专利名称：3-羟基丁酸、4-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物作为组织工程材料的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型生物材料3-羟基丁酸、4-羟基丁酸和3-羟基己酸 共聚物P(:3HB-co4HB-co-3HHx)作为组织工程生物材料的应用，背景抹术组织工程材料概述组织工程(Tissue Engineering)是应用细胞生物学和工程学的原 理，研究开发用于修复或改善人体病损组织或器官的生物活性替代物 的一门科学.其基本原理和方法是将体外培养扩增的正常组织细胞吸 附于一种具有优良细胞相容性并可以被机体降解吸收的生物材料上面 形成复合物，然后将细胞-生物材料复合物植入人体组织、器官的病损 部位，在作为细胞生长支架的生物材料逐渐被机体降解吸收的同时， 细胞不断增殖、分化，形成新的并且其形态、功能方面与相应组织、 器官一致的组织，从而达到修复创伤和重建功能的目的(Vacanti & Langer， 1999) 可降解的支架材料、种子细胞与细胞生长调节因子并称为组织工 程的三大基本要素.其中寻找合适的支架材料备受人们关注，组织工 程支架材料的目的是为构建組织的细胞提供一个三維支架，有利于细 胞的粘附、增殖乃至分化，为细胞生长提供合适的外环境.除了符合 一般生物医学材料的要求外，组织工程学所需的理想生物材料还需满 足如下要求l)具备良好的生物相容性，不会因邻近组织的排异反应而 影响新组织的功能；2)具有可降解性及适宜的降解速率，当移植的细胞 或组织在受体内存活时，支架材料可自行降解；3)具有符合细胞、组织 器官要求的生物力学强度；4)良好的表面活性有利于细胞贴附， 并为细胞在其表面生长、增殖和分泌基质提供良好的微环境；5)便于加工成理想的二维或三维结构，而且移植到体内后能保持原有形 状(Shin et al， 2003.， Drury et al， 2003; Takezawa， 2003 ) 目前比较常用的可作为组织工程支架的材料主要有几大类型，其一为天然材料，包括胶原、甲壳素、壳聚糖、海条酸盐、毛发及血管等；其次是合成高分子材料，如聚氨酴、硅橡胶、聚乙烯、聚四象乙烯、聚碳酸薛、聚酸肝等.此外还有一类为复合材料(Shin etal，2003; Drury et al， 2003; Takezawa， 2003) 自20世紀80年代末以来的10 多年时间，关于组织工程材料的研究发展十分迅速，Advanced Tissue Science公司已有商品化人工皮肤Derma graft出售，用于治疗大面积 烧伤(Athanasiou et al， 2000).随着研究的深入更多的组织工程材料 也将涌现，但总体上讲，理想的组织工程支架材料尚未发现，相关研究都集 中在对现有材科的改性与复合，各种材料表面处理与修饰技术、材料 加工技术等(Shin et al， 2003; Drury et al， 2003; Takezawa， 2003 ).PHA在组织工程中的应用聚羟基脂肪酸^ ( polyhydroxyalkanoates或PHA )是细菌细胞内合成的一类高分子化合物.它的产生是在营养不平衡的环境下，细菌将多余的物质转化为碳源和能源的储备物，同时将水溶性的小分子转 化为水不溶性的大分子PHA (Wangetal， 1998) PHA的结构通式可表示为式(l-l)，与化学合成的高分子材料相比，依单体的组成不同， PHA具有从坚硬的晶体到柔软的弹性体等一系列不同的聚合物性质， 由于PHA的力学性能与某些热塑性材料如聚乙烯、聚丙烯类似，但又可完全降解进入自然界的生态循环，因而被认为是一种可能替代传统 的不可降解的、由石油合成的塑料的"生物可降解塑料"(Lee，1996).<formula>formula see original document page 5</formula>(M)R为取代基，可为饱和或不饱和、直链或支链的CVC"的烷基，m 为聚合度.n=l、 2或3.优选地，n-1,例如，当n-1, R-曱基时，PHA 单体为羟基丁酸(hydroxybutyrate或HB) ; R-乙基时为羟基戊酸(hydroxyvalerate或HV) ; R-丙基时为轻基己酸(hydroxyhexanoate 或HHx) ; R-丁基时为羟基庚酸(bydroxyheptanoate或HHp) ; R-戊基时为羟基辛酸(hydroxyoctanoate或HO)等.正因为PHA同时具有良好的生物相容性、生物可降解性和塑料的 热加工性能，此外还具有光学活性、压电性、气体相隔性等很多高附 加值性能，同时随着PHA发酵工艺和合成手段的提高，PHA已能规棋 生产，使其在价格上更具优势(Cai & Cheng ， 2001),所以作为生物医 用材料，这已经成为近年来生物材料领域最为活跃的研究热点.聚3-羟基丁酸醋(PHB)是最早被应用于骨折固定材料的PHA，但 由于单纯PHB易碎、热不稳定、降解时间长、可塑性和机械性能差等 缺点限制了它的广泛应用.将3-羟戊酸(3HV)引入PHB主链，形成3-羟基丁酸-3-鞋基戊酸共聚酯(PHBV)，可改善PHB的上述缺点.Rivard 等用PHB/9。/。PHV组成的PHBV共聚物制成三维立体泡沫用作软骨细 胞、成骨细胞培养支架，细胞均匀地分散在整个聚合物基质中，呈良 好的粘附、增殖状态，并在培养21天时细胞生长达最大密度(Rivard etal，1996).但PHBV共聚物还存在机械性能差、骨结合力弱等问题. 3-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物(PHBHHx)是作为PHB及PHBV的替 代产品出现的，其体外细胞亲和性研究发现，该材料制成膜或三维支 架后有利于成纤维细胞(Yang et al， 2002),软骨细胞(Deng et al， 2002),骨號基质干细胞(Yangeta1，2004)等黏附和增殖，并能够促 进软骨细胞外基质的形成(Deng et al， 2003 ).经过脂肪醃处理(Zhao etal，2002)或与PHB共混(Deng et al， 2002 )能够显著提高其细胞亲 和性，但是从降解实验来看，PHBHHx虽然能在磷酸緩冲液(PBS)中降 解，但仍然存在着降解较慢的问題，这将不利于体内移植后的组织重 建(Wangetal， 2004),将PHBHHX做成狗食管支架， 一段时间后 结果显示，虽然PHBHHx支架利于组织再生，但是PHBHHx降解援 慢，不利于食管组织重建(Chen & Wu， 2005) PHA家族中由于单聚物、共聚物及共混物种类的众多，所以同时 具备了多种多样的性能.随着PHA研究进一步的发展，除了单聚物， 二聚物，人们发现了更加新型的更多单体的PHA共聚物(Tajima etal， 2003; Abe et al， 1994 ).这种PHA在单体组成上比PHBHHx等二聚物 PHA有更多的变化，机械性能也更加优良，根据单体组成不同其性能可以从硬塑料到弹性体之间有很大调节空间，有着非常广阔的应用前景(Matsusaki et al， 2000)，将比已经实现产业化的几种PHA材料具 有更加优良的性能，能够满足更多的应用需求.目前，仍然需要具有良好的生物相容性和生物可降解性，同时具 有一定机械强度和延展性的新型生物材料.发明内容本发明一方面提供了 3-羟基丁酸、4-幾基丁酸和3-轻基己酸共聚 物在组织工程中的应用.优选地，所述共聚物中，4-羟基丁酸单体的摩尔比可以为2~15 %， 3-轻基己酸单体的摩尔比可以为5~30%.更优选地，所述共聚物 中，4-羟基丁酸单体的摩尔比可以为2-5%, 3-羟基己酸单体的摩尔比 可以为15~25%.根据一个特别优选的实施方式，4-鞋基丁酸单体的 摩尔比为3.5%,3-羟基己酸单体的摩尔比为22.7%.本发明的新型生物材料3-羟基丁酸、4-羟基丁酸和3-羟基己酸的 共聚物P(3HB-co-4HB-co-3HHx)，已被证明对很多细胞都有很好的生 物相容性，并且具有较好的生物降解性，是一种新型的的生物医用材 料.该类聚醋可以由微生物发酵方法获得.通过在三聚物制成的膜上 培养细胞显示，该类三聚物能显著的促进细胞的生长.因为是生物合 成材料，所以它拥有化学合成材料所不能比拟的一些特性如可降解 性，好的组织相容性等，因此可以作为一类生物材料应用到组织工程 中。本发明所提供的3-羟基丁酸、4-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物 P(3HB-co-4HB-co-3HHx)是一种比PHB、 PHBV、 PHBHHx等更优秀 的组织细胞相容性的材料.P(3HB-co-4HB-coJHHx)具有好的机械强 度和延展性，可以加工成型，符合组织工程对材料的要求.本发明中的新型生物材料P(3HB-co4HB-co-3HHx)与已有的应用 于组织工程中的生物材料如PHB和PLA相比，具有以下特点(1)是完全由微生物合成的生物高分子材料，具有很好的生物可降解性； (2)具有有机溶刑的溶解性；(3)易加工成型；(4)具有细胞相容 性；(5)具有更好的促进细胞生长增殖的能力.本发明另一方面提供了聚羟基脂肪酸共混物在组织工程中的应用，其中所述聚羟基脂肪酸共混物包含3-幾基丁酸、4-羟基丁酸二聚 物和3-羟基丁酸、3-幾基己酸二聚物.优选地，在所述共混物中，3-羟基丁酸、4-幾基丁酸二聚物和3-羟基丁酸、3-羟基己酸二聚物的重量比在1:4 ~ 4:1的范闺内.根据一 个特别优选的实施方式，3-羟基丁酸、4-羟基丁酸二聚物和3-幾基丁 酸、3-羟基己酸二聚物的重量比大约为1:2.优选地，3-羟基丁酸、4-羟基丁酸二聚物中，4-羟基丁酸羊体的摩 尔比可以为5~20%.优选地，3-羟基丁酸、3-羟基己酸二聚物中，3-羟基己酸单体的摩 尔比可以为5~20%.根据一个特别优选的实施方式，3-羟基丁酸、4-羟基丁酸二聚物 中，4-羟基丁酸单体的摩尔比为12%;并且3-羟基丁酸、3-羟基己酸 二聚物中，3-羟基己酸单体的摩尔比为12%.本发明的聚羟基脂肪酸共聚物和共混物特别适合用作组织工程支 架材料.本发明的聚羟基脂肪酸共聚物和共混物可用于制备各种组织工程 用品，例如但不限于支架、修复材料、缝合线、骨钉、管形材料、骨 修补物、组织再生基体、细胞培养附着材料、人造血管、创伤敷料、 细胞或组织包被、多孔膜、微粒或毫微粒、心脏修复材料、牙齿移植 材料或者心包膜等.由于本发明的聚羟基脂肪酸共聚物和共混物具有良好的促进细胞 粘附和生长的性能，因此可用作细胞或组织生长附着材料，尤其适合 于软骨细胞、间充质干细胞、成骨细胞、成纤维细胞和胚肺细胞，
困1显示了人间充质干细胞在P(3HB-co-4HB-co-3HHx)膜材上的 增殖.对照样品细胞培养板(不加膜)、PLA膜、PHBHHx膜.No films:不加膜.困2显示了小鼠成骨细胞MC3T3在P(3HB-eo>4HB-co-3HHx)膜材 上的增殖.对照样品细胞培养板(不加膜)、PLA膜、PHBHHx膜.图3显示了小鼠成纤维细胞L929在P(3HB-co-4HB-co-3HHx)膜 材上的增殖.对照样品细胞培养板(不加膜)、PLA膜、PHBHHx膜.困4显示了人胚肺细胞HLF在P(3HB-co-4HB-co-3HHx )膜材上 的增殖.对照样品细胞培养板(不加膜)、PLA膜、PHBHHx膜.困5显示了 MTT法检测不同比例混合的P(3HB-co-12%4HB) /P(3HB-co-12。/。HHx)及对照对兔软骨细胞增殖的影响.柱状困(自左至 右)所对应的材料依次示于困右側的框中(自上至下).其中P(3HB-co-12。/。4HB): P(3HB-co-12%HHx) -2: 4组和P3HB4HBHHx组和TCL 组相比有显著差异，p<0.05. n-6.困6显示了 P(3HB-co-12yo4HB)/P(3HB-co-12。/oHHx)共混物的热 学性质，从困中可以看出不同比例的混合物都只有一个Tg (玻璃化转 化温度)，即P(3HB-co-12%4HB)和P(3HB-co-12%HHx)是相容的 A4^il^A本发明所指的3-羟基丁酸、4-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物可以 是3-羟基丁酸、4-羟基丁酸和3-羟基己酸任何单体比例的三聚物，也 可以是该三聚物的共混物，三聚物的表面改性复合物，三聚物的表面 处理修饰物等.在本发明的聚合物中，对三种单体的比例没有特别的限制.但是， 优选的4-羟基丁酸单体的摩尔比可以为2~15%， 3-羟基己酸单体的摩 尔比可以为5~30%.本领域中已知多种对聚合物进行表面改性和表面处理的方法，可 由本领域技术人员根据具体需要确定采用何种方法.术语"3-羟基丁酸、4-羟基丁酸二聚物"是指由3-羟基丁酸单体和4-羟基丁酸单体聚合而成的二聚物.本发明的共聚物和共混物所适用的细胞包括兔软骨细胞、人间充 质干细胞，MC3T3成骨细胞，小鼠成纤維细胞L929，人胚肺细胞HLF等，但不限于这些细胞.本发明的P(3HB-co-4HB-co-3HHx)新材料以及其它的对照样品成 膜之后，用来培养人间充质干细胞72小时，经过MTT分析来检測对 比细胞的生长情况.试验结果显示，四组中PLA膜上生长的细胞最少， 而P(3HB-co-4HB-co-3HHx)膜上生长的细胞数量高于各对照组，且具 有显著差异性(p<0.05)(图1),该试验结果说明，对比不加膜的培养板、PLA膜、PHBHHx膜而言，至少在培养人间充质千細胞上，新 材料P(3HB-co-4HB-co-3HHx)具有更优的生物相容性.相对于对照组，小鼠成骨细胞MC3T3、小鼠成纤維细胞L929和 人胚肺HLF在P(3HB-co-4HB-co-3HHx)上生长的更好(困2，困3, 困4)，因此P(3HB-co-4HB-co-3HHx)比其他三种材料有更好的生物 相容性.与对照相比，本发明的包含P(3HB-co-4HB)和P(3HB-co-HHx)的 共混物可显著促进兔软骨细胞的增殖.实施例l: P(3HB-co-4HB-co-3HHx)的获得P(3HB-co-4HB-co-3HHx )的生产菌林可以通过对中国专利申请 03146663.X(公开号CN 1570085A )中公开的嗜水气单胞菌CGMCC NO 09U(该菌林已于2003年3月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心)进行基因工程改造而获得，其中将pA WC7基因 插入到质粒中然后转入到嗜水气单胞菌中构成重组菌.所涉及的操作 均为常规技术，可参考《分子克隆实验指南》等工具书.本实施例还提供了 P(3HB-co-4HB-co-3HHx)的采用不同菌林的另一种备选的制备方法.菌种带有PHBHHx合成基因pAaPC/的嗜水气生单胞菌 Je/wwo/wwZi^r印/H7a 4AK4 (p/mPC/)(清华大学生物系微生物实验 室提供).上述两种菌抹的培养方法是相似的，如下文所迷.LB培养基(Luria-Bertani Broth media): 5g/L酵母漫出物；10g/L胰蛋白胨；10g/LNaCl基本矿物盐培养基(Mineral media) : 9 g/L Na2HP04 ' 12H20; l.S g /L KH2P04; 1 g /L (NH4)2S04; 0.41 g /L MgS04; 0.05 g/L Fe(HI)-NH4-citrate; 0.02 g/L CaCl2 . 2H20和lml的微量元素，微量元素(每升l mol/L HCI含有)100 mg ZnS04 . 7H20; 30 mg MnCl2 . 4H20; 300 mg H3B03; 200 mg CoCI2 6H20; 10 mg CuS04 . 5H20; 20 mg NiCl2 6H20和30 mg NaMn04 2H20本实施例搮作如下/y;rfro/;/i//a 4AK4 (pAaPC刀在LB培养基(含有SO jig/mlkanamycin)中3010、 200 rpm培养过夜作为种子液，按照5%的接种 量将种子液接种到100 ml发酵培养基(MM培养基，含有50 iig/ml kanamycin)中，并加入十二酸(8g/L) ， 301C、 200rpm培养(48h) 小时.培养期间，添加l， 4-丁二醇(4g/L)作为底物生成4-幾基丁酸 单体的摩尔比为3.S%， 3-羟基己酸单体的摩尔比为22.7%的P(3HB-co-4HB-co-3HHx )材料，摇瓶培养48小时后，离心(5000rpm， 1S分钟)收集菌体，收集 的细胞用蒸馏水和乙酵洗涤两次.水冻干燥，用研钵将菌体磨碎，称 重，加入10倍体积的氯仿，加盖密闭.IOOTC烘箱中4小时.冷却至 室温后，抽滤，用IO倍体积的无水乙醇沉淀，再次抽滤，去除氯仿和 乙醇；真空干燥，得到新材料P(3HB-co-4HB-co-3HHx).具有不同4-羟基丁酸和3-羟基己酸单体摩尔比的P(3HB-co-4HB-co-3HHx)材料，可以通过对所用的底物浓度进行适当调整而制得.实施例2:人间充盾千细胞在P(3HB-co-4HB-co-3HHx)三聚物膜表面 的增殖聚合物溶解展膜的试剂三氯甲烷； 聚合物提纯和溶解加热回流的温度60TC; 聚合物提纯和溶解加热回流的时间0.5小时； 膜表面细胞增殖测定的对照聚乳酸(PLA)(分子重约为30^40万)；PHBHHx (分子量约为44万) 24孔培养板(不加PHA膜) 本实施例的操作如下在601C水浴回流保持O.S小时，使已纯化的P(3HB-co-4HB-co-3HHx)聚合物(4-鞋基丁酸单体的摩尔比为3.5%,3-羟基己酸单体的 摩尔比为22.7%，参见实施例1)完全溶解于三氯甲烷，室温下展膜， 经水冻干燥去除残余在膜中的有机溶刑.将膜剪至24孔板孔的大小， 将其完全浸入75。/。乙醇中过夜灭菌，用磷酸緩冲液(PBSpH7.4)反复 荡洗，去除残余的乙醇.取生长旺盛的人间充质干细胞接种到膜表面， 补加含有10%胎牛血清和5 ng/ml的DMEM培养基，使初始的细胞浓 度在2xl0"个/ml，置于""C C02培养箱中培养72小时.去除培养基，用PBS ( pH 7.4)荡洗，加入0.1 ml ^唑兰(MTT)和0.9 ml基本培养基 DMEM继续培养4小时，去除MTT溶液后加入lml DMSO (二甲基 亚砜)室温放置30分钟，取0.15ml浸出液于96孔细胞培养板中，酶 标仪双波长模式(540 nm和690 nm )下测定吸光度值.结果示于困1 中.实施例3:小氣成骨细胞MC3T3在Pf3HB-co-4HB-co-3HHx )三聚物 膜表面的增殖聚合物溶解展膜的试剂三氯甲烷；聚合物提纯和溶解加热回流的温度60TC;聚合物提纯和溶解加热回流的时间l小时；膜表面细胞增殖测定的对照聚乳酸(PLA)(分子量约为30-40万)；PHBHHx (分子量约为44万> 24孔培养板(不加膜) 本实施例的操作如下在60TC水浴回流保持1小时，使P(3HB-co-4HB-co-3HHx)(同实 施例2中的组成)完全溶解于三氯甲烷，逐滴加入到不断搅拌状态下 的无水乙醇中，抽滤取沉淀，可以重复以上步騍进行进一步纯化.将 纯化的P(3HB-co-4HB-co-3HHx)再按要求的比例溶解于三氯甲烷溶液 中，室温下展膜.将膜完全在75。/。的乙酵中浸泡12小时，紫外照射过 夜灭菌，用PBS( pH 7.4)反复洗三次，去除残液.取生长旺盛的MC3T3 细胞接种到膜表面，补加含有10%胎牛血清的DMEM培养基，使初始 的细胞浓度在2.0xl(^个/ml，置于371！ C02培养箱中培养48小时. 去除培养基用PBS ( pH 7.4)荡洗，加入1 ml MTT和9 ml DMEM继 续培养4小时，去除MTT溶液用PBS( pH 7.4 )荡洗，加入10 ml DMSO 室温放置30分钟，取0.05 ml浸出液于96孔细胞培养板中，酶标仪540 nm和690nm测定吸光度值.结果示于困2中.实施例4:小鼠成纤维细胞L929在P(3HB-co-4HB-co-3HHx)三聚物 膜袅面的增殖聚合物溶解展膜的试刑三氯甲烷；聚合物提纯和溶解加热回流的温度60TC; 聚合物提纯和溶解加热回流的时间l小时； 膜表面细胞增殖测定的对照聚乳酸(PLA)(分子量约为30-40万)；PHBHHx (分子重约为44万) 24孔培养板(不加膜) 本实施例的操作如下在601C水浴回流保持1小时，使P(3HB-co-4HB-co-3HHx)(同实 施例2中的组成)完全溶解于三氣甲烷，逐滴加入到不断搅拌状态下 的无水乙醇中，抽滤淀，可以重复以上步骤进行进一步纯化.将 纯化的P(3HB-co-4HB-co-3HHx)再按要求的比例溶解于三氣甲烷溶液 中，室温下展膜.将膜完全在75%的乙醇中浸泡12小时，紫外照射过 夜灭菌，用PBS (pH7.4)反复洗三次，去除残液.取生长旺盛的成纤 维细胞L929接种到膜表面，补加含有10%胎牛血清的DMEM培养基， 使初始的细胞浓度在1.0xH^个/ml，置于37TC 0)2培养箱中培养48 小时.去除培养基用PBS( pH 7.4 )荡洗，加入1 ml MTT和9 ml DMEM 继续培养4小时，去除MTT溶液用PBS (pH 7.4)荡洗，加入10 ml DMSO室温放置30分钟，取0.05ml浸出液于96孔细胞培养板中，酶 标仪540nm和690nm測定吸光度值.结果示于田3中.实施例5:人胚肺(HLF)细胞在Pf3HB-co-4HB-co-3HHx)三聚物膜 袅面的增殖聚合物溶解展膜的试刑三氣甲烷；聚合物提纯和溶解加热回流的温度60TC;聚合物提纯和溶解加热回流的时间l小时；膜表面细胞增殖测定的对照聚乳酸(PLA)(分子量约为3(M0万)；PHBHHx (分子量约为44万)24孔培养板(不加膜)本实施例的操作如下在601C水浴回流保持1小时，使P(3HB-co-4HB-co-3HHx)(同实 施例2中的组成)完全溶解于三氯甲烷，逐滴加入到不断搅拌状态下 的无水乙醇中，抽滤取沉淀，可以重复以上步'稞进行进一步纯化，将纯化的P(3HB-cch4HB-co-3HHx )再按要求的比例溶解于三氯甲烷溶液 中，室温下展膜，将膜完全在75%的乙醇中浸泡12小时，紫外照射过 夜灭菌，用PBS (pH7.4)反复洗三次，去除残液.取生长旺盛的人胚 肺(HLF)细胞接种到膜表面，补加含有10%胎牛血清的1640培养基， 使初始的细胞浓度在2.0><104个/|111，置于"TC COz培养箱中培养48 小时.去除培养基用PBS (pH 7.4)荡洗，加入l mlMTT和9ml无 血清1640继续培养4小时，去除MTT溶液用PBS ( pH 7.4)荡洗， 加入10 ml DMSO室温放置30分钟，取0.05 ml浸出液于96孔细胞培 养板中，酶标仪540nm和690nm测定吸光度值.结果示于困4中.实施例6: P(3HB-co-12。/。4HBVP(3HB-co-12o/。HHx)共混物的制备 P(3HB-co-12%4HB)与P(3HB-co-12。/。HHx)以下列比例混合 (w/w):P(3HB-co-12%4HB):P(3HB-co-12%HHx)=0:6P(3HB-co-12%4HB):P(3HB-co-12%HHx)-l:5P(3HB-co-12%4HB):P(3HB-co-12%HHx)=2:4P(3HB-co-12%4HB):P(3HB-co-12%HHx)-3:3P(3HB,co-12%4HB):PG3HB-co-12%HHx)-4:2P(3HB-co-12。/。4HB):P(3HB-co-12%HHx)-5:lP(3HB-co-12%4HB):P(3HB-co-12%HHx)=6:0按照以上比例准确称量P(3HB-co-12。/o4HB)和P(3HB-co-12%HHx) 共1.8g，加入lOOml三氟甲烷中，65。C水浴中回流，待材料溶解后， 倒入直径15cm的玻璃培养皿中，于通风橱中干燥.待千燥成腹后，真 空冷冻干燥2天，以彻底除去三氯甲烷，^施例7:用DSC (热差扫描量热仪)检测P(3HB-co-12%4HBVP(3HB-co-l 2V。HHx、共混物热孝性盾 称取2mg共混物，放入DSC，检測程序如下 1:平衡温度于-60.00iC 2:等温1.00分钟3:以10.00 1C/分钟的速度升高到l糾.oot: 4:等温2.00分钟5:笫一轮循环结束 6:降低温度到-60.00 TC 7:温度平衡在-60.00 TC 8:等温1.00分钟 9:第二轮循环结束10:以10.001C/分钟的速度升高到180.001C 11:笫三轮循环结束 结果示于困6中，实施例8:兔软骨细胞的分离及培养(1) 取l月龄新西兰兔一只，兔耳静脉注射5ml空气致死.(2) 游离并用骨剪截取肱骨头、股骨头及膝关节，里入无菌平皿.(3) 带入超净工作台作如下搮作先用生理盐水充分漂洗，离断髌 韧带，内外側副韧带以及前后交叉韧带，切开膝关节，刮除关节周围 附着的组织如肌肉、脂肪、骨膜、滑膜，D-Hanks液充分漂洗.用尖 刀片充分利用软骨的弹性，削下每个关节表面的软骨，不要误带软骨 下骨和骨膜， 一般以不渗血为度.充分漂洗软骨小块，更换洗液3次. 用眼科小剪刀剪碎至lmm大小，用小刮匙把软骨小块转移至小锥形 瓶中.(4) 吸去漂洗液，加入0.25%胰蛋白醉溶液，并置入37TC、 5%C02 孵箱中消化30分钟，中途不时摇晃.(5) 加入0.2% 1I型胶原酶5ml，里37TC水浴中消化45min,将游 离出的带有蘇溶液的软骨细胞用悬液吸管吸出，120目尼龙网筛过滤， 所得滤液放入一无菌离心管内，1200r/min离心8min,弃上清，加 入5ml含有血清的DMEM培养液混匀以终止消化，1200r/min离心 5min,弃去上清液，只留下细胞球，并加入少量含有血清的培养液吸 打后先封口置放.原消化瓶中再加入0.2。/。II型胶原酶5m1,如前法消 化45min，消化后的处理同上.然后把2次消化所得的软骨细胞悬液 合并在一起.(6) 10%FBS的DMEM制成细胞悬液，调细胞悬液浓度至7.5X104.(7) 将细胞悬液接种于6孔培养板，置于37TC、5n/。C02孵箱中培养，实施例9: MTT法检测Pf3HB-co-12%4HBVPf3HB-co-12%HHx、 共混物对兔软骨细胞增值的彩响(1) 将制备好的P(3HB-co-12。/。4HB)/P(3HB-co-12Y。HHx)共混膜剪 成24孔培养板的孔一样大小的小块，70%的酒精消毒过夜，PBS洗两 次，铺在24孔板上待用.同时设置对照不加任何膜的培养板TCL、 PLA、 P3HB4HBHHx(4HB含量为1.2mol%>.每组设6个平行样，一 个空白对照.(2) 0.25%胰蛋白酶消化兔软骨细胞6分钟，吸除消化液，加入新 鲜培养液制成单细胞悬液，血球计数板计数.(3) 将消化好的兔软骨细胞以2xl0V孔的密度接种到铺有 P(3HB-co-12。/o4HB)/P(3HB-co-12y。HHx)共混物及对照的24孔培养板 上.每孔加lml含10。/。FBS的DMEM培养液，(4) 37。C, 5%<:02培养箱培养72小时之后，吸掉培养液，加入0.9ml 无血清培养液和0.1m，MTT 15mg/ml溶于PBS (磷酸盐緩冲液，pH 7.2 )，继续置培养箱中培养4小时，可见细胞被染成蓝紫色.(5) 吸掉无血清培养液和MTT混合液，每孔加lmlDMSO,置摇床上振荡半个小时，以使DMSO充分溶解蓝紫色的结晶.(6) 将24孔培养板中的DMSO吸到96孔培养板，酶标仪读取 540nm和690nm处的吸光值.结果示于困5中。本文中所涉及的参考文献，包括专利文件、学术论文、出版物等， 均以引用的方式将其全部内容包括在本文中 应当理解，在不偏离本发明的精神和范闺的情况下，本领域的普 通技术人员可以在形式和细节上对其做出各种改变和改进，而这些均 被认为落入了本发明的保护范围.枣者文献1. 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权利要求
1.3-羟基丁酸、4-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物在组织工程中的应用。
2. 根据权利要求l的应用，其中在所述共聚物中，4-羟基丁酸单 体的摩尔比在2~15%范闺内，3-羟基己酸单体的摩尔比在5-30%范 围内.
3. 根据权利要求2的应用，其中在所述共聚物中，4-轻基丁酸单 体的摩尔比在2~5%范闺内，3-羟基己酸单体的摩尔比在15~25%范 围内.
4. 根据权利要求3的应用，其中在所述共聚物中，3-羟基己酸单 体的摩尔比在20-25%范田内.
5. 聚羟基脂肪酸共混物在组织工程中的应用，其中所述聚羟基脂 肪酸共混物包含3-羟基丁酸、4-羟基丁酸二聚物和3-羟基丁酸、3-羟 基己酸二聚物.
6. 根据权利要求5的应用，其中所述共混物中，3-羟基丁酸、4-羟基丁酸二聚物和3-羟基丁酸、3-羟基己酸二聚物的重量比在l:4 ~ 4:1 的范闺内.
7. 根据权利要求5的应用，其中所述共混物中，3-羟基丁酸、4-轻基丁酸二聚物和3-雍基丁酸、3-羟基己酸二聚物的重量比大约为 1:2.
8. 根据权利要求5的应用，其中所述3-羟基丁酸、4-羟基丁酸二 聚物中，4-羟基丁酸单体的摩尔比为5~20%.
9. 根据权利要求5的应用，其中所述3-幾基丁酸、3-羟基己酸二 聚物中，3-羟基己酸单体的摩尔比为5~20%.
10. 根据权利要求5的应用，其中所述3-羟基丁酸、4-羟基丁酸二 聚物中，4-雍基丁酸单体的摩尔比为12%;并且所述3-羟基丁酸、3-羟基己酸二聚物中，3-羟基己酸单体的摩尔比为12%.
11. 根据权利要求l-10之任一项的应用，其中所迷共聚物或共混 物用作组织工程支架材料.
12. 根据权利要求1-10之任一項的应用，其中所述共聚物或共混 物用于制备支架、修复材料、缝合线、骨钉、管形材料、骨修补物、 组织再生基体、细胞培养附着材料、人造血管、创伤敷料、细胞或组织包被、多孔膜、微粒或毫微粒、心脏修复材料、牙齿移植材料或者 心包膜.
13. 根据权利要求1-10之任一项的应用，其中所述共聚物或共混 物用作细胞或组织生长附着材料.
14. 根据权利要求13的应用，其中所述细胞选自软骨细胞、间充质干细胞、成骨细胞全文摘要
本发明提供了3-羟基丁酸、4-羟基丁酸和3-羟基己酸共聚物在组织工程中的应用。已经证明，本发明的共聚物P(3HB-co-4HB-co-3HHx)易加工成型，并且对多种细胞具有良好的生物相容性和生物降解性，能显著地促进细胞生长。本发明还提供了聚羟基脂肪酸共混物在组织工程中的应用，其中所述聚羟基脂肪酸共混物包含3-羟基丁酸、4-羟基丁酸二聚物和3-羟基丁酸、3-羟基己酸二聚物。
文档编号A61L31/10GK101327335SQ20071011220
公开日2008年12月24日 申请日期2007年6月21日 优先权日2007年6月21日
发明者梁延省, 胡亚军, 谢文朋, 伟 赵, 陈国强 申请人:汕头大学