溶瘤弹状病毒的制作方法

专利名称：溶瘤弹状病毒的制作方法
溶瘤弹状病毒
背景技术：
本发明要求于2006年9月15日提交的美国临时申请系列60/844,726的优先权， 所述临时申请系列的全部内容通过引用合并入本文。I.发明领域本发明总地说来涉及病毒学和药物。在某些方面，本发明涉及溶瘤病毒，特别 是非VSV溶瘤弹状病毒和包含非VSV糖蛋白的溶瘤弹状病毒。II.背景许多病毒已显示在许多种肿瘤细胞中复制并且在体外杀伤它们(辛德比斯病 毒(Unno等人，2005)、仙台病毒(Kinoh等人，2004)、柯萨奇病毒(Shafren等人， 2004)、单纯疱疹病毒(Mineta等人，1995)、细小病毒(Abschuetz等人，2006)、腺病 毒(Heise等人，2000)、脊髓灰质炎病毒(Gromeier等人，2000)、新城疫病毒(Sinkovics and Horvath, 2000)、水泡性口膜炎病毒(Stojdl 等人，2000)、麻疹病毒(Mealesviras) (Grote等人，2001)、呼肠病毒(Coffey等人，1998)、逆转录病毒(Logg等人，2001)、 痘苗病毒(Vaccinia) (Timiryasova 等人，1999)、和流感病毒(Influenza) (Bergmann 等人， 2001))。此外，此类病毒已证明在治疗癌症的动物模型中是有功效的。水泡性口膜炎病毒(VSV)为熟知的和详尽研究的弹状病毒，已显示其在细胞培 养实验中杀伤肿瘤细胞系，并且已经证明其在多种基底细胞癌(rodentcancer)模型中的功 效(Stojdl等人，2000; Stojdl等人，2003)。然而，VSV不杀伤所有癌细胞。发明概述几种新鉴定的弹状病毒在杀伤特定的癌症或癌细胞系方面比VSV更加有效得 多。此外，VSV和减毒的VSV突变体具有神经毒性并且在啮齿类和灵长类动物中引发 CNS病状。几种弹状病毒不影响CNS (即，Muir Spring s和Bahia Grande Kerschner等 人，1986)，并且显示更可接受的安全特征。此外，基于新的弹状病毒的治疗可用于治疗 CNS的原发性和继发性癌症。本发明的弹状病毒(和/或其他溶瘤剂(oncolytic agent)) 可接连用于规避抗特定治疗性病毒的宿主免疫反应。这将允许长期治疗和提高功效。本发明的实施方案包括涉及非VSV弹状病毒的组合物和方法以及它们用作抗癌 治疗剂的用途。此类弹状病毒具有在体外和体内杀伤肿瘤细胞的性质。如本文所使用的，非VSV弹状病毒将包括一种或多种下列病毒或其变体 Araj as virus、金迪普拉病毒(Chandipura virus)、科卡病毒(Cocal virus)、伊斯法罕病 毒(Isfahiin virus)、Maraba病毒、皮理病毒(Piry virus)、水泡性口炎阿拉戈斯病毒、 BeAn 157575 病毒、博特克病毒(Boteke virus)、Calchaqui 病 毒、美洲鳗病毒(Eel virus American)、格雷洛奇病毒(Gray Lodge virus)、朱罗纳病毒(Jurona virus)、克拉马斯病毒 (Klamath virus) > 克瓦塔病毒(Kwatta virus)、La Joya 病毒、Malpais Spring 病毒、芒特埃 尔岗蝙蝠病毒(MountElgonbatviras)、Perinet 病毒、Tupaia 病毒、Farmington> 大巴伊 亚病毒(Bahia Grande virus)、MuirSprings 病毒、Reed Ranch 病毒、哈特公园病毒(Hart Park virus)、费兰杜病毒(Flanders virus)、凯米其j 病毒(Kamese virus)、Mosqueiro 病毒、莫苏里病毒(Mossuril virus)、巴鲁病毒(Bararviras)、Fukuoka病毒、克恩峡谷病毒 (Kern Canyon virus)、恩科比逊病毒(Nkolbisson virus)、禾丨J丹特病毒(Le Dantec virus)、 Keuraliba 病毒、Connecticut 病毒、新明托病毒(New Minto virus)、莎草病毒(Sawgrass virus)、查可病毒(Chaco virus)、SenaMadureira 病毒、蒂姆博病毒(Timbo virus)、阿尔 姆皮瓦病毒(Almpiwar virus)、阿鲁卡病毒(Aruac virus)，班戈兰病毒(Bangoranviras)、 卞博病毒(Bimbo virus)、BivensArm病毒、Blue crab病毒、查里维勒河病毒(Charleville virus)、 Coastal Plains 病毒、DakArK 7292 病毒、Entamoeba 病毒、力口巴病毒(Garba virus) > 戈萨其jf病毒(Gossas virus)、Humpty Doo病毒、约英杰卡卡(Joinjakaka)病毒、肯 纳曼格拉姆病毒(Kannamangalam viras)、禾斗隆各病毒(Kolongo virus)、Koolpinyah病毒、 Kotonkon 病毒、兰德几亚病毒(Landjia virus)、Manitoba 病毒、马可病毒(Marcoviras)、 Nasoule病毒、纳瓦鲁病毒(Navarro virus)、Ngaingan病毒、Oak-Vale病毒、奥博第安 病毒(Obodhiang virus)、奥衣塔(Oita)病毒、奥安戈(Ouango)病毒、帕里河病毒(Parry Creekviras)、Rio Grande cichlid 病毒、圣德吉姆巴病毒(Sandjimbaviras)、西格马病毒 (Sigma virus)、Sripur 病毒、SweetwaterBranch 病毒、Tibrogargan 病毒、Xiburema 病毒、 雅塔病毒(Yatavirus)、罗得岛(Rhode Island)病毒、Adelaide River 病毒、Berrimah 病毒、 金伯禾1J病毒(Kimberley viras)或牛失fi暂热病毒(Bovine ephemeral fever viras)。 在某些方 面，非VSV弹状病毒可以指Dimarhabdovirus的超级群(定义为能够感染昆虫和哺乳动物 细胞的弹状病毒)。在特定的实施方案中，弹状病毒不是VSV。在特定的方面所述非 VSV弹状病毒是Carajas病毒、Maraba病毒、Farmington> Muir Springs病毒和/或大巴 伊亚病毒，包括其变体。
本发明的一个实施方案包括方法和组合物，其包含溶瘤非VSV弹状病毒或编码 弹状病毒N、P、M、G和/或L蛋白，或其变体(包括其嵌合体和融合蛋白)的一种或 多种的重组溶瘤非VSV弹状病毒，所述变体与下列病毒的N、P、M、G和/或L蛋白具 有至少或至多 20、30、40、50、60、65、70、75、80、85、90、92、94、96、98、99、 100% (包括其间的所有范围和百分数)的氨基酸同一性，所述病毒是Arajasviras、金迪 普拉病毒、科卡病毒、伊斯法罕病毒、Maraba病毒、皮理病毒、水泡性口炎阿拉戈斯病 毒、BeAn 157575病毒、博特克病毒、Calchaqui病毒、美洲鳗病毒、格雷洛奇病毒、朱 罗纳病毒、克拉马斯病毒、克瓦塔病毒、La Joya病毒、Malpais Spring病毒、芒特埃尔岗 蝙蝠病毒、Perinet病毒、Tupaia病毒、Farmington>大巴伊亚病毒、Muir Springs病毒、 Reed Ranch病毒、哈特公园病毒、费兰杜病毒、凯米斯病毒、Mosqueiro病毒、莫苏里病 毒、巴鲁病毒、Fukuoka病毒、克恩峡谷病毒、恩科比逊病毒、利丹特病毒、Keuraliba病 毒、Connecticut病毒、新明托病毒、莎草病毒、查可病毒、Sena Madureira病毒、蒂姆博 病毒、阿尔姆皮瓦病毒、阿鲁卡病毒、班戈兰病毒、卞博病毒、Bivens Arm病毒、Blue crab病毒、查里维勒河病毒、Coastal Plains病毒、DakArK 7292病毒、Entamoeba病毒、 加巴病毒、戈萨斯病毒、Humpty Doo病毒、约英杰卡卡病毒、肯纳曼格拉姆病毒、科隆 各病毒、Koolpinyah病毒、Kotonkon病毒、兰德几亚病毒、Manitoba病毒、马可病毒、 Nasoule病毒、纳瓦鲁病毒、Ngaingan病毒、Oak-Vale病毒、奥博第安病毒、奥衣塔病 毒、奥安戈病毒、帕里河病毒、Rio Grande cichlid病毒、圣德吉姆巴病毒、西格马病毒、 Sripur 病毒、SweetwaterBranch 病毒、Tibrogargan 病毒、Xiburema 病毒、雅塔病毒、罗德岛病毒、Adelaide River病毒、Berrimah病毒、金伯利病毒或牛短暂热病毒。这些病毒 的任何 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、 45、50、55、60、65、70、75、80、85种或更多种(包括其间的所有整数或范围)可明确
地不包括在所述范围内。VSV或任何非VSV弹状病毒可以是可向其中整合入变体G蛋 白或其他病毒蛋白的背景序列。在本发明的另一个方面，非VSV弹状病毒或其重组体可包含编码一种或多种非 VSV弹状病毒的N、P、M、G或L蛋白(包括其嵌合体和融合蛋白)的至少或至多10、 20、30、40、45、50、60、65、70、80、90、100、125、175、250 个或更多连续氨基酸 (包括其间的所有值和范围)的核酸片段。在某些实施方案中，嵌合G蛋白可包括VSV 或非VSV G蛋白的细胞质部分、跨膜部分或细胞质及跨膜部分。本发明的方法和 组合物可包括第二治疗性病毒例如溶瘤或复制缺陷型病毒。溶 瘤剂通常是指能够杀伤、裂解癌细胞或停止癌细胞的生长的试剂。对于溶瘤病毒，该术 语是指在某种程度上可在癌细胞中复制，引起癌细胞死亡、裂解或癌细胞生长停止并且 通常对非癌细胞具有最小的毒性效应的病毒。第二病毒包括但不限于腺病毒、痘苗病 毒、新城疫病毒、甲病毒、细小病毒、疱疹病毒、弹状病毒、非VSV弹状病毒等。在其 他方面，组合物是药学上可接受的组合物。组合物还可包括第二抗癌剂，例如化学治疗 齐U、放射治疗剂或免疫治疗剂。本发明的另外的实施方案包括杀伤过度增殖(hyperproliferative)的细胞的方法， 该方法包括将细胞与分离的溶瘤弹状病毒组合物接触；或另外的方法包括治疗癌症患者，包括施用有效量的溶瘤弹状病毒组合物。在本发明的某些方面，细胞可包含在患者中，其可以是过度增殖的细胞、赘生 性细胞、癌前细胞、癌细胞、转移性细胞(metastaticcell)或已转移的细胞(metastasized cell)。可对具有易于被至少一种非VSV弹状病毒或包括非VSV弹状病毒的治疗方案或 组合物杀伤的细胞的患者施用非VSV弹状病毒。可单独地或以各种组合施用具有1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10或更多种非VSV弹状病毒或重组非VSV弹状病毒的治疗性组 合物1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。施用的组合物可具有10、100、IO3, 104、105、IO6、107、IO8、109、1010、1011、IO12、1013、IO14 或更多病毒颗粒或空斑形成 单位(pfu)。可通过腹膜内、静脉内、动脉内、肌内、皮内、皮下或鼻内施用来进行给 药。在某些方面，可全身性，特别是通过血管内施用(其包括注射、输注等)施用组合 物。本发明的方法还可包括施用第二抗癌治疗，例如第二治疗性病毒。在特别的方面， 治疗性病毒可以是溶瘤病毒，更特别地非VSV弹状病毒。在其他方面，第二抗癌剂是化 学治疗剂、放射治疗剂、免疫治疗剂、手术等。本发明的实施方案包括涉及VSV弹状病毒的组合物和方法，其包括异源G蛋白 和它们作为抗癌治疗剂的用途。此类弹状病毒具有体外和体内杀伤肿瘤细胞的性质。如本文中所使用的，异源G蛋白包括非VSV弹状病毒。非VSV弹状病毒将包 括一种或多种下列病毒或其变体Arajas病毒、金迪普拉病毒、科卡病毒、伊斯法罕病 毒、Maraba病毒、皮理病毒、水泡性口炎阿拉戈斯病毒、BeAn 157575病毒、博特克病 毒、Calchaqui病毒、美洲鳗病毒、格雷洛奇病毒、朱罗纳病毒、克拉马斯病毒、克瓦塔 病毒、La Joya病毒、Malpais Spring病毒、芒特埃尔岗蝙蝠病毒、Perinet病毒、Tupaia病毒、Farmington>大巴伊亚病毒、Muir Springs病毒、Reed Ranch病毒、哈特公园病 毒、费兰杜病毒、凯米斯病毒、Mosqueiro病毒、莫苏里病毒、巴鲁病毒、Fukuoka病 毒、克恩峡谷病毒、恩科比逊病毒、利丹特病毒、Keuraliba病毒、Connecticut病毒、新 明托病毒、莎草病毒、查可病毒、Sena Madureira病毒、蒂姆博病毒、阿尔姆皮瓦病毒、 阿鲁卡病毒、班戈兰病毒、卞博病毒、Bivens Arm病毒、Blue crab病毒、查里维勒河病 毒、Coastal Plains病毒、Da kArK7292病毒、Entamoeba病毒、加巴病毒、戈萨斯病毒、 Humpty Doo病毒、约英杰卡卡病毒、肯纳曼格拉姆病毒、科隆各病毒、Koolpinyah病 毒、Kotonkon病毒、兰德几亚病毒、Manitoba病毒、马可病毒、Nasoule病毒、纳瓦鲁病 毒、Ngaingan病毒、Oak-Vale病毒、奥博第安病毒、奥衣塔病毒、奥安戈病毒、帕里河 病毒、Rio Grandecichlid病毒、圣德吉姆巴病毒、西格马病毒、Sripur病毒、Sweetwater Branch病毒、Tibrogargan病毒、Xiburema病毒、雅塔病毒、罗德岛病毒(RhodeIsland)、 Adelaide River病毒、Berrimah病毒、金伯利病毒或牛短暂热病毒。在某些方面，非VSV 弹状病毒可以指Dimarhabdovirus的超级群(supergroup)(定义为能够感染昆虫和哺乳动 物细胞的弹状病毒)。在特定的方面，非VSV弹状病毒是Carajas病毒、Maraba病毒、 Muir Springs病毒和/或大巴伊亚病毒，包括其变体。
本发明的一个实施方案包括方法和组合物，其包含含有异源G蛋白的溶瘤VSV 弹状病毒或重组溶瘤VSV弹状病毒，所述重组溶瘤VSV弹状病毒编码非VSV弹状病毒 N、P、M、G和/或L蛋白，或其变体(包括其嵌合体和融合蛋白)的一种或多种，所 述变体与非VSV弹状病毒的N、P、M、G和/或L蛋白具有至少或至多20、30、40、 50、60、65、70、75、80、85、90、92、94、96、98、99、100% (包括其间的所有范围 和百分数)的氨基酸同一性。在本发明的另一个实施方案中，包含异源G蛋白的VSV弹状病毒或其重组体可 包含核酸，所述核酸包含编码非VSV弹状病毒的N、P、M、G或L蛋白(包括其嵌合 体和融合蛋白)的至少或至多 10，20、30、40、45、50、60、65、70、80、90、100、 125、175、250个或更多连续氨基酸(包括其间所有值和范围)的核酸片段。在某些方 面，嵌合G蛋白可包含VSV或第二非VSV病毒或非VSV弹状病毒的细胞质部分、跨膜 部分或细胞质及跨膜部分。本发明的方法和组合物可包括第二治疗性病毒，例如溶瘤病毒或复制缺陷型病 毒。第二病毒包括但不限于腺病毒、痘苗病毒、新城疫病毒、疱疹病毒、弹状病毒、非 VSV弹状病毒等。在其他方面，组合物是药学上可接受的组合物。组合物还可包括第二 抗癌剂，例如化学治疗剂、放射治疗剂或免疫治疗剂。本发明的另外方面包括杀伤过度增殖的细胞的方法，所述方法包括将细胞与分 离的溶瘤弹状病毒、包含异源G蛋白分子的VSV、或非VSV弹状病毒组合物接触。另 外的方法包括癌症患者的治疗，所述治疗包括施用有效量的此类病毒组合物。在本发明的某些方面，细胞可包含在患者中，其可以是过度增殖的细胞、赘生 性细胞、癌前细胞、癌细胞、转移性细胞或已转移的细胞。可对具有易于被至少一种 病毒或包括病毒的治疗方案或组合物杀伤的细胞的患者施用本发明的病毒。可单独地 或以各种组合施用具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种病毒的治疗性组合物 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。施用的组合物可具有10、100、IO3, 104、ΙΟ5、ΙΟ6、ΙΟ7、ΙΟ8、ΙΟ9、ΙΟ10、ΙΟ11、ΙΟ12、ΙΟ13、IO14个或更多病毒颗粒或空斑形成单位 (pfo)。可通过腹膜内、静脉内、动脉内、肌内、皮内、皮下或鼻内施用来进行给药。在 某些方面，可全身性，特别是通过血管内施用(其包括注射、输注等)施用组合物。本 发明的方法还可包括施用第二抗癌治疗，例如第二治疗性病毒。在特定的方面，治疗性 病毒可以是溶瘤病毒，例如包含异源G蛋白的VSV，更特别地非VSV弹状病毒。在其 他方面，第二抗癌剂是化学治疗剂、放射治疗剂、免疫治疗剂、手术等。本发明的其他实施方案通过本申请来进行描述。关于本发明的一个方面所描述 的任何实施方案同样可用于本发明的其他方面，反之亦然。发明详述和实施例部分的实 施方案理解为可用 于本发明的所有方面的本发明的非限定性实施方案。术语“抑制”、“减少”或“预防”或这些术语的任何变型，当用于权利要求 和/或说明书时，包括任何可测量的减少或完全抑制以获得期望的结果。期望的结果包 括但不限于癌性或过度增殖状况的减轻、减少、减缓或根除以及生命的提高的质量或延 长。词汇“一”或“一个”的用途，当与权利要求和/或说明书中的术语“包 括”、“包含”结合使用时，可以表示“一”，但其也与“一个或多个”、“至少一 个”和“一个或多于一个”的意义一致。在整个本申请中，术语“大约”用于表示值包括用于测定值的装置或方法的误 差的标准差。除非明确指出表示只是选择性的或选择是相互排斥的，权利要求中的术语 “或”用于表示“和/或”的意义，尽管公开内容支持只表示选择性的和“和/或”的定义。如本说明书和权利要求中所使用的，词汇“包含”(和包含的任何形式，例如 “包括”和“含有”)、“具有”(和具有的任何形式，例如“拥有”和“有”)、“包
括”(和包括的任何形式，例如“包含”和“含有”)或“含有”(和含有的任何形式， 例如“包含”和“包括”)是包括界限端点的或两端未封闭的(open-ended)并且不排除 额外的、未引述的元件或方法步骤。本发明的其他目的、特征和有利方面将通过下列详细描述而变得显然。然而， 应当理解，详细描述和具体实例，当表示本发明的特定实施方案时，仅通过举例说明的 方式来给出，因为根据下面的详细描述，本发明的精神和范围内的各种改变和修饰对于 本领域技术人员将变得很明显。附图概述下列附图构成了本说明书的部分并且用于进一步例证本发明的某些方面。参考 一个或多个这些附图和本文中提供的特定实施方案的详细描述可更好地理解本发明。

图1.基于N蛋白的相对保守区域(119个氨基酸)的GDE比对，和使用副粘病毒 人副流感病毒1 (HPIV-I)作为外类群产生的弹状病毒之间的系统发生关系。通过邻接法 (Neighbor Joining Method)产生进化树和使用1000个树replica评估自展支持率(bootstrap value)(对于各分支节点所指示的)。分支长度与遗传距离成正比。标尺条相应于每氨基 酸位点的置换(Courtesy of H.Badrane and P.J.Walker)。图2.体外肿瘤细胞杀伤测定的总结。用不同病毒的系列稀释物感染来自NCI 60细胞组(cell panel)的细胞，进行96小时。使用结晶紫染色法测定细胞生存力以检测残留 的存活细胞。根据所得的细胞杀伤曲线计算EC5tl，并且将其总结于表格中。为了明了， 将EC5tl值转化成图例说明中描述的1至7的值。此外，阴影用于标示EC5tl范围(即， 最暗至最亮表示最高的EC5tl至最低的EC5tl值)。病毒缩写如下MS = Muir Springs、 BG=大巴伊亚病毒、NGG = Ngaingan、TIB = Tibrogargan、FMT = Farmington、MRB =Maraba、CRJ = Carajas、VSVHR =水泡性口膜炎病毒HR株系和VV =痘苗病毒 JX-963。该数据表明并非所有弹状病毒具有相同的溶瘤性，事实上密切相关的弹状病毒 在相同肿瘤细胞系中行为非常不同。因此，目前不存在预测具有溶瘤潜力的弹状病毒的 方法。需要经验检测来鉴定良好的溶瘤候选病毒。图3A-3B.肿瘤细胞系中弹状病毒的生产力。用不同的弹状病毒(MOI = 3)感 染SNB 19人成胶质细胞瘤和NCI H226人肺癌细胞系，并在一段时间内通过空斑测定就 病毒的产量对其进行监测。数据显示并非所有弹状病毒在这些肿瘤细胞系中具有相同的 复制能力。NCIH226细胞在病毒生产力方面显示巨大的差异，大巴伊亚病毒根本不产生 病毒，然而Maraba病毒却能够产生大量有感染性的病毒体。
图4.从质粒DNA形式回收重组弹状病毒的拯救系统的图示。在该实施例中， 已将Maraba病毒克隆入DNA质粒(在T7启动子和来自丁型肝炎病毒的核酶(rybozyme) 序列之间)。用T7表达痘苗病毒感染A549细胞，然后用经基因工程改造而表达GFP的 Maraba基因组载体转染所述细胞。纯化被拯救的病毒体，然后将其用于感染Vero细胞， 进行24小时，从而当通过荧光显微术显现时，在这些细胞中导致GFP表达。图5.生物选择溶瘤弹状病毒的改良株系。弹状病毒是准种(quasi-species)。大巴 伊亚病毒不是神经致病性的(neuropathogenic)但具有杀伤人成胶质细胞瘤细胞的能力。 本发明者预期提高其毒性但同时保持其对于癌细胞的选择性。为了提高弹状病毒对于肿 瘤细胞的毒性，本发明者选择在人成胶质细胞瘤细胞系中具有增加的复制能力的病毒突 变体。简而言之，使用2.5X IO6个病毒颗粒感染5X IO5个SNB19细胞，即MO I为5。 初次接种物具有200 μ 1的体积，并且在用PBS清洗细胞10次之前进行1小时感染。通 过空斑测定就病毒颗粒分析最后的清洗物以确保输入病毒的恰当清除。在不断增加的时 间点上，收集整个上清液，然后更换新鲜培养基。将收集的培养基用于感染新细胞以进 行扩增，并通过空斑测定就病毒颗粒的存在对其进行分析。对于第一代，测定在第4、 8、12和24hpi(感染后的小时)直至病毒释放的初始时间上产生的收集物。将来自最早 时间点的病毒扩增回IO6个的群体，然后再传代(re-passed)。图6.生物选择溶瘤弹状病毒的改良株系。在本实施例中，大巴伊亚病毒经历多 达6轮重复的生物选择。在感染后第4、6和8小时就SNB19细胞中的病毒产量监测亲 本株系(WT)和第4至6代的传代株系。初始病毒复制速度的明确和渐进的提高在不断 增加的生物选择轮次中是很明显的。MRB = Maraba病毒，其用作在癌细胞系中快速的 和期望的病毒复制的示例。图7.经历13轮生物选择的大巴伊亚病毒P13。该病毒不仅在生物选择方案中使 用的人成胶质细胞瘤(glioblastoma)中而且在不相关的人成胶质细胞瘤和人卵巢癌细胞系 上显示提高的病毒复制。这证明可生物选择弹状病毒以提高它们的溶瘤性质并且这些提 高对其他不同的癌症是有效的。
图8.用指定的病毒颅内感染Balb/C小鼠并且就发病率和/或死亡率对其进行监 测。野生型VSV(HR株系)和VSV的ΔΜ51突变体株系都具有极强的神经毒性，显示 后肢在感染的数天内麻痹，然而大巴伊亚病毒和Muir Springs病毒显示没有神经毒性。大 巴伊亚病毒P6是在人成胶质细胞瘤细胞中具有提高的复制的大巴伊亚病毒的经生物选择 的株系。该株系也显示没有神经毒性，表明可生物选择弹状病毒以提高对肿瘤细胞的毒 性同时保持它们在正常健康组织中的安全特征。图9.与金迪普拉病毒和WT VSV和Δ 51 VSV相比，Maraba和Carajas弹状病毒
的体内功效。通过在左乳腺、后乳腺中注射IO6个肿瘤细胞在5-8周龄的Balb/C雌性小鼠 中建立4T1肿瘤(表达萤火虫荧光素酶)。一周后，在第1和第2天静脉内注射小鼠(每 剂量=IO7PfuWT V SV、Δ 5IGFP VSV> Maraba 或金迪普拉病毒；或 108pfo Carajas)。使 用IVIS 200 (Xenogen)通过生物发光成像测定肿瘤响应(测量为光子/s/cm2)。图10.用伊斯法罕病毒G蛋白和VSV G蛋白假型化的G-IessVSV的感染性。图11.VSVWT、伊斯法罕病毒和RVRIsfGl病毒的一步生长曲线。图12.包含伊斯法罕病毒G蛋白的RVR保持溶瘤性质。评估伊斯法罕病毒、 VSV d51和RVRIsfGl对各种癌细胞系的细胞毒性。图13A-13C.包含IsfGl的RVR能够在体内逃脱对VSV的免疫反应。体内荧光 素酶检测用于测定用RVRIsfGl或VSV接种的小鼠中的病毒的量。图13A，注射入初次 接受实验的小鼠的重组病毒的体内检测。图13B，注射入用VSV免疫的小鼠的VSV的 体内检测。图13C，注射入用VSV免疫的小鼠的重组RVRIsfGl病毒的体内检测。图14.来自感染的肿瘤的病毒产量。在使用VSV的免疫存在或不存在的情况下 (如所指示的)用重组病毒或VSV感染肿瘤。图解数据显示通过肿瘤的感染产生的病毒 的量。图15.VSVWT、金迪普拉病毒和RVRchaG1的一步生长曲线。结果显示重组体产 生与VSV相同量的病毒。图16.VSVWT、金迪普拉病毒和RVRchaG1的细胞毒性。结果显示重组体是与 VSV细胞毒性一样。图17.VSVWT、Maraba病毒和RVRlvfaG1的一步生长曲线。结果显示重组病毒 滴度在第48和72小时比VSV大。 图18.VSV WT> Maraba病毒和RVRmmG1的细胞毒性。结果显示maraba和 RVRmmG1在肿瘤细胞系中都是有细胞毒性的并且它们对于肿瘤细胞通常比VSV WT更具 细胞毒性。发明详述本发明的方面基于非VSV弹状病毒或假型化的弹状病毒对几个类型或种类的癌 细胞的杀伤作用，所述癌细胞抗VSV的杀伤作用。这些溶瘤弹状病毒和重组弹状病毒的 一些有利方面包括下列方面(1)抗发明的弹状病毒的抗体极少不存在于大多数世界人 口中。(2)弹状病毒比其他溶瘤病毒例如腺病毒、呼肠病毒、麻疹病毒、细小病毒、逆转 录病毒和HSV复制更快。(3)弹状病毒可培养至高滴度，并且可通过0.2微米的滤器过 滤。(4)溶瘤弹状病毒和其重组体具有广谱宿主性，能够感染许多不同种类的癌细胞并且 不受特定细胞上的受体的限制(例如，柯萨奇病毒、麻疹病毒、腺病毒)。(5)本发明的弹状病毒易于进行遗传操作。(6)弹状病毒也具有细胞质生活周期并且不整合入宿主细胞 的遗传物质，这赋予了更有利的安全特征。本发明的实施方案包括涉及非VSV弹状病毒或假型化的弹状病毒的组合物和方 法和它们作为抗癌治疗剂的用途。I、弹状病毒科(Family Rhabdoviridae)(弹状病毒)
原型弹状病毒是狂犬病病毒和水泡性口膜炎病毒(VSV)，该病毒科研究最详尽 的病毒。尽管这些病毒共有相似的形态学，但它们在它们的生活周期、宿主范围和病理 学方面极其不同。弹状病毒是具有非节段(_)有义RNA基因组的子弹状病毒的科。存 在超过250种已知的感染哺乳动物、鱼、昆虫和植物的弹状病毒。该科分为至少5个属 (1)狂犬病病毒属包括狂犬病病毒、其他哺乳动物病毒、一些昆虫病毒；(2)水泡性病 毒属包括水泡性口膜炎病毒(VSV) ； (3)短暂热病毒属包括牛短暂热病毒(脊椎动 物)；(4)质型弹状病毒属包括莴苣坏死黄化病毒(植物)；和(5)核型弹状病毒属 包括马铃薯黄矮病毒(植物)。也已表明，存在包括多种感染哺乳动物和昆虫的弹状病毒 的称为Dimarhabdoviras的弹状病毒的超级群。弹状病毒科包括但不限于Arajas病毒、金迪普拉病毒(AF128868/gi 4583436，AJ810083/gi 57833891，AY871800/gi 62861470, AY871799/gi 62861468， AY871798/gi 62861466, AY871797/gi 62861464, AY871796/gi 62861462，AY871795/gi 62861460, AY871794/gi 62861459, AY871793/gi 62861457，AY871792/gi 62861455, AY871791/gi 62861453)、科卡病毒(AF045556/ gi 2865658)、伊斯法罕病毒(AJ810084/gi 57834038)、Maraba 病毒(SEQ ID NO 1-6)、Carajas 病毒(SEQ ID NO 7-12，AY335185/gi 33578037)、皮理病毒(D26175/ gi: 442480，Z15093/gi 61405)、水泡性 口炎阿拉戈斯病毒、BeAn 157575 病毒、博 特克病毒、Calchaqui病毒、美洲鳗病毒、格雷洛奇病毒、朱罗纳病毒、克拉马斯病毒、 克瓦塔病毒、La Joya病毒、Malpais Spring病毒、芒特埃尔岗蝙蝠病毒(DQ457103/ gi|91984805), Perinet 病毒(AY854652/gi 71842381), Tupaia 病毒(NC_007020/gi 66508427)、Farmington> 大巴伊亚病毒(SEQ ID NO 13-18)，Muir Springs 病毒、 ReedRanch 病毒、哈特公园病毒、费兰杜病毒(AF523199/gi 25140635，AF523197/ gi 25140634，AF523196/gi 25140633，AF523195/gi 25140632，AF523194/gi 25140631，AH012179/gi 25140630)、凯米斯病毒、Mosqueiro 病毒、莫苏里病毒、巴 鲁病毒、Fukuoka病毒(AY854651/gi 71842379)、克恩峡谷病毒、恩科比逊病毒、利 丹特病毒(AY854650/gi 71842377)、Keuraliba 病毒、Connecticut 病毒、新明托病毒、 莎草病毒、查可病毒、Sena Madureira病毒、蒂姆博病毒、阿尔姆皮瓦病毒(AY854645/ gi: 71842367)、阿鲁卡病毒、班戈兰病毒、卞博病毒、Bivens Arm病毒、Blue crab病 毒、查里维勒河病毒、Coastal Plains病毒、DakArK7292病毒、Entamoeba病毒、加巴 病毒、戈萨斯病毒、Humpty Doo病毒(AY854643/gi 71842363)、约英杰卡卡病毒、肯 纳曼格拉姆病毒、科隆各病毒(DQ457100/gi|91984799核蛋白(N)mRNA、部分cds)、 Koolpinyah 病毒、Kotonkon 病毒(DQ4570"/gi|9l9^797, AY854638/gi 71842354), 兰德几亚病毒、Manitoba病毒、马可病毒、Nasoule病毒、纳瓦鲁病毒、Ngaingan病 毒(AY854649/gi 71842375), Oak-Vale 病毒(AY854670/gi 71842417),奥博第安病毒(DQ457098/gi|91984795)、奥衣塔病毒(AB116386/gi 46020027)、奥安戈病 毒、帕里河病毒(AY854647/gi 71842371)、Rio Grande cichlid病毒、圣德吉姆巴病 毒(DQ457102/gi|9l984803)、西格马病毒(AH004209/gi 1680545, AH004208/gi 1680544，AH004206/gi 1680542)、Sripur 病毒、SweetwaterBranch 病毒、Tibrogargan 病毒(AY854646/gi 71842369)、Xiburema 病毒、雅塔病毒、罗德岛病毒、Adelaide River 病毒(UlO36Vgi 600151, AF234998/gi 10443747, AF234534/gi 9971785, AY854635/gi 71842348)、Berrimah 病毒(AY854636/gi 71842350])、金伯利病毒 (AY854637/gi 71842352)或牛短暂热病毒(NC_002526/gi 10086561)。某些未指定的血清型包括(I)Bahia Grande组(大巴伊亚病毒(BGV)、Muir Springs 病毒(MSV)、Reed Ranch 病毒(RRV) ； (2) HartPark 组(费兰杜病毒(FLAV)、 哈特公园病毒(HPV)、凯米斯病毒(KAMV)、Mosqueiro病毒(MQOV)、莫苏里病毒 (MOSV) ； (3) KernCanyon 组(巴鲁病毒(BARV)、Fukuoka 病毒(FUKAV)、克恩峡谷 病毒(KCV)、恩科比逊病毒(NKOV) ； (4) Le Dantec组(利丹特病毒(LDV)、Keuraliba 病毒(KEUV)、(5) Sawgrass 组(Connecticut 病毒(CNTV)、新明托病毒(NMV)、莎 草病毒(SAWV) ； (6) Timbo 组(查可病毒(CHOV)、Sena Madureira 病毒(SMV)、蒂 姆博病毒(TIMV)；和 (7)其他未指定病毒(阿尔姆皮瓦病毒(ALMV)、阿鲁卡病毒 (ARUV)、班戈兰病毒(BGNV)、卞博病毒(BBOV)、Bivens Arm 病毒(BAV)、Bluecrab 病毒(BCV)、查里维勒河病毒(CHVV)、Coastal Plains 病毒(CPV)、DakArK 7292 病毒 (DAKV-7292)、Entamoeba 病毒(ENTV)、加巴病毒(GARV)、戈萨斯病毒(GOSV)、 Humpty Doo病毒(HDOOV)、约英杰卡卡病毒(JOIV)、肯纳曼格拉姆病毒(KANV)、 科隆各病毒(KOLV)、Koolpinyah 病毒(KOOLV)、Kotonkon 病毒(KOTV)、兰德几亚 病毒(LJAV)、Manitoba 病毒(MNTBV)、马可病毒(MCOV)、Ngaingan> Nasoule 病毒 (NASV)、纳瓦鲁病毒(NAVV)、Ngaingan 病毒(NGAV)、Oak-Vale 病毒(OVRV)、奥博 第安病毒(OBOV)、奥衣塔病毒(OITAV)、奥安戈病毒(OUAV)、帕里河病毒(PCRV)、 Rio Grandecichlid病毒(RGRCV)、圣德吉姆巴病毒(SJAV)、西格马病毒[X91062] (SIGMAV)、Sripur 病毒(SRIV)、Sweetwater Branch 病毒(SWBV)、Tibrogargan 病毒 (TIBV)、Xiburema 病毒(XIBV)、雅塔病毒(YATAV)。本发明的方面可包括但不限于基于在哺乳动物细胞系中的生长、在成年小鼠 (动物)中不存在毒性或毒性最低、在乳鼠(动物)中不存在毒性或毒性最低选择非VSV 弹状病毒或假型化的弹状病毒。A、弹状病毒基因组通常，弹状病毒基因组大约11至15kb，具有大约50个核苷酸的3’前导序列和 大约60个核苷酸的(-)有义病毒RNA(vRNA)的非翻译5’区。通常，弹状病毒VRNA 具有编码5个蛋白的5个基因。弹状病毒在各基因的末端具有保守的多腺苷酸化信号并 且在5个基因的各基因之间具有短基因间区域。所有弹状病毒包含编码核壳体蛋白(N)、 磷蛋白(P，也称为NS)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和大蛋白(L)的5个基因。通常 这些基因如下在负有义vRNA上按顺序排列3' -N-P-M-G-(X)-L-5'。基因的顺序 很重要，因为其控制合成的蛋白质的比例。弹状病毒基因组的任何操作物通常将包括至 少5个转录结构域以保持以高水平感染和复制的能力。弹状病毒具有用于转录正有义信使RNA(mRNA)的内源RNA聚合酶。X基因并非存在于所有弹状病毒中。X基因编 码发现于鱼感染性造血组织坏死病毒的非结构蛋白(GenBank DQ164103/gi|76262981 ； DQ164102/gi|76262979 ； DQ164101/gi|76262977 ； DQ164100/gi|76262975 ； DQ164099/ gi|76262973 ； AB250935/gi| 112821165 ； AB250934/gi| 112821163 ； AB250933/ gi|112821161 ； AB250932/gi| 112821159 ； AB25093l/gi| 112821157 ； AB250930/ gi|112821155 ； AB250929/gi| 112821153 ； AB250928/gi| 112821151 ； AB250927/ gi|112821149，描述了 G蛋白编码核苷酸序列)、牛短暂热病毒中的非结构糖蛋白和狂犬 病毒中的假基因(pseudogene)。在弹状病毒基因组的不同位置发现了额外的(X)基因。 感染细胞中M蛋白的合成使细胞产生细胞病变，并且将最终导致细胞死亡。弹状病毒的传播视病毒/宿主的变化而变化，但大多数通过直接接触传播_例 如，狂犬病病毒通过动物咬伤或昆虫载体传播。存在长体内潜伏期，但这不反映在培养 中的病毒复制的动力学中。G蛋白结合宿主细胞表面上的受体，然后病毒通过G蛋白介 导的内吞作用和与载体的膜的融合进入细胞。无意受限于特定理论，弹状病毒的受体分子据认为是 磷脂而非特定的蛋白。弹 状病毒复制在细胞质中发生-L和NS蛋白都是进行转录所必需的_两者单独均不发挥功 能。产生5个单顺反子mRNA，其在5'末端加帽和在3'末端多腺苷酸化，并且各自在 信使的5'末端包含来自vRNA的3'末端的前导序列。这些mRNA通过病毒基因组中 ORF的依次转录而产生，并且已显示基因间序列负责终止和通过各基因间的聚合酶重新 起始转录，从而产生分开的转录物。子代VRNA从(+)有义中间体产生。基因组通过L+P聚合酶复合物(如在转 录中)进行复制，但还需要额外的宿主细胞因子。弹状病毒的特征在于这些事件全都 在充当病毒“工厂”的细胞质的部分中发生并且表现为特征性细胞质内含体(inclusion body)οB、病毒蛋白质变体在某些实施方案中，弹状病毒或非VSV弹状病毒可包括N、P、M、G，和/或 L蛋白中的一种或多种的变体。在本发明的某些方面，此类病毒蛋白变体可包含在下面 进一步定义的蛋白质性质的组合物中。蛋白质性质的组合物包括病毒颗粒和具有一种或 多种病毒蛋白组分的其他组合物。此类多肽变体可进行基因工程改造或就一种或多种生 理学或生物学特征例如宿主细胞范围、宿主细胞特异性、对非靶细胞或器官的毒性、复 制、对靶细胞的细胞毒性、癌细胞的杀伤、癌细胞的阻抑(stasis)、感染性、生产参数、 病毒颗粒的大小、病毒颗粒的稳定性、体内清除、免疫反应性等的改变进行选择。此类 多肽变体可通过使用多种本领域内已知的方法进行基因工程改造，所述方法包括下面描 述的各种诱变技术。在某些方面，N、P、M、G和/或L蛋白对于病毒可以是异源的 (例如，VSV可包含伊斯法罕病毒G蛋白或其变体)。C、重组弹状病毒可这样产生重组弹状病毒，即通过(1)完全使用CDNA或(2)转染入辅助细胞的 cDNA的组合或(3)转染入细胞(所述细胞进一步用minivirus感染，所述miniviras反向 提供产生感染性或非感染性重组弹状病毒所需的其余组分和活性)的cDNA来产生。通 过使用这些方法中的任一种(例如，miniviras、辅助细胞系或仅cDNA转染)，所需的最小组分是包含用于(1)通过弹状病毒N蛋白壳体化基因组(或反基因组(antigenomic)) RNA和(2)基因组和反基因组(复制中间体)RNA等同物的复制的顺式作用信号的RNA 分子。通过复制元件或复制子，本发明者产生在5'和3'末端最低限度地包含弹状病 毒的前导序列和尾随序列的RNA链。在基因组有义链中，前导序列位于3'末端，尾随 序列位于5'末端。位于这两个复制信号之间的任何RNA将依次进行复制。为了通过 N蛋白进行壳体化和为了起始转录和复制所必需的聚合酶结合，前导区和尾随区还必须 包含最小顺式作用元件。对于制备经基因工程改造的弹状病毒，包含G基因的minivirus也可包含前导 区、尾随区和具有用于产生G蛋白mRNA的适当的起始和终止信号的G基因。如果 miniviras还包含M基因，则也 必须存在用于产生M蛋白mRNA的适当的起始和终止信号。对于经基因工程改造的弹状病毒基因组内包含的任何基因，基因应侧翼于允许 这些基因表达和蛋白质产物产生的适当的转录起始和终止信号。特别地，异源基因(其 为通常不由从天然环境分离的弹状病毒编码的基因)在通常未发现其的位置、形式或背 景中包含弹状病毒编码区，例如，嵌合G蛋白。为了产生“非感染性”经基因工程改造的弹状病毒，所述经基因工程改造的弹 状病毒必须具有最小的复制子元件和N、P和L蛋白，并且其必须包含M基因(一个实 例是缺失G蛋白编码区的AG或G-Iess构建体)。这产生了从细胞出芽但为非感染性颗 粒的病毒颗粒。为了产生“感染性”颗粒，病毒颗粒必须额外地包含可介导，例如通过 使用附着蛋白或受体配体介导病毒颗粒结合和融合的蛋白质。弹状病毒的天然受体配体 是G蛋白。“合适的细胞”或“宿主细胞”是指允许重组弹状病毒的装配的任何细胞。为制备感染性病毒颗粒，首先用痘苗病毒VTF7-3 (Fuerst等人，1986)或编码T7 RNA聚合酶或其他合适的噬菌体聚合酶例如T3或SP6聚合酶的等同物(参见Usdin等 人，1993或Rodriguez等人，1990)感染合适的细胞系(例如，BHK细胞)。然后用包 含编码G、N、P、L和M弹状病毒蛋白的基因的单独的cDNA转染细胞。此类cDNA 将提供用于构建重组弹状病毒颗粒的蛋白。然后可通过本领域已知的任何方法转染细胞 (例如，脂质体、电穿孔等)。也将包含弹状病毒基因组RNA等同物的“多顺反子cDNA”转染入细胞系。如 果期望感染性重组弹状病毒颗粒在感染的细胞中是裂解性的，那么编码N、P、M和L蛋 白的基因以及任何异源核酸片段必须存在。如果不期望感染性重组弹状病毒颗粒是裂解 性的，那么编码M蛋白的基因不包括在多顺反子DNA中。关于“多顺反子cDNA”， 其是指至少包含含有编码N、P和L蛋白的基因的转录单位的cDNA。重组弹状病毒多 顺反子DNA还可包含编码蛋白质变体或其多肽片段的基因或治疗性核酸。可选择地，首 先产生的最初与病毒颗粒结合的任何蛋白或其片段可以反向提供。另一个预期的实施方案是包含编码报告蛋白或荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白 和其衍生物、半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、氯霉素乙酰转移酶等)的基因、 N-P-L或N-P-L-M基因和/或融合蛋白或治疗性核酸的多顺反子cDNA。另一个预期的多顺反子DNA可包含编码蛋白质变体的基因、编码报告子的基因、治疗性核酸和/或 N-P-L基因或N-P-L-M基因。产生重组弹状病毒的第一个步骤是从cDNA表达作为基因组或反基因组等同物 的RNA。然后该RNA被N蛋白包装，然后通过P/L蛋白进行复制。可回收所产生的 病毒。如果G蛋白不存于重组RNA基因组中，那么其通常以反向提供。如果G蛋白和 M蛋白都不存在，那么两者均以反向提供。关于制备“非感染性弹状病毒”颗粒，其方法可以与上述方法相同，除了转染 入细胞的多顺反子cDNA将只包含弹状病毒的N、P和L基因外。非感染性弹状病毒颗 粒的多顺反子cDNA可额外地包含编码报告蛋白的基因或治疗性核酸。关于有关产生缺 乏编码G蛋白的基因的重组弹状病毒的方法的另外的描述，参见Takada等人(1997)。1.产生病毒的细胞的培养通常在期望的温度(通常大约37°C )下温育转染的细胞，进行至少24小时。对 于非感染性病毒颗粒，收集上清液，分离病毒颗粒。对于感染性病毒颗粒，收获包含病 毒的上清液，将其转移至新鲜细胞(fresh cell)。温育该 新鲜细胞，进行大约48小时，然 后收集上清液。2.重组弹状病毒的纯化术语“分离”或“分离的”弹状病毒是指培养和纯化病毒颗粒(以使极少的细 胞碎片留下)的方法。一个实例是获取含有病毒体的上清液，然后将它们通过0.1-0.2微 米孔径大小的滤器(例如，Millex-GS、Millipore)以除去病毒和细胞碎片。可选择地， 使用梯度例如蔗糖梯度纯化病毒体。然后沉淀重组弹状病毒颗粒，将其重悬于期望的任 何赋形剂或载体中。可使用特异于特定蛋白的抗体，通过间接免疫荧光法测定滴度。3.使用cDNA和Miniviras或辅助细胞系制备重组弹状病毒的方法"minivirases"和“辅助细胞”(也称为“辅助细胞系”)提供相同的事物以 提供用于弹状病毒病毒体装配的弹状病毒蛋白的来源。弹状病毒miniviras的一个实例是 只表达G和M蛋白的VSVminiviras，如由Stillman等人，(1995)所报导的。辅助病毒 和miniviruses用作提供弹状病毒蛋白的方法，所述弹状病毒蛋白不从编码弹状病毒蛋白 的基因的转染的DNA产生。当使用miniviras时，为了提供T7 RNA聚合酶，如上所述使用痘苗病毒感染细 胞。将包含N、P和L基因的期望的多顺反子RNA和质粒转染入细胞。在大约3小时 后除去转染混合物，然后以大约1的感染复数(multiplicity of infection) (m.o.i.)用miniviras 感染细胞。Miniviras提供缺失的G和/或M蛋白。转染入细胞的多顺反子RNA将取 决于想要的是感染性重组弹状病毒还是非感染性重组弹状病毒。可选择地，miniviras可用于提供N、P和L基因。Minivirus还可用于产生除了 N、P和L外的M蛋白。Miniviras还可产生G蛋白。当使用辅助细胞系时，编码缺失的弹状病毒蛋白的基因通过辅助细胞系产生。 辅助细胞系具有用于产生不编码野生型G蛋白的重组弹状病毒颗粒的N、P、L和G蛋 白。从不为重组病毒基因组的部分的基因或DNA表达蛋白质。将这些质粒或其他载体 系统稳定地整合入细胞系的基因组。然后从细胞的基因组而非从细胞质中的复制子产生 蛋白质。然后可用包含不由辅助病毒表达的其他弹状病毒基因的多顺反子DNA和质粒cDNA转染辅助细胞系。所使用的多顺反子RNA将取决于期望的是感染性还是非感染性 重组弹状病毒。另外，如上所述提供缺失的基因产物(例如，G和/或M)。II.病毒组合物本发明涉及在研究和治疗患者的过度增殖细胞或赘生性细胞(例如，癌细胞)和 过度增殖性病况或瘤病况(neoplastic condition)(例如，癌症)中是有利的弹状病毒。其可 涉及但不限于具有减少的神经毒性的弹状病毒例如非VSV弹状病毒。在某些方面，弹状 病毒编码或包含一个或多个蛋白质组分(N、P、M、G，和/或L蛋白)或与VSV的基因 组不同的 核酸基因组(即，在氨基酸或核苷酸水平上至少或至多10，20，40，50，60， 70，80%同一)和/或用一个或多个突变或变异(与野生型病毒或病毒蛋白相比)来进行 构建，以便所述病毒具有期望的性质以用于抗癌细胞，同时与最初分离的病毒或VSV相 比对非癌细胞具有较低毒性或是无毒性。下面描述的教导提供了各种用于进行本发明的 方法和组合物的方案的实例。它们提供了通过使用生物选择或重组DNA或核酸技术产生 突变病毒或变异病毒的背景。A、蛋白质性质的组合物本发明的蛋白质性质的组合物包括病毒颗粒和包含病毒颗粒的组合物以及分离 的多肽。在某些实施方案中，本发明涉及产生或分离假型化的或非VSV溶瘤弹状病毒 (裂解、杀伤或迟滞癌细胞的生长的弹状病毒)。在某些实施方案，对弹状病毒进行基因 工程改造以使之包括弹状病毒蛋白(N、P、M、G和/或L)的多肽变体和/或编码治疗 性多肽的治疗性核酸。本发明的其他方面包括分离缺少一个或多个功能性多肽或蛋白的 弹状病毒。在其他实施方案中，本发明涉及弹状病毒和它们作为药学上可接受的制剂的 部分与蛋白质性质的组合物组合的用途或包含在其中的用途。如本文所使用的，“蛋白”或“多肽”是指包含氨基酸残基的聚合物的分子。 在一些实施方案中，使用蛋白质或多肽的野生型形式，然而，在本发明的许多实施方案 中，病毒蛋白或多肽的全部或部分不存在或经改变以使病毒在治疗患者方面更加有用。 上述术语在本文中可互换使用。“经修饰的蛋白”或“经修饰的多肽”或“变体蛋白” 或“变体多肽”是指其化学结构或氨基酸序列相对于野生型或参照蛋白或多肽发生了改 变的蛋白或多肽。在一些实施方案中，经修饰的蛋白或多肽具有至少一种改变的活性或 功能(公认蛋白质或多肽可具有多种活性或功能)。相对于野生型蛋白或多肽的活性或功 能或包含此类多肽的病毒的特征，可以以一些其他方法减小、减少、消除、增强、提高 或改变该经修饰的活性或功能(例如感染特异性)。预期可就一种活性或功能改变经修饰 的蛋白或多肽，然而在其他方面仍保持野生型或未改变的活性或功能。可选择地，经修 饰的蛋白可以是完全无功能的或其相应核酸序列可进行改变以使多肽根本不再表达，被 截短或作为移码或其他修饰的结果表达不同的氨基酸序列。在某些实施方案中，重组蛋白或多肽的大小可包含但不限于5、6、7、8、9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100、 110、 120、 130、140、 150、 160、 170、 180、 190、 200、 210、 220、 230、 240、 250、 275、 300、 325、 350、 375、 400、 425、 450、 475、 500、 525、 550、 575、 600、 625、 650、 675、 700、 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1100, 1200, 1300、1400、1500、1750、2000、2250、2500个或更多氨基分子残基，和可从其推导的
任何范围。预期，多肽可通过截短、使它们比它们的相应未改变的形式更短或通过可使 改变的蛋白质更长的融合或结构域改组(domain shuffling)来进行修饰。如本文所使用的，“氨基分子”是指本领域技术人员已 知的任何氨基酸、氨基 酸衍生物或氨基酸模拟物。在某些实施方案中，蛋白质性质的分子的残基是连续的，不 具有间断氨基分子残基的序列的任何非氨基分子。在其他实施方案中，序列可包含一个 或多个非氨基分子部分。在特定实施方案中，蛋白质性质的分子的残基的序列可被一个 或多个非氨基分子部分间断。因此，术语“蛋白质性质的组合物”包括包含天然合成的 蛋白质中20种普通氨基酸中的至少一种或至少一种经修饰的氨基酸或稀有氨基酸的氨基 分子序列。蛋白质性质的组合物可通过本领域技术人员已知的任何技术来制备，所述技术 包括通过标准分子生物学技术进行的蛋白质、多肽或肽的表达、蛋白质性质的化合物从 天然来源的分离或蛋白质性质的物质的化学合成。不同弹状病毒基因或基因组的核苷酸 和多肽序列之前已经公开，并且可见于本领域技术人员已知的计算机化的数据库。一个 这样的数据库是美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information) 的GenBank和GenPept数据库，其可通过国际互联网在ncbi.nlm.nih.gov/访问。可使用 本文中公开的或本领域技术人员已知的技术扩增和/或表达这些已知的基因和病毒的编 码区。B、功能方面当本发明提及病毒蛋白或多肽的功能或活性时，除非另外指出，其是指该病毒 蛋白或多肽在生理条件下的活性或功能。例如，G蛋白参与特定细胞类型的结合和感染 的特异性和功效。可使用本领域技术人员熟知的测定法例如感染性测定法、蛋白质结合 测定法、空斑测定法等确定具有该活性的分子。C、病毒多肽的变体本发明的多肽的氨基酸序列变体可以为置换、插入或缺失变体。编码病毒多 肽的基因的突变可影响(与野生型或未改变的多肽或其他参照多肽相比)多肽的1、2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28、 29、 30、 31、 32、 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45、 46、 47、 48、 49、 50、 51、 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58、 59、 60、 61、 62、 63、 64、 65、 66、 67、 68、 69、 70、 71、 72、 73、 74、 75、 76、 77、 78、 79、 80、 81、 82、 83、 84、 85、 86、 87、 88、 89、 90、 91、 92、 93、 94、 95、 96、 97、 98、 99、 100、 110、 120、 130、 140、 150、 160、 170、 180、 190、 200、 210、 220、 230、 240、 250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500 个或更多非连续或连续氨基 酸(即，片段)。可通过参考本文中公开的每一种病毒的GenBank登录号和相关公共数 据库条目来鉴定由弹状病毒编码的各种多肽，涉及弹状病毒科的所有GenBank条目通过 引用合并入本文。
缺失变体缺少天然的、未改变的或野生型蛋白的一个或多个残基。可缺失单个 残基，或可缺失结构域(例如催化或结合结构域)的全部或一部分。可将终止密码子导 入(通过置换或插入)编码核酸序列以产生截短的蛋白质。插入突变体通常包括在多肽 的非终止点添加物质，特殊类型的插入物是嵌合多肽，所述嵌合多肽包括替代靶蛋白的 相关部分的相关蛋白的同源或相似部分。这可包括免疫反应性表位或仅一个或多个残基 的插入。还可产生末端添加物，其通常称为融合蛋白。置换变体通常包括蛋白质内一个或多个位点上的一种氨基酸对另一种氨基酸的 交换，并且可设计用于调节多肽的一个或多个性质(在丧失或不丧失其他功能或性质的 情况下)。置换可以是保守的，即，一个氨基酸用相似形状和电荷的氨基酸替代。保守置 换在本领域内是熟知的并且包括，例如，丙氨酸至丝氨酸、精氨酸至赖氨酸、天冬酰胺 至谷氨酰胺或组氨酸、天冬氨酸至谷氨酸、半胱氨酸至丝氨酸、谷氨酰胺至天冬酰胺、 谷氨酸至天冬氨酸、甘氨酸至脯氨酸、组氨酸至天冬酰胺或谷氨酰胺、异亮氨酸至亮氨 酸或缬氨酸、亮氨酸至缬氨酸或异亮氨酸、赖氨酸至精氨酸、甲硫氨酸至亮氨酸或异亮 氨酸、苯丙氨酸至酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸、丝氨酸至苏氨酸、苏氨酸至丝氨酸、色 氨酸至酪氨酸、酪氨酸至色氨酸或苯丙氨酸以及缬氨酸至异亮氨酸或亮氨酸的改变。可 选择地，置换可以是非保守的，以便多肽的功能或活性受到影响。非保守性改变通常包 括用化学上不同的残基置换残基，例如用极性的或带电荷的氨基酸置换非极性的或不带 电荷的氨基酸，反之亦然。术语“功能等同密码子”在本文中用于指编码相同氨基酸的密码子，例如编码 精氨酸或丝氨酸的6个密码子，也指编码生物学上等同的氨基酸的密码子(参见下面表 1)。表1.密码子表
权利要求
1.杀伤过度增殖细胞的方法，其包括将所述细胞与分离的溶瘤弹状病毒接触，其中 所述弹状病毒编码(a)与SEQID NO 5或SEQ ID NO 11具有至少80%的氨基酸序列同一性的G蛋白；(b)与SEQID NO 2或SEQ ID NO 8具有至少90%的氨基酸序列同一性的N蛋白；(C)与SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 10具有至少80%的氨基酸序列同一性的M蛋白；(d)与SEQID NO 3或SEQ ID NO 9具有至少65 %的氨基酸序列同一性的P蛋白；或(e)与SEQID NO 6或SEQ ID NO 12具有至少80%的氨基酸序列同一性的L蛋白。
2.权利要求1的方法，其中所述细胞包含于患者中。
3.权利要求2的方法，其中所述细胞是癌细胞。
4.权利要求3的方法，其中所述癌细胞是转移性癌细胞。
5.权利要求2的方法，其中对所述患者施用所述溶瘤弹状病毒。
6.权利要求5的方法，其中通过腹膜内、静脉内、动脉内、肌内、皮内、瘤内、皮下 或鼻内施用来施用所述溶瘤弹状病毒。
7.权利要求1的方法，其还包括施用第二抗癌治疗。
8.权利要求7的方法，其中所述第二抗癌治疗是第二溶瘤病毒。
9.权利要求8的方法，其中所述第二溶瘤病毒是痘苗病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、新 城疫病毒、腺病毒、甲病毒、细小病毒或弹状病毒。
10.权利要求9的方法，其中所述第二抗癌剂是第二溶瘤弹状病毒。
11.权利要求10的方法，其中所述第二溶瘤弹状病毒是水泡性口膜炎病毒(VSV)、 Arajas病毒、科卡病毒、伊斯法罕病毒、Maraba病毒、皮理病毒、水泡性口炎阿拉戈斯 病毒、BeAn 157575病毒、博特克病毒、Calchaqui病毒、美洲鳗病毒、格雷洛奇病毒、 朱罗纳病毒、克拉马斯病毒、克瓦塔病毒、La Joya病毒、Malpais Spring病毒、芒特埃 尔岗蝙蝠病毒、Perinet病毒、Tupaia病毒、Farmington、大巴伊亚病毒、Muir Springs 病毒、Reed Ranch病毒、哈特公园病毒、费兰杜病毒、凯米斯病毒、Mosqueiro病毒、 莫苏里病毒、巴鲁病毒、Fukuoka病毒、克恩峡谷病毒、恩科比逊病毒、利丹特病毒、 Keuraliba病毒、Connecticut病毒、新明托病毒、莎草病毒、查可病毒、Sena Madureira 病毒、蒂姆博病毒、阿尔姆皮瓦病毒、阿鲁卡病毒、班戈兰病毒、卞博病毒、Bivens Arm病毒、Bluecrab病毒、查里维勒河病毒、Coastal Plains病毒、DakArK 7292病毒、 Entamoeba病毒、加巴病毒、戈萨斯病毒、Humpty Doo病毒、约英杰卡卡病毒、肯纳曼 格拉姆病毒、科隆各病毒、Koolpinyah病毒、Kotonkon病毒、兰德几亚病毒、Manitoba 病毒、马可病毒、Nasoule病毒、纳瓦鲁病毒、Ngaingan病毒、Oak-Vale病毒、奥博第 安病毒、奥衣塔病毒、奥安戈病毒、帕里河病毒、Rio Grandecichlid病毒、圣德吉姆巴病 毒、西格马病毒、Sripur 病毒、Sweetwater Branch 病毒、Tibrogargan 病毒、Xiburema 病 毒、雅塔病毒、罗德岛病毒、Adelaide River病毒、Berrimah病毒、金伯利病毒或牛短暂热病毒。
12.权利要求7的方法，其中所述第二癌症治疗是化学治疗剂、放射治疗剂或免疫治 疗剂。
13.杀伤过度增殖细胞的方法，其包括将所述细胞与分离的溶瘤弹状病毒接触，其中 所述弹状病毒编码(a)具有SEQID NO 5或SEQ ID NO 11的至少40个连续氨基酸的G蛋白；(b)具有SEQID NO 2或SEQ ID NO 8的至少40个连续氨基酸的N蛋白；(C)具有SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 10的至少40个连续氨基酸的M蛋白；(d)具有SEQID NO 3或SEQ ID NO 9的至少40个连续氨基酸的P蛋白；或(e)具有SEQID NO 6或SEQ ID NO 12的至少40个连续氨基酸的L蛋白。
14.权利要求13的方法，其中所述细胞包含于患者中。
15.权利要求14的方法，其中所述细胞是癌细胞。
16.权利要求15的方法，其中所述癌细胞是转移性癌细胞。
17.权利要求14的方法，其中对所述患者施用所述溶瘤弹状病毒。
18.权利要求17的方法，其中通过腹膜内、静脉内、动脉内、肌内、皮内、瘤内、皮 下或鼻内施用来施用所述溶瘤弹状病毒。
19.权利要求13的方法，其还包括施用第二抗癌治疗。
20.权利要求19的方法，其中所述第二抗癌治疗是第二溶瘤病毒。
21.权利要求20的方法，其中所述第二溶瘤病毒是痘苗病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、 新城疫病毒、腺病毒或弹状病毒。
22.权利要求21的方法，其中所述第二抗癌剂是第二溶瘤弹状病毒。
23.权利要求22的方法，其中所述第二溶瘤弹状病毒是水泡性口膜炎病毒(VSV)、 Arajas病毒、科卡病毒、伊斯法罕病毒、Maraba病毒、皮理病毒、水泡性口炎阿拉戈斯 病毒、BeAn 157575病毒、博特克病毒、Calchaqui病毒、美洲鳗病毒、格雷洛奇病毒、 朱罗纳病毒、克拉马斯病毒、克瓦塔病毒、La Joya病毒、Malpais Spring病毒、芒特埃 尔岗蝙蝠病毒、Perinet病毒、Tupaia病毒、Farmington、大巴伊亚病毒、Muir Springs 病毒、Reed Ranch病毒、哈特公园病毒、费兰杜病毒、凯米斯病毒、Mosqueiro病毒、 莫苏里病毒、巴鲁病毒、Fukuoka病毒、克恩峡谷病毒、恩科比逊病毒、利丹特病毒、 Keuraliba病毒、Connecticut病毒、新明托病毒、莎草病毒、查可病毒、Sena Madureira 病毒、蒂姆博病毒、阿尔姆皮瓦病毒、阿鲁卡病毒、班戈兰病毒、卞博病毒、Bivens Arm病毒、Bluecrab病毒、查里维勒河病毒、Coastal Plains病毒、DakArK 7292病毒、 Entamoeba病毒、加巴病毒、戈萨斯病毒、Humpty Doo病毒、约英杰卡卡病毒、肯纳曼 格拉姆病毒、科隆各病毒、Koolpinyah病毒、Kotonkon病毒、兰德几亚病毒、Manitoba 病毒、马可病毒、Nasoule病毒、纳瓦鲁病毒、Ngaingan病毒、Oak-Vale病毒、奥博第 安病毒、奥衣塔病毒、奥安戈病毒、帕里河病毒、Rio Grandecichlid病毒、圣德吉姆巴病 毒、西格马病毒、Sripur 病毒、Sweetwater Branch 病毒、Tibrogargan 病毒、Xiburema 病 毒、雅塔病毒、罗德岛病毒、Adelaide River病毒、Berrimah病毒、金伯利病毒或牛短暂 热病毒。
24.权利要求19的方法，其中所述第二癌症治疗是化学治疗剂、放射治疗剂或免疫治疗剂。
25.用于治疗癌症患者的方法，其包括施用有效量的分离的溶瘤弹状病毒，所述弹状 病毒编码(a)与SEQID NO 5或SEQ ID NO 11具有至少80 %的氨基酸序列同一性的G蛋白；(b)与SEQID NO 2或SEQ ID NO 8具有至少90%的氨基酸序列同一性的N蛋白；(C)与SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 10具有至少80%的氨基酸序列同一性的M蛋白；(d)与SEQID NO 3或SEQ ID NO 9具有至少65 %的氨基酸序列同一性的P蛋白；或(e)与SEQID NO 6或SEQ ID NO 12具有至少80%的氨基酸序列同一性的L蛋白。
26.权利要求25的方法，其中通过腹膜内、静脉内、动脉内、肌内、皮内、瘤内、皮 下或鼻内施用来施用所述溶瘤弹状病毒。
27.权利要求25的方法，其还包括施用第二癌症治疗。
28.权利要求27的方法，其中所述第二抗癌治疗包含第二溶瘤病毒。
29.权利要求28的方法，其中所述第二溶瘤病毒是痘苗病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、 新城疫病毒、腺病毒或弹状病毒。
30.权利要求29的方法，其中所述第二抗癌治疗包含第二溶瘤弹状病毒。
31.权利要求30的方法，其中所述第二弹状病毒是水泡性口膜炎病毒(VSV)、Arajas 病毒、科卡病毒、伊斯法罕病毒、Maraba病毒、皮理病毒、水泡性口炎阿拉戈斯病毒、 BeAn 157575病毒、博特克病毒、Calchaqui病毒、美洲鳗病毒、格雷洛奇病毒、朱罗纳 病毒、克拉马斯病毒、克瓦塔病毒、La Joya病毒、Malpais Spring病毒、芒特埃尔岗蝙 蝠病毒、Perinet病毒、Tupaia病毒、Farmington、大巴伊亚病毒、Muir Springs病毒、 Reed Ranch病毒、哈特公园病毒、费兰杜病毒、凯米斯病毒、Mosqueiro病毒、莫苏里病 毒、巴鲁病毒、Fukuoka病毒、克恩峡谷病毒、恩科比逊病毒、利丹特病毒、Keuraliba病 毒、Connecticut病毒、新明托病毒、莎草病毒、查可病毒、Sena Madureira病毒、蒂姆博 病毒、阿尔姆皮瓦病毒、阿鲁卡病毒、班戈兰病毒、卞博病毒、Bivens Arm病毒、Blue crab病毒、查里维勒河病毒、Coastal Plains病毒、DakArK 7292病毒、Entamoeba病毒、 加巴病毒、戈萨斯病毒、Humpty Doo病毒、约英杰卡卡病毒、肯纳曼格拉姆病毒、科隆 各病毒、Koolpinyah病毒、Kotonkon病毒、兰德几亚病毒、Manitoba病毒、马可病毒、 Nasoule病毒、纳瓦鲁病毒、Ngaingan病毒、Oak-Vale病毒、奥博第安病毒、奥衣塔病 毒、奥安戈病毒、帕里河病毒、Rio Grandecichlid病毒、圣德吉姆巴病毒、西格马病毒、 Sripur 病毒、SweetwaterBranch 病毒、Tibrogargan 病毒、Xiburema 病毒、雅塔病毒、罗德 岛病毒、Adelaide River病毒、Berrimah病毒、金伯利病毒或牛短暂热病毒。
32.权利要求27的方法，其中所述第二癌症治疗是化学治疗、放射治疗或免疫治疗或 手术。
33.用于治疗癌症患者的方法，其包括施用有效量的溶瘤弹状病毒，所述弹状病毒编码(a)具有SEQID NO 5或SEQ ID NO 11的至少40个连续氨基酸的G蛋白；(b)具有SEQID NO 2或SEQ IDNO 8的至少40个连续氨基酸的N蛋白；(C)具有SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 10的至少40个连续氨基酸的M蛋白；(d)具有SEQID NO 3或SEQ IDNO 9的至少40个连续氨基酸的P蛋白；或(e)具有SEQID NO 6或SEQ ID NO 12的至少40个连续氨基酸的L蛋白。
34.权利要求33的方法，其中通过腹膜内、静脉内、动脉内、肌内、皮内、皮下或鼻 内施用来施用所述溶瘤弹状病毒。
35.包含重组溶瘤弹状病毒的组合物，所述弹状病毒编码N、P、M、G或L蛋白中 的一个或多个的氨基酸变体，所述氨基酸变体与下列病毒的N、P、M、G或L蛋白中的 一个或多个具有至少80%但低于100%的氨基酸同一性，所述病毒是Arajas病毒、科卡 病毒、伊斯法罕病毒、Maraba病毒、皮理病毒、水泡性口炎阿拉戈斯病毒、BeAnl57575 病毒、博特克病毒、Calchaqui病毒、美洲鳗病毒、格雷洛奇病毒、朱罗纳病毒、克拉马 斯病毒、克瓦塔病毒、La Joya病毒、Malpais Spring病毒、芒特埃尔岗蝙蝠病毒、Perinet 病毒、Tupaia病毒、Farmington>大巴伊亚病毒、Muir Spring s病毒、Reed Ranch病毒、 哈特公园病毒、费兰杜病毒、凯米斯病毒、Mosqueiro病毒、莫苏里病毒、巴鲁病毒、 Fukuoka病毒、克恩峡谷病毒、恩科比逊病毒、利丹特病毒、Keuraliba病毒、Connecticut 病毒、新明托病毒、莎草病毒、查可病毒、Sena Madureira病毒、蒂姆博病毒、阿尔姆 皮瓦病毒、阿鲁卡病毒、班戈兰病毒、卞博病毒、Bivens Arm病毒、Blue crab病毒、查 里维勒河病毒、Coastal Plains病毒、DakArK 7292病毒、Entamoeba病毒、加巴病毒、 戈萨斯病毒、HumptyD00病毒、约英杰卡卡病毒、肯纳曼格拉姆病毒、科隆各病毒、 Koolpinyah病毒、Kotonkon病毒、兰德几亚病毒、Manitoba病毒、马可病毒、Nasoule 病毒、纳瓦鲁病毒、Ngaingan病毒、Oak-Vale病毒、奥博第安病毒、奥衣塔病毒、奥安 戈病毒、帕里河病毒、RioGrandecichlid病毒、圣德吉姆巴病毒、西格马病毒、Sripur病 毒、Sweetwater Branch病毒、Tibrogargan病毒、Xiburema病毒、雅塔病毒、罗德岛病 毒、Adelaide River病毒、Berrimah病毒、金伯利病毒或牛短暂热病毒。
36.权利要求35的组合物，其中所述弹状病毒是Maraba病毒、Carajas病毒、Muir Springs病毒、Farmington或大巴伊亚病毒。
37.权利要求35的组合物，其还包含第二溶瘤病毒。
38.权利要求37的组合物，其中所述第二溶瘤病毒是痘苗病毒、疱疹病毒、麻疹病 毒、新城疫病毒、腺病毒或弹状病毒。
39.权利要求38的组合物，其中所述第二溶瘤病毒是弹状病毒。
40.权利要求39的组合物，其中所述第二弹状病毒是Arajas病毒、科卡病毒、伊斯 法罕病毒、Maraba病毒、皮理病毒、水泡性口炎阿拉戈斯病毒、BeAn 157575病毒、博 特克病毒、Calchaqui病毒、美洲鳗病毒、格雷洛奇病毒、朱罗纳病毒、克拉马斯病毒、 克瓦塔病毒、La Joya病毒、Malpais Spring病毒、芒特埃尔岗蝙蝠病毒、Perinet病毒、 Tupaia病毒、Farmington>大巴伊亚病毒、MuirSprings病毒、Reed Ranch病毒、哈特公园 病毒、费兰杜病毒、凯米斯病毒、Mosqueiro病毒、莫苏里病毒、巴鲁病毒、Fukuoka病 毒、克恩峡谷病毒、恩科比逊病毒、利丹特病毒、Keuraliba病毒、Connecticut病毒、新明托病毒、莎草病毒、查可病毒、SenaMadureira病毒、蒂姆博病毒、阿尔姆皮瓦病毒、 阿鲁卡病毒、班戈兰病毒、卞博病毒、Bivens Arm病毒、Blue crab病毒、查里维勒河病 毒、Coastal Plains病毒、DakArK 7292病毒、Entamoeba病毒、加巴病毒、戈萨斯病毒、 Humpty Doo病毒、约英杰卡卡病毒、肯纳曼格拉姆病毒、科隆各病毒、Koolpinyah病 毒、Ko tonkon病毒、兰德几亚病毒、Manitoba病毒、马可病毒、Nasoule病毒、纳瓦鲁病 毒、Ngaingan病毒、Oak-Vale病毒、奥博第安病毒、奥衣塔病毒、奥安戈病毒、帕里河 病毒、Rio Grandecichlid病毒、圣德吉姆巴病毒、西格马病毒、Sripur病毒、Sweetwater Branch病毒、Tibrogargan病毒、Xiburema病毒、雅塔病毒、罗德岛病毒、Adelaide River 病毒、Berrimah病毒、金伯利病毒或牛短暂热病毒。
41.权利要求35的组合物，其中所述组合物是药学上可接受的组合物。
42.权利要求41的组合物，其还包含第二抗癌剂。
43.权利要求42的组合物，其中所述第二抗癌剂是化学治疗剂、放射治疗剂或免疫治 疗剂。
44.包含分离的溶瘤弹状病毒的组合物，所述弹状病毒具有编码下列病毒的变体N、 P、M、G或L蛋白中的一个或多个的至少40个连续氨基酸的核酸片段，所述病毒是 Arajas病毒、科卡病毒、伊斯法罕病毒、Maraba病毒、皮理病毒、水泡性口炎阿拉戈斯 病毒、BeAnl57575病毒、博特克病毒、Calchaqui病毒、美洲鳗病毒、格雷洛奇病毒、朱 罗纳病毒、克拉马斯病毒、克瓦塔病毒、La Joya病毒、Malpais Spring病毒、芒特埃尔岗 蝙蝠病毒、Perinet病毒、Tupaia病毒、Farmington>大巴伊亚病毒、Muir Spring s病毒、 Reed Ranch病毒、哈特公园病毒、费兰杜病毒、凯米斯病毒、Mosqueiro病毒、莫苏里病 毒、巴鲁病毒、Fukuoka病毒、克恩峡谷病毒、恩科比逊病毒、利丹特病毒、Keuraliba病 毒、Connecticut病毒、新明托病毒、莎草病毒、查可病毒、Sena Madureira病毒、蒂姆博 病毒、阿尔姆皮瓦病毒、阿鲁卡病毒、班戈兰病毒、卞博病毒、Bivens Arm病毒、Blue crab病毒、查里维勒河病毒、Coastal Plains病毒、DakArK 7292病毒、Entamoeba病毒、 加巴病毒、戈萨斯病毒、HumptyD00病毒、约英杰卡卡病毒、肯纳曼格拉姆病毒、科隆 各病毒、Koolpinyah病毒、Kotonkon病毒、兰德几亚病毒、Manitoba病毒、马可病毒、 Nasoule病毒、纳瓦鲁病毒、Ngaingan病毒、Oak-Vale病毒、奥博第安病毒、奥衣塔病 毒、奥安戈病毒、帕里河病毒、RioGrandecichlid病毒、圣德吉姆巴病毒、西格马病毒、 Sripur 病毒、Sweetwater Branch 病毒、Tibrogargan 病毒、Xiburema 病毒、雅塔病毒、罗 德岛病毒、Adelaide River病毒、Berrimah病毒、金伯利病毒或牛短暂热病毒。
45.权利要求44的组合物，其中所述弹状病毒是Maraba病毒、Carajas病毒、Muir Springs病毒或大巴伊亚病毒。
46.权利要求44的组合物，其还包含第二溶瘤病毒。
47.权利要求46的组合物，其中所述第二溶瘤病毒是痘苗病毒、疱疹病毒、麻疹病 毒、新城疫病毒、腺病毒或弹状病毒。
48.权利要求47的组合物，其中所述第二溶瘤病毒是弹状病毒。
49.权利要求48的组合物，其中所述第二弹状病毒是Arajas病毒、科卡病毒、伊斯 法罕病毒、Maraba病毒、皮理病毒、水泡性口炎阿拉戈斯病毒、BeAn 157575病毒、博 特克病毒、Calchaqui病毒、美洲鳗病毒、格雷洛奇病毒、朱罗纳病毒、克拉马斯病毒、克瓦塔病毒、La Joya病毒、Malpais Spring病毒、芒特埃尔岗蝙蝠病毒、Perinet病毒、 Tupaia病毒、Farmington>大巴伊亚病毒、MuirSprings病毒、Reed Ranch病毒、哈特公园 病毒、费兰杜病毒、凯米斯病毒、Mosqueiro病毒、莫苏里病毒、巴鲁病毒、Fukuoka病 毒、克恩峡谷病毒、恩科比逊病毒、利丹特病毒、Keuraliba病毒、Connecticut病毒、新 明托病毒、莎草病毒、查可病毒、SenaMadureira病毒、蒂姆博病毒、阿尔姆皮瓦病毒、 阿鲁卡病毒、班戈兰病毒、卞博病毒、Bivens Arm病毒、Blue crab病毒、查里维勒河病 毒、Coastal Plains病毒、DakArK 7292病毒、Entamoeba病毒、加巴病毒、戈萨斯病毒、 Humpty Doo病毒、约英杰卡卡病毒、肯纳曼格拉姆病毒、科隆各病毒、Koolpinyah病 毒、Kotonkon病毒、兰德几亚病毒、Manitoba病毒、马可病毒、Nasoule病毒、纳瓦鲁病 毒、Ngaingan病毒、Oak-Vale病毒、奥博第安病毒、奥衣塔病毒、奥安戈病毒、帕里河 病毒、Rio Grandecichlid病毒、圣德吉姆巴病毒、西格马病毒、Sripur病毒、Sweetwater Branch病毒、Tibrogargan病毒、Xiburema病毒、雅塔病毒、罗德岛病毒、Adelaide River 病毒、Berrimah病毒、金伯利病毒或牛短暂热病毒。
50.权利要求44的组合物，其中所述组合物是药学上可接受的组合物。
51.权利要求50的组合物，其还包含第二抗癌剂。
52.权利要求51的组合物，其中所述第二抗癌剂是化学治疗剂、放射治疗剂或免疫治 疗剂。
53.包含分离的重组弹状病毒的组合物，所述重组弹状病毒包含来自第一病毒的异源 病毒G蛋白和编码至少一个来自第二弹状病毒的第二病毒蛋白的RNA基因组，其中所述 异源病毒G蛋白的胞外结构域与伊斯法罕病毒G蛋白、金迪普拉病毒G蛋白、Maraba病 毒G蛋白、大巴伊亚病毒G蛋白、克拉马斯病毒G蛋白、Farminton病毒G蛋白、埃博 拉病毒G蛋白或Jaagsietke绵羊逆转录病毒G蛋白具有至少大约80%的同一性。
54.权利要求53的组合物，其中所述RNA基因组不编码异源病毒G蛋白。
55.权利要求54的组合物，其中所述RNA基因组编码来自第二弹状病毒的G蛋白。
56.权利要求53的组合物，其中所述RNA基因组编码治疗性基因。
57.权利要求53的组合物，其中RNA基因组编码来自下列病毒的G、M、P、N或 L蛋白，所述病毒是VSV、Arajas病毒、科卡病毒、伊斯法罕病毒、Maraba病毒、皮 理病毒、水泡性口炎阿拉戈斯病毒、BeAn 157575病毒、博特克病毒、Calchaqui病毒、 美洲鳗病毒、格雷洛奇病毒、朱罗纳病毒、克拉马斯病毒、克瓦塔病毒、La Joya病毒、 Malpais Spring病毒、芒特埃尔岗蝙蝠病毒、Perinet病毒、Tupaia病毒、Farmington>大 巴伊亚病毒、Muir Spring s病毒、ReedRanch病毒、哈特公园病毒、费兰杜病毒、凯米 斯病毒、Mosqueiro病毒、莫苏里病毒、巴鲁病毒、Fukuoka病毒、克恩峡谷病毒、恩 科比逊病毒、利丹特病毒、Keuraliba病毒、Connecticut病毒、新明托病毒、莎草病毒、 查可病毒、Sena Madureira病毒、蒂姆博病毒、阿尔姆皮瓦病毒、阿鲁卡病毒、班戈兰 病毒、卞博病毒、BivensArm病毒、Blue crab病毒、查里维勒河病毒、Coastal Plains病 毒、DakArK 7292病毒、Entamoeba病毒、加巴病毒、戈萨斯病毒、HumptyDoo病毒、 约英杰卡卡病毒、肯纳曼格拉姆病毒、科隆各病毒、Koolpinyah病毒、Kotonkon病毒、 兰德几亚病毒、Manitoba病毒、马可病毒、Nasoule病毒、纳瓦鲁病毒、Ngaingan病 毒、Oak-Vale病毒、奥博第安病毒、奥衣塔病毒、奥安戈病毒、帕里河病毒、RioGrandecichlid病毒、圣德吉姆巴病毒、西格马病毒、Sripur病毒、Sweetwater Branch病毒、 Tibrogargan病毒、Xiburema病毒、雅塔病毒、罗德岛病毒、Adelaide River病毒、 Berrimah病毒、金伯利病毒或牛短暂热病毒。
58.权利要求57的组合物，其中RNA基因组编码VSVG、M、P、N或L蛋白。
59.权利要求58的组合物，其中RNA基因组编码VSVG、M、P、N和L蛋白。
60.用于治疗癌症患者的方法，其包括(a)对所述患者施用有效量的第一溶瘤弹状病毒；和(b)对所述患者施用有效量的至少第二溶瘤弹状病毒，其中所述第二溶瘤弹状病毒包 含与所述第一溶瘤弹状病毒不同的G蛋白。
61.权利要求60的方法，其中所述癌症患者患有转移癌。
62.权利要求60的方法，其中所述癌症患者是具有免疫能力的。
63.权利要求60的方法，其中通过腹膜内、静脉内、动脉内、肌内、皮内、瘤内、皮 下或鼻内施用来施用所述第一溶瘤或第二溶瘤弹状病毒。
64.权利要求60的方法，其还包括施用额外的抗癌治疗。
65.权利要求64的方法，其中所述额外的癌症治疗是化学治疗剂、放射治疗剂或免疫 治疗剂。
66.权利要求60的方法，其中所述第一或第二溶瘤弹状病毒包含来自下列病毒的G 蛋白，所述病毒是水泡性口膜炎病毒(VSV)、Arajas病毒、科卡病毒、伊斯法罕病毒、 Maraba病毒、皮理病毒、水泡性口炎阿拉戈斯病毒、BeAn 157575病毒、博特克病毒、 Calchaqui病毒、美洲鳗病毒、格雷洛奇病毒、朱罗纳病毒、克拉马斯病毒、克瓦塔病 毒、La Joya病毒、Malpais Spring病毒、芒特埃尔岗蝙蝠病毒、Perinet病毒、Tupaia病 毒、Farmington>大巴伊亚病毒、Muir Springs病毒、Reed Ranch病毒、哈特公园病毒、 费兰杜病毒、凯米斯病毒、Mosqueiro病毒、莫苏里病毒、巴鲁病毒、Fukuoka病毒、 克恩峡谷病毒、恩科比逊病毒、利丹特病毒、Keuraliba病毒、Connecticut病毒、新明 托病毒、莎草病毒、查可病毒、Sena Madureira病毒、蒂姆博病毒、阿尔姆皮瓦病毒、 阿鲁卡病毒、班戈兰病毒、卞博病毒、Bivens Arm病毒、Blue crab病毒、查里维勒河 病毒、Coastal Plains病毒、DakArK 7292病毒、Entamoeba病毒、加巴病毒、戈萨斯病 毒、Humpty Doo病毒、约英杰卡卡病毒、肯纳曼格拉姆病毒、科隆各病毒、Koolpinyah 病毒、Kotonkon病毒、兰德几亚病毒、Manitoba病毒、马可病毒、Nasoule病毒、纳瓦 鲁病毒、Ngaingan病毒、Oak-Vale病毒、奥博第安病毒、奥衣塔病毒、奥安戈病毒、 帕里河病毒、Rio Grande cichlid病毒、圣德吉姆巴病毒、西格马病毒、Sripur病毒、 SweetwaterBranch病毒、Tibrogargan病毒、Xiburema病毒、雅塔病毒、罗德岛病毒、 Adelaide River病毒、Berrimah病毒、金伯利病毒或牛短暂热病毒。
67.权利要求66的方法，其中所述第一或第二溶瘤弹状病毒包含来自VSV或伊斯法 罕病毒的G蛋白。
68.权利要求67的方法，其中所述第一溶瘤弹状病毒包含来自VSV的G蛋白，且所 述第二溶瘤弹状病毒包含来自伊斯法罕病毒的G蛋白。
69.权利要求67的方法，其中所述第一溶瘤弹状病毒包含来自伊斯法罕病毒的G蛋 白，且所述第二溶瘤弹状病毒包含来自VSV的G蛋白。
70.权利要求60的方法，其还包括(C)对所述患者施用有效量的至少第三溶瘤弹状 病毒，其中所述第三溶瘤弹状病毒包含与所述第一和所述第二溶瘤弹状病毒不同的G蛋 白。
全文摘要
本发明的实施方案包括涉及非VSV弹状病毒的组合物和方法以及它们作为抗癌治疗剂的用途。此类弹状病毒具有在体外和体内杀伤肿瘤细胞的性质。
文档编号A61K48/00GK102026645SQ200780040733
公开日2011年4月20日 申请日期2007年9月17日 优先权日2006年9月15日
发明者C·布朗, D·斯托耶德尔, J·贝尔 申请人:渥太华健康研究所