偏诺皂苷在制备止血药物中的应用的制作方法

文档序号:1133475阅读:196来源:国知局

专利名称::偏诺皂苷在制备止血药物中的应用的制作方法
技术领域
:本发明涉及一种化合物偏诺皂苷在制药领域中的新用途。
背景技术
:偏诺皂苷(pennogenin)化合物,结构通式为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>通式中R2=H,CH3,CH2OH,=CH2X=0,N,Sd7-OH为R-构型或S-构型Rl二由单糖、双糖、三糖、四糖、五糖、六糖、七糖所组成的各种型式的直链糖链或支链糖链,其糖链组成糖的类型包括P-D-葡萄糖(!3-D-glucose)、a-D-葡萄糖(a-D-glucose)、a-L-鼠李糖(a-L-rhamnose)、(3-D-半乳糖(p-D-galactose)、a-D-半乳糖(a-D-galactose)、卩-D-甘露糖(P-D-mannose)、a-D-甘露糖(p-D-mannose)、a-D-阿拉伯糖(a-D-aradinose)、(3-D-阿拉伯糖(a-D-aradinose)、a-D-木糖(a-D-xylose)、卩-D隱木糖(a-D國xylose)、a-D-核糖(a-D-ribose)、(3-D-核糖(卩隱D-ribose)、a-D-来苏糖(a-D-lyxose)、P-D-来苏糖(p-D-lyxose)、a-L-夫糖(a-L-fUcose)。偏诺皂苷在植物界中分布并不十分广泛,含量较低。中国专利申请号02150907.7公开了一种"17-羟基OH27]甾体化合物、合成方法及其用途",能用于偏诺皂甙元或二氢偏诺皂甙元的合成。
发明内容本发明的目的在于提供偏诺皂苷化合物在制药中的新的应用。本发明涉及偏诺皂苷作为制备治疗全身性出血的药物中的应用。本发明涉及偏诺皂苷作为制备治疗各种内脏出血的药物中的应用。本发明涉及偏诺皂苷作为制备治疗妇女月经过多的药物中的应用。本发明涉及偏诺皂苷作为制备治疗妇女人工流产后出血过多的药物中的应用。本发明涉及偏诺皂苷作为制备预防各种出血危象的药物中的应用。本发明涉及偏诺皂苷作为制备白血病人化疗后出血倾向治疗的药物中的应用。本发明涉及偏诺皂苷作为制备癌症病人化疗后出血倾向治疗的药物中的应用。本发明涉及偏诺皂苷作为制备辐射、化学因素对人的血小板伤害所致出血倾向治疗的药物中的应用。为了更好地理解本发明的实质,下面将用偏诺皂苷的药理试验及结果来说明其在制药领域中的新用途。用基因芯片筛选功能基因改变并用常规实验验证活性,我们发现4个活性较强的偏诺皂苷化合物如下X=0,R2=H,[I]Rl二3"Oa-L-rha-py(1—4)~a-L—rha-py(l—4)—[a—L-rhapy(l—2)〗一p-D-glcpy[II]Rl=~3—Oa—L-rhapy(1—2)L—rhapy(1—4)]—J3-D~glcpy[III]R卜3-0-a—L-ara-fUra-(1—4)—[a-L一rha-py(l—2)]-(3-D~glc.py[IV]R卜3吞a—L—rha.py(l—2)—|3-D~glc.py我们发现和验证了其止血作用与基因IL-11显著表达上调有关。上调IL-11的基因表达,促进机体产生内源性IL-ll,不但可以促进血小板的生成,还可以增强血小板的功能;血小板生成周期约为15天,因此,在15天前后仍有强较作用,有效作用时间长。IL-11的生理、药理作用为高效率促进地骨髓中造血祖细胞、干细胞及幼稚血小板分化、成熟,并动员至外周血,临床上可用于癌症患者化、放疗后迅速恢复外周血小板数量以利于恢复人体正常止血功能,以及其它严重性血小板数量减少,血小板功能降低所致出血倾向。总而言之,IL-ll对血小板减少和增强血小板止血功能具有明确而强大的治疗作用。基因芯片法检测到的IL-ll上调表达Balb-c纯系小鼠给予含偏诺皂苷类化合物的药物,一定天数后从小鼠骨中提取总RNA,分离mRNA,逆转录成cDNA,给药组着Cy-3荧光(黄色),生理盐水组着Cy-5荧光(红色),混匀后,点于基因芯片上,玻片密封,80°C变性,42°C恒温杂交三小时,洗涤,晾干后,芯片扫描仪扫描,软件分析Cy-3和Cy-5两种荧光信号强度和比值,根据参照基因调整原始信号。荧光比值在1.8以上提示有很强的生物活性。结果见表l。表1偏诺皂苷类化合物对细胞因子IL-]1的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>它细胞因子的表达已知的最高也只有3.12倍,说明其作用强,专一性非常好。IL一ll作用于骨髓巨核系造血细胞,增强血小板功能,促进血小板生成。偏诺皂苷类化合物可以立即刺激IL-ll的基因表达(几小时之内就已检出其变化),进而促进高活性细胞因子IL-ll的生成。基因表达的改变又进一步从整体动物实验得到验证。偏诺皂苷类化合物体内止血作用一、偏诺皂苷类化合物口服给药对小鼠外周血PLT数量的影响方法Balb/c小鼠40只,18—22g雌性。按体重分成四组,分别为正常对照、偏诺皂苷类化合物10mg/kg、偏诺皂苷类化合物20mg/kg、偏诺皂苷类化合物40mg/kg,一日分为两次口服给药,共9次四天半。于给药前、给药后1天、3天、5天、7天、10天、14天割尾取血20ul,F—820血细胞计数仪检测血象。见表2和附图。表2偏诺皂苷类化合物口服给药对小鼠外周血血小板数量的影响(n=10)生理盐水组偏诺皂苷偏诺皂苷偏诺皂苷<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>结果血小板的主要功能为参与止血过程。血小板数量和功能障碍是导致出血的主要原因。表2示偏诺皂苷类化合物口服给药对大鼠外周血血小板数量的影响。从大的趋势上可以看出,给药三天后,血小板即己明显较生理盐水组升高,表明偏诺皂苷类化合物能迅速动员储存血小板进入外周血,参与止血等功能;至第七天,此时已停药四天,偏诺皂苷组仍然较生理盐水组明显为高;第十天时偏诺皂苷组与生理盐水组基本相当;但至第十四天,偏诺皂苷组竟然较生理盐水组还有一个血小板明显升高的过程。实验表明,一定剂量的偏诺皂苷类化合物口服给药可以通过刺激内源性血小板生成因子,增加大鼠外周血血小板数量,以10mg/Kg和20mg/Kg剂量疗效较好。二、偏诺皂苷口服给药对2xl(XVol/LADP诱导血小板聚集作用的影响动物分组Wistar大鼠16只,分为四组,分别为正常组、10mg/Kg组、20mg/Kg组和40mg/Kg组,每日给药两次,共7次,末次给药后一小时麻醉取血。血小板分离参考文献iWistar大鼠ip戊巴比妥40mg/Kg麻醉,用无菌注射器心脏取血约8ml,注入含3.8%柠檬酸钠(体积比l:10)的塑料管中,摇匀以防血液凝固。于室温140g离心IO分钟,上层乳浊液为富血小板血浆(PRP)。在20pM腺苷酸存在条件下,室温1500g离心10分钟。并用含20pM腺苷酸的HEPES-Tyrode's缓冲液(137mMNaCl,2.7mMKC1,lm:MMgCl2,3.8mMNaH2P04,5.5mMGlucose,3.8mMHEPES,0.35%BSA,PH6.5)洗涤。最后使血小板重新悬浮于HEPES-Tyrode's缓冲液中(PH7.35)。血小板计数用F—820血细胞计数仪计数,HEPES-Tyrode's缓冲液(PH7.35)调整血小板为3xl0Vml。图形测量Chronolog血小板聚集仪检测。样品于37°C保温2分钟,放入检测器。PRP总体积500ul,正常情况下每一样本均加入1.7mMCaCl2,再加10ulADP(终浓度2xl0—4mol/L)诱导聚集。然后记录5分钟图形,读取1分钟、2分钟、3分钟、5分钟及最大的聚集率。表3示偏诺皂苷类化合物口服给药三天后对2xl(^mol/LADP诱导血小板聚集作用的影响。ADP200^mol/L对大鼠血小板产生很强的聚集效果,聚集后不发生解离现象,从表3中看出,给予偏诺皂苷类化合物三天后,同生理盐水组相比,大鼠血小板5分钟聚集率在各剂量组均有显著增强,其中以中剂量组效果最好,l分钟聚集率也有增加,中剂量组与生理盐水组有明显差异。表4示偏诺皂苷类化合物口服给药三天后对2xl(T5mol/LADP诱导血小板聚集作用的影响。ADP20^mol/L也可诱导血小板聚集,但在刺激后5分钟内全部解聚。结果看出,同生理盐水组相比,中剂量组l、2、3分钟和最大聚集率显著增强,大剂量组2和3分钟聚集率明显增加,小剂量组同生理盐水组没有明显差异。这些结果表明,偏诺皂苷类化合物口服给药不但可以增强ADP诱导的血小板聚集,而且通过促进血小板造血祖细胞的成熟,聚集功能增强是偏诺皂苷类化合物发挥止血作用的又一影响因素。表3偏诺皂苷类化合物口服给药对血小板聚集功能的影响(ADP2X10—4mo]/L)_(给药二天,第三天测试).分组l分钟聚5555分钟聚集强S"~~生理盐水组29.78±3.5644.11±4.461Omg/Kg组32.54±3.5550.75±4.35**20mg/Kg组39.25±4.95**57.75±8.06**40mg/Kg纟且34.33±2.8450.42±5.04**给药组与生理盐水组比较,*P<0.05,**P<0.0i表4偏诺皂苷类化合物口服给药对血小板聚集功能的影响(ADP2XlCT5niolZL)(给药三天,第三天测试)分组l分钟2分钟3分钟最大聚集率5分钟生理盐水27.20±3.8324.40±5.132.06±3.7130.00±3.390.00±0.0010mg/Kg组28.00±3.2026.33±8,967.00±6.8631.44±3.680.00±0.0020mg/Kg组32.60±3.78*36.80±4.76林15.6±9.18**37.8±4.32**0.00±0.0040mg/Kg组31.80±2.4934.20±6.27**13.7±6.31**34.40±5.990.50±1.57给药组与生理盐水组比较,*P<0.05,**P<0.01三、偏诺皂苷对出血时间和出血量的影响取昆明种小鼠60只,体重20-25g雌雄兼用,随机分成四组。正常对照组、阳性对照组、受试药低剂量组、受试药高剂量组灌胃给药后2小时测定出血时间、出血量。实验时将小鼠放入特制的固定器中,然后剪去小白鼠尾部lcm,用滤纸每隔30秒吸取鼠尾部自行流出的血,记录出血时间,并把取血的滤纸用碱液浸泡,用751分光光度仪测透光率(T),T值越大表明出血量越小。结果见表5。表5偏诺皂苷对小白鼠出血时间和出血量的影响组别剂量动物数(只)出血时间(秒)X土SD透光率(T)X土SD生理盐水组云南白药组偏诺皂苷偏诺皂苷3g/kg6mg/Kg12mg/Kg15151515518.4±32.2213.5±22.9**212.5±25.5**138.9±17.4承*0.613±0.0610.886±0.053**0.864±0.038**0.931±0.019**给药组与生理盐水组比较,经T检验统计处理^P0.01实验结果表明偏诺皂苷能非常显著的縮短出血时间、减少出血量。四、偏诺皂苷对凝血时间的影响取小鼠60只,雌雄各半,体重20-25g,随机分成四组。生理盐水组、阳性对照组(云南白药)、受试药低剂量组、受试药高剂量组灌胃给药后2小时用毛细管法、玻片法测定凝血时间。结果见表6。表6偏诺皂苷对小鼠凝血时间的影响组别剂量动物数(只)'凝血时间(秒)毛细管法X土SD玻片法生理盐水组云南白药组3gZkg2020110.6±12.460.9±7.9林170.4±10.0104.6±8.1**偏诺皂苷高偏诺皂苷低6mg/Kg12mg/Kg2072.0±6.7林2059.0±5.2**121.8±11.6林101.6±10.4**给药组与生理盐水组比较,经T检验统计处理^P0.01实验结果表明偏诺皂苷能非常显著的縮短小鼠凝血时间。五、偏诺皂苷对环磷酰胺致出血倾向的治疗作用ICR小鼠40只,?3兼用,均分成4组(r^l0),即生理盐水组、造模组、12mg/Kg组和6mg/Kg组,口服给药,每天l次。第0、5、10日除生理盐水组外,其它各组小鼠分别腹腔注射环磷酰胺80mg/kg,然后继续给药3天。于末次给药后2小时用毛细管法、玻片法测定凝血时间。结果见表7。_表7偏诺皂苷对环磷酰胺所致出血倾向的治疗作用_X士SD组别剂量动物数(只)毛细管法玻片法生理盐水组/2095.4±11.1150.9±13.1环磷酰胺组/20165.8±26.4273.5±32.4偏诺皂贷6rag/Kg20134.2±15.7*210.5±18.5*偏诺皂苷12mg/Kg20118.5±12.6**182.6±19.3**给药组与环磷酰胺组比较,经T检验统计处理*P<0.05**P<0.01实验结果表明偏诺皂苷能非常显著的縮短环磷酰胺所致出血倾向的凝血时间。六、偏诺皂苷对苯所致出血倾向的治疗作用昆明种小鼠48只,?3兼用,均分成4组(11=12),除生理盐水组外,其它组小鼠皮下注射苯0.5ml/kg,连续12天,造模的当日,同时口服给药,每天1次,共18天,末次给药后lh用毛细管法、玻片法测定凝血时间。结果见表8。表8偏诺皂苷对苯所致出血倾向的治疗作用组别动物数(只)凝血时间(秒)毛细管法X士SD玻片法生理盐水组苯组偏诺皂苷偏诺皂苷6mg/Kg12呢/Kg2020202086.1±10.4200.6±33.6145.3±16.9*123.1±14.5**127.8±11.2289.5±37.1225.5±23.5*175.2±23.3林给药组与苯组比较,经T检验统计处理*P<0.05**P<0.01实验结果表明偏诺皂苷能非常显著的縮短苯所致出血倾向的凝血时间,七、偏诺皂苷对辐射所致白细胞减少和凝血功能降低的治疗作用为研究对急性放射病的治疗作用,观察了不同剂量的偏诺皂苷对6.5Gy照射小鼠造血恢复的影响。照射时间为给药第1天。予受照小鼠每日偏诺皂苷1、5及20tng/Kg治疗,连续15天。末次给药后lh用毛细管法、玻片法测定凝血时间。结果见表9。表9偏诺皂苷对辐射所致出血倾向的治疗作用<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实验结果表明偏诺皂苷能非常显著的缩短辐射所致出血倾向的凝血时间。其中以20mg/Kg的效果最好。以下八、九说明偏诺皂苷类化合物止血机理与凝血酶、血小板膜糖蛋白无关。八、诺皂苷类化合物口服给药对大鼠出凝血指标的影响激活部份凝血酶时间(APTT)是测定内源凝血系统较为敏感的筛选试验,血浆凝血酶原时间(PT)是外源凝血系统常用筛选方法之一,凝血酶时间(TT)是检测血浆纤维蛋白原含量变化的一种简便方法。表一比较了偏诺皂苷类化合物口服给药后大鼠APTT、PT和TT的变化,结果显示,同生理盐水组相比,各实验组APTT、PT和TT没有明显縮短,说明偏诺皂苷类化合物对机体内源性和外源性凝血机制无显著影响,其本身也不具有凝血因子的作用。表10偏诺皂苷类化合物口服给药后大鼠凝血参数TT、PT、APTT的改变<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>九、偏诺皂苷类化合物对大鼠血小板膜糖蛋白GpIIIa(CD61)、GpIb(CD42b)和GpIa(CD49a)表达的影响偏诺皂苷类化合物对大鼠血小板膜糖蛋白GpIIIa(CD61)、GpIb(CD42b)和GpIa(CD49a)表达的影响血小板膜糖蛋白Ib-IX复合物(GPIb-IX)是血小板膜的主要糖蛋白之一,研究发现GPIb是vW因子和凝血酶的受体,与细胞膜骨架相连,参与血小板的粘附作用,对维系血小板结构的完整及细胞形态具有重要作用,CD42b是GPIb的抗体。应用流式细胞仪检测了人血小板GPIb的含量,发现加入ADP(200pMol/L)明显增加GPIb的表达,而加入偏诺皂苷类化合物至25pg/ml,也不能明显增加GPIb的含量,说明偏诺皂苷类化合物对人血小板GPIb的表达没有明显的调节作用。GPIIb-IIIa是血小板上含量最多的膜糖蛋白,GPIIb与GPIIIa在钙的参与下以1:1的比例构成复合物。GPIIb-IIIa是纤原受体,一个纤原分子可以同时和至少两个GPIIb-IIIa结合,血小板通过各自表面的GPIIb-IIIa与纤原结合而聚集成团。在正常循环中的血小板不能与血浆纤原结合,只有血小板被激活时,暴露出GPIIb-IIIa上的纤原结合部位,与纤原结合,介导血小板聚集。CD61是GPIIIa的抗体,应用流式细胞仪同批观察了人血小板GPIIIa的表达,发现ADP(200nMol/L)可使血小板GPIIIa的表达增加近一倍,偏诺皂苷类化合物也能使GPIIIa的表达增加,并有剂量效应,但最大增加幅度也不到10%,表明偏诺皂苷类化合物对GPIIb-IIIa调节作用不明显。原理ELISA法,第一抗体为小鼠抗人CD61(或CD42b、CD49b)IgG,第二抗体为抗小鼠IgG-FITC。标准曲线根据标准化包被IgG的微粒制作。流式细胞仪检测荧光细胞比例及荧光强度。方法人肘静脉取血,枸椽酸钠抗凝,分离PRP,PRP细胞数调整为30万/mm3。取PRP500ul分别与ADP、偏诺皂苷类化合物及溶剂对照各10ul37°C孵育5min。其余可参照说明书如下操作(1)25ulPRP用配套稀释剂稀释至200ul。分别加入20ul的anti-CD61-Mab、anti-CD42b-Mab、anti-CD49b-Mab,室温孵育10min,以结合相应抗原。(2)以上各试管及40ul标准化包被IgG微粒各加IgG-FITC20ul,室温孵育10min,以着色,再加稀释剂2ml。(3)选定"门",用标准化包被IgG微粒建立流式仪标准曲线(4)样本分析表11偏诺皂苷类化合物对大鼠血小板膜糖蛋白CD61、CD42b和CD49a表达的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>拟合曲线为Y=1040.32+90.62xr=0.9993P=7.34xl0-4本发明的优点在于本发明对已知化合物偏诺皂苷发掘了新的医疗用途,开拓了一个新的应用领域;安全性良好,药理作用强,预示着很好的药用前景。本发明的偏诺皂苷可从多种渠道获得,可从植物中提取,也可用合成、半合成的方法获得。可用单体或混合物,可以是盐或与其它分子的复合物。可单独作为药用有效成分,也可与其它无排斥作用的组分配伍。偏诺皂苷类化合物与其它直接促进血小板聚集的药物相比,具有以下不同,其它直接促进血小板聚集的药物第一人体服用后,体内血药浓度很低,往往达不到足够的浓度去直接影响血小板。第二直接刺激血小板聚集的药物使血液处于高聚状态,容易引起血管栓塞,导致其它更严重的疾病,临床应用受到极大限制。第三:直接刺激血小板聚集作用是短暂的。第四直接刺激血小板聚集不具有升高血小板数量作用。'而偏诺皂苷类化合物通过调控内源性巨核系细胞成熟因子IL-11增强机体止血功能。IL-ll是功能强大的血小板促进因子,促进血小板巨核系祖细胞的成熟,增强血小板聚集和止血功能,能够达到用量小,作用强,有效时间长,并且在增强血小板功能的同时,能够显著增加血小板数量。经由IL-11介导的止血功能,是全身性,强效,持久的。在10-15天仍有较强作用。因此提前服用偏诺皂苷类化合物可以有效预防出血。因此偏诺皂苷类化合物不仅如中国专利85108520中所述可以治疗子宫功能性出血,更可以相比较其它直接促进血小板聚集的药物而言更安全地用于全身性出血;预防各种出血危象,如运动损伤,血管内弥漫性溶血、手术中出血;各种内脏出血(如流行性出血热所致不可预见性内脏大出血);妇女月经过多、妇女产后出血过多,妇女计划生育措施所致出血;血小板减少所致出血倾向,包括癌症患者化疗、放疗后血小板减少所致出血倾向,白血病人化疗后血小板减少所致出血倾向,辐射、化学因素对人的血小板伤害所致出血倾向。使用方法偏诺皂苷类化合物直接剌激内源性IL-11生成,口服不会产生过敏反应,可以长期服用。除白血病、癌症需加倍剂量外,其它病例可根据病程缓急每日服用0.1-80mg/60Kg人体重量,优化的为0.5-5mg/60Kg。服用方式包括口服、血管内注射、血管外注射、透皮吸收、雾化吸入和直肠吸收。附图1是偏诺皂苷类化合物U服给药对小鼠外周血血小板数量的影响图。具体实施方式实施例1:由已知方法提取、制备偏诺皂苷。在中国专利85108520,03135590.0,02133381.5中分别介绍了醇法、水法、水-醇法三种提取和以及剂型制备方法。可将偏诺皂苷加入淀粉及相应的辅料,混匀后制粒,压制成片剂。实施例2:也可以参考中国专利02150907.7的合成方法,由薯蓣皂苷合成母核pennogenin或由剑麻皂苷元合成dihydropennogenin,再在3位接上恰当的糖链。可将偏诺皂苷加入淀粉及相应的辅料,混匀后装入胶囊中制成胶囊剂。权利要求1、偏诺皂苷在作为制备化疗后出血倾向治疗的药物中的应用。2、权利要求1所述的偏诺皂苷在作为制备白血病人化疗后出血倾向治疗的药物中的应用。3、权利要求1所述的偏诺皂苷在作为制备癌症病人化疗后出血倾向治疗的药物中的应用。4、权利要求l所述的偏诺皂苷在作为制备辐射、化学因素对人的血小板伤害所致出血倾向治疗的药物中的应用。全文摘要本发明涉及一种化合物偏诺皂苷在制药领域中的新用途。本发明涉及偏诺皂苷作为具有止血功能的药物中的应用。本发明涉及偏诺皂苷作为制备全身性出血、各种内脏出血、月经过多、预防各种出血危象、辐射、化学因素对人的血小板伤害所致出血倾向的药物中的应用。本发明对已知化合物偏诺皂苷发掘了新的医疗用途,开拓了一个新的应用领域。本发明的偏诺皂苷配制成的药物主要为口服剂型,即可单独作为药用有效成分,也可与其它无排斥作用的组分配伍。文档编号A61K31/7048GK101156866SQ20071018220公开日2008年4月9日申请日期2004年11月17日优先权日2004年11月17日发明者从玉文,有冯,唐书明申请人:云南白药集团股份有限公司
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