专利名称：：一种重组复制缺陷型病毒、含有该病毒的药物组合物及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基因工程领域，具体而言，本发明涉及一种重组复制缺陷型病毒、含有该病毒的药物组合物及其应用，特别是含人融合基因LFA3-Fc的复制缺陷型病毒、以及抗银屑病的药物组合物。技术背景银屑病是一种常见的复发性、炎症性皮肤病，其以角质形成细胞过度增生、炎症细胞浸润和新生血管形成作为组织病理三要素。此外，银屑病还是一种具有遗传相关性的免疫性疾病。在与银屑病发病机制相关的众多因素当中，免疫性因素是首要因素，其中尤以T细胞(胸腺依赖性淋巴细胞)的激活最为相关，该T细胞是淋巴细胞的主要组分，其细胞表面有大量002受体表达，可举出的实例有004+0045110+和CD8+CD45RO+等。根据美国银屑病协会的报道，诱发银屑病的T细胞的激活必须满足两个条件第一，抗原呈递细胞(antigenpresentingcell,APC，可举出的实例有巨噬细胞，Langerhans细胞和树突状细胞等)必须要向T细胞呈递一种能被该细胞表面受体识别且匹配的抗原成分(但这些抗原的具体成分尚未能够阐明)；第二，结合在一起的APC和T细胞必须在一个或多个刺激通道的作用下，T细胞才能被激活。一旦T细胞被激活，它们就会释放出大量的细胞因子，这些细胞因子作用于位于表皮最外层的角质生成细胞，促使角质生成细胞分裂速度不断加快，这种现象被称为"过度增殖"。T细胞被激活后还可以激发一系列级联反应，其中包括辅助T细胞的激活以及发生皮肤内聚集现象。这最终使得皮损处出现大量的APC，而这些APC又反过来进一步激活了更多的T细胞，由此造成恶性循环。LFA3即淋巴细胞功能相关抗原3(Lymphocytefunction-associatedantigen-3,LFA-3;又名CD58)。APC表面的LFA3分子与T细胞的CD2的结合就是所述共刺激信号中的一种。这种LFA3与CD2的结合不仅激活了T细胞，还进一步促进一些细胞因子(如Y-干扰素)的分泌，而银屑病的发生与Y-干扰素的过度分泌也是密切相关的。由此可以看出一种有效的银屑病治疗药物是必须能够阻断这一恶性循环的药物。目前，很多生物制药公司也都釆用在循环开始之前就阻断这一过程的生物药(LFA3-Fc)来治疗银屑病。换言之，就是该LFA3-Fc可直接干扰T细胞的激活。所述LFA3-Fc是将人的LFA3胞外可溶部分与人IgGl的Fc片段融合而形成的新分子。该LFA3-Fc是一种双功能分子，其LFA3部分可与T细胞表面的CD2受体特异结合，抑制T细胞的激活，改变炎症反应进程；其IgGl的Fc片段可与NK细胞表面的CD16(Fcy受体III)结合，诱导T细胞的凋亡，最终减少和清除有记忆效应的T细胞。由于银屑病患者皮损处存在的大量被激活的T细胞上的LFA3/CD2共刺激通道被LFA3-Fc阻断，从而抑制了T细胞的作用，达到缓解和治愈银屑病的目的。但是，由于LFA3-Fc临床使用剂量高(每周一次肌肉注射15mg或静脉注射7.5mg，12周为一个疗程)、中国仓鼠卵巢细胞(Chinesehamsterovary，CHO)表达系统产量较低和难以规模化生产，使得目前的LFA3-Fc很难满足临床的需要。本发明采用基因治疗方案——将LFA3-Fc基因导入腺病毒，构建重组腺病毒(Ad-LF)，从而在体内使LFA3-Fc持续表达。采用本发明的方法可克服体外表达蛋白产量低、表达及纯化过程繁琐、重组蛋白半衰期短的问题，实现在体内可以长时间持续表达目的蛋白，同时还可以减少给药次数。
发明内容本发明第一方面涉及一种复制缺陷型病毒，该复制缺陷型腺病毒包含有启动子控制下的人融合基因LFA3-Fc，该人融合基因LFA3-Fc是由人的LFA3胞外可溶部分与人IgG的Fc片段融合形成的。根据本发明的第一方面，关于病毒载体，必须使用复制缺陷型病毒，例如复制缺陷型腺病毒、复制缺陷型单纯疱疹病毒和复制缺陷型新城疫病毒。本发明优选使用复制缺陷型病毒的原因在于，这种病毒载体不能在除包装细胞系(293、911、PERC6等)以外的细胞中复制增殖，其共同特点是缺失了病毒基因组中某些复制增殖所必需的基因。其中，本发明优选使用第一代5型腺病毒或第二代、第三代5型腺病毒。本发明的第二方面涉及一种含有本发明第一方面的复制缺陷型病毒的宿主细胞。例如可用本发明的重组复制缺陷型病毒直接转化宿主细胞，例如293细胞，也可以用带有融合基因LFA3-Fc的克隆载体与脂质体共转染宿主细胞。关于宿主细胞，可用于实施本发明的宿主细胞可以是真核或原核细胞，例如细菌、酵母、或者是动物细胞。此外，所述的宿主细胞优选是真核细胞。更进一步的，所述的宿主细胞是293细胞。本发明之所以采用293细胞是因为该细胞株转染了腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞，重组的复制缺陷型腺病毒可在此细胞中复制及包装；并且三种大规模培养方式(贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养)均可用于293细胞的培养。本发明第三方面提供一种抗银屑病的药物组合物，由下列成分组成a.—种重组复制缺陷型病毒，该复制缺陷型病毒包含有启动子控制下的人融合基因LFA3-Fc，该人融合基因LFA3-Fc是由人的LFA3胞外可溶部分与人IgG的Fc片段融合形成的；和b.药学上可接受的辅料。本发明的第四方面，提供了一种抗银屑病的药物组合物的制备方法。为了制备抗银屑病的药物组合物，应提供一种复制缺陷型病毒和药学上可接受的辅料，其中，所述的复制缺陷型病毒包含有启动子控制下的人融合基因LFA3-Fc，该人融合基因LFA3-Fc是由人的LFA3胞外可溶部分与人IgG的Fc片段融合形成的；以及将所述复制缺陷型病毒和所述药学上可接受的辅料混合。本发明抗银屑病的药物组合物优选为液体制剂形式，更优选为注射剂。可用一般用于配制病毒制剂的液体载体，例如纯净水，生理盐水，葡萄糖溶液等，作为所述药学上可接受的辅料。对于注射液，应该采用无菌无热源的液体载体。本发明的药物组合物一般应低温保存，例如保存在-2(TC温度下。根据本发明，能够实现含有所述重组腺病毒的宿主细胞分泌表达高活性(能感染包括肺癌、肝癌、子宫内膜癌、卵巢癌等多种细胞类型)的人重组LFA3-Fc多肽。试验证明，在体外，这些分泌表达的人重组LFA3-Fc多肽可以有效地抑制淋巴细胞的增殖。同时还证明，由本发明重组腺病毒制备成的抗银屑病注射剂，在体内转染细胞后能够使机体长时间持续表达高水平的人LFA3-Fc并保持完整的生物活性，能有效治疗银屑病。本发明还提供一种治疗银屑病的方法，该方法包括给患者施用有效量的本发明的重组复制缺陷型病毒粒子。对于作为本发明优选的药物组合物形式的注射剂，可以采用肌肉注射、静脉注射的方式给药，给药剂量可以根据一些已知的因素，诸如银屑病病情严重程度，病人体重，性别、年龄、给药方式等由医师容易地加以确定。例如可以一般可以在3xl()9-3xl0"范围内，优选在3><101()-3><1013范围内变动。本发明的抗银屑病注射剂可以弥补直接蛋白输注的药物体内稳定性差等缺陷，能增大给药时间的间隔、大大减少给药量、减轻患者经济负担并提高患者的生活质量。本发明的详细描述对于所用的人融合基因LFA3-Fc，可以采用现有技术中可得到的融合LFA3-Fc，也可以按照如下程序自行制备a.合成下列PCR引物，分别扩增人LFA3的胞外基因序列和人IgGl的Fc片段的基因序列Pl(SEQIDNo.2):5'CTCAAGCTTGCTAGCATGGTTGCTGGGAGCGACGC3'P2(SEQIDNo.3):5'ACGCGTCGACATAAAGAAAGAACTTCATGG3'P3(SEQIDNo.4):5'ACGCGTCGACAAAACTCACACATGCC3'P4(SEQIDNo.5):5'CGGGATCCTCATTTACCCGGAGACAGG3"b.将人LFA3的胞外段的基因序列构建入克隆载体；c.将人IgGl的Fc片段的基因序列构建入克隆载体得到LFA3-Fc融合基因。上述过程的一个具体例子包括，合成序列SEQIDNO.2和SEQIDN0.3的PCR引物(具有酶切位点序列)，以PCR方法扩增人LFA3胞外段cDNA;将片段插入克隆载体pUC18构建成pUC18-L;合成序列SEQIDN0.4和SEQIDNO.5的PCR引物(具有酶切位点序列)，以RT-PCR方法从人淋巴细胞总RNA中扩增人IgGl的Fc片段的cDNA;再将Fc片段的cDNA插入pUC18-L，构建成其中含有人LFA3-Fc融合基因的pUC18-LF。此时得到的人LFA3-Fc融合基因具有如SEQIDNO.l所示的核苷酸序列。上述过程所使用的克隆载体为重组DNA技术中最常用的载体，例如有质粒、噬菌体X，柯斯质粒和噬菌体M13，并且这些载体的受体细胞都是大肠杆菌。对于本发明中所使用的克隆载体没有特别限定，只要其能够在大肠杆菌中自主复制、能连同所带的外源DNA—起复制、以及易于同细菌DNA分开并加以纯化即可。在一个优选的实施方案中，所使用的克隆载体为pUC18。然后，将克隆到的人融合基因LFA3-Fc构建入穿梭载体，再与包含病毒基因组的质粒共转化宿主细胞例如大肠杆菌细胞，筛选出本发明的重组复制缺陷型病毒pAd-LF。关于宿主细胞，可用于实施本发明的宿主细胞可以是真核或原核细胞，例如细菌、酵母、或者是动物细胞。优选所述的宿主细胞是真核细胞。更进一步的，所述的宿主细胞是293细胞。本发明之所以采用293细胞是因为该细胞株易于转染，并且三种大规模培养方式(贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养)均可用于293细胞的培养。关于共转化的方法可分为两类，一类是直接基因转移技术，例如基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，其中以基因枪转化法为代表；另一类是生物介导的转化方法，例如农杆菌介导和病毒介导的转化方法。在本发明中，对于共转化的方法没有特别的限定。在一个优选的实施方案中，可以采用电穿孔的方法。将感染的宿主细胞培养后，通过离心分离得到所述的复制缺陷型病毒。通过将该复制缺陷型病毒与例如无菌注射用水混合并调节pH值便得到本发明第三方面的抗银屑病组合物的注射液。在一个优选的实施方案中，每毫升该注射剂含有3xl0义3x1013病毒粒子(VP)的病毒颗粒。本发明第四方面提供一种制备抗银屑病药物组合物的方法。根据本发明的一个具体实施方式，提供了一种制备注射剂的方法，包括以下步骤a.在无菌条件下取注射用水，按每毫升3xl01Q-3xl013VP加入复制缺陷型病毒；b.在无菌条件下将步骤a所述原料混合均匀，调节pH值至7.5-8.5;c.将步骤b产物无菌过滤后分装成注射剂。图1是重组腺病毒(Ad-LF)的构建流程图。图2是PCR产物的1%琼脂糖电泳图谱。其中M为lkb+lOObpDNA梯带(GBICO)，1为PCR产物。图3是RT-PCR产物的1%琼脂糖电泳图谱。其中M为lOObpDNA梯带(GBICO)，1为RT-PCR产物。图4是pAd-LF的酶切鉴定结果(PacI)的1%琼脂糖电泳图谱。其中M为lkbDNA梯带(GIBCO);1为筛选出的单克隆的编号。图5是PCR扩增鉴定重组腺病毒(PL1+PL2)的1%琼脂糖电泳图谱。其中M为100bpDNA梯带(GBICO)，C为阳性对照(pAd-LF)，l-6分别表示l-6号空斑。图6是PCR扩增鉴定重组腺病毒(PE1+PE2)的1%琼脂糖电泳图谱。其中M为100bpDNA梯带(GBICO)，C为阳性对照(pAd-LF)，l-6分别表示l-6号空斑。图7是Hela细胞的WesternBlot鉴定结果，其中R为还原条件，NR为非还原条件，蛋白质分子量标准采用RainbowMarker(GEHsdthcarc)o图8是病毒感染上清液对混合淋巴细胞增殖的抑制实验，其中，Ad-Null为空载腺病毒的感染上清液，Ad-LF为重组腺病毒Ad-LF的感染上清液。具体实施方式以下结合附图通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。实施例1人LFA3基因的制备本实施例用PCR方法从模板质粒pORF5-LFA-3(购自Invivogen公司)扩增出人LFA3胞外段(aa.1-120)cDNA片段。根据人LFA3基因序列设计并合成PCR引物，为了能将PCR产物直接插入克隆载体-pUC18(购自Invitrogen公司)并与其后的IgG1Fc片段融合，在5'引物中设计入HindIII和NheI酶切位点，3'引物中设计入Sall酶切位点，引物序列如下Pl(SEQIDN0.2):5'CTCAAGCTTGCTAGCATGGTTGCTGGGAGCGACGC3"P2(SEQIDNO.3):5'ACGCGTCGACATAAAGAAAGAACTTCATGG3'PCR条件如下PCR反应混合物在94'C变性5分钟后，按下列条件进行反应94'C变性30秒；55"C退火30秒；72T延伸30秒。反应30个循环。然后72X:再延伸12分钟。反应完成后，1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果表明扩增出与预期片段大小一致的380bp左右的DNA片段(见图2)。构建入pUC18，得到pUC18-L，测序结果表明所得到重组质粒中的目的基因与发表的人LFA3胞外段序列完全一致。实施例2人LFA3-Fc融合基因的制备本实施例用RT-PCR方法从人淋巴细胞总RNA中扩增出人IgGlFc(aa.247-473)的cDNA片段。根据人IgGl基因序列设计并合成RT-PCR引物，为了能将PCR产物插入LFA3片段后，发明人在5'引物中设计入SalI位点，在3'引物中设计入BamHI位点，引物序列如下P3(SEQIDN0.4):5'ACGCGTCGACAAAACTCACACATGCC3'P4(SEQIDN0.5):5'CGGGATCCTCATTTACCCGGAGACAGG3'RT-PCR条件如下RT-PCR反应混合物在5CTC变性30分钟后，按下列条件进行反应逆转录反应94'C变性30秒；50"C退火30秒；68r延伸1分钟。反应IO个循环。PCR反应94。C变性30秒；52'C退火30秒；68'C延伸1分钟。反应25个循环。然后68"C再延伸7分钟。反应完成后，1%琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物，结果表明扩增出与预期片段大小一致的720bp左右的DNA片段(见图3)。构建入pUC18-L，得到pUC18-LF，测序表明所得到重组质粒中的目的基因与预计的人LFA3胞外段序列(aa.l-120)与人IgGlFc(aa.247-473)融合基因的序列完全一致。实施例3重组腺病毒Ad-LF的构建及筛选先将克隆到的人LFA3-Fc融合基因构建入pAdenoVator-CMV5穿梭载体，再与包含腺病毒基因组的质粒pAdenoVatorAElE3共转化大肠杆菌BJ5183，筛选重组子，再转染293细胞，筛选重组腺病毒。1、将克隆到的人LFA3-Fc融合基因构建入pAdenoVator-CMV5穿梭载体后，再与包含腺病毒基因组(E1，E3缺失)的环状质粒pAdenoVatorAElE3(购自Qbiogene公司)用常规的电穿孔方法共转化大肠杆菌BJ5183(购自Qbiogene公司)，筛选重组子-pAd-LF，进行鉴定。结果表明筛选到了重组位点位于复制子和右臂之间的重组子pAd-LF(见图4)，可切出大小为4.5kb的片段。2、使用常规共转染方法将线性化的重组质粒pAd-LF与脂质体Lipofectamine(购自Invitrogen公司)共转染293细胞(购自ATCC)，筛选重组腺病毒Ad-LF。14天后，孵育的培养皿共出现6个空斑，分别提取每个空斑进行扩增。3、抽提腺病毒DNA，通过PCR扩增人LFA3-FcDNA片段鉴定是否为重组腺病毒，同时鉴定腺病毒特征性的E2B区片段。扩增人LFA3-FcDNA片段的引物为5'引物P1:5'CTCAAGCTTGCTAGCATGGTTGCTGGGAGCGACGC3'3'引物P4:5'CGGGATCCTCATTTACCCGGAGACAGG扩增腺病毒特异的E2B区的引物为5，引物PE1:5'TCGTTTCTCAGCAGCTGTTG3'3'引物PE2:5'CATCTGAACTCAAAGGGTGG3'经鉴定，挑取的空斑均插入人LFA3-FcDNA片段(1060bp左右的条带，见图5);挑取的空斑均扩增出腺病毒E2B阳性条带(860bp左右，见图6)。4、用筛选到的病毒感染Hda细胞，取培养上清用常规ELISA方法鉴定LFA3-Fc融合蛋白的表达情况，表达结果见表1。表1各空斑LFA3-Fc融合蛋白的表达情况Ad-LF空斑LFA3-Fc融合蛋白表达情况(A450)腦(xl)10(xl0)l(xlOO)1#2.04051.54350.16352#2.20851.62150.17353#1.60651.28950.12154#1.98751.12350.11755#2.01151.52150.15456#2.13451.67450,1475从测定结果看来，6个空斑均能表达融合蛋白LFA3-Fc，2#空斑表达最高。我们选择表达最高的空斑Ad-LF-2#，命名为Ad-LF。实施例4重组腺病毒的扩增和纯化将Ad-LF病毒种子液逐级扩增，最终感染5><106个293细胞，培养4872小时直至出现完全细胞病变(cytopathiceffect,CPE)，离心收集细胞，细胞沉淀重悬于100ml含5%FBS(胎牛血清)的DMEM培养基，-20。C/37。C反复冻融三次，离心去细胞碎片，上清即为病毒裂解液，备用。采用常规两步氯化铯(CsCl)密度梯度超离心法纯化Ad-LF，第一步采用不连续CsCl梯度去除大部分的细胞碎片以及缺陷的病毒颗粒(即不具备感染活性的病毒颗粒)，第二步采用连续CsCl密度梯度彻底将具备感染活性的病毒颗粒与缺陷的病毒颗粒区分开，最后再通过透析脱盐，去除CsCl，得到重组人LFA3-Fc腺病毒-Ad-LF。实施例5重组腺病毒Ad-LF对不同细胞的感染活性及WesternBlot鉴定我们将Ad-LF以不同的MOI值(multiplicityofinfection,感染复数)感染不同的哺乳动物细胞，包括人肺癌细胞株A549、人宫颈癌细胞株HeLa、人肝癌细胞株HepG2、人卵巢癌细胞株SKOV3，分别用ELISA和WesternBlot方法检测人LFA3-Fc融合蛋白的表达情况。分别将人肺癌细胞株A549、人宫颈癌细胞株HeLa、人肝癌细胞株HepG2、人卵巢癌细胞株SKOV3(购自ATCC公司)接种于6孔板，将实施例4所得的重组腺病毒Ad-LF以不同的MOI值0、5、10、50进行感染，培养48小时后，取上清液用试剂盒(购自Chemicon公司)检测LFA3-Fc的表达情况，结果见表2。表2不同细胞感染不同量的Ad-LF的表达情况<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>结果表明，重组腺病毒Ad-LF能感染包括肺癌、肝癌、子宫内膜癌、卵巢癌在内的多种细胞类型，表达并分泌人LFA3-Fc融合蛋白，说明Ad-LF具有较广谱的感染范围及较高的表达活性。同时以兔抗人LFA3抗体(1:500)(购自Chemicon公司)为一抗、羊抗兔IgG-HRP(购自DAKO公司)为二抗(1:3000)，用常规WesternBlot法进一步鉴定Hela细胞的表达产物是否与预计的相同。结果见图7，结果表明Hela细胞特异地表达人LFA3-Fc融合蛋白，分别用还原和非还原条件电泳，还原条件得到杂交条带与预计的一致(60kDa左右)，非还原条件的杂交条带为二聚体形式(119kDa左右)，均很弥散，呈现典型的糖蛋白电泳图谱。实施例6重组腺病毒Ad-LF抑制淋巴细胞增殖的活性测定在体外，我们通过混合淋巴细胞增殖的抑制试验来检测重组腺病毒Ad-LF表达的融合蛋白的活性。首先，Ad-LF感染Hela细胞(MOhl0)制备病毒感染上清液，备用。淋巴细胞分离液(Ficoll)分离的人淋巴细胞分为两组，一组用RPMI1640洗涤两次，重悬于含10%FBS的RPMI1640中，得到终浓度为3xl06/ml的细胞悬液，作为反应细胞(respondercells);另一组用2000rads-射线处理得到终浓度为3xl06/ml的细胞液，作为刺激细胞(stimulatorcells)。反应细胞和刺激细胞按1:1的比例加入圆底96孔板(1.5xl0V孔细胞)，每孔加入50m1病毒感染上清液(等二倍稀释)，置于37°〇，5。/。C02孵箱孵育5天。第五天，每孔加入1pCi的&标记的胸腺嘧啶，孵育15小时后，用多头细胞收集器收集细胞，用液闪测定仪测定每孔相对放射性(以CPM表示)。结果如图8所示，结果表明LFA3-Fc融合蛋白浓度与淋巴细胞增殖的抑制之间存在剂量依从性，在l:4稀释浓度时对淋巴细胞细胞的抑制达到50%;而空载腺病毒Ad-Null感染上清则无抑制效应。这说明了Ad-LF表达的LFA3-Fc融合蛋白在体外的确可以显著地抑制淋巴细胞的增殖。实施例7重组腺病毒Ad-LF注射剂的制备在无菌条件下取500ml注射用水，加入实施例4所得的重组腺病毒Ad-LF(3xl010-3xl013VP)、Tris0.484g、MgCl20.076、蔗糖16g，混合均匀，再加注射用水至总体积1000ml，同时用HCl调节pH值至8.0。无菌过滤后分装成lml/支的重组腺病毒Ad-LF注射齐U，于-2(TC保存。综上，由本发明中的人LFA3-Fc融合基因构建的重组腺病毒Ad-LF能感染多种类型的细胞，并大量稳定地分泌表达高活性的重组人LFA3-Fc多肽。由本发明的重组腺病毒制备的抗银屑病注射剂，能使机体持续高水平的表达具有完整生物活性的重组人LFA3-Fc多肽。这弥补了蛋白输注人LFA3-Fc药物体内稳定性差、有效浓度持续时间十分短暂的局限，能大大减少给药量、降低用药成本、减轻患者负担，同时还提高了患者的生活质量，具有很好的市场前景。以上的较优的具体实施方式是对本发明作进一步的举例说明，但并非对本发明范围的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种变型或改进，只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的精神及所附上的权利要求书定义的范围之内。序列表〈110>〈120〉一种重组复制缺陷型病毒、含有该病毒的药物组合物及其应用〈130〉F卜070270-59<160>7〈170>Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉1044<212>隨〈213〉重组人LFA3-Fc融合基因<400>1atggttgctgggagcgacgcggggcgggccC3CtgCtttggtttcatc3gctgtttttccgtaactttccatgtaccaagcaatgtgcctgat3a3gttgcagsactggaaasttctgaagttt3ttt3g3C3CtgtgtC3ggt3gCCtCgatg3gtatg3aatggaatcgccaaat3ttg3caaa3ctcscacstgcccaccgtgccc3ttCCtcttCCCCCC33a3CCC33gg3C3CCtgCgtggtggtgg3Cgtg3gCC3Cg33g3CggCgtgg3ggtgC3t33tgCC3Sg3C333gcgtgtggtcagcgtcctcscCgtCCtgC3Ctgcaaggtctccaac3a3gccctcccsgccctgggggtcctcagcgtggtctgcctgctg60caacaaatatatggtgttgtgtatgggaat120ttaaaagaggtcctatggaaaaaacaaaag180ttcagagctttctcatcttttaaaastagg240actatctacaacttaacatcatcagatgaa300actgataccatgaagttctttctttatgtc360gcacctgaactcctgggaggaccatcagtc420ctcstgatctcccggscccctgsggtC3ca480CCtg3ggtC33gttC33Ctggt3Cgtgg3C540ccgcgggaggagcagtacaacagcacgtac600caggactggctgaatggcaaggsgtacasg660cccatcgagaaaaccatctccassgccaaa720司有物力跃明怀东磊光太为凯勇立仁绍亚红波琦莞..........东韩何阳杨张钟闻李何唐gggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaag780aaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag840tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactcc900gacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcagggg960aacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagc1020ctctccctgtctccgggtaaatga1044<210>2<211>35〈212〉瞧〈213〉引物1(P1)〈400>2ctcaagcttgctagcatggttgctgggagcgacgc35<210>3〈211〉30〈212〉陽〈213〉引物2(P2)〈400>3acgcgtcgacataaagaaagaacttcatgg30<210>4<211>26〈212>DNA<213>引物3(P3)<400>4acgcgtcgacaaasctcacacatgcc26〈210〉5<211>27〈212〉瞧〈213〉引物4(P4)〈400>5cgggatcctcatttacccggagacagg27<210>6〈211>20〈212〉DNA<213>引物PE1<400>6tcgtttctcagcagctgttg20<210>7<211>20<212>DNA〈213>引物PE2〈400>7catctgaactcaaagggtgg20权利要求1.一种重组复制缺陷型病毒，其特征在于该复制缺陷型病毒包含有启动子控制下的人融合基因LFA3-Fc。2.根据权利要求1所述的复制缺陷型病毒，其特征在于，所述的人融合基因LFA3-Fc是由人的LFA3胞外可溶部分与人IgG的Fc片段融合形成的。3.根据权利要求2所述的复制缺陷型病毒，其特征在于，所述的人融合基因LFA3-Fc的核苷酸序列如SEQIDNO.l所示。4.根据权利要求1到3中任一项所述的复制缺陷型病毒，其特征在于所述复制缺陷型病毒是复制缺陷型腺病毒、复制缺陷型单纯疱疹病毒或复制缺陷型新城疫病毒中的任何一种。5.根据权利要求4所述的复制缺陷型病毒，其特征在于，所述的复制缺陷型病毒为5型腺病毒。6.—种含有权利要求1到6中任一项所述复制缺陷型病毒的宿主细胞。7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于所述宿主细胞为293细胞。8.—种权利要求1到6中任一项所述的重组复制缺陷型病毒的制备方法，该方法包括将人融合基因LFA3-Fc插入复制缺陷型病毒基因组中并置于启动子控制下的步骤。9.一种药物组合物，其特征在于由权利要求1到6中任一项所述的复制缺陷型病毒和药学上可接受的辅料构成。10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于所述的药物组合物为注射液，每毫升注射液含有3xl0夂3x1013病毒粒子。11.权利要求1到6中任一项所述的复制缺陷型病毒用于制备抗银屑病的药物的应用。全文摘要本发明涉及一种重组复制缺陷型病毒，该复制缺陷型病毒包含有启动子控制下的人融合基因LFA3-Fc，其中该人融合基因LFA3-Fc是由人的LFA3胞外可溶部分与人IgG的Fc片段融合形成的。本发明还涉及一种抗银屑病的药物组合物，该药物组合物由所述的复制缺陷型病毒和药学上可接受的辅料组成。根据本发明方法制成的抗银屑病药物组合物注射剂可以实现在体内长时间持续表达目的蛋白，因而可以减少给药次数。文档编号A61P17/00GK101113459SQ200710130548公开日2008年1月30日申请日期2007年7月16日优先权日2007年7月16日发明者凯何,波何,琦唐,张仁怀,李红光,杨立明,钟绍东,闻亚磊,勇阳,韩为跃申请人:东莞太力生物工程有限公司