赖氨酸-基聚合连接基的制作方法

专利名称：赖氨酸-基聚合连接基的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物递送体系。特别是，本发明涉及含支链部分的聚合物-基药物递送体系，该支链部分提供多个末端氨基以改善某些生物活性部分的 负载和递送。
背景技术：
在这几年中，提出了许多方法用于将治疗剂递送进体内和改善那些药剂 的生物利用率。 一种尝试是包括这种药剂作为可溶性运输体系的一部分。这 种运输体系可包括固有的缀合物-基体系或前药。特别是，聚合物运输体系 可改善药剂的溶解性和稳定性。例如，水溶性的聚环氧烷与治疗部分如蛋白 质和多肽的缀合是已知的。参见，例如，美国专利4，179，337，其公开在此引 入作为参考。该'337专利公开了由PEG修饰的生理活性的多肽在体内循环延 长的时间，且具有减少的免疫原性和抗原性。
也认识到其它改进。例如，含节基消除体系、三烷基锁定体系等的聚 合物-基药物递送平台体系公开于Enzon Pharmaceuticals作为可释放递送蛋 白质、肽和小分子的一种方式。也参见Greenwald等人J. Med. Chem. Vol. 42, No. 18, 3657-3667; Greenwald等人J. Med. Chem. Vol. 47, No. 3, 726-734; Greenwald等人，J. Med. Chem. Vol. 43, No. 3, 475-487。上述每一个的内容在 此引入作为参考。
为将治疗剂如小分子和寡核苷酸缀合至聚环氧烷(polyalkylene oxide)， 聚合物的羟基端基团必须首先转化为反应性官能团(fonctional group)。该过程经常涉及"活化"且该产物称为"活化的聚环氧烷"。其它聚合物类似被活化。 尽管上述尝试和优点，但仍在寻求在PEG和聚合物缀合技术(如具有较 高治疗剂负载的聚合物)中进一步的改进。本发明解决了这种需求以及其它 问题。

发明内容
为克服上述问题且改进药物递送技术，由此提供新的支链聚合物和以 此制备的缀合物。
在本发明一个方面，提供式(I)的化合物
、， R, b H~~丫2一(Li)c Rs
L卜3和L，卜3为独立选择的双官能连接基(biftmctional linker); Y,和Y、独立地为0、 S或NR2o;
R2.7、 R，2-6和R20独立地选自氢、Cw烷基、C2—6烯基、C2—6炔基、C3.19 支链烷基、C^环烷基、C^取代的烷基、C2—6取代的烯基、C2-6取代的炔 基、C3-8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、Q-6杂 烷基、取代的d.6杂烷基、d.6烷氧基、芳氧基、Cw杂烷氧基、杂芳氧基、 Cw烷酰基、芳基羰基、C2.6烷氧基羰基、芳氧基羰基、C2—6烷酰基氧基、
其巾
R,为基本上非抗原性的水溶性聚合物; A为封端基团或芳基羰基氧基、C2—6取代的烷酰基、取代的芳基羰基、C2_6取代的烷酰基氧 基、取代的芳氧基羰基、C2_6取代的烷酰基氧基和取代的芳基羰基氧基；
Rwo和R，9—K)独立地选自氢、OH、离去基团、官能团、靶向基团、诊 断剂和生物活性部分；
(a) 和(a，)独立地为0或正整数；
(b) 和(b，)独立地为正整数；和
(c) 、 (c，)、 (d)、 (d，)、 (e)和(e，)独立地为0或1. 在本发明一些优选的方面，所述聚合物药物-递送体系包括赖氨酸。 在一些优选的方面，本发明连接至支链部分的至少一个官能团缀合至
靶向部分。
在一些优选的方面，本发明连接至支链部分的至少一个官能团缀合至
生物活性部分。
在一些特别优选的方面，R,包括分子量为约5,000至约60,000的直链 或支链的聚(乙二醇)残基，Y,和Y、为0, Yw和Y，2—3为NH， (a)和(a，)为0 或1, (b)和(b，)为约2至约4, (c)、 (c，)、 (d)和(d，)为0，且(e)和(e，)为1。在
一个具体方面，R2-7、 R，2-6和R2Q选自氢、曱基和乙基，且每个更优选氢。
在本发明另 一方面，提供制备本文所述的化合物的方法和使用本文所 述的化合物的治疗方法。
本文所述含支链部分的聚合物运输体系的 一 个优点为技术人员能增加
药物(medicinal agent)的负载。本文所述的聚合物体系的另 一优点允许连接第 二药物(agent)。支链部分上的多取代将使本领域技术人员能将其连接第二药 物以具有用于治疗的协同作用，或连接靶向基团以选择性靶向递送。本文所 述的聚合物递送体系使得将药物靶向至治疗位点。
基于支链部分的本文所述的聚合物运输体系的另一优点为所述聚合物 输送体系具有改善的稳定性。不限于任何理论，聚合物和如官能团、生物活 性部分和靶向基团的部分之间的共价键周围的疏水微环境防止共价键暴露 于能改变共价键的碱性水性介质或酶，从而稳定该共价键。聚合物体系的稳 定性也使得在连接至耙向基团或生物活性部分之前长期储存。
为本发明的目的，术语"生物活性部分"和"生物活性部分的残基"应理 解为是指生物活性化合物的部分，其在生物活性化合物经历取代反应(在该 取代反应中连接运输载体部分)后保留。200780034217.2
说明书第4/38页
除非另有限定，为本发明目的
术语"烷基"应理解为包括直链、支链、取代的(例如，被卣素-、烷氧基-
和硝基-取代的)Cw2烷基、C3—8环烷基或取代的环烷基等；
术语"取代的，，应理解为包括加入一个或多个原子，或用一个或多个不 同原子替换官能团或化合物中含有的 一个或多个原子；
术语"取代的烷基"包括羧基烷基、氨基烷基、二烷基氨基、羟基烷基 和巯基烷基；
术语"取代的环烷基"包括如4-氯环已基的部分；芳基包括如萘基的部 分；取代的芳基包括如3-溴苯基的部分；芳烷基包括如曱苯曱酰基的部分； 杂烷基包括如乙基噻吩的部分；
术语"取代的杂烷基"包括如3-曱氧基-p塞吩的部分；烷氧基包括如曱氧 基的部分；且苯氧基包括如3-硝基苯氧基的部分；
术语"卣素"应理解为包括氟、氯、碘和溴；且
术语"足够量"和"有效量"在本发明中是指达到治疗效果的量，该效果 为本领域技术人员所理解。
附图简述


图1示例性阐述实施例l-2所述的合成方法。 图2示例性阐述实施例3-8所述的合成方法。 图3示例性阐述实施例9-14所述的合成方法。 图4示例性阐述实施例15-17所述的合成方法。 图5示例性阐述实施例18-21所述的合成方法。
发明详述 A. 概述
在本发明一个方面，提供式(I)的化合物Y，
R2 丄？"^~~丫2—(h)c—R9
A——R，——(L3)e—C-C'
~丫3-(L2)d—R10
R6
(I)
其中
R,为基本上非抗原性的水溶性聚合物; A为封端基团，或
R'9一(L'1)c'一丫'2
R'10—(L'2)d'—Y'3
L卜3和L，w为独立选择的双官能连接基；
Yi和Y、独立地为0、 S或NR加；
Yw和丫，2.3独立地为O、 S、 SO、 S02或NR7;
Rw、 R，2-6和R2Q独立地选自氢、Q-6烷基、C2-6烯基、C2_6炔基、C3_19 支链烷基、C3—8环烷基、Cw取代的烷基、C2—6取代的烯基、C2-6取代的炔 基、C3—8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、Q-6杂 烷基、取代的Q—6杂烷基、d—6烷氧基、芳氧基、d—6杂烷氧基、杂芳氧基、 C2—6烷酰基、芳基羰基、C2—6烷氧基羰基、芳氧基羰基、C2.6烷酰基氧基、 芳基羰基氧基、C2-6取代的烷酰基、取代的芳基羰基、C2—6取代的烷酰基氧
基、取代的芳氧基羰基、C2.6取代的烷酰基氧基和取代的芳基羰基氧基；
Rwo和RVi。独立地选自氢、OH、离去基团、官能团、靶向基团、诊 断剂和生物活性部分；
(a) 和(a，)独立地为0或正整数，优选0或1至3的整数且更优选0;
(b) 和(b，)独立地为正整数，优选约1至约10,更优选约2至约6且最优 选4;禾口
(c) 、 (c,)、 (d)、 (d，)、 (e)和(e，)独立地为0或1。在本发明这些方面，可用于取代的取代基，其中相应于R2.7、 11，2.6和 R20的部分表示可被取代，可包括例如，酰基、氨基、酰胺基、脒、芳烷基、
芳基、叠氮基、烷基巯基、芳基巯基、羰基、羧酸基(carboxylate)、氰基、 酯、醚、曱酰基、卣素、杂芳基、杂环烷基、羟基、亚氨基、硝基、硫代羰 基、硫代酯(thioester)、硫代乙酸基(thioacetate)、硫代曱酸基(thioformate)、 烷氧基、磷酰基、膦酸基(phosphonate)、次膦酸基(phosphinate)、曱硅烷基、 巯基、硫酸基(sulfate)、磺酸基(sulfonate)、氨磺酰基(sulfamoyl)、磺酰胺基 (sulfonamide)禾口磺酰基。
在本发明另一方面，所述生物部分包括含-NH2的部分、含-OH的部分 和含-SH的部分。
在另一方面，A可选自H、 NH2、 0H、 C02H、 C!-6烷氧基和CN6烷 基。在一些其它优选的实施方案中，A可为曱基、乙基、曱氧基、乙氧基、 H和OH。 A更优选曱基或曱氧基。
这一个具体实施方案中，本文所述化合物具有式(II):
在一些优选实施方案中
本文所述化合物可为
例如，
在更优选的实施方案中
本文所述化合物可为例如
N' H其中，A为封端基团，或
<formula>formula see original document page 28</formula> ;和
所有其它变量如上定义。
在一些优选实施方案中，R2_7、 RV6和R2Q独立地为氢或CH3。在一些 特别优选的实施方案中，R2.8、 R，2-8和R2。都为氢或CH3。在其它具体实施方 案中，R3_6和R，3-6包括氬和CH3。在其它具体实施方案中，Y,包括O和NR20, 且112.8、 R，2.s和R4包括氢、C,.6烷基、环烷基、芳基和芳烷基。
B.基本上非抗原性的水溶性聚合物
本文所述的化合物所用的聚合物优选为水溶性聚合物且基本上为非抗 原性的如聚环氧烷(PAO，s)。
在本发明一个方面，本文所述的化合物包括直链的、末端支链的或多 臂的聚环氧烷。在本发明一些优选的实施方案中，所述聚环氧烷包括聚乙二 醇和聚丙二醇。
聚环氧烷的平均分子量为约2,000至约100,000道尔顿，优选约5，000 至约60,000道尔顿。该聚环氧烷可更优选约5,000至约25,000或约20，000 至约45,000道尔顿。在一些特别优选的实施方案中，本文所述的化合物包括 平均分子量约12,000至约20,000道尔顿或约30,000至约45,000道尔顿的聚 环氧烷。这一个具体实施方案中，聚合物部分的分子量为约12,000或40,000 道尔顿。
所述聚环氧烷包括聚乙二醇和聚丙二醇。更优选，所述聚环氧烷包括 聚乙二醇(PEG)。 PEG通常由以下结构所表示 -O-(CH2CH20)n-
其中(n)代表聚合物的聚合度，且其取决于聚合物的分子量。或者，本发明聚 乙二醇(PEG)残基部分可选自 -Y71-(CH2CH20)n-CH2CH2Y71-, -Y71-(CH2CH20)n-CH2C(=Y72)-Y71-，
-Y7l-C(=Y72)-(CH2)a71-Y73-(CH2CH20)n-CH2CH2-Y73-(CH2)a71-C(=Y72)-Y71-,和
-Y71-(CR7iR72)a72-Y73-(CH2)b7i-0-(CH2CH20)n-(CH2)b71-Y73-(CR7iR72)a72-Y7-,
其中
丫71和Y"独立地为O、 S、 SO、 S02、 NR"或化学键； Y"为O、 S或NRm;
1171.74独立地为与可用于R2的部分相同的部分；
(a71)、 (a72)和(b71)独立地为0或正整数，优选0-6,且更优选1;和
(n)为约10至约2300的整数。
支链的或U-PEG衍生物描述于美国专利5,643,575 、 5，919，455 、
6,113,906和6,566,506，且每篇的公开内容在此引入作为参考。这些聚合物
的非限制性实例相应于具有以下结构的聚合物体系(i) - (vii): o
<formula>formula see original document page 29</formula><formula>formula see original document page 30</formula>
其中
丫61.62独立地为O、 S或NR^;
丫63为O、 NR62、 S、 SO或S02
(w62)、 (w63)和(w64)独立地为O或正整数； (w61)为0或1; mPEG为曱氧基PEG
其中PEG如上定义且该聚合物部分的总分子量为约2,000至约 100,000道尔顿；且
Rw和R62独立地选自氢、Cw烷基、C2.6烯基、C2-6炔基、(:3.19支链
烷基、C^环烷基、C,-6取代的烷基、02-6取代的烯基、(32.6取代的炔基、
CYs取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、C,-6杂烷
基、取代的C,-6杂烷基、CL6烷氧基、芳氧基、d-6杂烷氧基、杂芳氧基、 C2—6烷酰基、芳基羰基、C2_6烷氧基羰基、芳氧基羰基、C2-6烷酰基氧基、 芳基羰基氧基、C^取代的烷酰基、取代的芳基羰基、C2.6取代的烷酰基氧 基、取代的芳氧基羰基、C2_6取代的烷酰基氧基、和取代的芳基羰基氧基。
在另一方面，所述聚合物包括多臂PEG-OH或"星形-PEG，，产物，如公 开于NOF Corp. Drug Delivery System catalog, Ver. 8, 2006年4月，其公开内 容在此引入作为参考。所述聚合物可使用公开于美国专利5,122,614或 5,808,096专利的活化技术转化为适当活化的形式。具体地，所述PEG可为<formula>formula see original document page 31</formula>(u，)为约4至约455的整数；且该残基的最多3个末端部分被曱基或其 它低级烷基封端。
在一些优选实施方案中，所有4个PEG臂可转化为合适的活化基团， 以促进与芳族基的连接。转化之前的这些化合物包括
<formula>formula see original document page 31</formula>H3O(0CH2CH2)u.—0 H3C-(OCH2 0
0—(CH2CH20)u.-CH3
(CH2CH20)u,—CH2CH2—OH
H3C-(OCH2CH2)u,—0 H3C-(OCH2CH2)u'za
0—(CH2CH20)u,-CH2CH2—OH
、(CH2CH20)u'—CH2CH2—OH
HO-CH2CH2-(OCH2CH2)u,—0
0—(CH2CH20)u,-CH2CH2—OH
、(CH2CH20)u,—CH3
H3C-(OCH2CH2)u.—O HO-CH2CH2-(OCH2CH2),Q
0—(CH2CH20)u.-CH2CH2—OH
、(CH2CH20)u,—CH3
H3C-(0CH2CH2)u,—O HO-CH2CH2-(OCH2CH2)u<0
O—(CH2CH20)u'-CH2CH2—OH
、(CH2CH20)u'—CH2CH2—OH
HO-CH2CH2-(OCH2CH2〉u,—Q H3C-(OCH2CH2)u.z0
HO-CH2CH2-(OCH2CH2)u.—O HO-CH2CH2-(OCH2CH2),0
和
0—(CH2CH20)u,-CH2CH2—OH
、(CH2CH20)u,—CH2CH2—OH
0—(CH2CH20)u,-CH2CH2—OH 0\(CH2CH20)u'—CH2CH2—OH
本文包括的聚合物质优选为在室温水溶性的。这些聚合物的非限制性
实例包括聚环氧烷均聚物如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧乙烯化多元 醇、其共聚物和其嵌段共聚物，条件是保持该嵌段共聚物的水溶性。
在另一实施方案中，作为基于PAO的聚合物的替代物，可使用一种或 多种有效地非抗原性物质，如葡聚糖、聚乙烯醇、基于碳水化物的聚合物、/或其共聚物。也参见共同转让
的美国专利6,153,655,其内容在此引入作为参考。本领域技术人员应理解所 使用的活化与在此所述的对PAO's如PEG所述的类型相同。本领域技术人 员将进一步认识到上述实例仅是解释性的，所有具有本文所述性质的聚合物 质都在考虑范围内。为本发明的目的，"基本上或有效地非抗原性的，，是指本 领域技术人员理解的所有物质，其为无毒的且在哺乳动物中不引起可感觉到 的免疫原应答。
在一些方面，可使用具有末端氨基的聚合物以制备本文所述的化合物。 以高纯度制备含末端胺的聚合物的方法描述于美国专利11/508,507和 11/537,172，每篇的内容在此引入作为参考。例如，具有叠氮基(azides)的聚 合物与膦—基还原剂如三苯基膦或碱金属硼氬化物还原剂如NaBEU反应。或
者，包括离去基团的聚合物与保护的胺盐如曱基-叔丁基亚氨基焦碳酸酯 (methyl-tert-butyl imidodicarbonate)的钟盐(KNMeBoc)或二-A又丁基亚氨基焦 碳酸酯(di-tert-butyl imidodicarbonate)的钾盐(KNBoc2)反应，然后脱保护该被
大于99%。
在其它方面，具有末端羧酸基的聚合物可在本文所述的聚合物递送体系
11/328,662,其内容在此引入作为参考。该方法包括首先制备聚环氧烷的叔 烷基酯，然后转化至其羧酸衍生物。制备PAO羧酸的方法的第一步包括形 成中间体如聚环氧烷羧酸的叔丁基酯。在碱如叔丁醇钾的存在下，该中间体 通过PAO与卣代乙酸叔丁基酯反应而形成。 一旦叔丁基酯中间体形成，该 聚环氧烷的羧酸衍生物能容易以纯度超过92。/。，优选超过97。/。，更优选超过 99%且最优选超过99.5%而提供。
C. 双官能连接基
双官能连接基包括氨基酸或氨基酸衍生物。所述氨基酸可为天然存在 的和非天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸的衍生物和类似物以及现有技
术已知的非天然存在的氨基酸(D或L),疏水的或非疏水的，也在本发明的考 虑范围内。合适的非天然存在的氨基酸的非限制性实例包括2-氨基已二酸、 3-氨基已二酸、(3-丙氨酸、(3-氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、Y-氨基丁
33酸(piperidinicacid)、 6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、 2-氨基庚二酸、2,4-氨基丁酸、锁链素、2,2-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、 N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、异锁链素 、另'卜异亮氨酸、N-曱基甘氨酸、肌氨酸、N-曱基-异亮氨酸、6-N-曱基-赖氨 酸、N-曱基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸和鸟氨酸。 一些优选的氨基酸残基 选自甘氨酸、丙氨酸、蛋氨酸或肌氨酸，且更优选甘氨酸。 或者，L"和L，w独立地选自<formula>formula see original document page 34</formula>-[C(=0)]v(CR22R23CR28R290)t(CR24R25)t,[C(=0)]v'-，
-[CK))]vO(CR22R23CR28R290)t(CR24R25)t'[C(=0)〗v,-,
-[C(=0)]vNR21(CR22R23CR28R290)t(CR24R25)t,[C(=0)]v'-，
-[C(=0)]v(CR22R23CR28R290)t(CR24R25)t,0[C(=0)]v'-，
-[C(=0)]v(CR22R23)t(CR24R25CR28R290)t,[C(=0)]v'-，
-[C(=0)]v(CR22R23)t(CR24R25CR28R290)t，NR26[C(=0)]v'-，
-[C(=0)]vO(CR22R23CR28R290)t(CR24R25)t'0[C(=0)]v'-，
-[C(=0)]vO(CR22R23)t(CR24R25CR28R290)t'[C(=0)]v'-，
-[C(=0)]vO(CR22R23)t(CR24CR25CR28R290)t'NR26[C(=0)]v'-，
-[C(=0)]vNR21(CR22R23CR28R290)t(CR24R25)t,0[C(=0)]v,-,
-[C(=0)]vNR21(CR22R23)t(CR24R25CR28R290)t'[C(=0)]v'-，
-[C(=0)]vNR21(CR22R23)t(CR24R25CR28R290)t,NR26[C(=0)]v'-
R化29独立地选自氢、C,-6烷基、C3_12支链烷基、CV8环烷基、Cw取
代的烷基、<:3.8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、c"杂烷基、
取代的d.6杂烷基、d.6烷氧基、笨氧基和Cw杂烷氧基；
(t)和(t，)独立地为0或正整数，优选0或约1至约12的整数，更优选约 1至约8的整数，且最优选1或2;和
其中:(v)和(v，)独立地为0或1。
在一些优选实施方案中，L,-3和L，w独立地选自
丫17
c-
38
A51 一(丄)x'" (匕14)q"
c
p1、1
—一o-
R: C —
R39 "R42
C
-(C5R44R45)-
z"
^19
k" N-C——C-(J)x11.<
, R41 —(CR46R47) m"
R43 l j n11
—，一S——S_，一
R50 I》
R
51
〇
、\
-Val-Cit-,
-Gly-Phe陽Leu-Gly-, -Ala-Leu-Ala-Leu-, -Phe-Lys-,
rnyw- Y=c
Y=c R IcO
-養-Val—Cit—C-N
O , 》 II H /=\
-〖-Phe—Lys—C-N~^^>~^
HNH^^)~~\ 乂 -卜Val-Cit、u o、 O O，
》h/n~0^ %
O 0,
-Val-Cit-C(=0)-CH2OCH2-C(=0)-, -Val-Cit-C(=0)-CH2SCH2-C(=0)-,和 -NHCH(CH3)-C(=0)-NH(CH2)6-C(CH3)2-C(=0)-
其中，
Yn—19独立地为0、 S或NR^;
R3M8、 R5G—51和As独立地选自氢、d—6烷基、(:3.12支链烷基、(:3.8环
烷基、Cw取代的烷基、C3—8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、 d—6杂烷基、取代的d.6杂烷基、d.6烷氧基、苯氧基和d-6杂烷氧基；
Ar为芳基或杂芳基部分；
L,,.,5为独立选择的双官能间隔基(spacer);
J和J'独立地选自主动运输至靶细胞的部分、疏水的部分、双官能连 接部分和其组合；
(cll)、 (hll)、 (kll)、 (zll)、 (mll)和(nll)为独立选择的正整数，优选1; (all)、 (ell)、 (gll)、 (jll)、 (oll)和(qll)独立地为0或正整数，优选l;
和
(bll)、 (xll)、 (x，ll)、 (fll)、 (ill)和(pll)独立地为0或1。 在更优选的实施方案中，Lw和L，,.3独立地选自 -[C(=0)]rNH(CH2)2CH=N-NHC(=0)-(CH2)2-, -[C(=0)]rNH(CH2)2(CH2CH20)2(CH2)2NH[C(=0)]r,-, -[C(=0)]rNH(CH2CH2)(CH2CH20)2NH[C(=0)〗r'-， -[C(=0)]rNH(CH2CH2)sNH(CH2CH2)s,[C(K))]r'-, -[C(=0)]r NH(CH2CH2)sS(CH2CH2》[C(=0)]r'-，
-[C(O)]rNH(CH2CH2)s0(CH2CH2)s'[C(=0)]r'-，
37-[C(=0)]rNH(CH2CH20)(CH2)NH[C(=0)] -[C(=0)]rNH(CH2CH20)2(CH2)[C(=0)]r'-: -[C(=0)]rNH(CH2CH20)s(CH2)s'[C(=0)]r'--「C(=0)],.NHCH2CH2NH[C(=0)〗r'-, -[C(,],NH(CH2CH2)20[C(:0)p -， -[C(=0)]rNH(CH2CH20)[C(=0)]r'_, -[C(=0)〗rNH(CH2CH20)2[C(=0)]r，-， -[C(=0)]rNH(CH2)3[C(=0)〗r'-， -[C(=0)]rO(CH2CH20)2(CH2)[C(=0)]r'-， -[C(=0)]rO(CH2)2NH(CH2)2[C(=0)]r'-， -[C(=0)]rO(CH2CH20)2NH[C(=0)]r,-， -[C(=0)]rO(CH2)20(CH2)2[C(=0)]r'-， -[C(=0)]rO(CH2)2S(CH2)2[C(=0)]r'-，
-[C(=0)]rO(CH2CH2)0[C(=0)]r'-, -[C(=0)],.0(CH2)3NH[C(=0)]r'-, -[C(,],0(CH2)30[C(O)]广， -[C(=0)]rO(CH2)3[C(=0)]r,-, -[C(=0)]rCH2NHCH2[C(=0)]r'-, -[C(=0)]rCH2OCH2[C(=0)]r，-, -[C(0)]rCH2SCH2[C(=0)]r'_, -[C(=0)]rS(CH2)3[C(=0)]r,-， -[C(=0)]r(CH2)3[C(=0)]r-，
其中，(r)和(r，)独立地为0或1。
在另一实施方案中，L,_3和LY3包括相应于上述所示的结构，但具有乙烯基、砜残基、氨基、羧基、巯基、酰肼、肼基曱酸基(carbazate)等而 不是马来酰亚胺基。
I). Rwo和RVu)基团
1. 离去基团和官能团
在一些方面，合适的离去基团包括，但不限于，卣素(Br、 Cl)、活化的 碳酸酯(acrivated carbonate)、羰基咪唑、环酰亚胺石克S同(cyclic imide thione)、 异氰酸基(isocyanate)、 N-羟基琥珀酰亚胺基、对硝基苯氧基、N-羟基邻苯二 曱酰亚胺(N-hydroxyphtalimide)、 N-羟基苯并三唑基、咪唾、曱苯磺酸基 (tosylate)、曱磺酸基(mesylate)、三氟乙基磺酸基(tresylate)、硝基苯磺酸基 (nosylate)、 C,-(36烷氧基、C,-C6烷酰基氧基、芳基羰基氧基、邻硝基苯氧基、 N-羟基苯并三唑基、咪唑、五氟苯氧基、1,3，5-三氯苯氧基和1,3,5-三氟苯氧 基或其它合适的离去基团，这些对于普通技术人员将是明显的。
为本发明的目的，离去基团是指能与在所需靶点上的亲核物反应的基 团，所述靶点即生物活性部分、诊断剂、靶向部分、双官能间隔基、中间体 等。因此所述耙点包含用于置换的基团，例如在蛋白质、肽、酶、天然或化 学合成的治疗分子如多柔比星和间隔基如单-保护的二胺上发现的OH、 NH2 或SH基。
在一些优选实施方案中，将聚合物运输体系连接至生物活性部分的官 能团包括可进一步缀合至生物活性基团的马来酰亚胺基、乙烯基、砜残基、 氨基、羧基、巯基、酰肼、肼基曱酸基等。
在本发明另一些优选实施方案中，Rwo和RV,o可选自H、 OH、曱氧 基、叔丁氧基、N-羟基琥珀酰亚胺基和马来酰亚胺基.
2. 生物活性部分
在本发明一些方面，生物活性部分包括胺-、羟基-或含巯基的化合物。 这些合适的化合物的非限制性实例包括有机化合物、酶、蛋白质、多肽、抗 体、单克隆抗体、单链抗体或寡核苷酸等。有机化合物包括，但不限于下述 部分，如喜树碱和类似物如SN38和伊立替康，和相关拓朴异构酶I抑制剂， 紫杉烷和紫杉醇衍生物，包括AZT的核苷，包括柔红霉素、多柔比星的蒽 环类抗生素化合物；对氨基苯胺芥子(p-aminoaniline mustard)、美法仑、Ara-C(阿糖胞苷)和相关抗代谢物化合物，例如吉西他滨等。或者，生物活性部分 可包括心血管剂、抗瘤剂、抗感染药、抗真菌药如制霉菌素和两性霉素B、 抗焦虑剂、肠胃病药、中枢神经系统活化剂、止痛剂、致育因子、避孕剂、
抗炎剂、甾体药物、anti-urecemic agents、血管扩张剂和血管收缩剂等。应 理解其它没有具体陈述但具有合适的含胺-、羟基-或巯基的基团的生物活性 物质也是预期的且也在本发明范围内。
在本发明另一方面，所述生物活性化合物适用于动物(例如，哺乳动物， 包括人)的治疗中(对于需要这种治疗的病症)的医药或诊断用途。
对适用于本文的生物活性部分的种类的唯一限制为存在至少一个含 胺-、羟基-或巯基的位置，其可与载体部分反应和连接，且在以缀合至本文 所述的聚合物运输体系的形式时生物活性没有实质损失。或者，适于掺入本 发明的聚合运输缀合物化合物的母体化合物可在从连接的化合物水解释放 后有活性，或水解释放后没有活性但在经历进一步化学过程/反应后变得有活 性。例如， 一种由聚合运输体系递送至血流的抗癌药，可保持无活性直到进 入癌细胞或肺瘤细胞，然后其被癌细胞或肺瘤细胞化学作用活化，例如，被 该细胞独有的酶反应活化。
本发明另 一方面提供任选用连接至本文所述聚合物运输体系的诊断标 记制备的缀合物化合物，其中该标记由诊断或成像目的选择。因此，合适的 标记通过将任何合适部分(例如，氨基酸残基)连接至任何现有技术标准的放 射同位素、射线不透性标记、磁共振标记或其它适用于磁共振成像的非放射 性同位素标记、荧光型标记、显示可见颜色的标记和/或能在紫外线、红外线 或电化学刺激下发焚光的标记而制备，以使在手术过程中成像肿瘤组织，等 等。任选地，将诊断标记掺入和/或连接至缀合的治疗部分，以使得监测治疗 性生物活性物质在动物或人患者中的分布。
在本发明另 一方面，本发明的标记的缀合物可通过现有技术已知的方 法使用任何合适的标记(包括，例如、放射性同位素标记)而容易的制备。仅
仅作为实例，这些包括'"碘、'"碘、,锝和/或川铟以制备放射免疫-闪烁 剂以用于在体内肺瘤细胞中的选择性摄取。例如，存在许多现有技术已知的
方法以将肽连接至Tc-99m，包括，仅仅作为实例，公开于美国专利5，328，679; 5,888,474; 5,997,844;和5,997,845中的那些，在此引入作为参考。3.把向基团
在一些方面，本文所述的化合物包括耙向基团。所述靶向基团包括受体 配体、抗体或抗体片段、单链抗体、耙向肽、乾向碳水化物分子或凝集素。 l巴向基团增强乾组织和细胞群对本文所述的化合物的结合或摄取。例如，耙
向基团的非限制性实例包括血管内皮细胞生长因子、FGF2、生长抑素和生 长抑素类似物、转铁蛋白、促黑素、ApoE和ApoE肽、维勒布兰德氏因子(von Willebrand's Factor)和维勒布兰德氏月太(von Willebrand's Factor p印tides)、 &泉病 毒纤维蛋白.和腺病毒纤维蛋白肽、PD1和PD1肽、EGF和EGF肽、RGD肽、 叶酸等。在本发明另一方面，所述靶向基团包括单克隆抗体、单链抗体、生 物素、细胞粘附肽、细胞穿透肽(cell penetrating peptides) (CPPs)、荧光化合 物、放射标记的化合物和适体(aptamers)。在本发明另一方面，所述耙向试剂 可包括选择蛋白、TAT、穿膜肽(Penetratin)、 PolyArg和叶酸。
E. 合成聚合物递送体系
形成具有支链单元的聚合物。在本发明一个方面，制备本文所述化合物的方 法包括
^形式的
支链部分的式(IV)的化合物反应
<formula>formula see original document page 41</formula>其中R,为基本上非抗原性的水溶性聚合物;A,为封端基团或M,;A2为封端基团或Mj为-OH、 SH或一NHR3o;M2为OH或离去基团，该离去基团选自卣素、活泼的碳酸酯 (carbonates)、活泼的酯、异氰酸基(isocyanate)、 N-羟基琥珀酰亚胺基、 曱苯磺酸基、曱磺酸基、三氟乙基磺酸基、硝基苯磺酸基、邻硝基苯 氧基和。米唑；M3.4和M，3-4为独立选择的保护基团，其选自叔-Boc (叔丁基氧基 羰基)、Cbz (千氧羰基)和TROC (三氯-乙氧基羰基)；L3和L，3为独立选择的双官能连接基；Y,和Y，,独立地为O、 S或NR2o;Yw和丫，2.3独立地为O、 S、 SO、 S02或NR7;R2-7、 R，2.6、 R加和R邓独立地选自氢、C,_6烷基、(:2-6烯基、C2—6炔 基、(33.19支链烷基、<:3.8环烷基、C"取代的烷基、(32.6取代的烯基、C^取代的炔基、C3-8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取 代的杂芳基、Q_6杂烷基，取代的d-6杂烷基、d-6烷氧基、芳氧基、c^杂烷氧基、杂芳氧基、(:2.6烷酰基、芳基羰基、c2.6烷氧基羰基、芳氧基羰基、C2.6烷酰基氧基、芳基羰基氧基、C2，6取代的烷酰基、取代的芳基羰基、C2—6取代的烷酰基氧基、取代的芳氧基羰基、C2.6取 代的烷酰基氧基和取代的芳基羰基氧基；(a) 和(a，)独立地为0或正整数，优选0或1至3的整数且更优选0.，(b) 和(b，)独立地为正整数，优选1至10,更优选2至6且最优选4; 和(e)和(e，)独立地为0或1。 可通过用强酸如三氟乙酸(TFA)或其它卣代乙酸、HC1、硫酸等或通过使用催化氢化将,<formula>formula see original document page 43</formula>其中八3为封端基团或<formula>formula see original document page 43</formula>或者，得未保护的氨基末端基团进一 步与式(VI)的化合物反应:<formula>formula see original document page 44</formula>每个R"9独立地为靶向基团、诊断剂或生物活性部分；M5为-OH或离去基团；每个L",独立地为双官能连接基；和每个(c)独立地为0或1.支链部分与聚合物部分的连接或含支链部分的聚合物体系与式(VI)的 化合物的缀合优选在偶联剂的存在下进行。合适的偶联剂的非限制性实例包 括1,3-二异丙基碳二亚胺(DIPC)、任何合适的二烷基碳二亚胺、2-卣代-l-烷 基-p比啶镄卣化物(Mukaiyama试剂)、l-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺 (EDC)、丙烷膦酸环酐(PPACA)和苯基二氯磷酸酯等，其可从例如商业来源 如Sigma-Aldrich Co.获得或使用已知技术合成。优选地，所述反应在惰性溶剂如二氯曱烷、氯仿、DMF或其混合物中 进行。该反应可优选在碱的存在下进行，所述碱如二曱基氨基吡咬(DMAP)、 二异丙基乙基胺、吡啶、三乙胺等，以中和任何产生的酸。该反应可在约0。C 至约22。C(室温)下进行。由本文所述方法制备的一些具体实施方案包括<formula>formula see original document page 45</formula><formula>formula see original document page 46</formula><formula>formula see original document page 47</formula><formula>formula see original document page 48</formula><formula>formula see original document page 49</formula><formula>formula see original document page 50</formula><formula>formula see original document page 51</formula><formula>formula see original document page 52</formula>mPEG具有式CH30(CH2CH20)n-;PEG具有式-0(CH2CH20V ,(n)为约10至约2，300的整数；和
Rwq和RVn)独立地选自靶向基团、诊断剂和生物活性部分F.治疗方法
技术领域：
本发明另一方面，提供治疗哺乳动物多种医学病况的方法。该方法包括向需要这种治疗的哺乳动物给药有效量的本文所述化合物。该聚合缀合物化合物尤其用于治疗哺乳动物中与用母体化合物治疗的疾病类似的疾病、例如，酶替代疗法、肿瘤性疾病、减少肿瘤负荷、仿止赘生物转移和防止肿瘤/赘生物生长。
给药的聚合缀合物的量，将取决于其中包含的母体分子的量。通常，治疗方法中使用的聚合缀合物的量是在哺乳动物中有效达到所需治疗结果的量。通常，不同聚合缀合物化合物的剂量将依据母体化合物、聚合物分子量、体内水解速率等而稍有改变。本领域技术人员将基于临床实验和治疗效果确定所选的聚合运输缀合物的最佳剂量。实际剂量将对本领域技术人员是明显的，而不用过多的实验。
本发明的化合物可包含于一种或多种合适的药物组合物以向哺乳动物给药。所述药物组合物可为根据现有技术已知方法制备的溶液、混悬液、片剂、胶嚢等。也预期这些组合物的给药可通过口服和/或肠胃外途径，这取决于技术人员的需要。例如，可使用组合物的溶液和/或悬浮液作为载体溶媒以通过任何本领域已知的方法注射或滴注该组合物，例如，通过静脉注射、肌肉注射、腹膜注射、皮下注射等。这种给药也可通过输注进入体间隙或体腔，以及通过吸入和/或鼻内途径。然而，在本发明的优选方面，所述聚合缀合物通过肠胃外向需要的哺乳动物给药。
实施例
提供以下实施例以进一步理解本发明，但不是以任何方式限制本发明的范围。实施例中的黑体数字相应于附图中所示的那些。整个实施例中使用缩写，例如DCM(二氯曱烷)、D正A(二异丙基乙基胺)、DMAP(1二曱基氨基吡咬)、DMF (N,N，-二甲基甲酰胺)、DSC (二琥珀酰亚胺基碳酸酯)、EDC(l-(3-二曱基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)、IPA(异丙醇)、NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)、PEG(聚乙二醇)、SCA-SH(单链抗体)、SN38 (7-乙基-10-轻基喜树碱)、TBDPS (叔丁基-二丙基曱硅烷基)和TEA(三乙胺)。
一般方法.所有反应在干燥氮气氛或氩气氛中进行。使用商业试剂没有进一步纯化。所有PEG化合物在使用前真空干燥或通过从曱苯共沸蒸馏。除非另有所述，使用VarianMercury300NMR光谱仪，且使用氘代氯仿作为溶剂，以300 MHz获得NMR谱，以75.46 MHz获得13C NMR谱。化学位移(5)以距低场四曱基硅烷(TMS)的百万分率(ppm)记录。
HPLC方法.反应混合物和中间体和最终产物的纯度通过BeckmanCoulter System Gold HPLC仪器监测。其使用ZORBAX 300SB C8反相柱(150 x 4.6 mm)或Phenomenex Jupiter 300A CI8反相柱(150 x 4.6 mm),并具有168 Diode Array UV Detector,使用梯度为10-90 %的乙腈在0.05 %三氟乙酸(TFA)中的溶液，流速为1 mL/分钟。)
实施例1 PEG-[Lys (Boc)22，化合物(3)
共沸PEG-二胺(化合物1, Mw. 20 kDa， 25 g, 1.25 mmol)且真空去除甲苯至干。溶于200 mL的DCM中，并添加Boc-Lys-Boc (化合物2, 2.638 g, 5 mmol)和DMAP (610 mg, 5mmol)且将反应混合物冷却至0 。C保持15分钟，然后加入EDC (958 mg, 5 mmol)。使反应混合物在搅拌下温热至室温过夜。真空去除溶剂至千且残余物从2-丙醇重结晶得到14g产物.'"CNMR5 171.30， 78.3，53.44， 39.08, 38.27， 31.59, 28.72, 27.63， 27.52, 21.71。
实施例2. PEG-[Lys (NH2)2，化合物(4)
将化合物3 (14 g)溶于240 mL的TFA/DCM (1:l)混合物中且在室温搅拌4小时。真空浓缩反应混合物且通过加入乙醚沉淀残余物，且倾析出溶剂。将固体溶于60mL的0.1 MNaHC03中，并用DCM萃取直到水层变清。有机层通过无水MgS04干燥且真空去除溶剂得到粗产物，其从2-丙醇重结晶得到13g产物13CNMRS 174.4, 53.79, 39.13, 37.9， 33.55, 26.90, 21.71。实施例3. SCHAF-DGA-OH，化合物(7a)
将化合物SCH-OH (化合物SCH AF, 5.0 g, 7.135 mmol)、 DMAP (3.49 g， 28.5 mmol)和二羟乙酸酐(化合物6， 1.66 g， 14.3 mmol)溶于200 mL无水 DCM中并搅拌2小时。然后溶液用100 mL的0.1 NHC1洗涤四次并用无水 MgS04干燥。过滤溶液且真空去除溶剂。残余物在真空干燥过夜以得到产物 (5.61 g, 6.87 mmol, 96 %): I3CNMR5 10.23, 17.11, 22.07， 37.33, 38.65, 48.73, 50.69， 53.34, 55.88, 60.18, 68.03, 68.18， 68.75, 70.53， 71.96, 83.76 (JCF = 4 Hz)， 104.46 (JCF = 26 Hz), 111.18 (JCF = 20 Hz), 115.03, 116.51, 118.66, 123.53， 125.11 (JCF = 12 Hz), 125.39, 128.44 (JCF = 7 Hz)， 134,64, 144.32, 144.81, 150.21， 150.32， 153.03, 153.32, 158.78 (JCF = 244 Hz, JCF= 12Hz)， 162.59 (JCF = 248 Hz， JCF = 12 Hz), 169,07, 171.42。
实施例4. SN38-TBDPS-DGA-OH，化合物(7b)
在与实施例3相同的条件下将10-OTBDPS-SN38 (化合物SN38-TBDPS)
与化合物6反应以提供化合物7b。
实施例5. SCH-戊二酸(Glutaric)-OH，化合物(9a)
将化合物SCHAF (5.67 g, 8.10mmol)、 DMAP (20.3 g， 166 mmol)和戊二 酸酐(化合物8, 18.9 g, 166 mmol)溶于600 mL无水DCM中并搅拌过夜。然 后溶液用200 mL的0.1 N HC1洗涤三次并蒸发至胶状。然后将其溶于600 mL 乙腈/0.1M碳酸钠=1/1溶液中且搅拌4小时，然后蒸发乙腈。将产物萃取 回有机溶剂DCM中。有机层通过无水MgS04干燥。过滤溶液且真空去除溶 剂。将残余物真空干燥过夜得到所述产物(6.09 g， 7.47 mmol， 92%)。 13C NMR S 10.36, 17.27, 20.06, 22.30, 33.46, 37.43, 38.79, 49.06, 50.58, 53.37, 55.92, 60.23， 68.86, 70.69， 71.03, 83.93 (JCF = 4.7 Hz), 104.57 (JCF = 26 Hz), 111.27 (JCF = 24 Hz), 115.10, 116.59， 118.50, 123.50, 125.13， 125.48 (JCF = 12 Hz)， 128.53 (JCF = 10 Hz， JCF = 5.4 Hz), 134.51, 144.53, 145.60, 150.55， 150.69， 153.03, 158.93 (JCF = 247 Hz, JCF = 12 Hz), 162.73 (JCF = 247 Hz, JCF = 12 Hz), 172.07。
实施例6. SN38-TBDPS-戊二酸-OH，化合物(9b)以与实施例5中所述相同的条件将化合物SN38-TBDPS与化合物8反 应以提供化合物8b。
实施例7. SCH-琥珀酸(Succinic)-OH，化合物(lla)
以与实施例5中所述相同的条件将化合物SCH AF与琥珀酸酐(化合物 IO)反应以提供化合物11 a 。
实施例8. SN38-TBDPS-琥珀酸-OH，化合物(llb)
以与实施例5中所述相同的条件将化合物SN38-TBDPS与化合物10反 应以纟是供化合物11 b。
实施例9. PEG-[Lys (DGA-SCH AF)22，化合物(12a) 将化合物4 (0.5 g)溶于10 mL无水DCM中，并添加化合物7a (158 mg) 和DMAP (71 mg)。将反应混合物在水浴中冷却至0 。C然后加入EDC (74 mg)。反应混合物在室温搅拌过夜。真空部分去除溶剂且残余物以所述顺序 从IPA、 THF和DCM-乙醚(ether) (4:11, v/v)重结晶三次。分离产物且在真空 烘箱45 。C干燥过夜以得到所需产物(0.36 g， 64%产率)。通过US实验测量 的SCH AF的量为11% wt/wt: 13C丽R 5 9.71, 16.57, 21.41, 36.65， 68.09, 48.26, 49.75, 55.07， 59.52, 66.94, 67.01， 67.11， 67.14, 67.21, 67.29, 67.37, 67.42， 67.48, 67.76， 68.11， 68.83, 69.75, 70.71, 71.40, 71.54, 78.17, 78.30, 83.23, 103.84, 110.38， 110.67, 114.36, 115.68, 117.58, 122.72, 124.73， 124.84, 124.91， 127.86， 127.94, 134.33, 143.96, 144.97, 149.77, 149.82, 150.17， 152.18, 152.30， 152.43, 159.97, 160.15, 168.05, 168.21， 170.66。
实施例10. PEG-[Lys (DGA-SN38-TBDPS)2J2，化合物(12b)
以与实施例9中所述相同的条件将化合物7b与化合物4反应以提供化 合物12b。
实施例11. PEG-[Lys (戊二酸-SCH AF)22，化合物(13a)
以与实施例9中所述相同的条件将化合物8a与化合物4反应以提供化 合物13a。实施例12. PEG-[Lys (戊二酸-SN38-TBDPS)22，化合物(13b)
以与实施例9中所述相同的条件将化合物8b与化合物4反应以提供化 合物13b，
实施例13. PEG-Lys(琥珀酸-SCHAF)22，化合物(14a)
以与实施例9中所述相同的条件将化合物9a与化合物4反应以提供化 合物14a。
实施例14. PEG-[Lys(琥珀酸-SN38-TBDPS)22，化合物(14b)
以与实施例9中所述相同的条件将化合物9b与化合物4反应以提供化 合物14b。
实施例15. PEG-[Lys (DGA-SN38)2]2，化合物(15b)
将TBAF (4当量)在THF和0.05 M HC1溶液(v/v)的1:1混合物中的溶液 添加至化合物12b的水溶液中。反应混合物在室温搅拌4小时，然后，用 DCM萃取两次。将合并的有机层合并并用MgS04干燥，过滤并在真空蒸发。 残余物溶于7倍体积(volume叫uivalent)的DMF并用37倍体积的IPA沉淀。 过滤固体并用IPA洗涤。重复用DMF/IPA沉淀。最后将残余物溶于DCM中 且通过加入乙醚沉淀。过滤固体并在40 。C在真空烘箱中干燥过夜以提供产 物。
实施例16. PEG-[Lys (戊二酸-SN38)22，化合物(16b)
将化合物13b进行与实施例15所述相同的条件以提供化合物16b。
实施例17. PEG-[Lys (琥珀酸-SN38)22，化合物(17b)
将化合物14b进行与实施例15所述相同的条件以提供化合物17b。
实施例18. PEG2-C3-胺，化合物(20)
将PEG2陽NHS (化合物18， Mw. 40 kDa, 0.0025 mmol)溶于无水DCM (10 mL)中并将1,3-丙基二胺(0.01 mmol)添加至该溶液中。将该反应混合物在室温搅拌过夜。真空部分去除溶剂并添加乙醚以沉淀粗产物，其从DCM-乙醚 中重结晶以得到所需产物。
实施例19. PEG2-[Lys (NHBoc)2，化合物(21)
将PEG2-胺(化合物20, 1.25 mmol)共沸且真空去除甲苯至干。将共沸的 PEG2-胺溶于200 mL的DCM中并添力口 Boc-Lys-Boc (化合物2, 2.638 g, 5 mmol)和DMAP (610 mg, 5mmo1),并将反应混合物冷却至0 。C保持15分钟， 然后添加EDC (958 mg, 5 mmol)。将反应混合物在搅拌下温热至室温过夜。 真空去除溶剂至干且残余物从IPA中重结晶以得到所述产物。
实施例20. PEG2-[Lys (NH2)2〗，化合物(22)
将化合物21溶于DCM (10 mL)中并将TFA (5 mL)緩慢添加至该溶液中。 室温搅拌溶液2小时。真空浓缩反应溶液并添加乙醚以沉淀产物。过滤分离 产物并在45 。C真空干燥过夜。
实施例21. PEG2-[Lys (DGA-SCH AF)2，化合物(23)
将化合物4 (0.5 g)溶于10 mL无水DCM并添加化合物7a (158 mg)和 DMAP (71 mg)。将反应混合物在冰浴中冷却至0 。C然后加入EDC (74 mg)。 反应混合物在室温搅拌过夜。真空部分去除溶剂且残余物以所述顺序从IPA、 THF和DCM-乙醚(4:11, v/v)中重结晶三次。分离产物并在真空烘箱45 。C干 燥过夜以得到所述产物。
实施例22.测定PEG前药的水解速率
通过使用C8反相柱(Zorbax SB-C8)并使用(a) 0.1 M乙酸三乙铵緩冲 液，和(b)乙腈制得的梯度流动相测得水解速率。使用lmL/分钟的流速，并 使用UV检测器监测色谱。为在緩冲液中水解，以浓度5 mg/mL将PEG衍 生物溶于0.1 M的pH7.4的PBS中，而为在血浆中水解，将衍生物以20mg / 100 pL浓度溶于蒸馏水并将900 大鼠血浆添加至该;容液中。将混合物涡 旋2分钟并分配于2 mL玻璃小瓶中，且每个小瓶含有100 iaL该等分的混 合物。该溶液在37 。C培养不同的时间。以合适间隔将曱醇-乙腈(l: 1, v/v， 400 )iL)混合物添加至小瓶且混合物涡旋1分钟，然后通过0.45 mm滤膜过滤(任选然后通过0.2 mm滤膜二次过滤)。将20 pL滤液的等分试样注入HPLC。 基于峰面积，估算出天然化合物和PEG衍生物的量，且不同介质中每种化 合物的半衰期使用线性回归分析根据PEG衍生物的消失计算。将化合物12a 进行水解且结果为pH7.4的PBS緩冲液中t,/2=大于24小时，和在大鼠血浆 中t,/2pi=5小时和t,力卩二 15小时。
权利要求
1.式(I)的化合物其中R1为基本上非抗原性的水溶性聚合物；A为封端基团，或L1-3和L’1-3为独立选择的双官能连接基；Y1和Y’1独立地为O、S或NR20；Y2-3和Y’2-3独立地为O、S、SO、SO2或NR7；R2-7、R’2-6和R20独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-19支链烷基、C3-8环烷基、C1-6取代的烷基、C2-6取代的烯基、C2-6取代的炔基、C3-8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、C1-6杂烷基、取代的C1-6杂烷基、C1-6烷氧基、芳氧基、C1-6杂烷氧基、杂芳氧基、C2-6烷酰基、芳基羰基、C2-6烷氧基羰基、芳氧基羰基、C2-6烷酰基氧基、芳基羰基氧基、C2-6取代的烷酰基、取代的芳基羰基、C2-6取代的烷酰基氧基、取代的芳氧基羰基、C2-6取代的烷酰基氧基和取代的芳基羰基氧基；R9-10和R’9-10独立地选自氢、OH、离去基团、官能团、靶向基团、诊断剂和生物活性部分；(a)和(a’)独立地为0或正整数；(b)和(b’)独立地为正整数；和(c)、(c’)、(d)、(d’)、(e)和(e’)独立地为0或1。
2. 根据权利要求1的化合物，其中所述离去基团选自卤素、活泼的酯、 咪唑、环酰亚胺硫酮、N-羟基琥珀酰亚胺基、对硝基苯氧基、N-羟基邻苯二 曱酰亚胺基、N-羟基苯并三唑基、曱笨磺酸基、曱磺酸基、三氟乙基磺酸基、 硝基苯磺酸基、d-Q烷氧基、C,-C6烷酰基氧基、芳基羰基氧基、邻硝基苯 氧基、N-羟基苯并三唑基、五氟苯氧基、1,3，5-三氯苯氧基和1,3,5-三氟苯氧 基。
3. 根据权利要求1的化合物，其中所述官能团选自马来酰亚胺基、乙烯 基、砜残基、氨基、羧基、巯基、酰肼和肼基曱酸基。
4. 根据权利要求1的化合物，其中R9—H)和R，9-K)独立地选自OH、曱氧基、叔丁氧基、对硝基苯氧基和N-羟基琥珀酰亚胺基。
5. 根据权利要求1的化合物，其中所述生物活性部分选自含-NH2的部 分、含-OH的部分和含-SH的部分。
6. 根据权利要求1的化合物，其中所述生物活性部分选自药物活性化合 物、酶、蛋白质、寡核苷酸、抗体、单克隆抗体、单链抗体和肽。
7. 根据权利要求1的化合物，其中Lw和L，i.3独立地选自 -[C(=0)]v(CR22R23)t[C(=0)]v,-,-[C(=0)]v(CR22R23)t-0[C(=0)]v,-，-[C(=0)]v(CR22R23)t-NR26[C(=0)]v'-，-[C(=0)]vO(CR22R23)t[C(=0)]v,-，-[C(=0)]vO(CR22R23)tO[C(=0)]v,-，-[C(=0)]vO(CR22R23)tNR26[C(=0)]v，-，-[C(=0)]vNR21(CR22R23)t[C(=0)]v,-，-[C(=0)]vNR21(CR22R23)tO[C(=0)]v'-，-[C(=0)]vNR21(CR22R23)tNR26[C(=0)]v，-,-[C(=0)]v(CR22R23)tO-(CR28R29)t'[C(=0)]v,-，-[C(=0)]、,(CR22R23)tNR2"CR28R29)t'[C(=0)]v'-，-[C(=0)]v(CR22R23)tS-(CR28R29)t'[C(=0)]v,-，-[C(=0)]vO(CR22R23)tO-(CR28R29)t'[C(=0)]v,-，-[C(=0)]v〇(CR22R23)tNR26-(CR28R29)t,[C(=0)]v,-,C(=0)]vO(CR22R23)tS-(CR28R29MC(=0)]v'-， C(二O)]VNR2, (CR22R23)tO-(CR28R29)t'[C(=0)]v'_ ， C(=0)]vNR21(CR22R23)tNR26-(CR28R29)t'[C(=0)]v'-， C(=0)]vNR21(CR22R23)tS-(CR28R29)t'[C(=0)]v'-， C(=0)]v(CR22R23CR28R290)tNR26[C(=0)]v'-, C(=0)]v(CR22R23CR28R290)t[C(=0)]v,-， C(=0)]vO(CR22R23CR28R290)tNR26[C(=0)]v'-， C(=0)]vO(CR22R23CR28R290)t[C(=0)]v'-, C(=0)]vNR21(CR22R23CR28R290)tNR26[C(=0)]v，-, C(=0)]vNR21(CR22R23CR28R290)t[C(=0)]v'-， C(=0)]v(CR22R23CR28R290)t(CR24R25)t'[C(=0)]v,-, C(=0)]vO(CR22R23CR28R290)t(CR24R25)t'[C(=0)]v'-， C(=0)]vNR21(CR22R23CR28R290)t(CR24R25)t，[C(=0)]v,-， C(=0)]v(CR22R23CR28R290)t(CR24R25)t'0[C(=0)]v'-, C(=0)]v(CR22R23)t(CR24R25CR28R290)t，[C(=0)]v'-, C(=0)]v(CR22R23)t(CR24R25CR28R290)t'NR26[C(=0)]v,-， C(=0)]vO(CR22R23CR28R290)t(CR24R25)t,0[C(=0)]v'-， C(=0)]vO(CR22R23)t(CR24R25CR28R290)t,[C(=0)]v'-， C(=0)]vO(CR22R23)t(CR24CR25CR28R290)t'NR26[C(=0)]v,-C(=0)〗vNR2I(CR22R23CR28R290)t(CR24R25)t,0[C(=0)]v,-, C(=0)]vNR21(CR22R23)t(CR24R25CR2SR290)t'[C(=0)]v,-, )]vNR21(CR22R23)t(CR24R25CR28R290)t'NR26[C(=0)]\ Q、<formula>formula see original document page 4</formula><formula>formula see original document page 5</formula>-[C(=0)]vNR21(CR22R23)t~^^(CR24R25)t.O[C(=0)]v-其中21.29独立地选自氢、Cw烷基、Cw2支链烷基、(33.8环烷基、C^取 代的烷基、C^取代的环烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、C,—6杂烷基、 取代的Cw杂烷基、C,，6烷氧基、苯氧基和C,.6杂烷氧基；(t)和(t，)独立地为0或正整数；和 (v)和(v，)独立地为0或1。
8.根据权利要求1的化合物，其中Lw和L，w独立地选自<formula>formula see original document page 5</formula><formula>formula see original document page 6</formula>其中，Y,M9独立地为0、 S或NR48;R3M8、 115。.51和八51独立地选自氢、Cw烷基、Cw2支链烷基、C3—8环 烷基、d-6取代的烷基、C3-8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、 C,—6杂烷基、取代的C"杂烷基、Cw烷氧基、苯氧基和Cm杂烷氧基；Ar为芳基或杂芳基部分；L,卜15为独立选4奪的双官能间隔基；J和J'独立地选自主动运输至靶细胞的部分、疏水的部分、双官能连 接部分和其组合；(cll)、 (hll)、 (kll)、 (zll)、 (mll)和(nll)为独立选择的正整数； (all)、 (ell)、 (gll)、 (jll)、 (oll)和(qll)独立地为0或正整数；和 (bll)、 (xll)、 (x，ll)、 (fll)、 (ill)和(pll)独立地为0或1。
9.根据权利要求1的化合物，其中Lw和LY3独立地选自<formula>formula see original document page 7</formula>]rNH(CH2)2CH=N-NHC(=0)-(CH2)2-,1]卿CH2)2(CH2CH20)2(CH2)卿C(,]r]rNH(CH2CH2)(CH2CH20)2NH[C(=0)〗r'-, i]rNH(CH2CH2)sNH(CH2CH2)s'[C(=0)]r'-， |r NH(CH2CH2)sS(CH2CH2)s'[C(=0)]r'-， ]rNH(CH2CH2)(CH2CH20)[C(=0)]r'-, ]rNH(CH2CH2)s0(CH2CH2)s'[C(O)]r'-, i]rNH(CH2CH20)(CH2)NH[C(=0)]r'-， i]rNH(CH2CH20)2(CH2)[C(=0)〗r'-, ]rNH(CH2CH20)s(CH2)s,[C(=0)]r,-, i],.NHCH2CH2NH[C(=0)]r -, ]rNH(CH2CH2)20[C(O)]r'-， ]rNH(CH2CH20)[C(=0)]r'-, ']rNH(CH2CH20)2[C(=0)]r'-， ]rNH(CH2)3[C(=0)〗r,-, ']rO(CH2CH20)2(CH2)[C(=0)]r'-,rO(CH2)2NH(CH2)2[C(=0)]r'-,0(CH2CH20)2NH[C(=0)]r，-, ]rO(CH2)20(CH2)2[C(=0)]r，-, ^0(CH2)2S(CH2)2[C(:0)]广， ']rO(CH2CH2)NH[C(=0)]r'-, ]rO(CH2CH2)0[C(0)]r'-， ,CH2)卿C(K))]广， '],.0(CH2)30[C(=0)]r'-,'罪2NHCH2[C(喝]广， i]rCH2OCH2[C(=0)]r -， ]rCH2SCH2[C(=0)]r'-, ^S(CH2)3[C(0)]广， ],(CH2)3[C(=0)]r-，—C(=。)]rOCH2 _[C(=0)]rOCH2 —[C(=0)]rNHCH2 —[C(=0)]rNHCH2其中，(r)和(r，)独立地为0或1。
10. 根据权利要求l的化合物，其中L,.3和L，w独立地选自氨基酸、 氨基酸衍生物和肽。
11. 根据权利要求l的化合物，其具有式(II)<formula>formula see original document page 8</formula>(11)。
12. 根据权利要求1的化合物，其中A选自H、 NH2、 OH、 C02H、 C,_6烷氧基和C,_6烷基。
13. 根据权利要求1的化合物，其中包括直链的、末端支链的或多 臂的聚环氧烷。
14. 根据权利要求13的化合物，其中所述聚环氧烷选自聚乙二醇和聚 丙二醇。
15. 根据权利要求13的化合物，其中所述聚环氧烷选自 <formula>formula see original document page 8</formula>-Y73-(CH2CH20)n- 和<formula>formula see original document page 8</formula>其中丫71和丫73独立地为O、 S、 SO、 S02、 NR"或化学键； Y"为O、 S或NR74;R7I、 R72、 R73和R74独立地选自与可用于R2的部分相同的部分； (a71)、 (a72)和(b71)独立地为0或正整数；和 (n)为约10至约2300的整数。
16. 根据权利要求13的化合物，其中所述聚环氧烷为式-0-(CH2CH20)n-的聚乙二醇其中(n)为约10至约2，300的整数。
17. 根据权利要求1的化合物，其中R,的平均分子量为约2，000至约 100,000道尔顿。
18. 根据权利要求1的化合物，其中R,的平均分子量为约5,000至约 60,000道尔顿。
19. 根据权利要求l的化合物，其中R，的平均分子量为约5,000至约 25,000道尔顿或约20,000至约45,000道尔顿。
20. 根据权利要求1的化合物，其中112.8和R，2-s独立地选自氬、曱基、 乙基和异丙基。
21. 权利要求1的化合物，其选自<formula>formula see original document page 9</formula><formula>formula see original document page 10</formula><formula>formula see original document page 11</formula><formula>formula see original document page 12</formula><formula>formula see original document page 13</formula><formula>formula see original document page 14</formula><formula>formula see original document page 15</formula><formula>formula see original document page 16</formula><formula>formula see original document page 17</formula>其中mPEG具有式CH30(CH2CH20)n-; PEG具有式-0(CH2CH20)n- ， (n)为约10至约2,300整数；和Rwo和RV,o独立地选自靶向基团、诊断剂和生物活性部分
22.权利要求1的化合物，其选自 <formula>formula see original document page 17</formula><formula>formula see original document page 18</formula>mPEG具有式CHrO(CH2CH20)n-; PEG具有式-0(CH2CH20)n-,和 (n)为约10至约2,300整数。
23.制备具有支链部分的聚合物的缀合物的方法，包括 (i)在足以形成式(V)的化合物的条件下，使式(m)的化合物与式(vi) 的化合物反应<formula>formula see original document page 18</formula><formula>formula see original document page 19</formula>(v),和(ii)在足以形成式(V，)的化合物的条件下脱保护式(V)的化合物: <formula>formula see original document page 19</formula>其中R,为基本上非抗原性的水溶性聚合物;A,为封端基团或M,;As为封端基团或A;为封端基团或 <formula>formula see original document page 19</formula>M,为—0H、 SH或一NHR3o;M2为OH或离去基团；M3—4和M，3-4为独立选择的保护基团；L3和L，3为独立选择的双官能连接基；Y,和Y、独立地为0、 S或NR2o;丫2-3和Y，2.3独立地为O、 S、 SO、 S02或NR ;R2-7、 R，2-6、 R20和R3。独立地选自氢、Cw烷基、C2-6烯基、(32-6炔基、 Cw9支链烷基、C3-s环烷基、Cw取代的烷基、C2—6取代的烯基、C2-6取代的炔基、(33.8取代的环烷基、芳基、取代的芳基、杂芳基、取代的杂芳基、C,-6杂烷基、取代的C,.6杂烷基、d_6烷氧基、芳氧基、C,—6杂烷氧基、杂 芳氧基、C2—6烷酰基、芳基羰基、C2-6烷氧基羰基、芳氧基羰基、C2-6烷酰 基氧基、芳基羰基氧基、C2—6取代的烷酰基、取代的芳基羰基、C2—6取代的 烷酰基氧基、取代的芳氧基羰基、C2_6取代的烷酰基氧基和取代的芳基羰基 氧基；(a) 和(a，)独立地为0或正整数；(b) 和(b，)独立地为正整数；和 (e)和(e，)独立地为0或1。
24. 权利要求23的方法，还包括 将脱保护的式(V')的化合物与式(VI)的化合物在足以形成式(VII)的化 合物的条件下反应M5—(L'、)c—R"g (VI)其中每个R，，9独立地为靶向基团、诊断剂或生物活性部分;A4为封端基团或M5为-OH或离去基团； 每个L",独立地为双官能连接基； 每个(c)独立地为0或1;和 所有其它变量如权利要求23所定义。
25.治疗哺乳动物的方法，包括向需要的患者给药有效量的式(I)的化合物。
全文摘要
本发明提供含支链部分的聚合连接基。也公开了制备该聚合连接基的方法和使用其制备缀合物的方法。
文档编号A61K9/127GK101516336SQ200780034217
公开日2009年8月26日 申请日期2007年9月15日 优先权日2006年9月15日
发明者普拉桑纳·雷迪, 洪 赵 申请人:安佐制药股份有限公司