专利名称：肌肉损伤抑制组合物的制作方法
的组合物，更详细的是，涉及以醋酸菌或食醋的脂溶性有机溶剂提取 物作为有效成分的肌肉损伤抑制组合物。而且，本发明还涉及以醋酸
菌的碱性稳定脂质，碱性稳定脂质中的N-酰基二氢鞘氨醇 (N-acylsphinganine)， 二氢鞘氨醇，氨基脂质或薛类化合物作为有效 成分的肌肉损伤抑制组合物。
背景技术：
家务劳动，园艺劳动，上班目的的步行等日常生活的活动，闲暇 时进行的趣味和休闲活动等所有身体活动在维持健康上是有用的，人 们认为尤其是体育活动等运动对健康维持提高更为有益，不仅对比赛 者，而且也普及到一般人。
但是，也存在如果进行过度的体育活动等运动而损伤肌肉的情况， 有时也发生反效果的情况。
已知这种肌肉损伤由运动超负荷而引起， 一旦一部分肌肉中发生 损伤，损伤的肌肉的细胞分泌细胞素和趋化因子(Chemokine)，促进中 性白血球和巨噬细胞的浸润。因此，人们认为由于中性白血球增加而 生成的活性氧种类，以及由中性白血球释放的髓过氧化物酶(以下也称 为MPO)的作用生成的次氯酸等，对周边肌肉造成损伤等扩大作用导致 了伴随炎症的症状的发生。这可以通过研究MPO活性，了解运动超负荷 而导致的肌肉损伤程度。
此外，通过研究细胞素的其中一种白细胞介素-6(以下也称为 IL-6)，趋化因子一种的与中性白血球的游走相关的中性白血球趋化性 因子-1 (以下也称为CXCL-1)等的分泌量和基因表达量，也可以了解肌肉的损失程度。
对于这种伴随肌肉损伤的炎症，已知有保泰松(phenylbutazone)， 水杨酸衍生物，茚甲新(indomethacin)，苯乙酸等非类固醇类消炎物 质等。
但是，这种非类固醇类消炎物质的作用尽管有助于从炎症发生的 恢复治疗，但并不具有抑制防止肌肉损伤的作用。
而且，该非类固醇类消炎物质会导致肌粘膜的损伤和胃溃疡等对 消化器官的副作用。
因此，为了抑制这些副作用，人们还提出了在该非类固醇类消炎 物质中混合磷脂的组合物(例如，参照专利文献l),但未必能够满足。
为了期待更有效的作用，需要具有防止肌肉损伤的功能且副作用 尽量少的安全性高的物质，例如通过维生素E消除由于运动超负荷而 形成的活性氧种类可以抑制肌肉损伤的扩大作用(例如，参照非专利文 献l)。
而且，人们还提出了番茄红素(lycopene)等也抑制肌肉蛋白质 分解，具有筋肉损伤预防作用(例如，参照非专利文献2)。
但是，尽管这些物质安全性更高，但也无法充分满足抑制预防肌 肉损伤的作用。
因此，需要开发安全性高，效果更强的肌肉损伤抑制组合物。 专利文献l:特开昭55-89225号公报 专利文献2:特开2004-59518号公报
非专利文献l:东北J. Exp.Med. (Tohoku J.Exp.Med.)， 198巻， p47-53, 2002年
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于解决上述问题，提供安全性高且肌肉损伤抑制 效果更强的肌肉损伤抑制组合物。 用于解决问题的手段鉴于上述问题，本发明人着眼于一直作为酿造制醋菌等使用的认 识到高安全性的醋酸菌。此外，已知醋酸菌自古以来就与人们的饮食
生活深深相关，在食醋制造之外，例如欧洲的传统食品里海酸奶 (Caspian sea yogurt)中也含醋酸菌，也有长期的食用历史。
而且，由于醋酸菌在食醋发酵工序中的发酵终止后，经过过滤， 再被废弃，因此可以便宜地获得。
此外，本发明人着眼于通过醋酸菌发酵而制造的食醋，食醋是自 古以来备受青睐的酸味调味料，现有米醋，谷物醋，黑醋，糙米醋， 苹果醋和葡萄醋等水果醋，醇醋等。
本发明人进行了积极的研究，其结果是在用脂溶性有机溶剂从上 述醋酸菌或食醋中提取获得的脂溶性有机溶剂提取物中发现了肌肉损 伤抑制作用，从而完成了本发明。
此外，本发明人在醋酸菌的脂溶性有机溶剂提取物中所含的碱性 稳定脂质中，构成碱性稳定脂质的N-酰基二氢鞘氨醇，二氢鞘氨醇， 氨基脂质(或称"氨基脂类")，萜类化合物(terpenoid compounds) 等中也发现了肌肉损伤抑制作用，从而完成了本发明。
即，权利要求l中涉及的本发明提供肌肉损伤抑制组合物，其特 征在于含有醋酸菌的脂溶性有机溶剂提取物作为有效成分。
而且，权利要求2中涉及的本发明提供权利要求l所述的肌肉损伤 抑制组合物，其特征在于所述脂溶性有机溶剂为乙酸乙酯。
此外，权利要求3中涉及的本发明提供权利要求1所述的肌肉损伤 抑制组合物，其特征在于所述脂溶性有机溶剂提取物是碱性稳定脂质。
此外，权利要求4中涉及的本发明提供权利要求3所述的肌肉损伤 抑制组合物，其特征在于所述碱性稳定脂质为N-酰基二氢鞘氨醇。
此外，权利要求5涉及的本发明提供权利要求3所述的肌肉损伤抑 制组合物，其特征在于所述碱性稳定脂质为二氢鞘氨醇。
此外，权利要求6涉及的本发明提供权利要求3所述的肌肉损伤抑 制组合物，其特征在于所述碱性稳定脂质为氨基脂质。
此外，权利要求7涉及的本发明提供权利要求3所述的肌肉损伤抑制组合物，其特征在于所述碱性稳定脂质为薛类化合物。
此外，权利要求8涉及的本发明提供肌肉损伤抑制组合物，其特 征在于含有食醋的脂溶性有机溶剂提取物作为有效成分。
此夕卜，权利要求9涉及的本发明提供权利要求8所述的肌肉损伤抑 制组合物，其特征在于所述脂溶性有机溶剂为乙酸乙酯。
发明的效果
本发明的醋酸菌或食醋的脂溶性有机溶剂提取物通过经口摄取 可以发挥强肌肉损伤抑制作用。此外，本发明的醋酸菌的脂溶性有机 溶剂提取物中所含的碱性稳定脂质，以及构成碱性稳定脂质的N-酰基 二氢鞘氨醇，二氢鞘氨醇，氨基脂质，碎类化合物通过经口摄取，也 可以发挥强肌肉损伤抑制作用。
因此，本发明可以提供安全性高而且肌肉损伤抑制效果强的肌肉 损伤抑制组合物，通过经口摄取作为食品等形式的本发明中涉及的肌 肉损伤抑制组合物，可以期待能够预防体育活动和激烈运动中肌肉损 伤和伴随日常生活中的身体活动的轻度的肌肉损伤。
图l:是表示本发明的轻度运动量下的心脏，比目鱼肌，腓肠肌
(gastrocnemius muscle)的MP0活性的图。
图2:是表示本发明的大强度运动量下的心脏的MPO活性的图。
图3:是表示本发明的醋酸菌脂溶性提取物，醋酸菌碱性稳定脂质的肌
肉损伤抑制效果的图。
图4:是表示本发明的N-酰基二氢鞘氨醇，二氢鞘氨醇，氨基脂质和辟 类化合物肌肉损伤抑制效果的图。
具体实施例方式
以下，对本发明进^f亍详细的说明。
作为本发明中使用的醋酸菌，没有特别限制，例如，可以例举属 于葡糖酸醋杆菌属(Gluconacetobacter)，葡糖杆菌属(Gluconobacter)， 醋杆菌属(Acetobacter) ， Asaia属或Acidomonas 属等的醋酸菌。
更详细的是，首先，作为葡糖酸醋杆菌属的醋酸菌，可以例举汉 氏葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter hansenii)，重氮营养葡糖酸醋 軒菌(Gluconacetobacter diazotrophicus) ， Gluconacetobacter intermedius ， Gluconacetobacter sacchari , 木糖葡糖酸醋杆菌 (Gluconacetobacter xylinus), 欧洲 葡糖酸醋杆菌 (Gluconacetobacter europaeus), 月l从葡萄酸醋杆菌 (Gluconacetobacter oboediens)等。
接着，作为葡糖杆菌属(Gluconobacter)的醋酸菌，可以例举弗 氏葡萄杆菌(Gluconobacter frateurii)， 蜡状葡糖杆菌 (Gluconobacter cerinus)等。
此外，作为醋杆菌属(Acetobacter)的醋酸菌，可以例举 Acetobacter tropicalis, Acetobacter indones iens is ， Acetobacter syzygii， Acetobacter cibinongensis, Acetobacter orientalis， 巴氏醋杆菌 (Acetobacter pasteurianus) ， Acetobacter orleanensis, Acetobacter lovaniensis， 醋化醋杆菌(Acetobacter aceti), 果实醋杆菌(Acetobacter pomorum)等。
j);匕夕卜，作为Asaia属的醋酸菌,可k乂命J举Asaia bogorensis， Asaia siamensis等。
而且,作为Acidomonas属的醋酸菌，可以例举Acidomonas methanol ica等。
此外，作为醋酸菌，除上述外，还可以适当使用可以在食醋制造 或酸奶等发酵食品中使用的醋酸菌，从自然界分离的并且已经在微生 物保藏机构中保藏的可以发放的保藏菌林等。
而且，由于醋酸菌可以在醋酸发酵中^f吏用而且在椰杲(Natade coco)，里海酸奶，红茶菌等中有食用历史，因此认为其安全性高，尤 其是，由于在食醋发酵工序中在发酵后通过过滤而被分离，再被废弃， 因此还可以大量便宜地获得。
7此外，本发明中可使用的食醋没有特別限制，可以例举例如米醋， 谷物醋，黑醋，糙米醋，苹果醋和葡萄醋等水果醋，醇醋等，其中的 谷物醋由于以小麦，玉米，米等谷物作为原料来制造，被广泛食用， 比较^f更宜，因而优选。
本发明中，如权利要求1或8中所述，使用含有用脂溶性有机溶剂 从上述的醋酸菌或食醋中提取的有效成分的提取物构成肌肉损伤抑制 组合物，此外，如权利要求3-7所述，使用从脂溶性有机溶剂提取物中 提取的碱性稳定脂质，或该碱性稳定脂质中的N-酰基二氢鞘氨醇，二 氢鞘氨醇，氨基脂质，辟类化合物等构成肌肉损伤抑制組合物，但也 可以例如含有这些成分作为有效成分，也可以使用经破碎处理的醋酸菌等。
而且，醋酸菌的破碎处理可以按照常规方法，例如，用超声波式 破碎才几，法式沖床(French press)等高压式石皮碎机来实施。
本发明中使用的脂溶性有机溶剂被定义为例如乙酸乙酯，苯酚， 正丁醇等疏水性有机溶剂，或者组合了这些疏水性有机溶剂和丙酮， 乙醇，甲醇，丙醇，异丙醇，丁醇等亲水性有机溶剂的混合溶剂或者 含有这些物质的水溶液。其中，如权利要求2或9所述，优选极性呈中 性的乙酸乙酯、或其混合溶剂。
而且，醋酸菌或食醋来源的脂溶性有机溶剂提取物的制备可以用 上述脂溶性有机溶剂直接提取，特别优选的是，在制备来自于醋酸菌 的脂溶性有机溶剂提取物时，在用脂溶性有机溶剂提取之前增加一个 预先通过用丙酮等亲水性有机溶剂处理醋酸菌悬浮液而除去逐渐析出 的物质的工序。
醋酸菌来源的碱性稳定脂质可以通过以下方式制备使用乙醇， 丙酮，己烷，氯仿，甲醇，乙酸乙酯等的1种或2种以上构成的有机溶 剂，从醋酸菌中提取脂类，对提取的脂质成分，实施弱碱性分离处理 除去磷脂。如果考虑食品用途中的安全性，理想的是低极性溶剂，作 为提取溶剂合适的是己烷或丙酮等。
这样获得的醋酸菌的碱性稳定脂质中包括作为含有成分的N-酰基二氢鞘氨醇，二氢鞘氨醇，氨基脂质，碎类化合物，脂肪酸等。这 些化合物一般作为醋酸菌的菌体来源的膜脂质，包含于属于醋杆菌属， 葡糖杆菌属，葡糖酸醋杆菌属等中的醋酸菌中，该化合物的详细情况 如下。
即，作为N-酰基二氢鞘氨醇，包括N-2'-羟棕榈酰-二氢鞘氨醇， 0-1-葡糖苷酸基-N-2'-羟棕榈酰-二氢鞘氨醇，N-顺式-vaccenoyl-二 氢鞘氨醇，0-1-葡糖苷酸基-N-棕榈酰-二氲鞘氨醇等。
此外，作为氨基脂质，包括例如鸟氨酰牛磺酸脂质3-(棕榈酰)-羟棕榈酰-鸟氨酰-牛磺酸，鸟氨酸脂质3-(棕榈酰)-羟棕榈酰-鸟氨酸， 溶血(lyso)-鸟氨酸脂质3-轻棕榈酰-鸟氨酸等。
此外，作为碎类化合物(藿烷类hopanoids)化合物，包括例如 四羟基细菌藿烷(Tetrahydroxybacteriohopane) (C35-辟烯醇)，高 泛烷-22-醇，hop-22 (29)-烯等。
而且，作为脂肪酸，包括例如顺式-ll-十八碳烯酸等。
N-酰基二氢鞘氨醇是指包含于碱性稳定脂质中的二氢鞘氨醇脂 质的一部分，是在鞘氨醇(sphingoid)碱基二氢鞘氨醇上结合了脂肪酸 的总称为神经酰胺的化合物， 一般用以下化学式(l)表示。而且，式(l) 中-CO-R表示酰基。式(l)中，已知构成酰基的脂肪酸是羟基脂肪酸或 普通脂肪酸，饱和烃或不饱和烃，直链状或分支状的，碳原子数为2-30 以下的脂肪酸。
而且，作为醋酸菌来源的N-酰基二氢鞘氨醇，确认的是构成酰基 的作为脂肪酸的肉豆蔻酸，软脂酸，硬脂酸，棕榈油酸，油酸，11-十八碳烯酸，亚油酸，2-羟基肉豆蔻酸，2-羟基软脂酸等，尤其是N-2'-羟基棕榈酰-二氢鞘氨醇，N-棕榈酰-二氢鞘氨醇，N-顺式-vaccenoyl-二氢鞘氨醇占其组成比的多数(例如，参照《岩手大学大学院连合农学研究科博士论文》，后藤英嗣著，p. 11-41，2001年)。
以上化合物根据醋酸菌的种类而其含量比不同，在醋酸菌所属的 革兰氏阴性菌中只作为膜脂质的主要构成成分存在，不作为革兰氏阳 性菌和真核生物等其它生物的脂质成分存在，或者为极微量的化合物 类。
从醋酸菌或食醋中用有机溶剂提取肌肉损伤抑制物质制造肌肉 损伤抑制組合物可以按照常规方法。例如，对醋酸菌适当超声波石皮碎 后，用有机溶剂溶液提取肌肉损伤抑制物质后再浓缩。
食醋，同样也用有机溶剂溶液提取肌肉损伤抑制物质后再浓缩。 还可以将这些浓缩物直接作为肌肉损伤抑制组合物使用。而且，通过 液相层析和逆流分布法等分离纯化肌肉损伤抑制物质，并且收集这些 物质，将其作为肌肉损伤抑制物质使用。
此外，联合使用例如维生素E，辅酶Q10等抗氧化物质，氨基酸， 大豆蛋白，乳蛋白等也可以形成本发明的肌肉损伤抑制组合物。
而且，本发明的肌肉损伤抑制组合物的形态，可以作为溶解于水、 或醇，含水醇等中的溶液的形态，以及通过对其进行干燥获得的粉末 的形态，或者通过将其成形获得的片剂的形态等来使用。此外，运动 辅助食品，饮料食品，药品等的形态没有特别限制。
作为饮料食品的形态，具体可以例举混合于以西红柿，胡萝卜等 作为原料的蔬菜汁，苹果，菠萝，葡萄柚，橙子，桃等为原料的果汁， 或者蔬菜汁和果汁的混合品，醇饮料，牛奶，酸奶等乳制品，运动饮 料，咖啡，红茶，绿茶，乌龙茶等茶制品，或者黑醋，谷物醋，米醋， 糙米醋，黑醋，醇醋，苹果醋和葡萄醋等以水果作为原料的水果醋， 含有蔬菜作为原料的野菜醋等的食醋制品，糖果，口香糖，果冻，冰 淇淋，小甜饼等点心；主食面包，米饭，面等主食等中。
通过在上述形态中混合本发明的肌肉损伤抑制组合物，含有其它 天然物来源的健康功能成分，可以预期累加效应乃至协同效应。
作为本发明的肌肉损伤抑制组合物的醋酸菌脂溶性有机溶剂提 取物，醋酸菌碱性稳定脂质，N-酰基二氢鞘氨醇，二氢鞘氨醇，氨基
10脂质或薛类化合物或食醋脂溶性有机溶剂提取物的施用量为成人每天
0. 001mg-100g，优选O. lmg-10g。其中，按成人每天不到0. OOlmg的施 用量，无法充分抑制肌肉损伤。
本发明的肌肉损伤抑制组合物含有醋酸菌脂溶性有机溶剂提取 物，醋酸菌碱性稳定脂质，N-酰基二氢鞘氨醇，二氢鞘氨醇，氨基脂 质或薛类化合物或食醋脂溶性有机溶剂提取物作为有效成分，在与其 它的各种原料混合均匀后，还可以根据需要混合表面活化剂等，来谋 求稳定化。
作为这些表面活性剂，可以使用山梨聚糖脂肪酸酯，甘油脂肪酸 酯，丙二醇脂肪酸酯，蔗糖脂肪酸酯和卵磷脂等。
本发明的肌肉损伤抑制组合物的适用部位只要是肌肉没有特别 限定，可以例举比目鱼肌，腓肠肌等骨骼肌，平滑肌，呼吸肌，心肌 等，特别优选的是骨骼肌的比目鱼肌，腓肠肌和心肌。
本发明的肌肉损伤抑制组合物可以发挥效果的运动量没有特别 限制，可以是人的最大摄取氧量(VO2max)80y。以下的运动量，但尤为优 选40-60%的运动量。
对于本发明中肌肉损伤抑制效果，可以通过以下试验方法确认。
即，使用通过踏车使大鼠行走运动的系统。踏车是人们在以奔跑 和行走作为目的使用的跑步机，本发明中，是指大鼠专用的小型化机 械。这种踏车与以往通过强制游泳进行的运动方法不同，可以对肌肉 进行物理负荷，因此可以更严密地验证运动产生的效果。
本发明中，作为运动时的肌肉损伤的指标，在通过踏车使之行走 运动的系统中，使用存在于吞噬细胞之一的中性白血球的颗粒的MPO。 作为该理由，已知由于如果发生由于运动负荷造成的肌肉损伤，中性 白血球增加，中性白血球中的MPO释放到细胞外，与生物体内的过氧化 氩反应，生成反应性高的次氯酸，因而再对周边组织引发伤害，通过 测定MPO活性可以了解由于运动负荷而造成的损伤程度。
此外，通过用肌管细胞的系统验证细胞水平的本发明的损伤抑制 效果。所谓肌管细胞，其在使成肌细胞分化诱导的细胞中呈肌肉纤维样形态。而且，该方法比使用动物的试验方法更为直接地验证对肌肉 损伤的效果。
在使用该肌管细胞的系统中，测定作为肌肉损伤指标的作为 一 般
炎症标记物使用的细胞素IL-6，与中性白血球的游走相关的细中性白
血球cxcl-i。其原因已知是运动时肌肉损伤不仅是机械的肌肉损伤还 与该损伤诱发的炎症反应有很大关系，人们认为损伤的肌肉细胞分泌 细胞素和趋化因子，促进中性白血球和巨噬细胞的浸润。因此，测定
作为肌肉损伤的指标的IL-6， CXCL-1。 实施例
接下来，通过实施例等更详细地说明本发明，本发明的范围不受 这些实施例的任何限制。
制造例l (醋酸菌脂溶性有机溶剂提取物的大量制备) 作为醋酸菌林，使用木糖葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus NBRC15237)林。该菌抹保藏于独立行政法人制品评价技术基 础机构生物技术本部生物遗传资源部门(千叶县木更津市上总镰足 2-5-8),是可以发放的醋酸菌。
首先，醋酸菌脂溶性有机溶剂提取物按以下方法制备。将1.8kg 醋酸菌干燥菌体悬浮于35升水，用法式沖床压力式细胞破碎机，在 10000psi的破碎压力破碎后，与丙酮混合。然后，为了除去由于混合 而产生的杂质而进行过滤。再次混合丙酮除去杂质，重复两次。对获 得的过滤液进行减压浓缩，浓缩物加乙酸乙酯和水进行混合后，进行 分液，获得有机层。再次在水层中加入乙酸乙酯，同样分液回收有机 层。对有机层减压浓缩，溶解于乙醇，再次减压浓缩，获得108g醋酸 菌脂溶性有机溶剂提取物。
制造例2 (食醋脂溶性有机溶剂提取物的大量制备) 在1000升谷物醋中混合1200升乙酸乙酯，静置分液后，回收有机 层，进行减压浓缩。在达到15升左右的容量时投入等量乙醇，搅拌， 再进行减压浓缩，获得了 2 34g食醋脂溶性有机溶剂提取物。制造例3 (醋酸菌碱性稳定脂质的制备)
与制造例l一样，使用木糖葡糖酸醋杆菌(Giuconacetobacter xylinus NBRC15237)抹作为醋酸菌林。
首先，用以下方法制备醋酸菌来源的碱性稳定脂质。即，用氯仿 -甲醇系溶剂(氯仿甲醇水=1: 2: 0. 8)从该醋酸菌株的2000g干燥菌体 中提取，然后，进行2层分离，作为脂质粗级分回收下层。然后，用O. 4N NaOH对脂质粗级分进行弱碱性分解除去磷脂，按照Folch的组成(氯仿 曱醇水=8:4:3)进行再提取，浓缩干燥，获得醋酸菌来源的碱性稳定 脂质。
通过使用硅胶平板的薄层层析确认获得的醋酸菌来源的碱性稳 定脂质中所含的脂质成分。作为该薄层层析中的展开溶剂，涉及脂肪 酸，碎类化合物，N-酰基二氢鞘氨醇使用氯仿甲醇-96:4，并且，涉 及二氢鞘氨醇和氨基脂质的使用氯仿甲醇水=65: 16: 2。
作为对照，以从被确认含有萜类化合物，N-酰基二氢鞘氨醇，氨 基脂质等的醋酸菌提取的纯化品(例如，参照前述的"带大研报"，23 巻，p. 917-925 (1978年)，"岩手大学大学院连合农学研究科博士论文"， 后藤英嗣著，P. 11-41 (2001年)和市售的二氢鞘氨醇(SIGMA社制))作为 指标。薄层层析的结果发现在碱性稳定脂质中也存在作为对照的化合 物。
而且，通过高效液相色i普确认碱性稳定脂质中的主要成分的含 量。在无水吡啶和氯化苯酰存在下于7 0 'C使碱性稳定脂质反应10分钟， 纯化含有萜类化合物和神经鞘脂类的苯酰衍生物。该苯酰衍生物提供 给高效液相色谱，检测紫外吸光230nm的波长。根据采用上述各化合物 的市售标准品或确认了结构的醋酸菌中提取的纯化品的标准曲线，计 算碱性稳定脂质所含的含量。使用己烷异丙醇=100: l的溶剂作为高 效液相色i普的移动相，流速为lml/分钟。
这样分析的醋酸菌来源的碱性稳定脂质中的主要成分示于下述表l。
而且，可以确认氨基脂质的存在(组合比未确认)，没有发现存在磷脂酰胆碱，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰丙三醇等磷脂类。
表l
醋酸菌来源的碱性稳定脂质的主要成分组合比(重量/重量％)
辟类化合物11. 511
N-酰基二氢鞘氨醇5.446
二氢鞘氨醇3. 173
制造例4(萜类化合物，N-酰基二氢鞘氨醇，氨基脂质，二氢鞘氨 醇的纯化)
将10g上述碱性稳定脂质提供给用氯仿平衡化的硅胶柱，用按氯 仿醋酸-99: l的容量比混合的溶剂洗涤后，用氯仿甲醇==97: 3的溶剂 洗脱，对获得的级分进行干燥，获得级分l。
然后，对通过用氯仿甲醇=96:4、 95: 5的溶剂洗脱获得的级分进 行干燥，获得级分2。再用氯仿甲醇-92:8， 9:1的溶剂洗脱脂质，对 获得的级分进行干燥，获得级分3。再用氯仿甲醇-2:l的溶剂洗脱， 对获得的级分进行千燥，获得级分4。
对获得的级分l，通过采用硅胶板的薄层层析确认构成脂质。作 为该薄层层析中展开溶剂，采用氯仿甲醇-96:4。其结果是，级分l 的构成脂质是与实施例l中使用的确认了N-酰基二氢鞘氨醇的醋酸菌 中获得的纯化品同一移动度的单一的点。此外，按照常规方法，用含 水甲醇性盐酸分解级分l，通过薄层层析分离成鞘氨醇类碱基 (sphingoid base)和月旨肪酸，并进4亍纯4匕。
对于这些鞘氨醇类碱基和脂肪酸，按照常规方法，进行三甲基甲 硅烷基化反应，通过气相色谦-质谦分析进行结构分析，结果发现含有 作为N-酰基二氢鞘氨醇的N-2'-羟棕榈酰-二氢鞘氨醇，N-棕榈酰-二氬 鞘氨醇，N-顺式-vaccenoyl -二氢鞘氨醇。
根据以上结果，确认了级分l的通过薄层层析检测到的单一的点 是N-酰基二氩鞘氨醇。
此外，通过薄层层析确认了级分2，级分3的构成脂质。作为薄层
14层析中的展开溶剂，级分2使用氯仿甲醇=96:4的溶剂，级分3、级分 4使用氯仿甲醇水-65:16:2的溶剂。作为对照，使用确认了制造例3 中使用的薛类化合物，氨基脂质的结构的从醋酸菌中获得的纯化品以 及市售的二氢鞘氨醇(SIGMA公司制)。
薄层层析的结果是，级分2的点与萜类化合物的对照一致，级分3 的点与氨基脂质的对照一致，级分4的主要点与氨基脂质的指标一致。
根据以上结果，分别确认了级分2中检测到的薄层层析的点含有 萜类化合物，级分3中检测到的薄层层析的点含有二氢鞘氨醇，级分4 中检测到的薄层层析的点含有氨基脂质。
实施例1 (轻度运动量下的肌肉损伤抑制效果)
使用Crl:CD(SD)大鼠，l周时间，10分钟/天通过踏车施加运动负 荷(带斜度6度，速度10m/分钟)，进行运动负荷后，进行一周通过
经口才聂取的试才羊施用。
饰食以固体饲料CRF-1 (0r ienta 1酵母工业社制)作为基本饲料， 试样分为以下3组(n-8),即只施用基本饲料(非施用区)，除基本饲料 外，按照最终达到500mg/kg大鼠体重强制施用制造例l中制备的醋酸菌 脂溶性有机溶剂提取物(醋酸菌提取物区)，按照最终达到500mg/kg大 鼠体重强制施用制造例2中制备的食醋脂溶性有机溶剂提取物(食醋提 取物区)。而且，在强制施用时，安装了一次性大鼠用经口管的聚丙烯 制一次性注射筒。
而且，在施用第7天进行尸检，测定心脏，比目鱼肌，腓肠肌的 MPO活性。MPO活性的测定，使用髓过氧物酶测试盒(Cytostore/^司制) 进行。
即，在约0. 5g各组织片中加入250nl溴化十六烷三甲胺 (Hexadecyltri—methylammounium bromide)溶液,用乳钵破碎，在 10000rpm离心后，回收上清。将回收的上清调整到组织蛋白质浓度达 到20mg/ml，制成MPO活性测定用组织石皮碎液。而且，組织蛋白质浓度 的测定采用Bio Rad DC-protein Assay (蛋白质测试)(Bio-Rad Laboratories公司制)e然后，为了进行反应液的调整，在100ml的o-邻联茴香胺 (o-dianisidine dihydrochloride)/磷酸緩沖液中力口入0. 5加1的1%过 氧化氢，将其作为反应液。在20ja 1的各组织的MP0活性测定用组织破 碎液中添加200 in l反应液，使用吸光度计，测定当时及l分钟后的450nm 的吸光度。
而且，MPO活性lU定义为每lg组织蛋白质反应lM过氧化氢时，每 上升每l分钟的吸光度(450nm)。
以上结果示于图l。而且，对各器官的未施用区，醋酸菌提取物 区，食醋提取物区，分别进行按照显著水准5。/。的t检验，用※表示发现 有显著差异的试验区。
图l的结果，与未施用区相比，醋酸菌提取物区和食醋提取物区 中，心脏，比目鱼肌，腓肠肌中MPO活性均显著减少，可以确认醋酸菌 脂溶性有机溶剂提取物和食醋脂溶性有机溶剂提取物均存在抑制肌肉 损伤。
实施例2 (大强度运动量下肌肉损伤抑制效果)
为了验证不同运动种类导致的效果的差异，l周时间，10分钟/ 天，进行踏车产生的运动负荷(带斜度6度，速度10m/分钟)后， 一边通过强制经口摄取施与饲料， 一边进行6天运动，在第7天通过踏 车进行运动负荷(带斜度IO度，速度20m/分钟)。
何食以固体饲料CRF-1 (Oriental酵母工业社制)作为基本铜料， 试样分为以下3组(n-8)，即只施用基本祠料(非施用区)，除基本饲料 外，按照最终达到500mg/kg大鼠体重强制施用制造例l中制备的醋酸菌 脂溶性有机溶剂提取物(醋酸菌提取物区)，按照最终达到500mg/kg大 鼠体重强制施用制造例2中制备的食醋脂溶性有机溶剂提取物(食醋提 取物区)。而且，在施用第7天，运动终止2小时后进行尸检，测定心脏 的MPO。测定方法与实施例l一样。
以上结果示于图2。而且，对未施用区，醋酸菌提取物区，食醋 提取物区，分别进行按照显著水准5M的t检验，用※表示发现有显著差 异的试验区。图2的结果，与未施用区相比，醋酸菌提取物区和食醋提取物区 中，MPO活性均显著减少，可以确认醋酸菌脂溶性有机溶剂提取物和食 醋脂溶性有机溶剂提取物均抑制肌肉损伤。而且，还确认了存在使运 动量增加的效果。
实施例3 (采用肌管的肌肉损伤抑制效果)
本评价系统中采用小鼠来源的C2C12成肌细胞。该细胞保存于理 化学研究所，是可以发放的细胞林。而且，通过分化诱导，由单核的 成肌细胞分化成多核的肌管细胞，形成肌纤维样的形态。将该细胞接 种于涂覆了胶原I的35mm培养亚中，用DMEM(l 1965-092; GIBC0公司制) + 10。/。FBS(以下也称为增殖培养基)，在37。C, 5%0)2的条件下培养直至 达到90%融合后，再用DMEM(11885-084; GIBCO公司制)+ 5。/。HS培养基 (以下也称为分化培养基)，在37。C， 5%002的条件下培养72小时，使之 分化成肌管细胞。而且，在48小时后更换一次培养基。
将制造例1中制造的醋酸菌脂溶性有机溶剂提取物，制造例3制造 的醋酸菌碱性稳定脂质，制造例4制造的辟类化合物，N-酰基二氢鞘氨 醇，氨基脂质，二氢鞘氨醇分别溶解于DMSO中，按终浓度10jig/ml添 加到分化培养基中。考虑到DMSO对细胞的影响，将培养基添加后的DMSO 调整到终浓度5 jLi 1/ml。添加后，于37。C， 5%0)2存在下培养24小时。
添加各脂质培养24小时的肌管细胞用PBS洗涤3次，用lmM H202+ 分化培养基于37'C, 5%0)2存在下培养2小时后废弃培养基，回收肌管 细胞。而且，在不直接^f吏用回收的细胞时，用液氮瞬间冷冻，使用前 一直在-80'C冷冻库中保存。
为了分析回收的细胞的IL-6和CXCL-l的基因表达，从细胞提取总 RNA，通过逆转录反应合成cDM,通过定量PCR分析基因的表达。即， 用含有苯酚，异石危氰酸胍的Trizol溶液(invitrogen公司制)按照附带 的操作规程提取并纯化总RNA,用于逆转录反应。提取的总RNA基于吸 光度(260nm， 280nm)的测定结果测定RNA浓度。
逆转录反应中反应液采用Taqman逆转录试剂，基于附带的操作手 册制备。而且，每个试样的总RNA量约为200ng。逆转录反应在25。C (10
17分钟)—48°C (30分钟)—95°C (5分钟)—4'C的条件下进行PCR反应，获 得cDNA。
用获得的cDNA进行定量PCR。定量PClH吏用qPCRs叩er mix-UDG with ROX作为反应试剂，IL-6用作引物使用Mm00446190 (AB公司制)， 用于CXCL-1用引物使用Mm00433859 (AB/^司制)，作为内部标准使用的 丙三醇3磷酸脱氬酶(以下也称为GAPDH)用作引物使用Mm99999915 (AB 公司制)，按照操作手册制备PCR反应液。定量PCR使用ABI prism7000, 在50。C2分钟—95°C 10分钟卄〈95。C 15秒—60°C l分钟〉(40个循环) —4。C的反应条件下进行，用GAPDH的测定值作为100的相对值表示IL-6 和CXCL-l的各测定值。
结果示于图3和图4。而且，与过氧化氬处理比较，分别对醋酸菌 脂溶性提取物，醋酸菌碱性稳定脂质，N-酰基二氢鞘氨醇，二氩鞘氨 醇，氨基脂质和碎类化合物处理区进行按照显著水准5y。的t检验，用※ 表示发现有显著差异的试验区。
根据图3的结果，在醋酸菌脂溶性提取物，醋酸菌碱性稳定脂质 中发现了 IL-6的基因表达抑制效果。
根据图4的结果，在N-酰基二氢鞘氨醇，二氢鞘氨醇，氨基脂质 和辟类化合物中发现了 IL-6， CXCL-1的各基因表达抑制效果。
根据以上结果，在本发明的醋酸菌脂溶性提取物，醋酸菌碱性稳 定脂质，鞘脂类，二氢鞘氨醇，氦基脂质和辟类化合物中发现存在肌 肉损伤抑制效果。
实施例4(片剂的制造)
(1)醋酸菌脂溶性有机溶剂提取物
用高速离心机(8000rpm，20分钟)对10千升的醋酸发酵液收集菌 体，获得10kg的湿菌体。用蒸馏水洗涤所得到10kg湿菌体后，用大型 冷冻千燥机冷冻减压干燥，获得了l. 8kg的干燥菌体。
将获得的干燥菌体lkg与10升丙酮一起装入索氏抽提器(Soxhlet extractor), 20小时加热环流。对获得的提取液减压干燥，添加10升 的乙酸乙酯和10升蒸馏水，分液之后，用转缸式蒸发机蒸发有机层，
18在达到l升左右的容量时等量投入乙醇，搅拌，用转缸式蒸发机蒸发干
燥后，获得了淡黄褐色的醋酸菌脂溶性有机溶剂提取物约50g。加入获 得的醋酸菌脂溶性有机溶剂提取物lg(O. 7重量％)，结晶纤维素 35g(26. 9重量％)，千燥玉米淀粉67g(51.5重量。/。)，乳糖22g(16. 9重量 %)，硬脂酸钙2g(1. 5重量n/。)和作为结合剂的聚乙烯吡咯烷酮3g(2. 3重 量°/。)，混合粉末化后，填充于硬明胶胶嚢中。 (2)食醋脂溶性有机溶剂提取物
将5升食醋与6升乙酸乙酯混合，用转缸式蒸发机蒸发有机层，在 达到约l升时加入等量乙醇，再用转缸式蒸发机蒸发后，获得了茶褐色 的食醋脂溶性有机溶剂提取物约1 g 。
加入获得的食醋脂溶性有机溶剂提取物lg(O. 7重量％)，结晶纤维 素35g(26. 9重量％)，千燥玉米淀粉67g(51. 5重量％)，乳糖22g(16. 9重 量％),硬脂酸钙2g(1. 5重量y。)和作为结合剂的聚乙烯吡咯烷酮3g(2. 3 重量％)，混合粉末化后，填充于硬明胶胶嚢中。
能够有效经口摄取。
实施例5(果冻的制造) (l)醋酸菌破碎粉末
用高速离心机器(8000rpm， 20分钟)对醋酸发酵液千升收集菌体， 获得了湿菌体10kg。使获得的湿菌体10kg分散于等量的蒸馏水。在通 过使分散的20kg的醋酸菌分散液3次通过高压均化器(20000psi)实施 细胞破坏处理后，用大型冷冻干燥机冷冻减压干燥，获得了l. 5kg的干 燥菌体粉末。
均匀混合获得的干燥菌体粉末8g (0. 8重量％)，砂糖250g (25重量 %),角叉茱胶1. 6g(0. 16重量％)， 刺槐豆胶(Locust bean gum)O. 8g(0. 08重量％)，黄原胶(xanthan gum) 0. 8g (0. 08重量％)，获 得粉状混合物。在锅中计量300g的水，溶解黑糖30g(3. 0重量％)，再混 合还原糖浆(hydrogenated syrup) 150g(15重量W，加入先前获得 的粉状混合物， 一边搅拌以使其不成块状， 一边混合。将它们搅拌均匀，加入余下的水258. 8g，加温。溶液温度在85匸加热10分钟溶解后， 用流水冷却，获得了含醋酸菌体的果冻食品。 (2)食醋脂溶性有机溶剂提取物
将50升食醋与60升乙酸乙酯混合，用转缸式蒸发机蒸发有机层， 在达到约10升时加入等量乙醇，再用转缸式蒸发机蒸发后，获得了茶 褐色的食醋脂溶性有机溶剂提取物约1 Og。
混合均匀获得的食醋脂溶性有机溶剂提取物8g(0. 8重量％),砂糖 250g(25重量y。)，角叉菜胶l. 6g(0. 16重量％)，刺槐豆胶O. 8g (0. 08重 量％),黄原胶O. 8g (0. 08重量％)，获得粉状混合物。用锅计量300g的水， 溶解黑砂糖30g(3. 0重量％)，再混合还原糖浆150g(15重量。/。)，加入先 前获得的粉状混合物， 一边搅拌使得其不成块状， 一边再混合。将它 们搅拌均匀，加入余下的水258. 8g，加温。溶液温度在85。C加热10分 钟溶解后，用流水冷却，获得了含食醋脂溶性有机溶剂提取物的果冻 食品。
可以期待上述(1)和(2)中制备的果冻食品作为肌肉损伤抑制组 合物，能够有效经口摄取。 实施例6(饮料的制造)
(1) 含醋酸菌体的食醋
用高速离心机器(8000rpm， 20分钟)对醋酸发酵液10千升收集菌 体，获得了湿菌体10kg。使获得的湿菌体10kg分散于100L食醋中。使 分散的醋酸菌分散液3次通过高压均化器(20000psi)，实施细胞破坏处 理。将该溶液分注于容积为500ml的瓶中，通过加温至75。C进行杀菌，
获得了含醋酸菌体的食醋。
(2) 含高浓度的食醋脂溶性有机溶剂提取物的食醋 将500升食醋与600升乙酸乙酯混合，用转缸式蒸发机蒸发有机
层，在达到50升左右时加入等量乙醇，再用转缸式蒸发机蒸发后，获 得了茶褐色的食醋脂溶性有机溶剂提取物(食醋脂溶性级分)约100g。 使获得的食醋脂溶性级分100g分散于l升食醋。将该溶液分注于容积为 500ml的瓶中，通过加温至75。C进行杀菌，获得了含高浓度的食醋脂溶性有机溶剂提取物的食醋。
可以期待，上述(1)和(2)制备的饮料作为肌肉损伤抑制组合物可以有效经口摄取。
工业上利用的可能性
本发明可以廉价地提供对人体的安全性高而且具有肌肉损伤抑制效果的经口物品。因此，通过作为食品等形式经口摄取本发明涉及的肌肉损伤抑制组合物品，可以预期能够预防体育活动和激烈运动中肌肉损伤和伴随日常生活中身体活动的轻度的肌肉损伤的效果。
权利要求
1、肌肉损伤抑制组合物，其特征在于含有醋酸菌的脂溶性有机溶剂提取物作为有效成分。
2、 权利要求l所述的肌肉损伤抑制组合物，其特征在于所述脂溶性 有机溶剂是乙酸乙酯。
3、 权利要求l所述的肌肉损伤抑制组合物，其特征在于所述脂溶性 有机溶剂提取物是碱性稳定脂质。
4、 权利要求3所述的肌肉损伤抑制组合物，其特征在于所述碱性稳 定脂质为N-酰基二氢鞘氨醇。
5、 权利要求3所述的肌肉损伤抑制组合物，其特征在于所述碱性稳 定脂质是二氢鞘氨醇。
6、 权利要求3所述的肌肉损伤抑制组合物，其特征在于所述碱性稳定脂质是氨基脂质。
7、 权利要求3所述的肌肉损伤抑制组合物，其特征在于所述碱性稳 定脂质是薛类化合物。
8、 肌肉损伤抑制组合物，其特征在于含有食醋的脂溶性有机溶剂 提取物作为有效成分。
9、 权利要求8所述的肌肉损伤抑制组合物，其特征在于所述脂溶性 有机溶剂是乙酸乙酯。
全文摘要
本发明的目的在于提供一种安全性高且肌肉损伤抑制效果更强的肌肉损伤抑制组合物。本发明提供一种肌肉损伤抑制组合物，其特征在于含有醋酸菌的脂溶性有机提取物，优选醋酸菌的乙酸乙酯提取物，醋酸菌碱性稳定脂质，N-酰基二氢鞘氨醇，二氢鞘氨醇，氨基脂或萜类化合物。本发明还提供了一种肌肉损伤抑制组合物，其特征在于含有食醋的脂溶性有机溶剂提取物，优选食醋的乙酸乙酯提取物作为有效成分。
文档编号A61K31/164GK101583353SQ20078005002
公开日2009年11月18日 申请日期2007年1月16日 优先权日2007年1月16日
发明者杉山健一, 榊原玲奈 申请人:味滋康集团有限公司