言，确定 检测的范围、敏感性、精度、可靠性、特异性及再现性。某 些免疫测定法的实例详细描述于(例如)Cwrre"Z /VWoco" /" Mo/織/ar肠/ogy, John Wiley & Sons, N.Y. (2005)， 11.1-11.3 中。视情况，经AR调节的IKKa激酶活性程度可在暴露于测试 组合物或负控制组合物(例如细胞培养基)的报导体细胞中测 定。举例而言，在有或无IKKaRT-调控物测试组合物的雄激素 刺激细胞之后，可制备细胞溶解产物且AR错合的IKKa激酶含 量可由使用AR单抹抗体(例如来自Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz， CA)的AR-441)的免疫沉淀反应，接着由使用 组蛋白H3作为受质的活体外蛋白激酶测定法来测定。组蛋白 H3磷酸化的程度指示经AR刺激的IKKa活性程度。或者，在测 试组合物存在下IKKa活性可在活体外测定。举例而言，可首 先4吏用自(例^口) Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA)的多抹抗IKKa的多林抗体将全部IKKa自细胞溶解 产物中免疫沉淀。接着检测经免疫沉淀的激酶在有或无测试 组合物的情况下其使组蛋白H3磷酸化的能力。上述雄激素响应报导体细胞(例如雄激素响应报导体细 胞抹)也适用于测定非人类哺乳动物测试受检者中(例如小
鼠、大鼠、仓鼠、天竺鼠、兔、狗、猫或猴中)的IKKaRT活 性。对异种移植物具耐受性的动物模型(例如棵小鼠或棵大 鼠)尤其适用。首先将报导体细胞注入测试受检者中。随后在 自测试受检者获得的生物试样(例如血样、皮肤试样、前列腺 组织的活组织试样等)中检测报导体活性。其它或另外，可直 接在测试受检者中(意即活体内)检测报导体活性。荧光素酶 为用于活体内检测的尤其适用的报导体多肽。举例而言，对
含有表达荧光素酶的报导体细胞的测试受检者投与适当发光 受质(例如荧光素)。接着(例如)由(例如)美国专利第6,596,257 号中所述的光学断层摄影术在活体内检测由活体内荧光素酶 活性所产生的光子发射。适用于活体内成像的电荷耦合装置 摄影机系购自(例如)Xenogen (Alameda, CA)之IVIS②系统。来 自测试受检者的生物试样中的IKKa活性程度亦可由上述方 法测定。待测定IKKa活性的生物试样可包括仅才艮导体细胞、 报导体细胞与原生细胞两者或仅原生细胞。
在测试受斥企者中报导体及IKKa活性的量测适用于(例如) 评估在上述测试组合物报导体检测中所识别的IKKoiRT调控 物在活体内的效用。
上述促进剂报导体检测可用于识别抑制IKKaRT的组合 物。所属组合物包括(例如)来自螺蜞菊、鳢肠或旱莲草之植 物提取物，及抑制IKKa活性的纯化合物，例如叶含蟛蜞菊内 酯、叶黄酮、槲皮酮、洋元荽黄素、15-脱氧-厶12'14-前列腺素 h及前列腺素Al 。
IKKaRT抑制剂可用于治疗雄激素刺激的疾病。举例而 言，可对需要的受检者投与含有有效剂量之IKKaRT抑制剂的 组合物(例如含有鳢肠提取物或叶含蟛蜞菊内酯的组合物)以 治疗雄激素刺激的疾病，例如前列腺癌、良性前列腺肥大、 乳癌、男性秃头症、痤疮丙酸杆菌、多嚢性卵巢症、体染色 体显性多嚢性肾病或雄性素过多症。在投与抑制剂组合物之前，该受检者被诊断为患有雄激素刺激的疾病或患该病的高 风险。举例而言，在前列腺癌的情况下，在来自该受检者的生物试样(例如血样)中测定PSA含量。用于PSA的检测可如(例 如)美国专利第6,300,088中所描述来进^f亍。PSA含量的量测也 可在投与作为响应此治疗的治疗指示剂的抑制剂组合物之后 在不同时间点进行。在某些状况下，受检者可具有患前列腺癌之高风险，例 如由过高PSA含量所指示。因此，可通过对该受检者预防性 地投与含有有效剂量的IKKaRT抑制剂的物质来降低该受检 者的前列腺癌风险。上述包括例如来自螺蜞菊、鳢肠或旱莲草的植物提取物 及例如叶含螺蜞菊内酯、叶黄酮、槲皮酮、洋元荽黄素、15-脱氧-厶12，14-前列腺素h或前列腺素Al的纯化合物的抑制剂组 合物可并入医药组合物中以供预防或治疗使用。举例而言， 医药组合物可包括有效剂量的叶含壞蜞菊内酯及医药学上可 接受的载剂。术语"有效剂量"指对治疗的受检者施与产生预 防或治疗作用所需的活性组合物的量。本领域技术人员认为， 有效剂量可根据所治疗的疾病类型、疾病严重性、受检者的 整体健康状况及/或年龄、先前治疗、投药途径、赋形剂用法 及与其它预防或治疗处理共享的可能性而改变。为实施本发明的方法，可以非经肠、经口 、经鼻、经直 肠、局部或经面颊的途径投与活性组合物。本文中所用之术 语"非经肠"指经皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动 脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内或病灶内以及任4可合适的注入 技术。无菌可注射组合物可为无毒非经肠可接受的稀释剂或溶 剂中的溶液或悬浮液，诸如1,3-丁 二醇中的溶液。可4吏用的可 接受+某剂及溶剂为甘露醇、水、林格氏液(Ringer's solution) 及等张氯化钠溶液。另外，已知不挥发性油用作溶剂或悬浮 介质(例如合成之单甘油酯或二甘油酯)。诸如油酸的脂肪酸 及其甘油酯衍生物系适用于制备如天然医药学上可接受的油的可注射物，诸如橄榄油或蓖麻油，具体是其聚氧乙基化的 形式。所述油溶液或悬浮液也可含有长链醇稀释剂或分散剂、 羧甲基纤维素或类似分散剂。出于调配目的，也可使用常用 于制造医药学上可接受的固体、液体或其它剂型的其它常用界面活性剂(诸如土温(Tween)或司盘(Span)或其它类似乳化 剂)或生物可用性增强剂。用于口服投药的组合物可为任何经口可接受的剂型，包 括胶囊、锭剂、乳液及水性悬浮液、分散液及溶液。在锭剂 的情况下，常用载剂包括乳糖及玉米淀粉。亦通常添加诸如 硬脂酸镁等润滑剂。对于胶嚢形式的口服投药，适用稀释剂 包括乳糖及干玉米淀粉。当经口服投与水性悬浮液或乳液时， 可将活性成份悬浮或溶解于与乳化剂或悬浮剂组合的油相 中。若需要，则添加某些甜味剂、调味剂或着色剂。鼻用喷雾剂或吸入组合物可根据医药调配物的技术中熟 知之技术制备。举例而言，使用千醇或其它合适的防腐剂、 增强生物可用性的吸收促进剂、碳氟化合物及/或此项技术中 已知的其它增溶剂或分散剂，可将该组合物制备成于生理食 盐水中的溶液。也可以用于直肠投药的栓剂形式投与活性组合物。医药组合物中的载剂就其与该组合物的活性成份而言兼 容(且较佳地，能够使活性成份稳定)且就待治疗的受检者无 害的方面而言必须为"可接受的"。 一 或多种增溶剂可用作传 递活性化合物的医药赋形剂。其它载剂的实例包括胶状氧化 硅、硬脂酸镁、纤维素、月桂基硫酸钠及D&C Yellow # 10。以下具体实例仅作为例示性解释，且在任何情况下决不 限制本申请的其余部分。在无进 一 步细述的情况下，相信熟 知此项技术者可基于本文中的说明最大程度地利用本发明。 本文中所引用的所有文献的全文以引用的方式并入本文中。实例1前列腺癌报导体细胞抹之产生及特征22Rvl细月包才朱系购自ATCC。通才艮质体(p5.7kb陽PSA-Luc) 通过将5.7 kb PSA促进剂插入pGL3质体(Promega)中来建构。22RvPSA36-103细』包才朱通过 <吏p5.7kb-PSA-Luc及pGK画puro稳、 定转染至22Rvl细胞中而得到且对所描述的嘌微素进行选择 (Fryer及Archer, 1998)。
对于荧光素酶活性检测，8 x 1 04个衍生自22Rvl的细胞在 48孔多孔盘中生长。细胞培养基为含有5%炭包被的葡聚糖吸 附胎牛血清(Hyclone)的RPMI 。 细胞在培养物中生长 一 天之 后，更换其生长培养基以包括如下所述的实验或对照组合物， 且使细胞生长再继续20小时。通过添加被动溶解緩沖液 (Promega)使细胞溶解，接着使用荧光素酶检测系统(Promega) 及VICTOR2多标计数仪(PerkinElmer)进行焚光素酶^r测，并 标准化成如由库马斯(Bradford)蛋白质测套组(Pierce)所量 测的溶解蛋白质。
AR信号转导路径促进前列腺癌发展。因此，发明人建立 基于细胞的模型以观测人类前列腺癌细胞中的雄激素回应促 进剂活性。发明人将PS A-荧光素酶报导体稳定转染至22Rvl 细胞中以产生22RvPSA36-103雄激素回应报导体细胞4朱。将 22RvPSA3 6-103细胞在雄激素存在下培养20小时。通过超过 基线高达约100倍的雄激素、睾固酮或5a-二氢睾固酮(10 nM) 以剂量依赖性方式刺激PS A-荧光素酶活性。由于类固醇激素 二醇及孕酮未能诱导PSA-荧光素酶表达，因此诱导 22RvPSA3 6-103纟田胞中的PSA-荧光素酶表达对雄激素为特异 性的，类似于如Shao等人，(2003)， iVo"a/e， 57:1-7中的活体 内CWR22异种移植物的类固酮特异性。低基础活性及由雄激 素对PSA-荧光素酶表达的有效诱导证明22RvPSA3 6-103细胞 可用于识别雄激素回应促进剂活性的调控物。
实例2雄激素诱导AR与IKKa相互作用
发明人研究IKKa或IKK(3在雄激素刺激后是否可与 22Rv/PSA3 6-103纟田胞中经活化的AR相互作用。在将细胞曝露 于10 nM的5a二氢睾固酮历时五分钟之后，检测与IKKa的错 合物中AR的共免疫沉淀反应。与AR相关的IKKa含量在10至 15分钟内积累且达到峰值，接着在30分钟后下降，且在60分钟后完全减少。相反，在所有时间点，侦测到IKK(3在AR4普合 物中仅处于极低含量。如由使用AR及IKKa抗体之间接免疫荧 光染色所测定，AR及IKKa共定位于核中。其共定位之后接着 为类似于由所述蛋白质的共免疫沉淀反应所测定的时程。结果共同证明AR活化诱导细胞核中AR与IKKa之间错合 物的形成以活化雄激素回应靶基因转录。实例3 IKKa抑制降低雄激素回应促进剂活性 使用上述荧光素酶检测受试IKK抑制剂1 5 -脱氧-△12'14-前 列腺素J2 、前列腺素Al及叶含蟛蜞菊内酯抑制雄激素回应促 进剂活性的能力。所述化合物以剂量依赖性方式抑制5a-二氢 睾固酮诱导的荧光素酶表达。相反，IKK-p-特异性抑制剂 SC-5 14在所测试的任何浓度下对雄激素回应促进剂活性不发 挥作用。此结果暗示AR信号转导路径经由IKKa特异性产生作 用。为证实此结论，发明人建构能够诱导IKKa或IKK卩之 RNAi-敲除的22RvPSA3 6-103细月包才朱。发明人所使用的小发夹RNAi表达系统为另，J处(van de Wetering等人，2003)所报导的可诱导的表达系统的修改。使用以下发夹敲除序列IKKa C有义链5'-GCAGGCUCUUUCAGGGACA-3') IKK卩(有义链5'醫GGUGAAGAGGUGGUGGUGAGC-3') 两个序列报导于Takaesu等人，2003中。建构tet操纵子调 节的HI -小发夹RNA表达框且将其插入来自Invitrogen (Carlsbad, CA)的pcDNA6tTRJM质体中。4吏每个经敲除的质体 转染至22RvPSA36-103纟田胞中以产生稳定转染的细胞抹。子 细胞林中IKKa或IKK(3的敲除通过免疫印迹法测定。显示最显 著敲除的两个细胞株用于进 一 步研究。为诱导RNAi调节的敲 除，与媒剂对照组作比较，将细胞在含有1 (ig/ml强力霉素的 培养基中生长3天。根据上述荧光素酶检定程序进行随后的处 理及4全测。与上述IKK抑制剂结果一致，IKKa的RNAi敲除使雄激素 诱导的PSA-荧光素酶表达减少50%至60%。相反，IKK卩的敲 除显示对雄激素诱导的荧光素酶无作用，此暗示IKKa而非 IKK卩对于雄激素响应促进剂活性为所需的。
实例4 IKKa抑制剂对前列腺癌细胞生长的作用
假定AR信号转导路径的活化刺激前列腺细胞增殖且发 明人发现此路径中涉及IKKa,发明人设法确定IKKa抑制是否 会减少前列腺癌细胞之增殖。为此目的，在有或无IKK抑制剂 的雄激素存在下，22Rvl纟田胞及22RvPSA3 6-103纟田胞的集落形 成效率系通过使2xl0"个细胞在12孔多孔盘中生长6天来测 定。每三天更换生长培养基。在生长周期结束时，用于磷酸 盐緩沖生理食盐水中的0.1 %结晶紫将细胞集落染色，干燥且 摄影。结晶紫的细胞保持性通过用水中的20%乙酸萃取且在 ODs95下进行量测以作为集落形成效率的定量指标。
在相同浓度下用于上述实验中以抑制雄激素回应促进剂 活性的叶含螺蜞菊内酯证明对以剂量依赖性方式抑制雄激素 刺激的22Rvl与22RvPSA3 6-103纟田胞的集落生长高度有效。相 反，IKKp-特异性抑制剂SC-514未能抑制集落生长。IKKa之 RNAi敲除对减少雄激素刺激的集落生长亦有效。另 一 方面， IKK卩的RNAi敲除未能减少集落生长。
该等结果确定，当IKKa出现于前列腺癌中时，其对雄激 素刺激之细胞增殖很关键，且IKKa的抑制可有效治疗此癌 症。
其它实施例
本说明书中所揭示的所有特征可与任何组合相组合。本 说明书中所揭示的每个特征可由用作相同、等效或类似用途 的替代性特征替代。举例而言，候选IKKaRT调控物组合物抑 制IKKa活性的能力可自除雄激素回应报导体细胞以夕卜的 IKKa-表达细胞中检定。当然，所述测定也在本发明之范畴内。
通过上文描述，熟悉此项技术者可易于确定本发明的基 本特征，且在不脱离本发明的精神及范畴下可作出本发明的
19多种变化及修改以使其适应多种用法及条件。因此，本发明 亦涵盖其它实施例。序列表
:11(H中央研究院
:120>转录调控物组合物
<130> 08919-144001
<140> 095129843 <141> 2006"08-14
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<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
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权利要求
1.一种含有有效剂量的IκB激酶亚单位α抑制剂的组合物的用途，其用于制备这样的药剂，所述药剂用于治疗需要治疗的受检者中雄激素刺激的疾病。
2. 如权利要求l的用途，其中在投与该药剂之前，进一 步诊断该受检者患有所述雄激素刺激的疾病。
3. 如权利要求1的用途，其中该组合物为植物提取物。
4. 如权利要求3的用途，其中该植物为蟛蜞菊(Wedelia chinensis)、 鳢肠(Eclipta prostrata)或旱莲草(Eclipta alba)。
5. 如权利要求1的用途，其中该抑制剂为叶含蟛蜞菊内 西旨(wedelolactone)、 叶黄S同(luteolin)、 樹皮酉同(quercetin)、 洋 元荽黄素(apigenin)、 1 5-脱氧-厶12'14-前列腺素八或前列腺素 Al 。
6. 如权利要求5的用酯。
7. 如权利要求l的用 列腺癌、良性前列腺肥大 菌、多嚢性卵巢症、体染 症。
8. 如权利要求7的用 列腺癌。
9. 如权利要求8的用 进 一 步测定来自该受检者 含量。
10. —种含有有效剂量的IkB激酵亚单位a活性抑制剂的 组合物的用途，其用于制备这样的药剂，所述药剂用于降低 对于前列腺癌具高患病风险的受检者的前列腺癌风险。
11. 一种用于识别由IkB激酶亚单位a调节的转录活性的 调控物的方法，其包含提供哺乳动物细胞，其表达IkB激酶亚单位a及雄激素受 体，且含有经分离的核酸，所述核酸包括可操作性地连接于途，其中该抑制剂为叶含螺蜞菊内途，其中该雄激素刺激的疾病为前 、乳癌、男性先头症、痤疮丙酸杆 色体显性多嚢性肾病或雄性素过多途，其中该雄激素刺激的疾病为前途，其中在投与该药剂之前或之后 的生物试样中的前列腺特异性抗原编码报导体多肽序列的雄激素回应促进剂序列，以使得该细胞表达该报导体多肽；将该细胞与测试组合物接触；及检测表达量或所表达的报导体多肽的活性，其中与无该 测试组合物的情况相比，在该测试组合物存在下该表达量或 该报导体多肽的活性的差异指示该测试组合物调控由IkB激 酶亚单位a调节的转录活性。
12. 如权利要求11的方法，其中该雄激素回应促进剂包括 SEQIDNOs:l、 2或3中的至少一个复本。
13. 如权利要求12的方法，其中该雄激素回应促进剂包括 SEQIDNOs:l、 2及3中的至少一个复本。
14. 如权利要求1 3的方法，其中该雄激素回应促进剂包括 SEQ ID NO:4。
15，如权利要求11的方法，其进 一 步包含将该细胞与该雄 激素受体的促效剂接触。
16. 如权利要求11的方法，其中该雄激素受体为该；维激素 受体的组成性活性突变体。
17. 如权利要求11的方法，其进 一 步包含在该接触步骤之 后，测定该IkB激酶亚单位a的活性程度。
18. —种用于测定非人类哺乳动物测试受检者中由IkB激 酶亚单位a调节的转录活性的方法，其包含将细胞引入该测试受检者中，该细胞表达IkB激酶亚单位 ct及雄激素受体且含有包括可操作性地连接于编码报导体多 肽序列的雄激素回应促进剂的经分离的核酸，以使得所述细 胞表现该多肽；及检测由引入该测试受检者中的所述细胞所表达的该报导 体多肽的活性，其中该报导体活性之检出指示在该测试受检 者中由IkB激酶亚单位a调节的转录活性。
19. 如权利要求18的方法，其中该雄激素回应促进剂包括 SEQIDNOs:l、 2或3中的至少一个复本。
20. 如权利要求19的方法，其中该雄激素回应促进剂包括 SEQIDNOs:l、 2及3中的至少一个复本。
21. 如权利要求20的方法，其中该雄激素回应促进剂包括 SEQ ID NO:4。
22. 如权利要求1 8的方法，其中该活性在活体内检测。
23. 如权利要求1 8的方法，其进 一 步包含测定来自该测试 受检者的生物试样中该IkB激酶亚单位a的活性程度。
全文摘要
本发明涉及通过对需要治疗的受检者投与含有有效剂量的IκB激酶亚单位α活性抑制剂的组合物来治疗该受检者的雄激素刺激的疾病的方法。亦可对具有前列腺癌高患病风险的受检者投与该组合物作为用以降低该受检者的前列腺癌风险的方法。另一种方法涉及识别由IκB激酶亚单位α所调节的转录活性的调控物。又一种方法涉及测定非人类哺乳动物测试受检者中由IκB激酶亚单位α调节的转录活性。
文档编号A61K31/5575GK101313926SQ200710109268
公开日2008年12月3日 申请日期2007年5月30日 优先权日2007年5月30日
发明者萧培文 申请人:中央研究院