专利名称：通过抑制利于软骨形成的分子来治疗肌腱病变的制作方法
技术领域：
本发明的技术领域涉及通过降低受损腱中的软骨和/或纤维软骨产生 来治疗肌腱病变。本发明进一步涉及抑制与在受损腱中软骨和/或纤维软骨 产生相关的分子。
背景技术：
肌腱病变为用来描述多种类型的腱病症的通常术语。术语"腱炎"(表 示"腱的炎症")通常用来描述腱的问题，但炎症很少是腱疼痛的原因。最 通常地，腱疼痛实际上是腱中或周围的结締组织中 一 系列微撕裂的症状， 更加适当地称为肌腱变性(tendinosis)。其它的腱病症包括起因于伴随纤维 定向障碍的胶原变性的键疼痛、腱中的类黏蛋白基质增加、钙化、腱过度 使用、血管化、老化、以M对身体突起的摩擦。越来越多数量的腱专家 使用肌腱病变来描述这些病症，通常共同表征为腱炎、肌腱变性 (tendinosis)、腱围炎(paratendinitis)、腱鞘炎(tenosynovitis)、 paratenonitis、腱过度使用损伤、以及创伤。Khan等人,S/7or伤Af^/ 27:393-408 (1999).
正常的腱组织包含紧密填充的结締组织，其具有规则排列的胶原纤维 束，所述的胶原纤维以相同方向运行在初级、二级和三级、具有高抗张强 度的纤维束中。扁平、锥形的腱细胞(tenocyte)分散在这些纤维中，这些腱细胞合成富含I型胶原的勦性细胞外基质(ECM) 。 I型胶原束为腱提 供弹性和结构支持。在健康的腱中，在ECM合成和降解之间存在动态平 衡。然而，肌腱病变负面地影响这种平衡，并导致胶原纤维结构重排和解 体。胶原束的解体导致腱出现软骨。在肌腱病变组织中清楚地观察到ECM 中成纤维细胞、肌成纤维细胞、新血管形成以及糖胺聚糖(GAG)的病理学 聚集。Tallon等人，M^/5WS/^rtoExe/T 33(12):1983-90 (2001); Khan等人， S/7^feAT^/27(6):393-408 (1999)。受损腱中代谢和形态上的变化导致疼痛 和对撕裂与破裂的易感。
目前，认为受损腱ECM的降解和重塑由从定居结締组织细胞和侵入 性炎症细胞释放的金属蛋白酶引起，其中所述的金属蛋白酶能够降解基质 大分子例如聚集蛋白聚糖、饰胶蛋白聚糖和^链蛋白聚糖。这些金属蛋 白酶包括MMP(MatrixMetalIoproteinases，基质金属蛋白酶)、ADAM(A Disintegrin And Metalloproteinase，解联蛋白和金属蛋白酶)和ADAMT(A Disintegrin And Metalloproteinase with Thrombospondin Motifs, 具有血 小板反应蛋白基序的解联蛋白和金属蛋白酶，例如聚集蛋白聚糖酶)。Riley G.， Ex/7eW/^v Mo/Af^/ 7(5):l-23 (2005); Rees等人，B/oc/ie附/ 350:180-188(2000)。然而，MMP的广谱抑制剂在治疗与肌腱病变具有病 理相似性的骨关节炎的临床试验上是不成功的。Clark等人，五xpeW 0/7& 77iw7Wgeto 7(1): 19-34 (2003)。因此，抑制金属蛋白酶不大可能有效地治 疗肌腱病变。事实上，在高度受力的腱例如冈上肌腱和跟腱中需要最小水 平的金属蛋白酶活性来提供具有适当水平的ECM的腱。Riley G.， Ex/^" 細胁/脸"7(5): 1-23 (2005)。
目前，存在多种标准的非手术性和手术性肌腱病变治疗。非手术性方 法包括休息、冷疗法、活性修正、物理疗法、非类固醇类抗炎药物(NSAID )、 和皮质类固醇。休息和活性修正可以帮助患一些这种病症的患者，但还存 在大量不能用这些疗法治疗的临M体。尽管广泛使用，但经口的抗炎药 物疗法尚未在控制的研究中证实有用，并且具有不希望的副作用。 一些研究进一步表明，事实上，非类固醇类药物疗法对康复过程具有副作用，这 是因为其通过减轻疼痛而使患者忽视肌腱病变的早期症状。
皮质类固醇通常用于降低组织中的炎症，但不建议使用此类药物治疗 肌腱病变，特别是因为皮质类固醇抑制胶原的合成。 一些研究在用可的松 治疗的患者中观察到短期的改善，但跟踪患者超过1年的研究显示高的症 状复发率和不确定的有效率。可的松注射也具有腱破裂、感染、皮肤脱色 和皮下萎缩的风险。在糖尿病患者中，注射可能导致高血糖。
腱修复的外科方法包括清创术和受损腱的修复。然而，开放或关节镜 外科手术具有许多潜在的并发症，例如深度感染、损伤神经血管结构、以 及形成伤疤。外科手术也很昂贵，并且具有伴随局部或全身麻醉的额外风 险。
因此，仍然存在对治疗腱相关损伤、优于现有疗法的方法的需求。柔 韧腱組织的损伤或其它损害痊愈慢，并且需要数月或者甚至数年才能完全 恢复。腱相关损伤对社会具有显著影响。在美国，过度^f吏用损伤占全部损
失相关的机构出诊的将近7%。 Woodwell等人，Adv Data 346:1-44 (2004)。 基于美国劳工部4亍业就业统计部门(U.S. Department of Labor, Bureau of Labor Statistics)数据的信息，此类损伤导致工作时间显著损失(见 http:〃www.bls.gov/lif)。
发明概述
本发明提供新的治疗肌腱病变的方法。通过对过度使用的大鼠腱进行 转录概况分析，现在已经发现，软骨特异的基因例如聚集蛋白聚糖、多功 能蛋白聚糖、Col2al (1I型胶原)和Sox9的表达水平在受损的腱中增加。这 些结果表明受损的腱組织由于过度使用而转变为纤维软骨。与主要包含I 型胶原的腱不同，纤维软骨含有II型胶原和大的蛋白聚糖，例如聚集蛋白 聚糖和多功能蛋白聚糖。腱中软骨和纤维软骨的形成对于腱修复是有害的， 因为软骨組织破坏了紧密填充的腱I型胶原纤维。这种破坏降低了腱的抗 张强度和弹性。因此，本发明提供通过降低患者腱组织中软骨特异性蛋白聚糖的形成 来在患者中治疗肌腱病变的方法。本发明也提供减少软骨特异性蛋白聚糖 形成的化合物在制备治疗肌腱病变的药物中的用途。
在一些实施方案中，这些方法和用途包括降低涉及在患者腱组织中合 成聚集蛋白聚糖和/或多功能蛋白聚糖的酶的活性。在特定实施方案中，这
些方法和用途包括在患者腱组织中降低硫酸软骨素N-乙酰氨基半乳糖基 转移酶1(CS-GalNAcT-l)和/或半乳糖胺多肽N-乙酰氨基半乳糖基转移酶 l(GalNT-l)的活性。在其它实施方案中，这些方法和用途包括降低一种或 多种涉及软骨蛋白聚糖合成的其它酶的活性，其中所述的酶包括但不限于 UDP-D-木糖:核心蛋白质p-D-木糖基转移酶、Gal转移酶、GlcA转移酶、 GlcNAc转移酶、磺基转移酶、硫酸软骨素合酶和硫酸乙酰肝素磺基转移 酶。
涉及产生软骨结构蛋白质的酶和其它蛋白质的活性可以通过直接或间 接地抑制酶或其它蛋白质的功能来降低，或者通过抑制酶或其它蛋白质自 身的表达来降低。
本发明也提供通过降低患者腱组织中软骨特异性结构蛋白质的表达来 治疗患者的肌腱病变的方法。本发明进一步提供降低软骨特异性结构蛋白 质表达的化合物在制备治疗肌腱病变的药物中的用途。在一些实施方案中， 软骨特异性结构蛋白质例如但不限于聚集蛋白聚糖、多配体蛋白聚糖 3(syn-3)、多功能蛋白聚糖以及II型胶原的表达受到直接抑制。在其它实施 方案中，降低了涉及软骨特异性基因表达的转录因子的活性。这些转录因 子和信号转导蛋白质包括例如Sox9。
在其它实施方案中，本发明包括鉴定治疗肌腱病变的化合物的方法， 其中包括向需要治疗的受试者施用测试化合物、并检测该物质抑制涉A^ 组织中糖胺聚糖(glycoglycosaminoglycan)—(GAG)合成的酶的活性的能力。
在一些实施方案中，鉴定治疗肌腱病变的化合物或者评估治疗的方法 包括(l)提供至少一种选自CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、石克酸乙酰肝 素(葡糖胺)3-0-磺基转移酶1(Hs3stl)、 GalNT-l和Sox9的样品成分；(2)将样品与测试化合物组合；(3)测量样品成分应答测试化合物的活性；以及 (4)确定测试化合物是否抑制样品成分的活性。
本发明额外的目的和优点将部分在下文的描述中给出，并且部分在描 述中显而易见，或者可以通过实施本发明而学习到。本发明的目的和优点 通过下文的详细描述和所附权利要求书中特别指出的成分及组合来实现和 获得。
应当理解，上述一般描述和下文的详细描述仅为范例和解释性的，并 不限制所述本发明。
掺入和构成本说明书一部分的附图显示了本发明的一些实施方案，并
和描述一^L解释本发明原理的作用。
附图简述
在图l-7中，SST代表冈上肌腱；PT代表膝腱未损伤的内参；R代表 进行了过度使用步骤(Soslowsky等人，J. Shoulder Elbow Surg. 9:79-84 (2000))的动物；C代表未进行过度使用步骤的对照动物；时间过程是l、 2 和4周；并且BM代表骨髓。
图1显示使用Affymetrix RAE230 2.0基因芯片、在过度使用的腱(图 1A)中Col2al (1I型胶原)4周的基因表达谱。如图(图1B)所示，也测定了正 常肌骨胳组织中Col2al基因的表达水平。表达谱表明，与正常腱组织相比， Col2al在软骨组织和过度使用的腱组织中都高度表达。
图2显示使用Affymetrix RAE230 2.0基因芯片、在过度使用的腱(图 2A)中Agcl(聚集蛋白聚糖)4周的基因表达谱。如图(图2B)所示，也测定 了正常肌骨胳组织中Agcl基因的表达水平。表达谱表明，与正常腱组织 相比，Agcl在软骨组织和过度使用的腱组织中都高度表达。
图3显示使用Affymetrix RAE230 2.0基因芯片、在过度使用的腱(图 3A)中Sox9(sry-型高泳动族框9)4周的基因表达镨。如图(图3B)所示，也 测定了正常肌骨胳组织中Sox9基因的表达水平。表达镨表明，与正常腱组 织相比，Sox9在软骨组织和过度使用的腱组织中都高度表达。图4显示使用Affymetrix RAE230 2.0基因芯片、在过度使用的腱(图 4A)中CspgZ(多功能蛋白聚糖^周的基因表达语。如图(图4B)所示，也测 定了正常肌骨胳组织中多功能蛋白聚糖基因的表达水平。表达镨表明，与 正常腱组织相比，多功能蛋白聚糖在软骨组织和过度使用的腱组织中都高 度表达。
图5显示使用Affymetrix RAE230 2.0基因芯片、在过度使用的腱(图 5A)中硫酸软骨素N-乙酰氨基半乳糖基转移酶(CS-GalNAcT-l)4周的基因 表达谱。如图(图5B)所示，也测定了正常肌骨胳组织中CS-GalNAcT-l基 因的表达水平。表达谱表明，与正常腱组织相比，CS-GalNAcT-l在软骨 组织和过度使用的腱组织中都高度表达。
图6显示使用Affymetrix RAE230 2.0基因芯片、在过度使用的腱(图 6A)中GalNT-l (GalNTl-UDP-N-乙酰基-a-D-半乳糖胺:多肽-N-乙酰^^ 半乳糖基转移酶1)4周的基因表达谱。如图(图6B)所示，也测定了正常肌 骨胳组织中GalNT-l基因的表达水平。表达语表明，与正常腱组织相比， GalNT-l在过度4吏用的腱组织中高度表达。
图7显示使用Affymetrix RAE230 2.0基因芯片、在过度使用的腱(图 7A)中Hs3stl (A乾酸乙酰肝素(葡糖胺)3-0-磺基转移酶l)4周的基因表达 谱。如图(图7B)所示，也测定了正常肌骨胳组织中Hs3stl基因的表达水平。 表达谱表明，与正常的腱相比，Hs3stl在过度使用的腱中高度表达，并且 与正常的腱组织相比在软骨组织中高度表达。
序列简述
CS-GalNAcT-l的核苷酸和氨基酸序列可以以下列登录号从Genbank 获得人(NM—018371);小鼠(NMJ72753)和大鼠(XM—224757)。
CS-GalNAcT-2的核苷酸和#^酸序列可以以下列登录号从Genbank 获得人(NM—018590);小鼠(NM—030165)和大鼠(XM—232316)。
GalNT-l的核苷酸和tt酸序列可以以下列登录号从Genbank获得 人(NM—020474);小鼠(NM—013814)和大鼠(NM—124373)。聚集蛋白聚糖的核苷酸和M酸序列可以以下列登录号从Genbank 获得人(NM—001135);小鼠(NM—007427)和大鼠(NM—0221卯)。
Col2al的核苷酸和M酸序列可以以下列登录号从Genbank获得 人(NM—001844);小鼠(NMJ)31163)和大鼠(NM—012929)。
Sox9的核苷酸和M酸序列可以以下列登录号从Genbank获得人 (NM—000346);小鼠(NMJ)11448)和大鼠(XM 343981)。
多功能蛋白聚糖的核苷酸和M^列可以以下列登录号从Genbank 获得人(NM—004385);小鼠(XM—488510)和大鼠(XM—215451)。
硫酸乙酰肝素(葡糖胺)3-0-磺基转移酶1的核苷酸和M酸序列可 以以下列登录号从Genbank获得人(NM—005114)、小鼠(NM—010474)和 大鼠(NM—053391)。
发明详述
本发明提供通过降低一种或多种涉M组织中软骨和/或纤维软骨形 成的分子的活性来治疗肌腱病变的方法。
为了更加容易理解本发明，首先定义一些术语。额外的定义在本发明 的详细说明中给出。
如本文所用，术语"肌腱病变"包括所有发生在腱中和周围的病理，其 中包括但不限于腱炎、肌腱炎、肌腱变性、腱围炎、腱鞘炎(tenosynovitis )、 腱过度4吏用损伤和创伤、腱周围炎(perintendinitis)以及paratenonitis。
如本文所用，术语"腱缺陷"指的是任何腱病症，其中包括但不限于肌 腱病变。
如本文所用，术语"受损的腱"指的是患有肌腱病变或腱缺陷的腱组织。 如本文所用，术语"过度使用的"腱指的是患有因为过度使用、而非直
接创伤引起的腱缺陷或肌腱病变的腱。
如本文所用，术语"患者，，或"受试者"指的是任何对腱缺损敏感、患有
腱缺损或者处于腱缺损恢复过程中、并且需要治疗的人或动物。如本文所用，术语"腱炎"指的AM^腱炎(另一种说法)、肌腱病变、或 腱的炎症。
如本文所用，术语"肌腱变性"指的AI/L腱病变或在腱中发生微撕裂导 致腱弱化、通常导致疼痛、僵硬和失去强度的任意变性病症。
如本文所用，术语"腱损伤"指的是肌腱病变或者任意腱组织变得缺陷
或退^匕的病症o
如本文所用，术语"小分子"包括除多肽和核酸以外的、能起影响生物 过程作用的任意化学或其它组分。
如本文所用，术语"治疗(动词)"或"治疗(名词)"指的是任意对哺 乳动物包括人疾病的给药或应用方案，并且包括抑制疾病。其包括阻止疾 病发展和减轻疾病，例如通过复原或恢复或修复丟失、失去或缺陷的功能、 或者刺激无效的过程。
如本文所用，术语"活性"指的是可以通过多种方式进行抑制、减低或 干扰的酶或蛋白质的生物学功能。
如本文所用，术语"酶的活性"指的是与酶相关的一种或多种生理活性、 催化活性、调节活性或酶促活性。
如本文所用，术语"有效量"表示足够显示有意义的患者益处、即治愈 肌腱病变或者增加治愈和改善症状的速率的每种本发明抑制剂的总量。
I.腱和软骨的组成
腱包含有序的I型胶原层，其间分敉着小量的III型胶原、成纤维细 胞样腱细胞和软骨细胞样纤维软骨细胞。I型胶原被填充进入致密的胶原 纤维中，这在腱^t所贴附的肌肉拉伸和牵拉时为其提供强度和僵硬。相对 地，软骨包含n型胶原和蛋白聚糖，并且设计来抵抗压缩、而非张力。纤 维软骨为腱和软骨组织的混合物，并且主要存在于腱和骨头之间的界面处。 在腱内形成软骨和纤维软骨对腱的功能是有害的，这是因为其破坏紧密填 充的i型胶原纤维、并且降低腱的抗张强度。因此，本发明的方法可以用 来在受损或损伤的腱组织中阻止或降低软骨和/或纤维软骨的形成。腱中软骨形成的一个指征是在组织中出现增加水平的蛋白聚糖，这通
常通过这些蛋白聚糖的糖胺聚糖(GAG)侧链的存在来检测。蛋白聚糖为表 征为具有一个或多个线性GAG链的核心蛋白质的糖蛋白家族，其中所述 的GAG链由重复的二糖单位组成。硫酸软骨素蛋白聚糖例如聚集蛋白聚 糖和多功能蛋白聚糖为软骨特异的。聚集蛋白聚糖是软骨主要的结构成分， 并且负责软骨的压缩强度和弹性。聚集蛋白聚糖分子的7jC合和聚集产生多 种在软骨组织中承担压缩性负荷的凝胶。Watanabe等人，/ 肌oc/^附 12《4):687-93 (1998)。软骨组织中存在的其它蛋白聚糖包括硫酸乙酰肝素 蛋白聚糖，例如多配体蛋白聚糖3 (syn-3)。 Kirn-Safran等人，所r幼Z)e/ecto 72(C部分):69-88 (2004)。
II.促进软骨和纤维软骨形成的分子
本发明部分基于下列发现，即软骨特异性基因(例如聚集蛋白聚糖、 多功能蛋白聚糖和II型胶原)在受损的腱中表达增加。由在Soslowsky等 人，/S/^"Ww ￡76ow9:79-84 (2000)所述的大鼠腱过度使用模型中获 得的基因表达谱的这一结果表明受损的腱由于过度使用而转变为纤维软 骨。
本发明也部分基于下列发现，即涉及软骨特异性蛋白聚糖糖胺聚糖 (GAG)侧链合成的酶在过度使用的腱中表达增加。这个发现即软骨特异性 酶在受损腱中上调为在严重受损腱中观察到的GAG聚集提供了机制。 Khan等人，S/^Ws Af^/ 27:393-408 (1999)和Tallon等人，AT^/S/ wte
33(12):1983-90 (2001)。这些增加的GAG水平表明，蛋白聚糖例如 聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖和syn-3的水平在受损的腱中增加。因此， 可以通过降低负责产生这些蛋白聚糖的酶的活性来防止软骨特异性蛋白聚 糖聚集，进而治疗肌腱病变。A.在肌腱病变中促进软骨形成的分子受到上调
使用Affymetrix 061^(:出？@系统来鉴定正常腱和遭受过度使用步骤的 腱之间基因表达的差异。基因表达语产生多于400个过度使用后在冈上肌 腱中差异调节的基因。通过4周过度使用，107个基因受到上调，并且27 个基因受到下调。 一些最高上调的基因为软骨特异性的基因，其中包括胶 原2型a-l链(Col2al)、 Sox9、多功能蛋白聚糖和聚集蛋白聚糖。其它上 调的基因包括涉及软骨蛋白聚糖上GAG侧链形成的基因，其中包括 CS-GalNAcT-l、 GalNT-l和Hs3stl。基于这些结果，这些分子自身或者 其它负责这些分子活性的起始或维持、或者负责编码这些分子的基因表达 的分子可能涉及过度使用的腱中软骨和/或纤维软骨的形成。这些分子可以 包括如下文所列的酶、转录因子和信号转导因子
酵
一种抑制腱组织中软骨或纤维软骨产生的方法为抑制涉及蛋白聚糖合 成的酶的表达或活性。涉及蛋白聚糖GAG链合成的酶的完整目录见Silbert 等人，/f/BM5 h/e 54:177-186 (2002)和Sugahara等人,/VBMB丄《/e 54:163-175 (2002)。这些酶包括在过度使用的腱中表达增加的蛋白质(实施 例l)。因此，本发明的一个实施方案涉及抑制下列任意一种酶的表达或 活性
CS-GalNAcT画l和CS-GalNAcT-2(EC 2.4.1.174和EC 2.4.1.175)涉及硫 酸软骨素GAG侧链的起始和延伸。CS-GalNAcT-l涉及软骨素GAG的 起始和延伸，而CS-GalNAcT-2涉及这些相同软骨素GAG的延伸。关于 这些酶详细的描述，请参见Uyama等人，/.所o/. C7ie附.277(11):8841-8846 (2002)、 Gotoh等人，丄&W. C7^附.277(41):38189陽38196(2002)、 Sato等人 / C7^附.278(5):3063-3071 (2003)、 Uyama等人，/ C7^附. 278(5):3072-3078 (2003)。UDP-D-木糖:核心蛋白质p-D-;Mt基转移酶(EC 2.4.2.269)，其涉及将 最初的木糖部分添加到蛋白聚糖核心蛋白质上，这是GAG侧链合成最初 的步骤之一；
Gal转移酶(EC 2.4.1.133和EC 2.4.1.134)，其涉及将半乳糖残基添加 到新的GAG侧链的木糖部分上；
GlcA转移酶(EC 2.4.1.135、 EC 2..4.1.226和EC 2.4.1.225)，其涉及将 GlcA部分添加到新的GAG侧链的半乳糖残基上；
GlcNAc转移酶(EC 2.4.1.223和EC 2.4.1.224)，其涉及将GlcNAc部分 添加到通过CS-GalNAcT酶添加的石危酸软骨素GAG的GalNAc部分上；
磺基转移酶(EC 2.8.2.5和EC 2.8.2.1),其涉及将硫酸根残基转移到硫 酸软骨素GAG上；
硫酸软骨素合成酶(EC 3.1.6.4和EC 3.1.6.12),其涉及将硫酸根残基初 次添加到硫酸软骨素GAG上；
GalNT-l(E.C.2.4.1.41)催化在糖蛋白上形成0-连接的寡糖侧链中的第 一步。White等人，C7iem 270(41):24156-65 (1995);并且
Hs3stl(EC 2.8.2.23)催化硫酸根残基添加到硫酸乙酰肝素GAG上。 Shworak等人，C7^w 272(44): 28008-19 (1997)
直接或间接抑制任意一种这些酶的活性将减少蛋白聚糖的形成。下文 讨论了抑制这些酶的方法。
2,基因表达
防止软骨和/或纤维软骨形成的备选方法是直接或间接地防止受损腱 组织中软骨特异性蛋白质的表达。例如，可以通过许多方法降低多功能蛋 白聚糖或聚集蛋白聚糖，软骨特异性蛋白聚糖的表达，其中所述的方法包 括防止编码聚集蛋白聚糖或多功能蛋白聚糖的基因的转录或翻译、或者防 止涉及聚集蛋白聚糖或多功能蛋白聚糖基因表达的转录因子的表达或功能 (这将具有防止这些基因转录的结果)。实施本发明时重要的是确保对软骨特异性因子的抑制作用局限在受损 的腱中，因为许多软骨特异性因子包括蛋白聚糖和II型胶原是功能性关节 软骨和其它组织重要的成分。
构蛋白质表达的非酶蛋白质的活性或表达。通过抑制这些基因的表达或活
及软骨结构蛋白质表达的蛋白质包括但不限于Sox9。
其它抑制腱组织中软骨或纤维软骨形成的方法涉及直接地抑制主要软 骨结构蛋白质例如聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖和II型胶原的表达(而 非活性)。发现下列基因在受损的腱組织中受到上调，并且这些基因与软 骨形成相关。
a) Sox9
Sox9 (sry-型高泳动族框9)为涉及软骨发育的转录因子。Sox9在软骨 细胞中表达，这和胶原al(II)基因(Col2al)的表达一致。Sox9通过激活或 增强表达软骨结构蛋白质例如II型胶原的基因的转录来调节软骨发生。 Shum等人，爿W/iW船/ 仏4(2):94-106 (2002); Bi等人，G^w". 22(1):85-9 (1999)。
Col2al
Col2al编码软骨的主要成分，II型胶原的al链。Cheah等人，iVocA^/
(/S爿82(9):2555-9 (1985)。 Agcl
Agcl编码聚集蛋白聚糖蛋白聚糖的核心蛋白质。Doege等人， E;Cffce〃"/"尸A/V^r/x Gew&s f5Vwi^fe/， I. /". i oy"， Cl Z),，编著.)Academic Press (New York) 137-152 (19卯)。如本文所用，术语"聚集蛋白聚糖"指的 是软骨组织特异的大蛋白聚糖。聚集蛋白聚糖包含包被了许多硫酸软骨素 GAG部分的蛋白质核心。聚集蛋白聚糖是软骨的主要结构成分，并且能够 结合水和形成粘性的凝胶样物质。这种7JC合作用为软骨组织提供了弹性和 压缩强度。Cspg2
Cspg2编码多功能蛋白聚糖蛋白多糖的核心蛋白质。多功能蛋白聚糖 是另 一个具有许多硫酸软骨素侧链的大蛋白聚糖。像聚集蛋白聚糖一样， 多功能蛋白聚糖结合水，并且形成增加组织强度和弹性的黏性凝胶。 Knudson等人，^附CW/Dev12:69-78 (2001)。
B.通过抑制促进软骨形成的分子来治疗肌腱病变 本发明提供通过降低上文所列分子的表达和/或活性来治疗或预防肌
腱病变的方法。本发明进一步提供施用上文所列分子的抑制剂来治疗或预
防肌腱病变的方法。 治疗策略
本发明部分基于下列发现，即编码聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖 Sox9、 II型胶原、CS-GalNAcT-l、 GalNT-l和HS3stl的基因的表达水平 在过度使用的腱组织中与对照组织相比显著增加(图1-7)。这个结果表明， 涉及蛋白聚糖合成途径的酶或其它分子的表达增加导致受损的腱组织转变 为软骨和/或纤维软骨。因此，在一个实施方案中，本发明包括治疗肌腱病 变的方法，其中包括通过抑制涉及软骨和/或纤维软骨合成的酶或其它分子 的活性、表达或聚集来降低腱组织中软骨和/或纤维软骨的形成。
阻断涉A^:中软骨或纤维软骨形成的酶或其它分子活性的抑制剂在本
发明中是有用的。用于本发明方法的抑制剂被任选糖基化的、加入聚乙二 醇的或者连接于另一个非蛋白质的聚合物。抑制剂可以被修饰为具有改变 的糖基化模式(即与最初的或天然的糖基化模式相比是改变的)。如本文所 用，"改变的，，表示与最初的抑制剂相比添加或删除了一个或多个糖类部分、 和/或添加或删除了 一个或多个糖基化^i点。向抑制剂添加糖基化位点可以
一种增加糖部分数量的方式是通过将糖苷化学或除波偶联于抑制剂的M 酸残基。这些方法在WO87/05330和Aplin等人，CW, Wev 5/od^附 22:259-306 (1981)中进行了描述。存在于底物上的任意糖部分的移除可以化学或S^地完成，如Sojar等人，祝oc/ie附5/0/7/i戸259:52-57 (1987)、 Edge等人，^mz/肌oc/^附118:131-137 (1981)和Thotakura等人， 五"^附o/ 138:350-359 (1987)中所述。
包括例如肽、小分子和核酸的蛋白质和非蛋白质抑制剂也可以用于本 发明的方法。
a)肽和小分子
用于本发明方法的抑制剂包括小的有机肽和分子、以及小的无机分子。 这些肽和小分子包括合成和纯化的天然存在的抑制剂。本领域熟知鉴定特 异靶向于目的蛋白质的肽和小分子的方法。例如，可以使用耙蛋白质i^！ 和/或生物学功能的测定来筛选肽和/或'J 、分子文库对乾蛋白质例如 CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT國2、 GalNT-l和/或Sox9的抑制。在另一个 实施方案中，可以在靼蛋白质例如CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、 GalNT-l和/或Sox9的竟争性放射性配体结合测定中用其底物或配体篩选 小分子和/或肽文库。
备选地，可以用基于焚光共振能量转移(FRET )的测定例如时间分 辨的FRET(TR-FRET)测定来鉴定抑制剂。在示例性实施方案中，将蛋白 聚糖的核心蛋白质用His或GST标签标记，并使用偶联了铕(荧光团) 的抗His或GST抗体来标记蛋白质。备选地，将核心蛋白质在赖氨酸或半 胱氨酸残基上用铕进行非特异性标记。供体糖分子用Cy5 (荧光染料)标 记。可以用于这项测定的供体和受体分子的列表可以在Uyama等人，/肌o/ C&附278(5):3072-78 (2003)的表1中找到。
受体和供体分子以不同比率与和不与乾酶组合。TR-FRET测定通过
下列步骤进行，即在340nm激发系统、分别在615和665 nm测量铕和 Cy5的发射、并计算Cy5发射与铕发射的比率。
当不存在酶时，供体和受体分子彼此不能紧密靠近，并且Cy5和铕分 子的个体焚光不存在淬灭，进而产生基线水平的比率。当向测试系统中加 入靼酶时，供体糖分子转移至受体蛋白质，并且淬灭系统的荧光。Cy5与 铕荧光的比率随着转移的糖分子数量达到最大而增加。为了鉴定靶酶的抑制剂，向测定系统中加入肽或小分子。当测试化合 物能够抑制糖向蛋白质的转移时，荧光的淬灭就会减少。如果测试肽能够
抑制酶100。/。的转移活性，那么Cy5发射与铕发射的比率就为基线水平。 然后在基于细胞的系统中评估在这项测定中至少抑制50。/。酶活性的化合 物来评定其降低GAG合成(如下文所述)的能力。
本发明也提供^f吏用额外的篩选测定例如二级和三级测定(secondary and tertiary assay )，来进一步鉴定此类分子对腱形态的作用，例如使用 上文详细描述测试。
b) 显性失活的突变体
在本发明的一些实施方案中，突变的CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、 GalNT-l、 Hs3stl或Sox9蛋白质可以用在本发明的方法中作为抑制剂。例
体或经改造的同源物可以用于本发明的方法。
c) 核酸
能够阻断上文所列的靶分子活性的核酸在本发明中是有用的。此类抑 制剂可以编码与例如CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、 GalNT-l、 Hs3stl 或Sox9相互作用的蛋白质。备选地，此类抑制剂可以编码能与靼分子(例 如GalNAc)的底物或配体相互作用的蛋白质，并且如果所编码的蛋白质 阻断耙分子与其底物或配体的结合、或者如果其阻断底物或配体结合乾分 子后的活性，那么此类抑制剂就在本发明的方法中是有效的。当然，抑制 剂可以编码同时与靶分子及其底物或配体相互作用的蛋白质。此类核酸可 以用来表达例如CS-GalNAcT-l、CS-GalNAcT-2、Hs3stl、GalNT-l或Sox9 的抑制剂来用于本发明的方法。
本发明的方法也包括使用干扰性RNA分子("RNAi")来降低上文所 列的任意分子或其蛋白质结合配偶体的表达，其中所述的干扰性RNA分 子包括但不限于短的干扰性RNA (siRNA)、短的发夹RNA ( shRNA ) 和短的双链RNA (sdsRNA) 。 RNAi可以通过引入核酸分子例如合成的 短干扰性siRNA或RNA干扰剂来起始，进而抑制或沉默靶基因的表达。见，例如美国专利^>开号2003/0153519和2003/01674901、以及美国专利 号6，506，559和6,573,099。
siRNA可以化学合成，通过体外转录产生，或者在宿主细胞内产生。 一般而言，siRNA至少长15-50个核苷酸，例如长20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29或30个核苷酸。siRNA可以是大约15至大约40个 核苷酸长度的双链RNA (dsRNA)，例如大约15至大约28个核苷酸的长度， 其中包括大约19、 20、 21或22个核苷酸长度，并且可以在每条链上包含 具有大约O、 1、 2、 3、 4、 5或6个核苷酸长度的3，和/或5，突出端。siRNA 可以通过转录沉默来抑制乾基因。优选地，siRNA能够通过降解乾信使 RNA或者特异地转录后基因沉默(PTGS )乾信使RNA来促进RNA干扰。
用于本发明方法的siRNA也包括小的发夹RNA ( shRNA ) 。 shRNA 包含短的(例如大约19至大约25个核苷酸)的反义链、接着是大约5个 至大约9个核苷酸的核苷酸环、以及类似有义链(analogous sense strand)。 备选地，有义链可以在核苷酸环结构之前，并且反义链可以在之后。这些 shRNA可以包含在质粒和病毒载体中。
siRNA分子的耙向区域可以选自所给的耙序列。例如，核苷酸序列可 以从起始密码子下游大约25-100个核苷酸处起始。核苷酸序列可以含有5， 或3，非翻译区，以及靠近起始密码子的区域。本领域熟知设计和制备siNRA 分子的方法，其中包括多种选择序列作为RNAi反应物的规则。见，例如 Boese等人，Af"/ioA五rtgwo/ 392:73-96 (2005)。
siRNA可以寸吏用Hannon等人，7Vfl似"418:244-251 (2002)、 McManus 等人，A^/^Wews 3:737-747 (2002)、 Heasman等人，所o/ 243:209-214 (2002)、 Stein等人，/ C/," /wwW， 108:641-644 (2001)和Zamore等人， Aw"肌o/8(9):746-750 (2001)所述的标准技术产生。优选的siRNA为5， 磷酸化的。
siRNA可以用来耙向例如CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、 GalNT画l、 Hs3stl、 Sox9、 Agcl、 Cspgl或Col2al、或者上文所列的其它分子、及其 底物或配体。核酸可以从其自然环境，以基本纯的或同质的形式获得、分离和/或纯 化。熟知在多种不同宿主细胞中克隆和表达多肽的系统。适当的宿主细胞
包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒(baculovirus)系统。本领域 可用的表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括例如中国仓鼠卵巢细胞、HeLa 细胞、幼地鼠肾细胞、NSO小鼠黑素瘤细胞、以及许多其它细胞。关于适 合从核酸产生蛋白质的其它细胞见Gene Expression Syst ems, Fernandez等人，Academic Press (1999)。 RNAi分子可以化学合成，或者 从编码siRNA或shRNA序列的DNA序列表达。
为了产生上文所列分子显性失活突变体，可以选择或构建含有适当调 节序列的适当载体，其中所述的调节序列包括启动子序列、终止子序列、 多聚腺苷酸化序列、增强子序列、选择或标记基因以及其它适当的序列。 根据需要，载体可以是质粒或病毒，例如噬菌体或噬菌粒。更多细节参见， 例如Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook等人，第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)。许多操作核酸的已知技术和 方法，例如制备核酸构建体、诱变、测序、将DNA引入细胞和基因表达、 以及蛋白质分析中，都在Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 等人编辑，第2版，John Wiley & Sons (1992)中详细描述。
可以将核酸融合至编码额外多肽序列的其它序列，例如用作标记或才艮 告基因的序列。标记或报告基因的实例包括内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶 (CAT)、腺苷脱氨酶(ADA)、 M糖苷磷酸转移酶(负责新霉素(G418)抗性)、 二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素-B-磷酸转移酶(HPH)、胸腺嘧咬核苷激 酶(TK)、 lacZ(编码半乳糖苷酶)、黄噤呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)、 荧光素酶。本领域也熟知许多其它基因。
2.抑制酶活性
在本发明特定的实施方案中，治疗肌腱病变的方法包括降低、抑制或 下调涉及蛋白聚糖生物合成的酶的活性，其中所述酶例如涉及将硫酸软骨 素GAG添加到聚集蛋白聚糖和/或多功能蛋白聚糖上的那些。这些酶包括 例如CS-GaINAcT-l、 CS-GalNAcT-2、 UDP-D-木糖:核心蛋白质p-D-木糖基转移酶、Gal转移酶、GlcA转移酶、GlcNAc转移酶、磺基转移酶、硫 酸软骨素合酶、Hs3stl和Ga證-l。
在示例性实施方案中，本发明包括降低、抑制或下调受损腱中 CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、 GalNT-l和/或Hs3stl酶的活性。在其 它实施方案中，本发明包括降低、抑制或下调受损腱中Xyl转移酶、Gal 转移酶、GlcA转移酶、GalNAc转移酶、GlcNAc转移酶、磺基转移酶或 硫酸软骨素合酶的活性。上述肽或小分子抑制剂可以用来实行这些方法。
a)鉴定酶活性的抑制剂
本发明进一步包含鉴定和评估在受损腱组织中作为CS-GalNAcT-l 、 CS-GalNAcT-2、 GalNT-l、 Hs3stl、 Xyl转移酶、Gal转移酶、GlcA转移 酶、GalNAc转移酶、GlcNAc转移酶、磺基转移酶或硫酸软骨素合酶的抑 制剂的物质的功效的方法。
此类抑制剂阻断或降低涉;^M中软骨或纤维软骨形成的酶的活性。这
些抑制剂包括修饰的可溶性底物、蛋白质、小分子以及核酸。
鉴定治疗肌腱病变的物质的方法包括测定每个独立物质对上文所列酶 的酶活性、蛋白质-耙相互作用或者蛋白质-蛋白质相互作用的效果。多种 体内或体外的测定可以用来测定抑制剂治疗肌腱病变的功效。在一示例性
实施方案中，通过类似于高通量篩选(HTS)的方法，通过测定小分子影 响例如上文所列酶的酶活性、靶结合或蛋白质-蛋白质相互作用的能力而对 其潜在的治疗用途进行了体外评估。
在典型的HTS测定中，候选化合物对例如酶活性、配体-受体结合等的 抑制效果可以通过将存在已知浓度候选者时的测试测定与参照进行比较来 测定，其中所述的参照在不存在候选者和/或在存在已知抑制剂化合物时进 行。 一般地，可以使用常规染料、荧光或放射性活性分子来监测候选化合 物的效果。因此，例如，可以鉴定出抑制配体与其受体结合、或者抑制酶 活性、降低酶过程周转的候选化合物。
本发明的示例性实施方案提供在体外鉴定治疗肌腱病变的物质的方 法，其中包括(l)提供至少一种选自CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、GalNT-l和Hs&tl的样品成份的样品；("组合样品成分和测试物质；p)测 定样品成分应答测试物质的活性；并(4)确定测试物质是否抑制样品成分的 活性。
在一个示例性实施方案中，鉴定治疗肌腱病变的物质的体外方法包括 用BMP-2蛋白质或表达BMP-2蛋白质的腺病毒处理软骨外植体、初级软骨 细胞颗粒培养物或者软骨细胞系。BMP-2刺激ECM和GAG合成。然后将 测试化合物加入培养物中，并通过测量35S到GAG侧链中的掺入和/或通过 DMMB测定来评估抑制剂对GAG合成的效果。测试化合物的效果将与适当 的载体对照进行比较。
潜在的酶抑制剂的体内测定可以包括(l)重复向哺乳动物(例如 Sprague-Dawley大鼠)施用至少2、 4、 6或8周时间的测试抑制剂；(2)将哺 乳动物每周5天、每天l小时以17米/分钟进行下坡跑步方案(实施例l);
肌腱的效果，其^认为腱变:生(例如:胞和形态-学上的异常)的变緩归因 于抑制剂，并且表明抑制剂对于治疗腱变性病症是有效的。
应当理解，用于本发明方法的测试抑制剂可以在一种或多种腱变性病 症的动物模型和/或人中进行评估。
本领域已知多种在体内和体外在存在抑制剂时测量酶活性的测定。一 些较常用的测定的实例包括分光光度法、荧光分光测定法、圆二色性 (circular dichroism )、自动化的分光光度法和荧光分光测定法、偶联测 定、自动化的酸或碱滴定法、放射性方法、无标记的光学检测和酶抑制测 定。在示例性实施方案中，CS-GalNAcT-l和/或CSGalNAcT-2的酶活性如 Uyama等人，J Biol Chem 277(11):8841-46 (2002)中所述进行检测。在另一 示例性实施方案中，GalNT-l的酶活性如White等人，J Biol Chem 270 (41):24156-65 (1995)所述进行检测。
例如，用于本发明方法的酶抑制剂可以与其抑制的酶相互作用。备选 地，抑制剂可以与例如酶底物(例如GalNAc )或其它结合配偶体相互作用。 如果抑制剂阻断酶与其底物的结合、并且/或者如果抑制剂阻断底物结合酶后的活性，那么其可以降低或者并且在本发明中有效。当然，抑制剂可以
与酶和第二种因子例如其底物都相互作用。在这个方面，CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、 GalNT-l和/或Hs3stl的抑制剂包括例如^f务饰的可溶性底 物、其它蛋白质(包括结合酶和/或酶底物的蛋白质)、修饰形式的酶或其 片段、前肽、肽和所有这些抑制剂的模拟物。
酶的抑制剂可以例如是直接的酶抑制剂，结合并中和酶的活性；降低 酶的表达水平；影响前体分子的稳定性或向活性、成熟形式的转变；干扰 酶与其一个或多个底物的结合；或者其干扰酶的细胞内功能。
3.抑制转录因子活性
用于本发明方法的转录因子抑制剂可以直接通过结合、或者间接通过
在这个方面，Sox9的抑制剂可以包括经々务饰的可溶性配体或靶分子、小分 子和核酸。
本领域已知在存在抑制剂时在体内和体外测量Sox9活性的测定。 一些 较常用的Sox9抑制剂的测定的实例包括酵母双杂交系统、荧光素酶报告基 因、测定存在Sox9抑制剂时软骨细胞特异性基因(例如Col2al、 Agcl)表 达水平的PCR测定、Sox9或软骨特异性基因的Western印迹分析、瞬时转 染、氯霉素乙酰转移酶(CAT)测定和Northern印迹分析。
可以使用多种基于荧光共振能量转移(FRET)的蛋白质-蛋白质或蛋白 质-核酸相互作用的测定来测定抑制剂对Sox9与其结合配偶体相互作用的 壮阔用。例如，可以使用AlphaScreenTM扩增的发光近似性同质测定(购自 普金艾尔莫公司(PerkinElmer⑧))，或者可以采用生物发光共振能量转 移(Bioluminesence Resonance Energy Transfer)(购自普金艾尔莫公司
(PerkinElmer )的BRETTM)来进行干扰Sox9结合性相互作用的抑制剂的 体外测定。
在一个实施方案中，本发明提供用于鉴定治疗肌腱病变的物质的体外 测定的方法，其中包括(l)提供融合于供体荧光分子的上文所列靶分子； 组合靶分子和测试物质；(3)加入融合于受体荧光分子的靶分子的结合配偶体；(4)检测靶分子和其结合配偶体之间的荧光能量转移水平；并(5)测定测 试物质是否抑制靶分子与其结合配偶体的相互作用。
抑制剂能够干扰靶分子与其结合性配偶体的结合，并进而影响两者间 的FRET水平。因此，可以使用FRET测量来鉴定多种效力的抑制剂。 一旦 在体外鉴定了靶分子的抑制剂，就可以进行进一步的体内测试来测定抑制 剂在预防腱中软骨和纤维软骨形成中的功效和适用性。
4. 抑制蛋白质表达
在另一个实施方案中，治疗肌腱病变的方法包括降低、抑制或下调基 因例如CS-GalNAcT画l、 CS-GalNAcT-2、 GalNT-l 、 Hs3stl 、 Col2al、 Cspgl、 Agcl和/或Sox9、及其编码的多肽或蛋白质的表达和/或聚集。用于抑制这 些基因表达的组合物包括例如上文II(B)(l)(c)部分中所述的干扰性RNA分 子。
这些抑制剂可以以任意方式施用，但在特定实施方案中，将表达RNAi 抑制剂的DNA掺入腺病毒栽体，然后将所述载体注射进入需要腱修复的患 者。在示例性实施方案中，编码RNAi的核苦酸序列位于polII启动子的下游， 如Wahdwa等人，Curr Opin Mol Ther 6(4):367-72 (2004)中所述。将siRNA 和shRNA插入腺病毒载体的方法为本领域熟知，并在Krom等人，BMC Biotech 6(11):[先于印刷的电子发行中进行了描述。备选地，直接将RNAi 抑制剂注射i^受损的腱组织、并通过电穿孔法将其转运进入细胞，如 Schiffelers等人，Arthritis & Rheumatism 52(4):1314-18 (2005)中所述。
5. 肌腱病变病症
本发明的方法可以用来在任何需要该治疗的哺乳动物中治疗或预防肌 腱病变，其中所述的哺乳动物包括人、灵长类、猴、啮齿动物、羊、兔、 狗、豚鼠、马、牛和猫。可以治疗或预防的病症包括例如腱炎、肌腱炎、 肌腱变性、腱围炎、腱鞘炎(tenocynovitis)、腱过度使用损伤、腱创伤、腱 周围炎、paratenonitis、和"肌腱病变"病症家族中的任意其它病症。
肌腱病变可以由于过度使用和重复运动、突然损伤(从轻度到重度)、 逐渐变性或老化导致。大多数腱损伤由一系列疾愈緩慢的小裂伤(肌腱变性)组成，所述小裂伤减弱腱、通常导致疼痛、僵硬和失去强度。肌腱病变通 常需要数周的治疗、减少或改变活动、以及休息。太快恢复使用受损的腱 将导致更多的腱损伤，使受损的腱更加容易撕裂或破裂。因此，通过本发 明治疗或预防的病症包括伴随过度使用、体育或事故相关损伤和创伤、营 养缺乏和年龄增长的腱变性病症(急性和慢性两种)。
肌腱病变的一个实例是外上髁炎，也已知为"网球肘(tennis elbow)"， 这是熟知的体育医学和矫形外科病症。这种病症潜在的病理涉及过度使用 和微撕裂肘部处的桡侧腕短伸肌腱。身体尝试修复这些微撕裂，但在许多 情况中，愈合过程是不完全的。进行慢性外上髁炎手术的患者的病理学样 品显示受损腱中紊乱的血管成纤维细胞发育异常。这种不完全的修复尝试 导致变性的、不成熟的、并且血管化的组织。不完全修复的组织比正常的 腱组织弱，并且缺乏行使正常功能的强度。这种弱化的组织也通过引起疼 痛，并消极地影响生活质量而限制患者。类似的不完全修复存在于其它类 型的腱相关损伤或损害中，例如膝腱炎(跳跃者膝)、跟腱炎(常见于跑步运 动员)、和肩袖腱炎(常见于"过头顶，，的运动员，例如棒球投手)。
肌腱病变也可以由于例如增长的年龄、不好的饮食、体育活动、创伤、 损伤或药物例如培氟沙星(pefloxacin)引起。例如，前列腺素E1(PGE1) 诱导的、前列腺素E2(PGE2)诱导的或者培氟沙星诱导的肌腱病变是人肌腱 病变建立的很好的动物模型。在一个实施方案中，本发明提供在个体中治 疗或预防药物诱导的肌腱病变例如培氟沙星诱导的肌腱病变的方法。在其 它示例性实施方案中，本发明提供治疗或预防由于过度使用、体育或事故 相关的损伤和创伤、营养缺乏和年龄增长诱导的肌腱病变的方法。
本发明进一步提供通过向哺乳动物施用分子活性和/或表达的抑制剂 来治疗或预防腱变性病症、延緩腱退化、恢复腱品质、维持腱健康、治疗 或预防腱组织的低氧变性、治疗或预防腱组织的透明素变性、治疗或预防 腱组织的类黏蛋白或myxoid变性、治疗或预防腱组织的类血纤维蛋白变 性、治疗或预防腱组织的脂类变性、治疗或预防腱组织的钙化、治疗或预 防腱组织的纤维软骨和骨的组织转化、维持腱的微观结构完整性、维持腱中的纤维结构、维持腱中的纤维排列、维持正常的腱血管供应、维持腱组
织中正常的细胞构成、恢复腱组织中正常的ECM含量、减少腱组织中GAG 的病理学聚集、和/或维持腱的质量、抗张强度和/或柔性品质的方法，其中 所述的分子例如CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、 GalNT-l、 Xyl转移酶、 Gal转移酶、GlcA转移酶、GalNAc转移酶、GlcNAc转移酶、磺基转移酶、 硫酸软骨素合酶、Col2al、聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、Hs3stl和/或 Sox9，并且施用上述抑制剂的量为在肌腱病变组织中预防或降低此类分子 活性和/或表达的有效量。 6.评估治疗和动物模型
本发明的方法可以用来在腱组织中治疗肌腱病变或微缺陷。治疗后或 者治疗期间的腱品质可以例如通过评估腱的耀Jf见结构完整性、腱皎原稳定 性、腱组织细胞构成的变异、腱血管化、和/或GAG含量来测定。在治疗后 或者治疗期间评估腱健康的方法为本领域已知，并且包括但不限于磁共振 成像(MRI)、超声波扫描术、以及功能性和/或疼痛评估。备选地，腱的健 康可以通过评估腱组织中GAG的水平来测定。
一种测定腱G AG含量的测定为对于测量腱中硫酸化糖胺聚糖(G AG) 浓度的1，9-二甲基亚甲蓝(DMMB)测定。另 一种测定腱GAG含量的测定为 组织学的爱茜蓝(AB)染色，其可以用来检测腱组织中增加数量的GAG。
III.治疗的方法和药物组合物
用于本发明方法的抑制剂可以通过局部的、经口的、静脉内的、 内的、肌内的、腔内的、皮下的、植入的或者经皮的方式局部或全身施用。
在示例性实施方案中，也可以通过基因疗法的方式向个体施用抑制剂， 其中在体内向患者施用编码抑制剂的核酸序列。在示例性实施方案中，将
病毒表达载体。然后直接将腺病毒注射进入患者的腱，在所述的腱中表达 核酸抑制剂。例如，Mehta等人，J Hand Surg30A(l):136画41 (2005)、 Lou等人，J Orthoped Res 19:1199-1202 (2001)和Lou， Clin Orthopaed Rel Res 379S:S252-55 (2000)中描述了腺病毒介导的核酸向腱组织递送的实例。
在其它示例性实施方案中，将核酸抑制剂掺入其它病毒表达载体，例 如慢病毒、疱渗病毒和腺伴随病毒。适当的载体可以通过评估每种类型病 毒在初级腱细胞中的体外传染性来进行选择。
备选地，将核酸抑制剂直接注射"腱组织，并通过电穿孔转移" 细胞，如Schiffelers等人，Arthritis & Rheumatism 52(4):1314曙18 (2005)中所 述。
在其它示例性实施方案中，用于本发明方法的肽或小分子抑制剂可以 包被在经皮肤的贴剂上，并直接应用于覆盖腱组织的皮肤，如Paoloni等人, J Bone Joint Surg 86A(5):916-22 (2004)中所述。
本领域已知治疗肌腱病变的分子的施用方法。"施用"不限于任意的特 定递送系统，并且可以不限制地包括肠胃外的(包括皮下的、静脉内的、髓 内的、关节内的、肌内的、腔内的或腹膜内的注射)、直肠的、局部的、经 皮肤的或者经口的(例如在胶嚢、混悬剂或片剂中)。可以局部或全身地发 生向个体施用，以单次剂量，或者连续或间断地重复施用，并且以任何的 多种生理学上可接受的盐形式，和/或与作为药物组合物(上文所述)部分 的可药用载体和/或添加剂一起施用。本领域技术人员熟知生理学上可接受 的盐形式、标准的药物制剂才支术和赋形剂。见Physicians， Desk Reference (PDR) 2003，第57版，Medical Economics Company, 2002和Remington: The Science and Practice of Pharmacy,编著。Gennado等人，第20版， Lippincott, Williams & Wilkins， 2000)。
用于本发明方法的抑制剂可以施用从大约l jiig/kg至大约20 mg/kg的剂 量,这取决于症状的严重度和疾病的i^艮。适当的有效剂量由主治医生从 下列范围选择例如大约l照/kg至大约20mg/kg、大约l jng/kg至大约10 mg/kg、大约l fig/kg至大约l mg/kg、大约10照/kg至大约l mg/kg、大约10 ^g/kg至大约100 pg/kg、大约IOO jig至大约l mg/kg、以及大约500 pg/kg至 大约l mg/kg。在另一个示例性实施方案中，重复施用抑制剂至少2、 4、 6、 8、 10、 12、 20或40周的时期，或者至少l、 1.5或2年或者高达受试者的终身，从而 来例如治疗肌腱病变。在本发明的另一个实施方案中，以单次剂量施用抑 制剂来例如刺激恢复腱的正常结构和组成。
一般而言，用于本发明方法的抑制剂可以施用在10-8和10-7、 10-7和 10-6、 10-6和10-5或者10-5和10-4g/kg之间的剂量。在一种动物模型中完成 的治疗有效剂量可以转换为用在另 一动物包括人中，使用本领域已知的换 算系数。见，例如Freireich等人，Cancer Chemother Reports 50(4):219-244 (1966)。
在本发明方法中使用的抑制剂的确切剂量基于想要的结果凭经验确 定。示例性结果包括(l)腱变性病症得到治疗或预防；(2)腱退化得到緩解； (3)腱的品质得到恢复；(4)腱的健康得到维持；(5)腱的低氧变性得到治疗或 预防；(6)腱的透明素变性得到治疗或预防；(7)腱的类黏蛋白或myxioid变 性得到治疗或预防；(8)腱的类血纤维蛋白变性得到治疗或预防；(9)腱的脂 类变性得到治疗或预防；(10)腱的钙化得到治疗或预防；(ll)腱的纤维软骨 和骨的组织转化得到治疗或预防；(12)腱的纤维结构得到维持；(13)腱中的 纤维排列得到维持；(14)腱正常的血管供应得到维持；(15)腱中正常的细胞 构成得到维持；(16)腱中正常的ECM含量得到恢复；和/或(17)腱的质量、 抗张强度和/或柔性品质得到维持。例如，施用有效量的抑制剂来至少20、 30、 40、 50、 100、 200、 300、 400或500%地减緩腱的退化(例如腱质量的、 结构组成、和/或对微撕裂和疼痛敏感性的损失)。
在一些实施方案中，用于本发明方法的组合物还包含可药用的赋形剂。 如本文所用，词语"可药用的赋形剂，，指的是任意和所有与药物施用兼容的 溶剂、*剂、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和延迟吸收剂等。本领 域熟知此类介质和物质作为药物活性物质的用途。组合物也可以含有其它 提供补充的、额外的或者增强的治疗功能的活性化合物。药物组合物也可 以与施用说明一起包括在容器、包装或者分样器(dispenser)中。与本发明方法联合施用的药物组合物应当被配制成与其预期的施用途 径兼容。此类制剂的实例包括结晶蛋白质制剂，其是以棵露的或者与生物
可降解聚合物(例如PEG、 PLGA)组合来提供。
用于本发明方法的抑制剂可以作为药物组合物与载体凝胶和基质或者 其它用于引导骨再生和/或骨替换的组合物一起施用。此类基质的实例包括 合成的聚乙二醇(PEG)、羟磷灰石、基于胶原和血纤蛋白的基质、Tisseel 血纤蛋白胶等。
在一些实施方案中，抑制剂可以与其它治疗性化合物例如NSAID、皮 质类固醇、 一氧化氮、睾酮、雌激素、生长因子(例如BMP-12、 BMP-13 和MP52)《且合或伴随地施用。
用于本发明方法的抑制剂可以被包被在腱植入物、基质和贮存系统上、 或者掺入其中来促进治疗或预防腱损伤。
实施例
实施例l:大鼠冈上肌腱由于过度使用表达软骨标记
了研究。先前已经描述了腱过度使用的大鼠模型。Soslowsky等人，J Shoulder Elbow Surg 9:79-84 (2000)。已经表明，炎性和生血管标记在这个 模型中被改变(Perry等人，J Shoulder Elbow Surg 14:79S-83S (2005))，但采
取更广泛的途径来理解围绕过度使用损伤的事件。
对24只雄性Sprague-Dawley大鼠(400-450 g)进行冈上肌腱(SST)过度 使用方案1周(11=8)、 2周(11=8)和4周(11=8)。方案由每周5天、每天l小时的以 17米/分钟的下坡跑(10%坡度)组成。额外的6只大鼠用作笼内活动的对照 (时间0)。在每个时间点，两只额外的非跑动大鼠被用作年龄匹配的同龄 组对照。
在尸体剖检时，从每个肩部取出冈上肌腱，并从每个膝部取出膝腱 (PT)。膝腱用作运动效果的内参，因为用此方案其不显示过度使用的明显 征状。称量采集的腱，并速冻在液氮中。将组织冷冻破碎，并用TRIzol试剂(英杰生命科技公司(Invitrogen ))抽提。用RNeasy试剂盒(强基因公司 (QIAGEN))从抽提物的水相中分离RNA。用分光光度计测定RNA的浓 度。监测大于30，000个转录物表达水平的转录概况分析用Affymetrix大鼠基 因组230 2.0阵列进行。对所有阵列图像都在视觉上检查缺陷和品质。在进 一步的分析中排除高背景、低信号强度、或者主要缺陷的阵列。信号值用 Gene Chip Operating System 1.0 (GCOS， Affymetrix)测定。对于每组阵列， 将统计值标准化为100的平均信号强度值。将默认的GCOS统计值用于所有 分析。如果基因在任意组织中的平均表达大于100个信号单位、并且具有通 过GCOS默认设置测定的Present (P) call的样品百分数大于或者等于66。/。， 那么就认为基因是可检测的。将标准化的信号值转变为底数为10的对数。 如果ANOVA检测的p值《.01，并且在任意时间点跑动和对照间的差异都为 至少2倍，那么就认为基因是差异表达的。
过度^f吏用后，在冈上肌腱中超过400个基因受到差异调节。通过跑动4 周，107个基因受到上调，并且27个基因受到下调。在最高上调的基因中， 许多是在软骨组织中高度表达的，其中包括II型胶原al、多功能蛋白聚糖 和聚集蛋白聚糖。这些结果表明，过度使用的腱转变为纤维软骨的表型。 这些相同基因在跑动动物的膝腱中未受到上调(见图l-7)。 实施例2:制备siRNA抑制剂
siRNA如下选择，即通过将CS-GalNAcT-l、 GalNT-l或Hs3stl的核苷
列输入商业网站(例^口sirnawizard.com或Ambion⑧siRNA Target Finder)来设计特异的siRNA。序列选择指导包含在这些工具中。
siRNA的功效通过将其转染进入C-20/A4和/或C-28/I2软骨细胞，并通 过实时RT-PCRJli测CS-GalNAcT-l和/或GalNT-l的表达来测量。具相同核 普酸组成的适当乱序(scramble)siRNA被用作实验对照。
实施例3:蛋白聚糖合成的抑制剂的体外测试系统
如果siRNA能够降低C-20/A4和/或C-28/I2软骨细胞中CS-GalNAcT-l、 GalNT-l或Hs3stl的表达，那么就测试其降低蛋白聚糖GAG侧链产生的能 力。用BMP-2蛋白质或表达BMP-2的腺病毒处理C-20/A4和/或C-28/I2软骨细胞来刺激细胞外基质和GAG的合成。将siRNA或者备选地，小分子、GAG 合成的抑制剂加入到培养物中，并通过比较在存在或不存在抑制剂时35S 到蛋白聚糖中的掺入来评估抑制剂的效果。备选地，通过用DMMB测定比 较在存在或不存在抑制剂时GAG的水平来评估抑制剂的效果，如Arai等人， Osteoarthritis and Cartilage 12:599-613 (2004)中所述。
实施例4:通过CS-GalNAcT-l、 GalNT-l或Hs3stl的siRNA抑制来治疗 肌腱病变的方法
用跑台过度使用方案(实施例l)或者局部注射PGE1、 PGE2或培氟 沙星(300 mg/ml)l周(每周5次)来在大鼠中+秀导肌腱病变。
一旦在体外发现siRNA降低了CS-GalNAcT-l、 GalNT-l或Hs3stl的活 性，就将其转换为shRNA，并将shRNA序列克隆和插入腺病毒，例如Krom 等人，BMC Biotech 6(11):[电子发行]中所述。使用腺病毒来在体内表达 shRNA、并随后抑制CS-GalNAcT-l和/或GalNT-l的表达。将注射方法在 初级腱细胞中进行优化。
将表达shRNA的功能性腺病毒直接注射ii7v受损的腱(Mehta等人，J Hand Surg 30A(1):136-41 (2005))来局部降低CS-GalNAcT-l和/或GalNT-l 基因的表达。包括乱序序列(Scramble sequence )作为实验对照。通过评 估GAG水平来评估腱中软骨组织形成的量。使用组织学的爱茜蓝染色来检 测腱组织中糖胺聚糖(GAG)的增加的量。使用DMMB试剂定量从腱中抽提 的石克酸化GAG的量。
抑制CS-GalNAcT-l和/或GalNT-l对肌腱病变的效果的体内评估通过 组织学和腱强度的机械性或功能性检测来测定。如果与未处理的对照相比， GAG水平显著下降和/或被降低到与正常、未受损伤的腱相似的水平，就认 为抑制剂是有效的。备选地，当与未处理的对照相比，如果功能或机械测 试证明改善的功能和/或降低的疼痛，就认为抑制剂是有效的。
权利要求
1. 在患者中治疗肌腱病变的方法，其包括降低患者腱组织中软骨特异性蛋白聚糖的形成。
2. 权利要求l的方法，其中所述的患者为人。
3. 权利要求l的方法，其中所述的患者选自灵长类、猴、啮齿动物、 羊、兔、狗、豚鼠、马、牛和猫。
4. 权利要求l的方法，其包括降低患者腱组织中涉及蛋白聚糖合成的 酶的活性，所述蛋白聚糖选自聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖和多配体蛋 白聚糖-3。
5. 权利要求1的方法，其包括降低患者腱组织中硫酸软骨素N-乙酰氨 基半乳糖基转移酶1(CS-GalNAcT-l)和/或半乳糖胺多肽N-乙酰氨基半乳 糖基转移酶l(GalNT-l)的活性。
6. ^又利要求1的方法，其中所述的活性通过抑制CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、 Hs3stl和/或GalNT-l的酶活性来降低。
7. 冲又利要求l的方法，其中所述的活性通过抑制CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、 Hs3stl和/或GalNT-l基因的表达来降4氐。
8. 权利要求l的方法，其包括降低涉及软骨产生的转录因子的活性。
9. 权利要求8的方法，其包含降低Sox9的活性。
10. 权利要求9的方法，其中所述的活性通过抑制Sox9增强软骨特异 性基因表达的能力来降低。
11. 权利要求8的方法，其中所述的活性通过抑制Sox9基因的表达来 降低。
12. 权利要求l的方法，其包括降低软骨特异性蛋白质的表达。
13. 权利要求12的方法，其包括降低选自聚集蛋白聚糖、多功能蛋白 聚糖和多配体蛋白聚糖-3的蛋白聚糖的表达。
14. 权利要求12的方法，其包括降低Col2al的表达。
15. 权利要求l的方法，其中所述的肌腱病变为腱炎。
16. 权利要求l的方法，其中所述的肌腱病变为肌腱变性。
17. 权利要求l的方法，其中所述的肌腱病变为腱损伤。
18. 在患者中治疗肌腱病变的方法，其包括向患者的腱组织中施用 CS画GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2 、 GalNT-l、 Hs3stl和/或Sox9的抑制剂。
19. 权利要求18的方法，其中所述的抑制剂降低CS-GalNAcT-l和/ 或GalNT-l的酶活性。
20. 权利要求18的方法，其中所述的抑制剂降低CS-GalNAcT-l和/ 或GalNT-l的表达。
21. 权利要求18的方法，其中所述的抑制剂局部施用。
22. 权利要求18的方法，其中所述的抑制剂包含干扰性RNA分子。
23. 权利要求18的方法，其中所述的抑制剂包含小分子。
24. 在患者中治疗肌腱病变的方法，其包括降低患者腱组织中软骨特 异性蛋白质的表达。
25. 权利要求24的方法，其包括抑制聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖 和/或II型胶原的表达。
26. 权利要求24的方法，其包括抑制Sox9的表达。
27. 权利要求24的方法，其包括抑制Sox9的活性。
28. 鉴定治疗肌腱病变的物质的方法，其包括向需要治疗的受试者施 用测试物质，并测量该物质抑制腱组织中涉及糖胺聚糖(GAG)生物合成 的酶的活性的能力。
29. 鉴定在治疗肌腱病变中有用的化合物的方法，其包括向需要治疗 的受试者施用测试化合物，并测量化合物抑制腱组织中涉及糖胺聚糖合成 的酶的活性的能力。
30. 根据权利要求29的方法，其进一步包括步骤(a) 提供至少一种选自CS-GalNAcT-l、 CS-GalNAcT-2、石危酸乙酰肝 素(葡糖胺)3-0-磺基转移酶1、 GalNT-l和Sox9的样品成分；(b) 将样品与测试化合物组合；(c) 测量样品成分应答测试化合物的活性；以及(d)确定测试化合物是否抑制样品成分的活性。
31. 化合物在制备治疗肌腱病变的药物中的用途，所述化合物降低软 骨特异性蛋白聚糖的形成。
32. 根据权利要求31的用途，其中所述的化合物降低涉及软骨合成的 酶或其它蛋白质的活性。
33. 根据权利要求32的用途，其中所述的化合物直接或间接抑制酶或 蛋白质的功能。
34. 根据权利要求32或33的用途，其中所述的化合物抑制酶或蛋白 质的表达。
35. 才艮据权利要求32至34中任意一项的用途，其中所述的酶选自 UDP-D-木糖:核心蛋白质P-D-木糖基转移酶、Gal转移酶、GlcA转移酶、 GlcNAc转移酶、磺基转移酶、硫酸软骨素合酶和硫酸乙酰肝素磺基转移 酶。
36. 根据权利要求35的用途，其中所述的酶选自硫酸软骨素N-乙酰氨 基半乳糖基转移酶1(CS-GalNAcT-l)、硫酸软骨素N-乙酰氨基半乳糖基转 移酶2(CS-GalNAcT-2)、半乳糖胺多肽N-乙酰氨基半乳糖基转移酶 1(GalNAcT-l)和硫酸乙酰肝素(葡糖胺)3-0-磺基转移酶1(Hs3stl)。
37. 才艮据权利要求31的用途，其中所述的化合物降低软骨特异性结构 蛋白质的表达。
38. 根据权利要求31的用途，其中所述的化合物降低涉及软骨特异性 结构蛋白质表达的转录因子的活性。
39. 根据权利要求38的用途，其中所述的转录因子为Sox9。
40. 根据权利要求31至39中任意一项的用途，其中所述的蛋白聚糖 选自聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、多配体蛋白聚糖-3和II型胶原。
41. 根据权利要求31至40中任意一项的用途，其中所述的肌腱病变 选自肌腱炎、腱炎、肌腱变性、腱围炎、腱鞘炎、腱损伤、腱创伤、腱周 围炎和paratenonitis。
42.根据权利要求31至41中任意一项的用途，其中向选自灵长类、 猴、啮齿动物、羊、兔、狗、豚鼠、马、牛和猫的患者施用药物。
全文摘要
本发明提供治疗肌腱病变的方法。治疗或预防的病症包括腱炎、肌腱炎、肌腱变性、腱围炎、腱鞘炎、腱过度使用损伤和创伤、腱周围炎、paratenonitis或其它腱变性病症。公开的治疗方法包括向患者施用有效量的、涉及肌腱病变的腱中软骨或纤维软骨形成的分子的抑制剂来治疗或预防腱变性病症、减缓腱退化、恢复腱的健康结构、刺激腱的再生、和/或维持腱的质量和/或品质。
文档编号A61K48/00GK101432026SQ200780015676
公开日2009年5月13日 申请日期2007年3月2日 优先权日2006年3月3日
发明者J·M·阿查姆褒特, S·叶林斯基 申请人:惠氏公司